1 la réponse de la modélisation moléculaire eduardo de oliveira catherine humeau elaine-rose maia...
Post on 03-Apr-2015
110 Views
Preview:
TRANSCRIPT
1
La réponse de la modélisation moléculaire
Eduardo DE OLIVEIRA
Catherine HUMEAU
Elaine-Rose MAIA
Séminaire Annuel Séminaire Annuel RP2ERP2E -- Le 15 janvier -- Le 15 janvier 20092009
Pourquoi les lipases sont-elles régiosélectives
dans l'acylation de flavonoïdes ?
Latifa CHEBIL
Mohamed GHOUL
Jean-Marc ENGASSER
2
INTRODUCTIONET
OBJECTIFS
3
• Composés Composés polyphénoliquespolyphénoliques à faible poids moléculaire à faible poids moléculaire
Les flavonoïdesLes flavonoïdes
Vaste spectre de Vaste spectre de propriétés biologiques bénéfiquespropriétés biologiques bénéfiques, mais…, mais…
… … faible solubilitéfaible solubilité en milieu hydrophile et hydrophobe. en milieu hydrophile et hydrophobe.
(Harvsteen, 2002 ; Boudet, 2006 ; Chebil et al., 2007)
• Métabolites secondaires de nombreuses Métabolites secondaires de nombreuses espèces végétalesespèces végétales
(…)(…)
(…)(…)
4
• Permet d’augmenter leur hydrophobicité (Permet d’augmenter leur hydrophobicité (lipophilisationlipophilisation))
• Peut être accomplie par voie Peut être accomplie par voie chimiquechimique ou ou enzymatiqueenzymatique
Acylation de flavonoïdesAcylation de flavonoïdes
(Chebil et al., 2006, Villeneuve et al., 2007)
• VOIE CHIMIQUE :VOIE CHIMIQUE :
• VOIE ENZYMATIQUE :VOIE ENZYMATIQUE :
OHOH
OHOH
OHOH
HOHO
OHOH
OHOH
OHOH
HOHO
OO-R-R
OHOH
OHOH
HOHO
OHOH
HOHO
R-R-OO
OO-R-R
Donneur
d’acyle (R)
P, T, milieu basique
Donneur
d’acyle (R)
Enzyme
OO-R-RR-R-OO
OO-R-R
OO-R-R
OO-R-R
HOHO
OHOH
OO-R-R
5
• ENZYME = protéine qui catalyse des réactions chimiquesENZYME = protéine qui catalyse des réactions chimiques
• LIPASES = enzymes capables de catalyser les réactions :LIPASES = enzymes capables de catalyser les réactions :– Hydrolyse de liaisons ester en milieu aqueuxHydrolyse de liaisons ester en milieu aqueux– Formation de liaisons ester en milieu organiqueFormation de liaisons ester en milieu organique
• De nombreuses applications en biotechnologie De nombreuses applications en biotechnologie (Jaeger, 2002)
• Lipase la plus utilisée : Lipase la plus utilisée : Candida antarcticaCandida antarctica lipase B (CALB) lipase B (CALB)
LipasesLipases
Structure de la CALB Cavité du site actif :
« Triade catalytique » au fond
6
Deux cas d’acylation de Deux cas d’acylation de flavonoïdes en utilisant la flavonoïdes en utilisant la
CALB CALB
O
OHOHHO
OH
O
OHOH
OOH
HO
O
• ISOQUERCITRINE :ISOQUERCITRINE :
O
OHOHHO
O-CO-CH-CO-CH33
O
OHOH
OOH
HO
O
Vinyl-
acetate
CALB
(Nakajima et al., 1999 ; Stevenson et al., 2006 ; Chebil et al., 2007)
O
OHOH
OOH
HO
OH
O
OHOH
OOH
HO
OH
• QUERCÉTINE :QUERCÉTINE :
Vinyl-
acetate
CALB
(Ardhaoui et al., 2004 ; Chebil et al., 2007)
Aucune réaction
6’’OH
7
Utiliser des outils de SIMULATION MOLECULAIRE pour expliquer, dans le cas de l'acétylation enzymatique de l’isoquercitrine et de la quercétine, catalysée par
la lipase B de Candida antarctica (CALB) :
(A) LA SPECIFICITÉ :Pourquoi la CALB est-elle capable de catalyser l’acétylation de l'isoquercitrine mais pas celle de la quercétine ?
(B) LA RÉGIOSÉLECTIVITÉ :Pourquoi, dans le cas de l'isoquercitrine, seulement un groupement hydroxyle (6’’-OH) précis du substrat réagit ?
ObjectifsObjectifs
8
METHODOLOGIE
9
Outils de simulationOutils de simulation
• Structure Structure cristallographiquecristallographique de l’enzyme CALB : de l’enzyme CALB : – Obtenue sur la Obtenue sur la Protein Data Bank (PDB)Protein Data Bank (PDB)– Code Code 1LBS1LBS
• LogicielsLogiciels– Discovery Studio (v.1.7)Discovery Studio (v.1.7)– Insight (v. 2005)Insight (v. 2005)– Champ de forces :Champ de forces :
• CHARMmCHARMm
– Algorithme de docking : • LigandFit
10
Chacune de ces orientations est placée dans la
cavité (« pose »)
Principe du dockingPrincipe du docking
Exploration de l’espace
conformationnel du ligand
Chaque conformation :
4 orientations
possibles
11
Choix de poses Choix de poses favorablesfavorables
Complémentarité géométrique :
BONNE ADEQUATION DE FORME AVEC LA CAVITE
Complémentarité chimique :
INTERACTIONS FAVORABLES AVEC LES RESIDUS PROCHES
• Liaisons H • Électrostatiques• Aromatiques (- et -)• Van der Waals • (…)
15.000 conformères (= 60.000 poses) GÉNERÉES…
… et seules les 50 les plus favorables RETENUES
12
Mécanisme réactionnel Mécanisme réactionnel simplifiésimplifié
(adapté de Uppenberg et al., 1994)
Enzyme libre
CIBLE DE DOCKING
SUBSTRAT DOCKÉ
Flavonoïde (accepteur d’acyle)
FH3C
F – OH
Flavonoïde acylé
Enzyme régénérée
H2C = CH
OH
CH3
Acyl-enzyme
H3CCH=CH2
Vinyl-acétate (donneur d’acyle)
13
(1)
(3)
(2)
L’étape critiqueL’étape critique
(1)Liaisons H entre ACE et les résidus Thr40 et Gln106
(2)Transfert de proton (activation de l’accepteur l’acyle)
(3)Attaque nucléophile sur l’acyle-enzyme
HO
OHOH
OHOH
HOHO Flavonoïde docké dans la cavité de l’acyl-enzyme
(adapté de Hult et al., 1998, 2000, 2001)
14
≤ 4Å
≤ 4Å
Analyse des poses retenuesAnalyse des poses retenues
HO
OHOH
OHOH
HOHO
MODE DE LIAISON MODE DE LIAISON PRODUCTIFPRODUCTIF : :
• Mode de liaison du ligand qui aboutit à une réaction.Mode de liaison du ligand qui aboutit à une réaction.• Le substrat docké doit obéir à Le substrat docké doit obéir à trois conditionstrois conditions : :
2 ou 3 liaisons H
(Botta et al., 2002 ; Vallikivi et al., 2005 ; Palocci et al., 2007)
Flavonoïde docké dans la cavité de l’acyl-enzyme
15
RESULTATSET
DISCUSSION
16
IsoquercitrineIsoquercitrine
OOHOH
HO
OH
OOH
OH
OOH
HO
O
Mode de liaison 1
PARTIE SUCRESUCRE AU FOND DE LA CAVITÉ
O OH
OH
HOO
H
O
OH
OH
OO
H
HOO
PARTIE PHÉNOLIQUEPHÉNOLIQUE AU FOND DE LA CAVITÉ
Mode de liaison 2
17
Mode de liaison 1Mode de liaison 1
SUCRESUCRE AU FOND DE LA POCHE AU FOND DE LA POCHE
+ hydrophobe+ hydrophile
VUE 1 : VUE VUE 1 : VUE FRONTALEFRONTALE DE LA CAVITE DE L’ENZYME DE LA CAVITE DE L’ENZYME (SURFACE DE CONNOLLY)(SURFACE DE CONNOLLY)
Partie phénolique à l’entrée
Partie sucre vers
le fond
Ile189
Val149
18
Mode de liaison 1Mode de liaison 1SUCRESUCRE AU FOND DE LA POCHE AU FOND DE LA POCHE
VUE 2 : VUE VUE 2 : VUE LATERALELATERALE DU LIGAND DOCKE ET DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANTDES RESIDUS INTERAGISSANT
Thr40
His224
Asp187
Ile189
Val149
Ser105
Gln106
ACE
• 3’’-OH :
• His224:N : 8.7 Å
• ACE:C : 7.4 Å
• 4’’-OH :
• His224:N : 6.2 Å
• ACE:C : 4.6 Å
• 6’’-OH :
• His224:N : 4.0 Å
• ACE:C : 3.5 Å
19
Mode de liaison 2Mode de liaison 2PARTIE PHÉNOLIQUEPARTIE PHÉNOLIQUE AU FOND DE LA POCHE AU FOND DE LA POCHE
VUE VUE LATERALELATERALE DU LIGAND DOCKE ET DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANTDES RESIDUS INTERAGISSANT
Thr40
His224
Asp187
Ile189
Val149
Ser105
Gln106
ACE
• 5-OH :
• His224:N : 8.3 Å
• ACE:C : 5.6 Å
• 7-OH :
• His224:N : 7.1 Å
• ACE:C : 5.2 Å
20
QuercétineQuercétineMode de liaison 1
AC
B
CYCLE AA AU FOND DE LA CAVITÉ
A
C
B
Mode de liaison 2
CYCLE BB AU FOND DE LA CAVITÉ
21
Mode de liaison 1Mode de liaison 1CYCLE ACYCLE A AU FOND DE LA POCHE AU FOND DE LA POCHE
VUE VUE LATERALELATERALE DU LIGAND DOCKE ET DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANTDES RESIDUS INTERAGISSANT
His224
Asp187
Thr40
Ser105
Gln106
ACE• 5-OH :
• His224:N : 6.3 Å
• ACE:C : 4.3 Å
22
Mode de liaison 2Mode de liaison 2CYCLE BCYCLE B AU FOND DE LA POCHE AU FOND DE LA POCHE
VUE 2 : VUE DU LIGAND DOCKE ETVUE 2 : VUE DU LIGAND DOCKE ET
DES RESIDUS INTERAGISSANTDES RESIDUS INTERAGISSANT
His224 Asp187
Thr40
Ser105
Gln106
ACE
Gln157
• 3’-OH :
• His224:N : 6.2 Å
• ACE:C : 5.7 Å
• 4’-OH :
• His224:N : 4.5 Å
• ACE:C : 3.7 Å
23
CONCLUSIONS
24
O
OHOHHO
O--CO-CHCO-CH33
O
OHOH
OOH
HO
O
His224
ACE
His224
ACE
Pas d’acétylation sur la partie phénolique et…
… acétylation seulement du 6’’-OH de la partie sucre.
Acétylation seulement du 6’’-OH de la partie sucre.
ISOQUERCITRINE
OK OK
25
His224
ACEHis224
ACE
… ni sur le cycle A. Pas d’acétylation sur le cycle B…
O
OHOH
OOH
HO
OH
Aucune réaction
QUERCÉTINE
OK OK
26
Trois CRITÈRES STRUCTURAUX doivent être satisfaits pour qu’un Trois CRITÈRES STRUCTURAUX doivent être satisfaits pour qu’un complexe enzyme-substrat puisse être considéré comme RÉACTIF complexe enzyme-substrat puisse être considéré comme RÉACTIF
::(1)(1) 2 ou 3 liaisons H entre l’acyle-enzyme et le 2 ou 3 liaisons H entre l’acyle-enzyme et le
« oxyanion hole »« oxyanion hole »(2)(2) Au moins un OH à Au moins un OH à ≤ 4 ≤ 4 Å de l’atome Ace:C Å de l’atome Ace:C (3)(3) Au moins un OH à Au moins un OH à ≤ 4 ≤ 4 Å de l’atome His224:NÅ de l’atome His224:N
(A) LA SPECIFICITÉ :Isoquercitrine : au moins un mode de liaison satisfait aux critères de réactivité = réaction OK OK Quercétine : aucun mode de liaison ne satisfait aux critères de réactivité = absence de réaction NON NON
(B) LA RÉGIOSÉLECTIVITÉ :6’’-OH : le seul OH de l’isoquercitrine satisfaisant aux critères de réactivité (donc le seul à pouvoir réagir).
MÉTHODOLOGIE PRÉDICTIVE ? ? ?MODÈLES EXPÉRIENCE
27
Équipe Biocatalyse-Bioprocédes - LIBio – ENSAIA /
INPL
• Eduardo Basilio DE OLIVEIRA (doctorant - 3ème année)
• Catherine HUMEAU (Maître de conférences)
• Mohamed GHOUL (Professeur)
• Jean-Marc ENGASSER (Professeur)
• Latifa CHEBIL (Maître de conférences)
• Évelyne RONAT (Informaticienne)
Collaborateurs – experts en Modélisation Moléculaire
• Elaine-Rose MAIA (Professeur – Université de Brasilia – Brésil)
• Bernard MAIGRET (Directeur de recherche - LORIA –CNRS)
MERCI DE VOTRE MERCI DE VOTRE ATTENTION !ATTENTION !
top related