08 bjordal johansen - nito
Post on 15-Oct-2021
3 Views
Preview:
TRANSCRIPT
06.04.2018
1
FilmArray BioThreat panelErfaringer fra BeredskapslaboratorietNITO BFI kurs 2018
Tone Bjordal Johansen, FHI
NIPH -
BSL3 agens
BSL4 agens - hanskebenk
06/04/2018
Beredskapslaboratoriet
Biosikkerhet
06.04.2018
2
NIPH - 06/04/2018
Nasjonalt Mikrobiologisk Beredskapslaboratorium
Beredskapsvakt 24/7
Nasjonalt beredskapslaboratorium for mikrober knyttet tilbioterror
•Pulverbrev
•Annen mistanke om bioterroragens
•Kliniske prøver med mistanke om høypatogene agens
Tilgjengelig for politi, helseforetak, medisinsk-mikrobiologiske laboratorier og andre offentlige instanser
Tilbyr RT-PCR og dyrkning av en rekke agens, ulike hurtigtester av toksiner og multiplex- analyser av høypatogene agens og toksiner
Nasjonalt referanselaboratorium for Brucella spp., Bacillusanthracis, Burkholderia mallei / pseudomallei
Avtale med Folkhälsomyndigheten i Sverige om ytterligereanalyse av BSL4 agens
NIPH -
•Naturlige utbrudd
•Ebola
•Pest
•Uhell / mislighold
•Laboratorieuhell
•Malpraksis
•Kriminell handling
•Bioterror –intensjonell handling
Biologiskhendelse:
Mistanke om eller bekrefteteksponering
for et biologiskagens som
kreverekstraordinær
handling og beredskap
06/04/2018
Bioterror vs biologisk hendelse
06.04.2018
3
NIPH - 06/04/2018
Bioingeniøren, mars 2018
NIPH -
Bacillus anthracis – anthrax / miltbrann
Yersinia pestis – pest
Coxiella burnetii – Q feber
Burkholderia mallei – snive
Burkholderia pseudomallei – pseudosnive
Brucella sp. – brucellose
Francisella tularensis- tularemi / harepest
Virale hemorragiske febere (Ebola / Marburg / CCHF)
MERS-CoV
Botulinumtoksin
Ricin
06/04/2018
Våre viktigste agens
06.04.2018
4
NIPH -
Varsling av prøve til vakthavende lege
(95214993)
Innsendelse(kategori A eller B
transport)
Mottak av prøve, prøveopparbeidelse i
BSL3 laboratorium
HurtigdiagnostikkFilmArray og RT PCR
Dyrking og verifiserende analyser
AST testing
Slektskapsanalyser / utbruddsetterforskning
06/04/2018
NIPH -
Agens Analyse Referansefunksjon
Bacillus anthracis Real-time PCR og dyrkning Ja
Brucella spp. Real-time PCR og dyrkning Ja
Burkholderia pseudomallei
/mallei
Real-time PCR og dyrkning Ja
Yersinia pestis Real-time PCR og dyrkning Ja*
Francisella tularensis ssp. Real-time PCR og dyrkning
Coxiella burnetii Real-time PCR
MERS CoV Real-time PCR Ja*
CCHFV Real-time PCR
Toksiner
Ricin/agglutinin Hurtigtest
Stafylokokk enterotoksin B
(SEB)
Hurtigtest
Botulinum neurotoksin type A
(BoNT-A)
Hurtigtest
Real-time PCR for BoNT-A,
B, C og E
Multiplex analyser
FilmArrayTM BioThreat panel 16 ulike target,
høypatogene agens og
toksiner
Annet
AST testing Mikrobuljongfortynning
WGS Ved behov
06.04.2018
5
NIPH -
Black box «all-in-one» multiplex PCR system
Kit for «syndromic diagnosis»
Respiratory panel
Blood culture identification panel
Gastrointestinal panel
Meningitis Encephalitis panel
BioThreat panel
Biomerioux
BioFireDefense
FilmArrayTM
NIPH -
• Bacillus anthracis, 3 Targets
• Brucella melitensis, 2 Targets
• Burkholderia mallei / pseudomallei, 2
Targets
• Clostridium botulinum
• Coxiella burnetii, 2 Targets
• Ebola virus (Zaire)
• EEE virus
• F. tularensis, 2 Targets
• Marburg virus, 2 Targets
• Ricinus communis
• Rickettsia prowazekii, 2 Targets
• Variola virus
• VEE virus, 2 Targets
• WEE virus
• Yersinia pestis, 2 Targets
• Orthopox virus, 2 Targets
06.04.2018
6
NIPH -
Prosedyre og prinsipp
NIPH -
Hver pouch har internkontroll (frysetørket Schizosaccharomyces pombe) – target er RNA transkript
Hver PCR analyseres i triplikat. Software evaluerer alle tre replikater ved positivt resultat, to av tre må
være positive for å rapportere som påvist. Tm må ikke avvike mer enn ± 1°C
Flere agens har to eller tre target
Kvalitetskontroll
06.04.2018
7
NIPH -
Fra BioFire Defence:
“The loading buffer contains high
concentrations of Guanadinium salt.
It is very effective at inactivating most
bacteria and virus for samples without
excessive biologic/organic load.
It is NOT effective against sporulated
bacillus. Understand that for pathogens
like Ebola, the viral titers in body fluids of
highly infected patients can be greater
than 10e10/ml. Even with a high log kill
for the buffer, it is hard to guarantee it
will be completely effective against such
numbers. ”
Biosikkerhet• P. aeruginosa
• 5, 10 og 15 min. i sample buffer
• Ingen vekst
• F. tularensis
• 10 min. i sample buffer
• Ingen vekst
In house testing av inaktivering
NIPH -
FilmArray maskinen inne på BSL3 laboratoriet
Prøve tilsettes i sikkerhetsbenk (BSCII)
Hvis mistanke om B. anthracis sporer i pulver eller virale agens i kategori BSL4 - hanskeboks
(BSCIII)
Prosedyre for uhell
Biosikkerhetstiltak
06.04.2018
8
NIPH -
Validering
Spikede prøver, ringtestprøver og pasientprøver
ble analysert
Generelt – svært gode resultater
Seiner DR et al. J Appl Microbiol 2013:
-LOD ≤ 250 genomiske ekvivalenter (GE) per prøve
for Bacillus anthracis, Francisella tularensis og
Yersinia pestis
-kryssreaksjon med nært beslektet DNA ikke påvist
Filmarray brukt som supplement til diagnostikken
siden 2016
NIPH -
Evaluere praktisk bruk og eventuelle
begrensinger med kitet
Ikke mål å bestemme analytisk sensitivitet og
spesifisitet
Raskt og enkelt supplement til diagnostikken ved
beredskapslaboratoriet for deteksjon av aktuelle
BSL3 agens, og at den kan brukes ved analyse av
de ulike prøvematerialer Beredskapslaboratoriet
analyserer
Metoden skal ha en sensitivitet som er i samsvar
med publiserte data og som er sammenlignbar
med resultater oppnådd med realtime PCR og
evt. dyrking.
Metoden skal være spesifikk, dvs at den i minst
mulig grad skal gi falske positive resultater
Begrensninger
Kostnad på kit begrenser antall analyser
Flere agens som kitet detekterer har vi ikke tilgjengelig for testing
Begrenset mengde prøvemateriale
06/04/2018
Krav
06.04.2018
9
NIPH -
Eksempel på kjøringerPrøve Målbakterie Matrix Realtime PCR FilmArray
resultat
Vurdering
FBD14 (05+07+12) Blank+ Y. p + B. mel serum 22,2 (Y.p) 25,2 (B. mel) Y. p og B. mel OK
NBDN15 (01+04+06) B. pinni + F. tul hol + Str. equi vann 27,0 (Bscp31), 27,4 (fopA) 28,3
(IsFtu2)
Brucella sp. + F. tul OK
NBDN15 (09) + inaktivert
kultur
B. abo +B. psm (10-10 fortynning) melk 21,8 (Bscp31)
B.psm i.u
Brucella sp.
B. m / B. psm not detected
Detekterte ikke lav fortynning
av B. psm
Inaktivert kultur x 4 B. mel+ B. cereus+ BoNTA+BoNTB blod i.u B. mel + C. botulinum OK
M2, pas. prøve B. mel (påvist ved dyrking) Blodkultur Ja, negativ på direkte realtime
PCR. Inhibisjon
B. mel OK
Ikke inhibisjon på FilmArray
Q3 (inaktivert 03+04) B. suis + Y. p blod 25,6(Bscp31) 21,7(ypo393)
17,5(pla) 21,2(Caf1)
Brucella sp. + Y. p OK
RKI E1 01 ringtest B. pinni bakterieopplsemming 32,9 (bscp31), 30,3
(BMeII0466)B. mel Skulle vært rapportert som
Brucella sp. Fikk også resultat
for B. mel på realtime PCR
E1 inakt 01+02+03 B. mel+ B.m + F tul tul Serum+ PBS 33 (Bscp31), 31(BMeII0466),
21 (B. m)
27 (tul4),
27 (fopA),
27 (F.tul tul)
B. mel
B. m / psm
F.tul
OK
Q2-08 B. canis HCA softagar Brucella sp OK
NIPH -
•B. melitensis detekteres med Filmarray
•B. abortus, B. pinnipedialis og B. suisrapporteres som Brucella spp
•FilmArray – positive når vanlig real-time PCR var negativ pga PCR inhibitorer(blodkultur)
•OBS: Et isolat (SLP) av B. pinnipedialisble rapporert som B. melitensis (ID konfirmert med Bruceladder)
Brucella spp.
•Detekterer C. burnetii
Coxiella burnetii
Erfaring
Smeltekurveanalyse - falsk positiv B. pinnipedialis SLP prøve
06.04.2018
10
NIPH -
•F. tularenis tularensis, F. tularensis holarctica og F. tularensis novicida - allerapporteres som F. tularensis
•F. philomiragia ble også rapportert som F. tularensis
•Positiv pasient prøve (BAL), som varanalysert mhp B. pseudomallei. Real-time PCR og dyrking; negativt for begge agens. Diagnose senere bekreftet m/ serologi
Francisella tularensis
•Positiv for pXO1 and pXO2 – rapporteressom B. anthracis detektert
•Hvis en eller begge plasmider mangler–rapporteres som Bacillus sp. detektert ogmed resultatet for hvert plasmid
•Bra resultater når ordinær real-time PCR viste hemming (SLP prøve)
•Beslektede Bacillus spp. – ikke rapportert
Bacillus anthracis
Melt curve analysis - false positive F. philomiragia
NIPH -
• Y. pestis - detekteres
• Y. pseudotuberculosis – ikke rapportert
• Falsk positive pasient prøve (direkte og i oppdyrket buljong). Også positive for pla ved real-time PCR, men ikke for caf1 eller ypo393.
• Ulike enterobakterier detektert ved dyrking (Citrobacter, Enterobacter, E. coli)
• Enterobacteriaceae positive for pla genet er tidlgere beskrevet(Armougom F et al Front Microbiol 2016, Hänsch S et al BMC Res Notes 2015)
Yersinia pestis
06.04.2018
11
NIPH -
•Detekterer begge arter, men skiller ikke mellom dem
Burkholderia mallei/pseudomallei:
•Detekterer C. botulinum type A.
•Vi testet C. botulinum type A, B, E og F - OK
Clostridium botulinum
•Inaktiverte SLP prøver analysert – Marburg virus detektert
Marburg virus
•EBOV Zaire detektert (inaktivert SLP)
•EBOV Sudan ikke detektert
Ebola virus
Andre agens
NIPH -
Bakteriekultur
Blodkultur
Lysert DNA
Ekstrahert DNA og RNA
Pasientprøver (vevsprøver, blod, BAL, CSF, leddvæske mm)
Miljøprøver (pulver, jord)
SLP
06/04/2018
Matriks
06.04.2018
12
NIPH -
Prøve
•pasientprøve
•Miljø / pulver
FilmArray –valgfritt
(unntatt pulver)
Direkte real-time PCR
Dyrking
•Bekreftende tester (PCR, Maldi-tof, andre)
06/04/2018
Diagnostisk flow
Vurdering: prøvetype, klinikk, arbeidstid eller vakt
NIPH -
+
• Enkel, rask og egnet for ulike matriks
• God sensitivitet
• Verdifullt supplemang for diagnostisk panel
• Egnet i vaktsammenheng
-
• Kostnad
• En prøve om gangen
• Skiller ikke mellom alle nært beslektede agens
• Falsk positiv Y. pestis
• Resulter må evalueres og bekreftes med andre metoder
06/04/2018
Oppsummering
FilmArrayTM BioThreat panel
- Raskt og nyttig verktøy
top related