第六章 核酸化学 nucleic acid
Post on 02-Jan-2016
217 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
1
第六章 核酸化学Nucleic acid
2
第一节 概述
核酸 (nucleic acid)
以核苷酸为基本组成单位的生物大分子,携带和传递遗传信息。
DNA ( Deoxyribonucleic acid) 脱氧核糖核酸 RNA ( Ribonucleic acid) 核糖核酸
3
• 1868 年 Fridrich Miescher 从脓细胞中提取“核素” • 1944 年 Avery 等人证实 DNA 是遗传物质• 1953 年 Watson 和 Crick 发现 DNA 的双螺旋结构• 1966 年 Nirenberg 发现遗传密码• 1975 年 Temin 和 Baltimore 发现逆转录酶• 1981 年 Gilbert 和 Sanger 建立 DNA 测序方法• 1985 年 Mullis 发明 PCR 技术• 1990 年 美国启动人类基因组计划 (HGP) • 1999 年 中国加入人类基因组计划• 2001 年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架• Post-genome era/OMICS era
一、核酸的发现和研究工作进展
4
二、核酸的分类及分布、功能
(deoxyribonucleic acid, DNA)
(ribonucleic acid, RNA)
脱氧核糖核酸
核糖核酸
90% 以上分布于细胞核,其余分布于核外如线粒体,叶绿体,质粒等。
分布于胞核、胞液。
携带遗传信息,决定细胞和个体的基因型 (genotype) 。
参与细胞内 DNA 遗传信息的表达。某些病毒 RNA 也可作为遗传信息的载体。
5
第二节 核酸的分子组成
6
一、元素组成主要元素组成: C 、 H 、 O 、 N 、 P(9~11%)
与蛋白质比较,核酸一般不含 S ,而 P 的含量较为稳定,占9-11% 。
二、基本构成单位:核苷酸 (nucleotide)
核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱三部分构成
7
戊 糖 (pentose)
8
1. 碱基 (base)
9
胺式亚胺式互变异构
10
酮式烯醇式互变异构
11
碱基的结构特征碱基的结构特征
嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系,在紫外区有吸收( 260 nm
左右)。
12
13
2. 2. 核苷 核苷 (nucleoside)(nucleoside)
糖与碱基之间的 C-N 键,称为 C-N 糖苷键。
°ûà×ऺËÜÕ Äòà×ऺËÜÕÄñàÑßʺËÜÕÏÙàÑßʺËÜÕ
N
N
OH
HO
N
N
NH2
HO
N
N
OH
H2N
N
N
N
N
N
N
NH2
O
H
H
OH
H
OH
H
HOCH2 HOCH2 O
H
H
OH
H
OH
H
O
H
H
OH
H
OH
H
HOCH2 O
H
H
OH
H
OH
H
HOCH2
核糖核苷: AR, GR, UR, CR脱氧核苷: dAR, dGR, dTR, dCR
14
3. 核苷酸 (ribonucleotide)
核苷和磷酸以磷酸酯键连接
15
稀有核苷酸稀有核苷酸
核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多,大部分是上述碱基的甲基化产物。
16
17
18
2 、稀有核苷酸:稀有碱基 / 核苷 / 核苷酸
3 、核苷酸的其他形式多磷酸核苷( NDP 、 NTP)
环化核苷酸( cAMP 、 cGMP 等)
辅酶或辅基( NAD 、 NADP 、 FAD 、 CoA 等,均含有 AMP )活性代谢物( UDPG 、 CDP- 胆碱等)
1 、核苷酸的组成:含氮碱基、戊糖和磷酸。
19
• ATP 分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。 ATP 水解时 , 可以释放出大量自由能。
• ATP 是生物体内最重要的能量转换中间体。 ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。
ATP
20
cAMP 和 cGMP
cAMP(3’,5’- 环化腺苷酸 )
和 cGMP(3’,5’- 环化鸟苷酸 ) 的主要功能是作为细胞的第二信使。
cAMP 和 cGMP 的环状磷酯键是一个高能键。在 p
H7.4, cAMP 和 cGMP 的水解能约为 43.9 KJ/mol ,比 ATP 水解能高得多。
21
22
第三节 核酸的分子结构第三节 核酸的分子结构
23
一、一级结构( primary structure )一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序及连接方式。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。1 、核苷酸的连接方式: 3, 5 磷酸二酯键2 、核酸的基本结构形式:多核苷酸链信息量: 4n
末端: 5’ 端、 3’ 端多核苷酸链的方向: 5’→3’
3 、表示方法:结构式、线条式、文字缩写
24
25
碱基组成分析—— Chargaff 规则: [A] = [T] ;[G] [C]
碱基的理化数据分析: A-T 、 G-C 以氢键配对较合理 DNA 的 X- 线衍射图谱分析
DNA 双螺旋结构的研究背景
26
二、 DNA 的空间结构1. DNA 的二级结构( secondary structure )(1) 碱基组成规则 (Chargaff 规则 )
[A]=[T] , [G]=[C] ; [A]+[G]=[T]+[C]( 嘌呤与嘧啶的总数相等 )
有种属特异性无组织、器官特异性
不受年龄、营养、性别及其他环境等影响
27
DNA 分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链 (简称 DNA 单链 )组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕,形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反,即其中一条链的方向为 5′ 端→ 3′ 端,而另一条链的方向为 3′ 端→ 5′ 端。
(2) DNA 双螺旋 (double helix model) 结构要点
28
嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成 90° 角。
29
螺旋横截面的直径约为 2nm,每条链相邻两个碱基平面之间的距离为 0.34 nm,每 10 个核苷酸形成一个螺旋,其螺矩(即螺旋旋转一圈的高度)为 3.4 nm。
34Å
30
维持两条 DNA 链相互结合的力是链间碱基对形成的氢键。碱基结合具有严格的配对规律 :A 与 T结合, G与 C结合,这种配对关系,称为碱基互补。A和 T之间形成两个氢键, G与 C之间形成三个氢键。
在 DNA 分子中,嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。
31
32
螺旋表面形成大沟 (major g
roove) 及小沟 (minor groov
e) ,彼此相间排列。小沟较浅;大沟较深,是蛋白质识别 DNA 碱基序列的基础。
氢键维持双链横向稳定性,碱基堆积力维持双链纵向稳定性。
33
其他螺旋形式
Z-DNA (左手双螺旋) A-DNA
34
35
(3)DNA 双螺旋的稳定性
• DNA 双螺旋结构在生理条件下很稳定。• 维持这种稳定性的因素包括:两条 DNA 链之间形成的氢
键,碱基堆积力。• 双螺旋结构内部形成的疏水区,消除了介质中水分子对
碱基之间氢键的影响;• 介质中的阳离子(如 Na+、 K+和 Mg2+)中和了磷酸基团
的负电荷,降低了 DNA 链之间的排斥力等。• 改变介质条件和环境温度,将影响双螺旋的稳定性。
36
天然存在的 DNA 分子最显著的特点是很长,分子质量很大,一般在 106~ 1
010 。大肠杆菌染色体由 400万碱基对 (ba
sepair , bp) 组成的双螺旋 DNA 单分子。其长度为 1.4×106nm ,相当于 1.4
mm ,而直径为 20nm ,相当原子的大小。黑腹果蝇最大染色体由 6.2×107bp 组成,长 2.1cm多瘤病毒的 DNA 由 5100bp 组成 ,长 1.7mm
37
2.DNA 的三级结构
双螺旋进一步扭曲 , 形成一种比双螺旋更高层次的空间构象。包括:线状 DNA 形成的纽结、超螺旋和多重螺旋、环状 DNA 形成的结、超螺旋和连环等
38
连环数 (L) :一条链绕另一条链缠绕次数
扭转数 (T) : DNA 双螺旋圈数
超螺旋数 (W) :超螺旋数
L=T+W
10nt/圈为能量最低状态, <10 时形成右手(负)超螺旋;>10 时形成左手(正)超螺旋。
39
3. DNA 在真核生物细胞核内的组装
核小体 (nucleosome) : 由 DNA 和组蛋白构成。
DNA :以左手螺旋缠绕在组蛋白上 ---1.8圈( 146 bp)
组蛋白核心 ---八聚体 H2B ,H2A ,H3 ,H4
H1组蛋白在核小体之间的连接 DNA 上( 54bp)
40
DNA 的存在形式 --- 染色质(体)
7 fold
6 fold
40 fold
5 fold
41
4. DNA 的功能
DNA 的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息,并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础,也是个体生命活动的信息基础。
基因从结构上定义,是指 DNA 分子中的特定区段,其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。
42
三、 RNA 的分子结构
43
1. RNA 的结构特点
• RNA 是单链分子,因此在 RNA 分子中,嘌呤的总数不一定等于嘧啶的总数。
• RNA 分子中,部分区域也能形成双螺旋结构,不能形成双螺旋的部分,则形成单链突环。这种结构称为“发夹型”结构。
• 在 RNA 的双螺旋结构中,碱基的配对情况不象 DNA 中严格。 G 除了可以和 C 配对外,也可以和 U 配对。G-U 配对形成的氢键较弱。不同类型的 RNA, 其二级结构有明显的差异。
• tRNA 中除了常见的碱基外,还存在一些稀有碱基,这类碱基大部分位于突环部分 .
44
2. 信使 RNA 的结构与功能
(1) 真核生物 mRNA 的结构特点
大多数真核 mRNA 的 5´ 末端均在转录后加上一个 7-甲基鸟苷,同时第一个核苷酸的 C´2 也是甲基化,形成帽子结构: m7GpppNm- 。
2. 大多数真核 mRNA 的 3´ 末端在转录后加上一多聚腺苷酸 (polyA) 结构( 20-250nt) 。
45
mRNA 核内向胞质的转运mRNA 的稳定性维系翻译起始的调控
帽子结构和多聚 A尾的功能
46
(2) 真核生物 mRNA 成熟过程
hnRNA (heterogeneous nuclear RNA)
Polycistronic mRNA
Prokaryote
Eukaryote
47
( 3 ) mRNA 的功能
把 DNA所携带的遗传信息,按碱基互补配对原则,转录并传送至核糖体,用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。
DNA
mRNA
蛋白
转录
翻译
原核细胞
细胞质
细胞核
DNA
内含子外显子
转录
转录后剪接转运
mRNA
hnRNA
翻译蛋白
真核细胞
48
3. tRNA 的结构与功能
(1) tRNA 的一级结构特点 含 10~20% 稀有碱基,如
DHU
3´ 末端为 - CCA-OH
5´ 末端大多数为 G
具有 TC
NH
NH
O
O
H
H
H
H
双氢尿嘧啶 (DHU) 假尿嘧啶 ()
次黄嘌呤 (I)
49
(2) tRNA 的二级结构----- 三叶草形
氨基酸臂 DHU 环 反密码子环: 额外环 TΨC 环
与 mRNA 的三联体密码互补配对,称为反密码子( anticodon )
3` 末端的 CCA-OH 单链用于连接该 tRNA 转运的氨基酸
识别氨酰 -tRNA合成酶
核糖体识别结合位点
I
II
III
IV
50
(2) tRNA 的三级结构----- 倒 L 型
51
(3) tRNA 的功能:活化、搬运氨基酸到核糖体,参与蛋白质的合成。
52
4. rRNA 的结构与功能
原核生物(以大肠杆菌为例) 真核生物(以小鼠肝为例)
小亚基 30S 40S
rRNA 16S 1542 个核苷酸 18S 1874 个核苷酸蛋白质 21 种 占总重量的 40% 33 种 占总重量的 50%
大亚基 50S 60S
rRNA 23S5S
2940 个核苷酸120 个核苷酸
28S5.85S
5S
4718 个核苷酸160 个核苷酸120 个核苷酸
蛋白质 33 种 占总重量的 30% 49 种 占总重量的 35%
核糖体的组成
(1)rRNA 的功能 :组成核蛋白体,作为蛋白质合成的场所。
53
54
5. 其他小分子 RNA
除了上述三种 RNA 外,细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子 RNA ,统称为非 mRNA 小 RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs), 或非编码蛋白质的 RNA(non-coding RNA, ncRNA) 。 种类:核内小 RNA ;核仁小 RNA ;胞质小 RNA ;催化性小 RNA ;小片段干涉 RNA
功能:参与 hnRNA 和 rRNA 的加工和转运。 ncRNA 在在基因表达以及应激信号传导等方面起着重要的调节作用。因此,有人也将其称为调节 RNA ( regulatory RNA )。
55
小片段干扰 RNA ( siRNA ):一些小的双链 RNA 可以高效、特异的阻断体内特定基因表达,促使 mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为 RNA干扰( RNA interference , RNAi ,也译作 RNA干预或干涉)。
56
RNAi 的作用机制:1 )在起始步骤,生物宿主将外源基因表达的双链 RNA进行切割,产生具有特定长度( 19-21
nt )和序列的小片段 siRNA ;
2 ) siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成 RNA诱导沉默复合物( RISC )。 RISC通过碱基配对定位到同源 mRNA 转录本上,并在距离 siRNA3' 端 1
2 个碱基的位置切割 mRNA 。
57
第四节 核酸的理化性质
58
一、核酸的一般理化性质
1 、 DNA 白色纤维状固体, RNA 白色粉末状固体,都微溶于水,不溶于乙醇,因此常用乙醇来沉淀 DNA ; DNA溶液黏度大于 RNA ;
2 、 DNA难溶于 0.14mol/L 的 NaCl溶液,可溶于 1~2
mol/L 的 NaCl溶液, RNA 则相反,可据此分离二者;3 、特征颜色反应 D-核糖+浓盐酸+苔黑酚 绿色; D- 2-脱氧核糖+酸+二苯胺 蓝紫色
59
4 、 两性解离:核酸含酸性的磷酸基团,又含弱碱性的碱基,为两性电解质,可发生两性解离;核酸相当于多元酸, pI 1~2 。
60
二、核酸的水解1 、酸水解糖苷键比磷酸酯键更易发生酸水解;嘌呤糖苷键酸中最易被打开
2 、碱水解糖苷键比磷酸酯键更易发生酸水解;由于 RNA 中 2‘-OH参与形成环磷酸酯, RNA更易发生碱水解
61
3 、酶水解核酸酶的分类
底物:核糖核酸酶 (RNase) ,脱氧核糖核酸酶 (DNase)
作用方式:内切酶和外切酶
磷酸二酯键断裂方式:
62
核糖核酸酶类
牛胰核糖核酸酶 ( RNase I)
Py Pu Py Py Pu Py
作用位点:嘧啶核苷 -3’-磷酸与其他核苷酸间的连键
核糖核酸酶 T1 ( RNase T1)作用位点: 3’ 鸟苷酸与其他核苷酸 5‘-OH 的连键
A G U G C A
63
脱氧核糖核酸酶类
牛胰脱氧核糖核酸酶 ( DNase I)
将 dsDNA 或 ssDNA切成 5’- 磷酸为末端的寡聚核苷酸
限制性内切酶 (restriction endonuclease)
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
EcoR I
E. coli strainEnzyme number
Hind II 5̀ G-T-Py-Pu-A-C C-A-Pu-Py-T-G 5̀
5̀ G-T-Py C-A-Pu + Pu-A-C
Py-T-G 5̀
64
三、紫外吸收 最大吸收波长: 260nm 核酸定量分析 核酸定性分析
65
1. DNA 或 RNA 的定量OD260=1.0 相当于
50μg/ml 双链 DNA
40μg/ml 单链 DNA (或 RNA )20μg/ml寡核苷酸
2.判断核酸样品的纯度DNA纯品 : OD260/OD280 = 1.8
RNA纯品 : OD260/OD280 = 2.0
OD260 的应用
66
四、变性、复性、分子杂交
1 、 DNA 变性( DNA denaturation )DNA 变性是指在理化因素作用下, DNA 分子中的氢键断裂,碱基堆积力遭到破坏,双螺旋结构解体,双链分开形成单链的过程。
方法:过量酸,碱,加热,变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。
67
变性后其它理化性质变化: OD260增高;粘度下降;比旋度下降;浮力密度升高;酸碱滴定曲线改变;生物活性改变
DNA 变性的本质是双链间氢键的断裂 , 一级结构不变
68
( 1 )增色效应: DNA 变性时其溶液 OD260增高的现象。
69
当 DNA 的稀盐溶液加热到 80-100℃时,双螺旋结构即发生解体,两条链彼此分开,形成无规线团。
( 2) DNA的热变性
融解温度( melting temperature, Tm ) :DNA 热变性过程中,紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称 为 融 解 温 度 ( Tm )或解链温度、变性温度。
70
影响 Tm值的因素离子强度
71
DNA 的性质和组成: GC 含量越高, Tm越大
( G+C)% = ( Tm-69.3 ) ×2.44
在 pH7.0, 0.165 mol/L NaCl溶液中
72
2. DNA 复性DNA 复性 (renaturation) 的定义 : 在适当条件下,变性DNA 的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象,这一现象称为复性。热变性的 DNA经缓慢冷却后即可复性,这一过程称为退火 (annealing) 。减色效应( hypochromic effect ) : DNA 复性时,其溶液 OD260降低。
73
DNA 复性过程中,如果将不同种类的 DNA单链分子或 RNA 分子放在同一溶液中,只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基 配 对 , 在适宜的条件(温度及离子强度)下,可以在不同的分子间形成杂化双链 (heteroduplex) 。这种现象称为核酸分子杂交。
核酸分子杂交 (hybridization)
74
75
核酸分子杂交的应用
76
第五节 核酸的研究方法
77
一、核酸的分离提纯和定量测定1. DNA 的分离 真核生物中的染色体 DNA 常与碱性蛋白结合成核蛋白( DNP )形式存在于核内。 浓盐法: 用浓盐( 1MNaCl )提取出 DNP ; 用氯仿 / 异丙醇,除去蛋白质; 冷乙醇沉淀出 DNA ;
78
2. RNA 的分离因为 RNase 无处不在而得 RNA提取分离更为困难。•所有玻璃器具都应高温灭菌,不能高温高压的用 0.1%焦碳酸二乙酯( DEPC )处理•破碎细胞时使用强变性剂,如胍盐,使酶失活;•在 RNA 反应体系内加入 RNA 酶的抑制剂;目前最常用的 RNA制备方法有两个: 1 )用酸性胍盐 /苯酚 /氯仿抽提:少量制备 RNA 。 2 )用胍盐 /氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心:大量制备 RNA
79
3. 核酸的定量测定
定糖法 RNA :核糖→ 糠醛 绿色物质( 670-68
0nm )
DNA :脱氧核糖 + 二苯胺 兰色物质( 595-620nm )
苔黑酚
紫外吸收法
1 个 A~ 50μg/ml 双链 DNA
~ 40μg/ml RNA 或单链 DNA
80
定磷法 核酸含磷量为 9.5%
1g 磷相当于 10.5g 核酸
琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭能插入 DNA 分子的碱基对间形成复合物 在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与 DNA 含量成正比
81
二、核酸的沉降特性与超速离心
不同构象的核酸(线形、环形、超螺旋),密度和沉降速率不同,用密度梯度离心可以将不同构象 DNA 、 RNA 与蛋白质区分开来。
石蜡油
蛋白质
开环 / 线性 DNA
环形 DNA
超螺旋 DNA 或 R
NA
82
8M CsCl , 45000 rpm , 16h
密度梯度: 1.80g/ml→1.55g/ml
平衡时:浮力密度 =CsCl密度 =离心力
ρ=ρ0 +4.2ω2( r2 - r02) × 10-10
ρ0:标准 DNA浮力密度
ρ :浮力密度(未知)ω :角速度(弧度 /秒) r :样品到转轴的距离
核酸密度测定
G-C 含量与 DNA 的浮力密度之间关系
ρ=0.1 xG-C + 1.658
83
三、核酸的凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳:用于大片段 DNA 的分离,精度低,但分离范围广;
聚丙烯酰胺凝胶电泳:小片段核酸分离
84
Sanger测定 DNA 核苷酸序列的方法: DNA合成终止法(双脱氧 DNA 链合成终止法)。
四、核酸的核苷酸序列测定1.DNA 的酶法测定
85
86
DNA 序列分析仪:
四色荧光基团标记的 dNTP
87
2. DNA 的化学法测序:
由 Maxam 和 Gilbert所发明。 其基本原理是用特异的化学试剂作用于 DNA 分子中的不同碱基,然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用 4 组不同的特异反应,可使末端标记的 DNA 分子切成不同长度的片断,其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱
88
4 组特异的反应如下:
( 1 ) G 反应:用硫酸二甲酯 DMS 使鸟嘌呤上的 N7原子甲基化,加热引起鸟嘌呤脱落,多核苷酸链可在此处断裂
( 2 ) G+A 反应:用甲酸使 A 和 G 嘌呤环上的 N原子质子化,从而使其糖苷键变得不稳定,再用哌啶使键断裂
( 3 ) T+C 反应:用肼使 T 和 C 的嘧啶环断裂,再用哌啶除去碱基
( 4 ) C 反应:当有盐存在时,只有 C 与肼反应,并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落,并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂
89
硫酸二甲酯( G ): *ACTTCG*ACTTCGACAG
甲酸( G+A ): *A*ACTTCG *ACTTCGA *ACTTCGACA*ACTTCGACAG
肼 /NaCl ( C ): *AC *ACTTC*ACTTCGA C*ACTTCGACAG 肼( C+T ): *AC *ACT *ACT T *ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG
从下往上读: CTACGTA ,末端 G 不能读出。
32P *ACTTCGACAG
90
五、聚合酶链式反应 (PCR)
1995 年 K.Mullis发明。基本步骤为:•设计一对引物以便有效扩增所需要的 DNA 序列,并尽量减少可能产生的非特异产物•优化反应体系:包括适量模板、引物、 4 种 dNTP 、 Taq
DNA 聚合酶和适量 Mg2+
•选择 3 个温度进行热循环:变性 94℃, 45- 60s ;退火,根据引物的 Tm , 1min ;延伸, 72℃, 1min 。循环•扩增完成后取出一定量的反应产物,检测扩增结果:先进行凝胶电泳,用溴化乙啶染色,紫外光下检测结果
91
Thermal Cycler Steps
Cycling: Repeat steps 1 through 3 (20 - 40 times)
Extend primers, yielding new double-stranded DNA
Anneal primers to single-stranded DNA
Denature double-stranded DNA
92
93
top related