skripsidosen.univpancasila.ac.id/dosenfile/2099211031129924184604march... · b. perumusan masalah...
Post on 16-Mar-2019
224 Views
Preview:
TRANSCRIPT
UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA VITRO TERHADAP
(Garcinia parvifoliaPlasmodium falcifarum
SKRIPSI
UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS
Garcinia parvifolia (Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN
Oleh :
SUCI FITRIYANI
NPM: 2005210210
Dibuat untuk memperoleh Gelar Sarjana Farmasi pada
Universitas Pancasila
UNIVERSITAS PANCASILA FAKULTAS FARMASI
JAKARTA 2010
UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN DAUN ASAM KANDIS
PADA KULTUR STRAIN W2
PERNYATAAN SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI
Saya yang bertandatangan di bawah ini menyatakan skripsi dengan judul ’UJI
AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO TERHADAP EKSTRAK
DAUN ASAM KANDIS (Garcinia parvifolia (Miq)Miq) PADA KULTUR
Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN W2’ adalah karya saya sendiri
dan belum diajukan untuk publikasi dalam bentuk apapun kepada pihak manapun.
Informasi yang berasal atau dikutip adalah karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah dicantumkan dalam daftar rujukan di bagian akhir
skripsi ini.
Jakarta, Juli 2010
Suci Fitriyani
NPM : 2005210210
UNIVERSITAS PANCASILA
FAKULTAS FARMASI
JAKARTA
PERSETUJUAN SKRIPSI
NAMA : Suci Fitriyani
NPM : 2005210210
PEMINATAN : FARMASI KLINIK DAN KOMUNITAS
JUDUL : UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA
IN VITRO TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM
KANDIS (Garcinia parfivolia(Miq)Miq) PADA
KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6
DAN STRAIN W2
Disetujui oleh :
Pembimbing
(Dr. Syamsudin, M.Biomed., Apt.)
UNIVERSITAS PANCASILA
FAKULTAS FARMASI
JAKARTA
PENGESAHAN SKRIPSI
Judul
UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS (Garcinia
parvifolia (Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN W2
OLEH:
SUCI FITRIYANI
NPM : 2005210210
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi Universitas Pancasila Pada tanggal 02 Agustus 2010
Universitas Pancasila
Fakultas Farmasi
Dekan
(Drs. I Wayan Redja, M.Chem., Apt.)
Pembimbing : 1. Dr. Syamsudin, M.Biomed, Apt 1......................... Penguji: 1. Dra. Syarmalina., M.Si., Apt 1......................... 2. Dr. Ros Sumarny, M.S., Apt 2......................... 3. Prof. ris. Drh. Darmono, M.Sc. 3........................
KATA PENGANTAR
Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala
rahmat dan taufik, serta hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi
dengan judul “UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO
TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS (Garcinia parvifolia
(Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN
W2” diajukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Universitas
Pancasila, Jakarta.
Dalam penulisan dan penyusunan skripsi ini, penulis telah banyak menerima
bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu penulis menyampaikan rasa hormat dan
terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Syamsudin, M. BIOMED, Apt,
selaku dosen pembimbing skripsi yang dengan sabar, tulus dan ikhlas telah
memberikan waktu, tenaga serta pikirannya dalam mengarahkan dan membimbing
penulis dalam penyusunan skripsi.
Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya juga disampaikan kepada:
1. Bapak Drs. I Wayan Redja, M.Chem, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Pancasila
2. Ibu Dr. Shirly Kumala, M.Biomed., Apt., selaku Pembantu Dekan I Fakultas
Farmasi Universitas Pancasila,
3. Ibu Dra. Erlindha gangga, Msi., Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik.
4. Ayah, ibu dan adikku tersayang, yang telah memberikan dukungan moral, doa,
kasih dan sayangnya selama penulis melakukan penelitian.
5. Seluruh pihak yang telah membantu, yang tidak dapat penulis sebutkan satu
persatu.
Akhir kata, penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi penelitian
dan pengembangan ilmu pengetahuan.
Jakarta, Juli 2010
Penulis
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR ......................................................................................... iv
DAFTAR ISI ...................................................................................................... v
DAFTAR TABEL.............................................................................................. viii
DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... ix
DAFTAR SINGKATAN.................................................................................... xi
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xii
ABSTRAK ......................................................................................................... xiii
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang ........................................................................... 1
B. Perumusan Masalah ................................................................... 2
C. Tujuan Penelitian ........................................................................ 2
D. Manfaat Penelitian ...................................................................... 3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
A. Asam Kandis ............................................................................... 4
1. Klasifikasi Tanaman.............................................................. 4
2. Sinonim ................................................................................. 4
3. Nama Daerah ......................................................................... 4
4. Deskripsi ............................................................................... 4
B. Xanton ......................................................................................... 5
C. Kromatografi................................................................................ 6
D. Ekstraksi ...................................................................................... 7
E. Malaria ........................................................................................ 8
1. Epidemiologi malaria............................................................... 8
2. Spesies parasit malaria............................................................. 9
3. Strain D6 dan strain W2 .......................................................... 14
F. Landasan teori ............................................................................. 14
BAB III RANCANGAN PENELITIAN
A. Prinsip Penelitian ........................................................................ 16
B. Bahan penelitian .......................................................................... 16
C. Tempat penelitian ........................................................................ 16
D. Prosedur penelitian ...................................................................... 16
E. Analisis data ............................................................................... 17
BAB IV BAHAN, ALAT DAN METODE PENELITIAN
A. Bahan........................................................................................... 18
B. Alat .............................................................................................. 19
C. Metode Penelitian........................................................................ 19
1.Identifikasi ekstrak.................................................................... 19
2.Pembuatan kultur P. falcifarum................................................ 22
3. Preparasi bahan uji .................................................................. 23
4. Sinkronisasi ............................................................................. 23
5. Uji aktivitas plasmodium ........................................................ 24
BAB V HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
1. Identifikasi ekstrak ........................................................................ 26
a. Penapisan fitokimia ................................................................. 26
b. Analisis dengan KLT .............................................................. 26
2. Pengujian aktivitas antiplasmodium ............................................. 36
a. Metode Mikroskopik .............................................................. 36
b. Metode SYBR Green I ........................................................... 45
BAB VI SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan .................................................................................... 50
B. Saran ........................................................................................... 50
DAFTAR RUJUKAN ....................................................................................... 51
LAMPIRAN....................................................................................................... 53
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel V.1 Senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak kloroform
dan ekstrak metanol daun asam kandis ............................................ 26
Tabel V.2 Hambatan pertumbuhan P. falcifarum strain D6 (%) dari
ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis
pada berbagai konsentrasi .............................................................. 36
Tabel V.3 Hambatan pertumbuhan P. falcifarum strain W2 (%) dari
ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis
pada berbagai konsentrasi .............................................................. 40
Tabel V.4 Hambatan pertumbuhan P. falcifarum strain D6 dan strain
W2 (%) dari klorokuin pada berbagai konsentrasi ......................... 44
Tabel V.5 Nilai linieritas fluoresensi pada P. falcifarum dari ekstrak
kloroform daun asam kandis pada berbagai konsentrasi ................ 45
Tabel V.6 Nilai linearitas fluoresensi pada P. falcifarum dari ekstrak
metanol daun asam kandis pada berbagai konsentrasi ................... 45
Tabel V.7 Nilai linieritas fluoresensi pada P. falcifarum dari klorokuin
pada berbagai konsentrasi .............................................................. 46
Tabel V.8 Nilai IC50 dari tiap ekstrak daun asam kandis ................................. 46
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar II.1 Garcinia parvifolia (Miq)Miq ..................................................... ... 5
Gambar II.2 Rumus umum xanton ................................................................... ... 5
Gambar II.3 Daerah geografi penyebaran malaria didunia .............................. ... 9
Gambar II.4 Stadium-stadium perkembangan P. falcifarum .......................... ... 10
Gambar II.5 Siklus perkembangan P. falcifarum ............................................ ... 14
Gambar IV.1 Gambaran lempeng sumur mikro uji aktivitas antiplasmodium...... 25
Gambar V.1 Profil bercak KLT ekstrak kloroform………………….................. 27
Gambar V.2 Profil bercak KLT ekstrak kloroform diuapi dengan uap amoniak. 28
Gambar V.3 Profil bercak KLT ekstrak kloroform disemprot denganpereaksi
Liebermann Burchard…………………………………………....... 29
Gambar V.4 Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi serium sulfat.30
Gambar V.5 Profil bercak KLT ekstrak metanol………………...……………... 32
Gambar V.6 Profil bercak KLT ekstrak metanol diuapi dengan uap amoniak…. 33
Gambar V.7 Profil bercak KLT ekstrak metanol dengan pereaksi Liebermann-
Burchard………………………………………………………...... 34
Gambar V.8 Profil bercak KLT ekstrak metanol dengan pereaksi serium sulfat... 35
Gambar V.9 Kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan
probit.................................................................................................. 37
Gambar V.10 P. falcifarum strain D6 ekstrak kloroform daun asam kandis dalam
sel darah merah pada berbagai konsentrasi……………………….... 38
Gambar V.11 P. falcifarum strain D6 ekstrak metanol daun asam kandis dalam
sel darah merah pada berbagai konsentrasi……………………….. 39
Gambar V.12 Kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan
probit................................................................................................ 41
Gambar V.13 P. falcifarum strain W2 ekstrak kloroform daun asam kandis dalam
sel darah merah pada berbagai konsentrasi……………………….. 42
Gambar V.14 P. falcifarum strain W2 ekstrak metanol daun asam kandis dalam
sel darah merah pada berbagai konsentrasi……………………….. 43
Gambar V.15 Kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan
probit................................................................................................ 44
DAFTAR SINGKATAN
1. CCM : Complete Culture Medium
2. DNA : Deoxyribonucleatid Acid
3. HEPES : N-(2-hydoroxyethyl) piperazine-N’-(2-ethaneculfonic acid)
4. IC50 : 50 % inhibitory Concentration
5. LAF : Laminary Air Flow
6. RPMI : Roswell Park Memorial Institute
7. WHO : World Health Organization
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Hasil determinasi daun asam kandis................................................. 53
Lampiran 2. Skema pembuatan ekstrak daun asam kandis…………...………… 54
Lampiran 3. Skema kerja pembuatan kultur P. falcifarum……………………… 55
Lampiran 4. Skema pengujian aktivitas antiplamodium (metode mikroskopi)….. 56
Lampiran 5. Skema pengujian aktivitas antiplamodium (metode SYBR Green I) 57
Lampiran 6. Foto bahan uji antiplasmodium…………………………………….. 58
Lampiran 7. Foto alat uji antiplasmodium……………………………………….. 59
Lampiran 8. Gambar grafik dari metode SYBR Green I......................................... 61
Lampiran 9. Jumlah skizon hidup dalam seluruh jumlah sel dalam area pandang
Mikroskop…………………………………………………………… 63
Lampiran 10. Tabel probit…………………………………………………………. 65
ABSTRAK
(A) SUCI FITRIYANI (2005210210) (B) UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO TERHADAP
EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS (Garcinia parvifolia (Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN W2
(C) xiv + 65 Halaman; 8 tabel; 21 gambar; 7 singkatan; 10 lampiran (D) Kata Kunci : Antiplasmodium, daun asam kandis, kultur P. falcifarum
Resistensi antiplasmodium terhadap obat malaria mendorong untuk dilakukan pengembangan terhadap obat baru. Salah satunya adalah daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) yang digunakan sebagai obat alternatif karena mengandung senyawa xanton. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui aktivitas antiplasmodium dari ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq ) dengan menggunakan metode mikroskopik dan SYBR Green I yang ditunjukkan dengan nilai IC50. Daun asam kandis diekstraksi secara berkesinambungan kemudian di uji aktivitas antiplasmodium secara in vitro dengan metode mikroskopik dan SYBR Green I. Pada metode mikroskopik, diperoleh nilai IC50 dari ekstrak kloroform 33,17 µg/mL pada strain D6 dan 0,55 µg/mL pada strain W2. Nilai IC50 dari ekstrak metanol 32,44 µg/mL pada strain D6 dan 41,23 µg/mL. Pada metode SYBR Green I diperoleh nilai IC50
dari ekstrak kloroform 14,29 µg/mL pada strain D6 dan 0,214 µg/mL pada strain W2. Nilai IC50 dari ekstrak metanol 48,00 µg/mL pada strain D6 dan 56,37 µg/mL pada strain W2. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) mempunyai aktivitas antiplasmodium terhadap kultur P. falcifarum strain D6 dan strain W2 pada metode mikroskopik dan metode SYBR Green I. Ekstrak kloroform mempunyai aktivitas antiplasmodium lebih kuat dari ekstrak metanol.
(E) Daftar Rujukan : 22 buah (1983-2009) (F) Dr. Syamsudin, M.Biomed.,Apt. (G) 2010
ABSTRACT
(A) SUCI FITRIYANI (2005210210) (B) IN VITRO ANTI-PLASMODIUM ACTIVITY TEST ON LEAVES OF
Garcinia parvifolia Miq ON CULTURE OF Plasmodium falcifarum strain D6 AND strain W2.
(C) xiv + 65 Pages; 13 tables; 12 figures; 6 abbreviations; 10 appendices (D) Key words: Anti-plasmodium, leaves of Garcinia parvifolia Miq, culture of
P.falcifarum
Malaria is the issue of world health either for developing or developed countries. Much P. falcifarum resistant to malaria medicine encourages people to improve new medicines. One of the medicines is leaves of G. parvifolio Miq that are used as alternative medicine because of containing xanton compound. The objective of this research is to know anti-plasmodium activity of G. parvifolio Miq leaves by means of microscopic and SYBR Green I methods shown by the value of IC50. Leaves of G. parvifolio Miq are extracted by means of chloroform and methanol solvent then the anti-plasmodium activity is tested in in vitro by means of microscopic and SYBY Green I method. In microscopic method, the value of IC50 from chloroform extract 33,17 µg/mL in strain D6 and 0,55 µg/mL in strain W2 is obtained. In SYBR Green I, the value of IC50 from methanol extract 48,00 µg/mL in strain D6 and 56,37 in strain W2 is obtained. From this research, it can be inferred that chloroform and methanol extracts of G. parvifolia Miq leaves have anti-plasmodium activity on culture of P. falcifarum strain D6 and strain W2 on microscopic and SYBR Green I methods in which chloroform extract has stronger anti-plasmodium than methanol extract does.
(E) List of references: 22 references (1983-2009) (F) Dr. Syamsudin, M.Biomed.,Apt. (G) 2010
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar belakang
Malaria merupakan masalah kesehatan di dunia, baik pada negara
berkembang maupun negara yang sudah maju. Penyakit malaria terjadi pada 105
negara dengan 300- 500 juta kasus malaria dan lebih dari satu juta jiwa kematian
pada tiap tahunnya, sehingga kebutuhan obat malaria sangat diharapkan. Spesies
yang banyak di jumpai di daerah tropis adalah P. falcifarum dan P. vivax yang
mengakibatkan terdiagnosisnya infeksi malaria sampai 95 persen, P. vivax
terdistribusi lebih luas dari pada P. falcifarum tetapi lebih sedikit kemungkinan
terjadi kematian. Sedangkan P. malariae ditemukan di beberapa daerah namun
prevalensinya sangat rendah. Di Indonesia, P. ovale hanya ditemukan didaerah
Papua (1).
Malaria merupakan penyakit yang disebabkan oleh parasit yang ditularkan
kepada manusia dan hewan. Vektor yang berperan pada penyakit ini adalah
nyamuk Anopheles. Salah satu faktor utama penyebab kegagalan pemberantasan
malaria adalah adanya nyamuk Anopheles yang resisten terhadap parasit malaria
yakni Plasmodium yang resisten terhadap antimalaria yang tersedia. Masalah
resistensi terhadap Plasmodium terutama pada Plasmodium falcifarum telah
menjadi masalah serius. Hal ini telah mendorong para peneliti untuk berusaha
menemukan antimalaria baru untuk menggantikan antimalaria yang sudah tidak
sensitif lagi . Salah satu usaha untuk menemukan antimalaria baru tersebut adalah
melalui eksplorasi senyawa aktif dari bahan obat alam utamanya tanaman obat
yang secara tradisional digunakan masyarakat untuk mengobati malaria di
berbagai daerah endemik di dunia (2).
Senyawa xanton diketahui memiliki aktivitas farmakologi yang luas antara
lain : antimikroba, anti kanker, antioksidan, dan antimalaria. Beberapa penelitian
senyawa turunan xanton dari tanaman genus Garcinia telah berhasil di uji
aktivitasnya antara lain : garciniaxanton dan cowaxanton dari tanaman G. dulcis
dan G. cowa yang mempunyai aktivitas antiplasmodium paling kuat dengan IC50
berturut-turut sekitar 0,96 µg/ml dan 1,5µg/ml (3).
Pada penelitian sebelumnya menunjukkan ekstrak kulit batang asam kandis
(G. parvifolia (Miq)Miq) mempunyai aktivitas antiplasmodium yang kuat (4).
Ektraksi bertingkat dari serbuk kulit batang asam kandis (G. parvifolia
(Miq)Miq) dengan menggunakan pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda
yaitu n-heksana, etil asetat, dan ekstrak n-butanol. Pada uji anti plasmodium baik
secara in vitro pada kultur P. falcifarum strain FCR-3 dan 3D7 maupun uji in
vivo yang diinfeksi dengan P. berghei menggunakan ekstrak n-heksana kulit
batang asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) pada mencit menggunakan ekstrak
n-heksana kulit batang asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) lebih efektif
dibanding ekstrak etil asetat dan ekstrak n-butanol (5). Pada penelitian ini
dilakukan uji antiplasmodium secara invitro terhadap daun asam kandis pada
kultur P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan W2 (resisten klorokuin),
diharapkan dapat diketahui aktivitas antiplasmodium ekstrak tersebut terhadap P.
falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan W2 ( resisten klorokuin).
B. Perumusan masalah
Apakah pada ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) memiliki efek
antiplasmodium terhadap kultur P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan
strain W2 (resisten klorokuin) dengan menggunakan metode mikroskopik dan
metode SYBR Green I?
C. Tujuan Penelitian
Untuk mengetahui aktivitas antiplasmodium dari ekstrak daun asam kandis (G.
parvifolia (Miq)Miq) dengan menggunakan metode mikroskopik dan metode
SYBR Green I yang ditunjukkan dengan nilai IC50.
D. Manfaat Penelitian
Diharapkan dapat mendorong penemuan anti malaria yang berasal dari
tumbuhan, khususnya dari tumbuhan keluarga Guttiferae.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Asam Kandis (Garcinia parvifolia (Miq)Miq) (6)
1. Klasifikasi Tanaman
Divisi : Spermatophyta
Sub Divisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledoneae
Bangsa : Parietales
Suku : Guttiferae
Marga : Garcinia
Jenis : Garcinia Parvifolia (Miq)Miq
Nama Umum : Asam Kandis
2. Sinonim
Garcinia dioica blume
Garcinia globulosa ridley
Garcinia motletana pierre
3. Nama Daerah
Kandis, Kandis Burung, Sempat Tebu
4. Deskripsi
Habitus : Pohon tinggi, tinggi 12-15 m dan besar batangnya 45 cm,
tumbuh di dataran Sumatra.
Kayu : Kayu berwarna kekuning-kuningan, agak keras dan awet,
tetapi mudah rapuh dan hanya dapat diperoleh dalam
ukuran kecil-kecil jika ditoreh akan keluar eksudat yang
berwarna kuning buram.
Kulit Kayu : Kulit kayu berwarna coklat tua, tebal 1-2 mm.
Getah
Buah
Daun
Bunga
B. Xanton
Xanton adalah pigmen fenol kuning yang reaksi warnanya dan hasil
kromatografinya sama dengan flavonoid (8). Golongan xanton mempunyai rumus
umum dibenzogamapiron.
: Getah kayunya mengandung getah kuning yang sangat
banyak, yang mengeras menjadi gumpalan
pada batang.
: Buahnya yang berwarna kuning jingga sebesar buah
tempuyung, agak bulat atau panjang.
: Permukaan daun kasar dan dari dasar daun
daun meruncing.
: Bunga jantan, panjang tangkai 4-10 mm, luas lingkar
tangkai 7-10 mm.
Gambar II.1 Garcinia parvifolia (Miq)Miq (7)
Xanton adalah pigmen fenol kuning yang reaksi warnanya dan hasil
kromatografinya sama dengan flavonoid (8). Golongan xanton mempunyai rumus
umum dibenzogamapiron.
Gambar II.2 Rumus Umum Xanton ( 9)
Getah kayunya mengandung getah kuning yang sangat
banyak, yang mengeras menjadi gumpalan-gumpalan kecil
: Buahnya yang berwarna kuning jingga sebesar buah
: Permukaan daun kasar dan dari dasar daun hingga ujung
10 mm, luas lingkar
Xanton adalah pigmen fenol kuning yang reaksi warnanya dan hasil
kromatografinya sama dengan flavonoid (8). Golongan xanton mempunyai rumus
Beberapa senyawa turunan xanton telah berhasil diisolasi dari tanaman
genus Garcinia dan dibuktikan aktivitas antiplasmodiumnya. Likhitwitayawuid
et al. berhasil menguji aktivitas beberapa turunan xanton dari tanaman G. dulcis
dan G. cowa. Diantara turunan xanton yang diuji, garciniaxanton dan cowaxanton
mempunyai aktivitas antiplasmodium paling kuat dengan nilai IC50 (konsentrasi
hambatan maksimal yang dapat menghambat pertumbuhan 50% dari
plasmodium) berturut-turut sekitar 0,96µg/ml dan 1,5 µg/ml (3).
C. Kromatografi
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah cara pemisahan campuran zat
menggunakan sebuah lapisan tipis bahan penyerap, karena menggunakan lapisan
tipis maka prosedurnya disebut Kromatografi Lapis Tipis. Campuran zat
ditempatkan pada satu ujung lapisan bahan penyerap, kemudian dengan bantuan
cairan rambat digerakkan ke ujung lainnya sampai batas tertentu, batas ini
disebut batas rambat. Selama perjalanan dari satu ujung ke ujung yang lain terjadi
pemisahan dari campuran zat, yang disebabkan oleh perbedaan sifat antara zat-
zat tersebut. Ada zat yang tetap tinggal dititik permulaan, ada zat yang merambat
sampai setengah perjalanan dan ada pula yang bergerak terus sampai mencapai
batas rambat. Pemisahan dianggap berhasil bila zat-zat dapat terpisah satu sama
lain sepanjang lapisan bahan penyerap.
Bahan penyerap disebut juga fase diam, fase stasioner atau fase tidak
bergerak, sebab bahan ini memang tetap tinggal diam selama proses
kromatografi. Sebaliknya cairan rambat disebut sebagai fase bergerak karena
merambat perlahan-lahan dari ujung lempeng ke ujung yang lain. Dan pada
umumnya silika gel biasa digunakan sebagai bahan penyerap.
Fase gerak (cairan rambat, cairan eluasi atau cairan pengembang) ialah
medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Fase gerak bergerak di
dalam fase diam, yaitu suatu lapisan berpori, karena ada gaya kapiler. Fase gerak
biasanya berupa zat organik mudah menguap, komposisinya sangat beragam, ada
yang terdiri dari satu zat organik, ada yang berupa campuran dua zat organik atau
lebih, semuanya tergantung pada keperluan sifat dari campuran zat yang akan
dipisahkan. Cairan pengembang yang banyak digunakan: n-heksana, heptana,
sikloheksana, karbontertraklorida, benzena kloroform, eter, etil asetat, piridina,
aseton, etanol, metanol, air (10).
D. Ekstraksi
Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut
sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia
yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang
tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein, dan lain-lain. Senyawa aktif
yag terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan ke dalam golongan
flavonoid, minyak atsiri, dan lain-lain. Dengan diketahuinya senyawa aktif yang
dikandung simplisia akan mempermudah pemilihan pelarut dan cara ekstraksi
yang tepat. Simplisia yang lunak seperti daun dan rimpang mudah diserap oleh
pelarut, karena itu pada proses ekstraksi tidak perlu diserbuk sampai halus (8).
Metode Ekstraksi, antara lain :
1) Cara Dingin
a. Maserasi
Maserasi adalah proses pengekstraksian simplisia dengan menggunakan
pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada
temperatur ruangan (kamar). Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan
prinsip metode pencapaian konsentrasi pada keseimbangan. Maserasi
kinetik berarti dilakukan pengadukan yang kontinu (terus menerus).
Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah
dilakukan penyaringan maserat pertama, dan seterusnya.
b. Perkolasi
Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai
sempurna (exhaustive extraction) yang umumnnya dilakukan pada
temperatur ruangan. Proses terdiri dari tahapan pengembangan bahan,
tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan /
penampungan ekstrak), terus menerus sampai diperoleh ekstrak (perkolat)
yang jumlahnya 1-5 kali bahannya.
2) Cara Panas
a. Refluks
Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya,
selama waktu tertentu dan jumlah terbatas yang relatif konstan dengan
adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada
residu pertama sampai 3-5 kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi
sempurna
b. Soxhletasi
Soxhletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang
umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi
kontinu dengan jumah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin
balik.
c. Digesti
Digest adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada
temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu
secara umum dilakukan pada temperatur 40-50o C.
d. Infus
Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air
(bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur
96-98o C) selama waktu tertentu (15-20 menit)
e. Dekok
Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama (≥30 menit) dan
temperatur sampai titik didih air (8,11).
E. Malaria
1. Epidemiologi Malaria
Di negara tropis maupun subtropis, hingga saat ini malaria masih menjadi
masalah kesehatan lebih dari 40 % atau 2,1 miliyar penduduk dunia di
perkirakan tinggal di daerah yang mempunyai resiko tinggi terkena malaria.
Tercatat 273 juta kasus penderita malaria di diagnosis secara klinis setiap
tahunnya. Kematian yang ditimbulkan akibat malaria mencapai 2 juta
pertahun yang terjadi terutama pada anak-anak dan ibu hamil (12). Di
Indonesia, di perkirakan sebanyak 2 orang dari 100.000 populasi mengalami
kematian akibat penyakit malaria. Hampir semua propinsi di Indonesia
mempunyai daerah endemis malaria, walaupun tingkat endemisitinya
berbeda-beda (13).
Gambar II.3 Daerah geografi penyebaran malaria di dunia (14)
2. Spesies Parasit Malaria
Penyebab malaria di indonesia sampai saat ini ada empat macam
plasmodium, yaitu : P. falciparum, P. vivax, P. malariae dan P. ovale.
Seorang penderita dapat ditulari oleh lebih dari satu jenis plasmodium yang
disebut infeksi campuran (mixed infection) misalnya infeksi oleh P.
falcifarum dengan P. vivax atau P. malariae. Infeksi campuran tiga jenis
parasit jarang terjadi. Dari keempat parasit tersebut, P. falciparum yang
sering menyebabkan malaria dengan gejala klinis berat sampai dapat
menimbulkan kematian (15).
Pada P. falciparum ukuran eritrosit terinfeksi normal, dan sering terdapat
lebih dari satu bentuk cincin didalam eritrosit. Bentuk tropozoit awal sering
terlihat di darah tepi, sedang skizon banyak terdapat di organ-organ dan otot,
jarang atau hanya sedikit dapat di temukan di darah tepi dan bentuknya
seperti topi dengan ukuran lebih kecil dari skizon P. vivax, dan mengandung
banyak merozoit. Didalam eritrosit kadang ada endapan sitoplasma yang
dinamakan titik-titik maurers merupakan bercak-bercak merah dengan
distribusi ireguler atau berbentuk celah-celah, ciri khas lain adalah pada
sitoplasma terdapat pseudopodia yang tampak pada lapisan darah. Parasit
malaria P. falciparum mengalami tiga perubahan morfologik yang berbeda
selama siklus 24 dan 72 jam dalam eritrosit manusia. Setelah invasi kedalam
eritrosit, parasit menjadi matur kedalam stadium cincin. Pertumbuhan
berikutnya kedalam stadium tropozoit yang di tandai oleh perubahan
morfologi dan biokimia pada membran plasma inang. Selanjutnya terjadi
maturasi parasit tropozoit kestadium skizon.
Gambar II.4 Stadium-stadium perkembangan P. falcifarum (16)
Daur hidup Plasmodium terdiri dari fase seksual eksogen (sporogoni) dalam
badan nyamuk Anopheles dan fase aseksual (skizogoni) dalam badan hospes
vertebrata.
a. Parasit dalam hospes vertebrata
1) Fase jaringan
Bila nyamuk Anopheles betina yang mengandung parasit malaria dalam
kelenjar liurnya menusuk hospes, sporozoit yang berada dalam air
liurnya masuk melalui probosis yang ditusukkan kedalam kulit.
Sporozoit segera masuk dalam peredaran darah dan setelah ½ jam
sampai 1 jam masuk kedalam sel hati. Sebagian sporozoid masuk ke sel
hati dan berkembang biak proses ini disebut skizogoni pra-eritrosit. Inti
parasit membelah diri berulang-ulang disertai oleh pembelahan
sitoplasma yang mengelilingi setiap inti sehingga terbentuk beribu-ribu
merozoit berinti satu. Pada akhir fase pra-eritrosit, skizon pecah,
merozoit keluar dan masuk di peredaran darah, sebagian besar
menyerang eritrosit yang berada di sinusoid hati tetapi beberapa
difagositosit. Pada P. vivax dan P. ovale sebagian sporozoit yang
menjadi hipnozoit setelah beberapa waktu (beberapa bulan sampai 5
tahun) menjadi aktif kembali dan mulai dengan skizogoni
eksoeritrositik sekunder.
2) Fase aseksual dalam darah
Waktu antara permulaan infeksi sampai parasit malaria ditemukan
dalam darah pertama kalinya karena jumlah parasit telah melewati
ambang mikroskopik disebut masa pra-paten, masa ini dapat dibedakan
dengan masa tunas atau masa inkubasi yang berhubungan dengan
timbulnya gejala klinis penyakit malaria. Masa tunas terbagi menjadi
dua yaitu masa tunas intrinsik dan masa tunas ekstrinsik. Masa tunas
intrinsik pada malaria adalah waktu antara sporozoit masuk dalam
tubuh hospes sampai timbul gejala demam biasanya berlangsung 8-37
hari. Masa tunas ekstrinsik adalah waktu antara nyamuk menghisap
darah yang mengandung gametosit sampai mengandung sporozoit
dalam kelenjar liurnya. Merozoid yang dilepaskan oleh skizon jaringan
mulai menyerang eritrosit. Stadium termuda dalam darah berbentuk
bulat, kecil; beberapa diantaranya mengandung vakuola. Stadium muda
ini disebut tropozoid. Kemudian parasit berkembang biak secara
aseksual melalui proses pembelahan yang disebut skizogoni. Inti parasit
membelah diri menjadi sejumlah inti yang lebih kecil, kemudian
dilanjutkan dengan pembelahan sitoplasma untuk membentuk skizon
skizon matang mengandung bentuk-bentuk bulat kecil, terdiri dari inti
dan sitoplasma yang disebut merozoid. Setelah skizogoni selesai,
eritrosit dan merozoid dilepaskan dalam aliran darah (sporulasi),
kemudian merozoid memasuki eritrosit baru dan generasi lain dibentuk
dengan cara yang sama. Pada daur eritrosit, skizogoni berlangsung
secara berulang-ulang selama infeksi dan menimbulkan parasitemia
yang meningkat dengan cepat sampai proses dihambat oleh imun
hospes.
3) Fase seksual dalam darah
Setelah 2 atau 3 generasi (3-15 hari) merozoid dibentuk, sebagian
merozoit tumbuh menjadi bentuk seksual. Proses ini disebut
gametogoni (gametogenesis). Bentuk seksual tumbuh tetapi intinya
tidak membelah. Gametosit mempunyai bentuk yang berbeda pada
berbagai spesies: pada P. falcifarum bentuknya seperti sabit atau pisang,
pada spesies lain bentuknya bulat.
b. Parasit dalam hospes invertebrata
1) Eksflagetasi
Bila nyamuk Anopheles betina menghisap darah hospes manusia yang
mengandung parasit malaria, parasit aseksual dicerna bersama dengan
eritrosit, tetapi gametosit dapat tumbuh terus. Inti pada mikrogametosit
membelah menjadi 4 sampai 8 yang masing-masing menjadi bentuk
panjang seperti benang (flagel) dengan ukuran 20-25 mikron, menonjol
keluar dari sel induk, bergerak-gerak sebentar dan kemudian
melepaskan diri. Flagel atau gamet jantan disebut mikrogamet;
makrogametosit mengalami proses pematangan (maturasi) dan menjadi
gamet betina atau makrogamet. Dalam lambung nyamuk mikrogamet
tertarik oleh makrogamet yang membentuk tonjolan kecil tempat masuk
mikrogamet sehingga pembuahan dapat berlangsung. Hasil pembuahan
disebut zigot.
2) Sporogoni
Pada permulaan, zigot merupakan bentuk bulat tidak bergerak, tetapi
dalam waktu 18-24 jam menjadi bentuk panjang dan dapat bergerak;
stadium seperti cacing ini berukuran panjang 8-24 mikron dan disebut
ookinet. Ookinet kemudian menembus dinding lambung melalui sel
epitel ke permukaan luar lambung dan menjadi bentuk bulat, disebut
ookista. Ookista makin lama makin besar dan kemudian pecah, ribuan
sporozoit dilepaskan dan bergerak dalam rongga badan nyamuk untuk
mencapai kelenjar liur, nyamuk betina sekarang menjadi infektif. Bila
nyamuk ini menghisap darah setelah menusuk kulit manusia, sporozoit
dimasukkan ke luka tusuk dan mencapai aliran darah hospes perantara.
Sporogoni yang dimulai dari pematangan gametoist sampai menjadi
sporozoit infektif, berlangsung selama 8 sampai 35 hari, bergantung
pada suhu luar dan spesies parasit (19).
Gambar II.5 siklus perkembangang P. falcifarum (18)
3. Strain D6 dan strain W2
Berdasarkan prosedur standar protokol dari WHO untuk menguji obat
antimalaria tehadap parasit malaria secara in vitro digunakan klon Sierra
Leone/D6 yang merupakan strain dari parasit malaria yang sensitif terhadap
klorokuin dan klon Indochina/W2 yang merupakan strain dari parasit malaria
yang resisten terhadap klorokuin. Selanjutnya kedua klon ini dikultur dalam
medium kultur jaringan dan digunakan secara teratur pada pengujian di
laboratorium malaria untuk penelitian antimalaria dengan menggunakan
berbagai metode (19).
F. Landasan Teori
1. Serbuk daun asam kandis diekstraksi secara berkesinambungan dengan
pelarut yang berbeda kepolarannya yaitu kloroform dan metanol dengan
tujuan untuk prefraksinasi awal.
2. Pada penelitian sebelumnya, ekstrak n-heksana, etil asetat dan n-butanol dari
kulit batang asam kandis mempunyai aktivitas antiplasmodium terhadap
strain FCR-3 dan 3D7.
3. Untuk menguji aktivitas antiplasmodium secara in vitro digunakan P.
falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan strain W2 (resisten klorokuin)
dengan metode mikroskopik dan metode SYBR Green I.
4. Ekstrak daun asam kandis mengandung senyawa xanton yang dapat berfungsi
sebagai anti malaria.
BAB III
RENCANA PENELITIAN
A. Prinsip Penelitian
Penelitian merupakan penelitian eksperimental secara in vitro, efek dari ekstrak
daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dilihat berdasarkan aktivitas
hambatan pertumbuhan dari P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan
strain W2 (resisten klorokuin) pada kultur.
B. Bahan Penelitian
Bahan Penelitian adalah daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) yang
diperoleh dari Desa Nangkalis Kab. Kapuas Hulu, Kalimantan Barat di
determinasi di Herbarium Bogoriensis Botani, LIPI Bogor.
C. Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Skripsi Fakultas Farmasi
Universitas Pancasila dan di Laboratorium NAMRU-2 bagian Parasitic Diseases,
Program, Badan Litbang Kesehatan, Jakarta.
D. Prosedur Penelitian
1. Pengumpulan bahan
2. Pembuatan simplisa
3. Pembuatan ekstrak
4. Identifikasi ekstrak
5. Pembuatan kultur
6. Preparasi bahan uji
7. Uji aktivitas antiplasmodium
E. Analisis Data
Hasil yang diperoleh dalam penelitian dianalisis sebagai berikut :
1. Metode mikroskopik
Data ditampilkan dalam bentuk tabel % hambat pertumbuhan. Konsentrasi
penghambatan 50 % (IC50) ditetapkan dengan analisa probit berdasarkan
hubungan log konsentrasi dan nilai probit.
Angka parasitemia = Jumlah eritrosit yang terinfeksi parasit x 100% Jumlah eritrosit yang diamati
% Hambat = Kontrol – Angka parasitemia x 100% Kontrol
2. Metode SYBR Green I
Data ditampilkan dalam bentuk tabel log konsentrasi dan linieritas
fluoresensi. Konsentrasi penghambatan 50 % (IC50) didapatkan dengan
memasukkan data antara log konsentrasi dan linieritas fluoresensi ke dalam
program Microsoft Excel. Selanjutnya data dianalisis dengan regresi non
linier menggunakan Software Graphad Prism (San Diego, CA)
BAB IV
BAHAN, ALAT DAN METODE PENELITIAN
A. Bahan
1. Bahan utama penelitian
Ekstrak kloroform dan ekstrak metanol dari daun asam kandis (G. parvifolia
(Miq)Miq, biakan parasit P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan
strain W2 (resisten klorokuin).
2. Bahan pereaksi
a. CCM
RPMI 1640 (Gibco BRL, Cat.No:31800-014), HEPES (Sigma, Cat.
No:H-3375), Natrium bicarbonat, Gentamicin Sulphate Solution 50
mg/mL (Sigma, G-1522).
b. Uji aktivitas antiplasmodium
CCM, Natrium klorida 3,5 %, sorbitol 500 g (Sigma, Cat.No:5-3889),
Giemsa 10 % (merk, Cat.No:1.09204.0500), Methanol pro analysis
(Merk,Cat.No:1.06009.2500),Microscopy immersion oil (Merk,
Cat.No:1.04699.0500), Hypoxanthine (Sigma, Cat.No:H9377), Lysis
buffer, SYBR Green I stock solution (Molecular Probes Inc, Cat.No:S-
7563), sel darah manusia golongan O+, serum darah manusia golongan O+.
c. Identifikasi ekstrak
Ammoniak 30 %, kloroform, asam klorida pekat, serbuk magnesium, amil
alkohol, natrium hidroksida 1 N, besi (III) klorida 1%, natrium asetat,
eter, asam asetat anhidrat, asam sulfat pekat, petroleum eter, pereaksi
Dragendorff, pereaksi Mayer, pereaksi stiassny, pereaksi Liebermann-
Burchard, pereaksi semprot serium sulfat.
B. Alat
Saringan milipore 0,2µm (Nalgene disposable filterware, Cat.No:120-0020),
Water-bath (Fisher scientific, Cat.No:15-458-106), Candle jar (Pyrex), Inkubator
(NAPCO, Cat.No:G101FC1), Laminary Air Flow (Biogard Hood The Baker
Company, model:315, Type:A2,Class:II, Cat.No:BM18502) Cultur Flask /
Lempeng kultur (Corning Flask. Cat.No:430168), 96 Well cell Cultur Cluster /
mikroplate dengan 96 sumuran (Costar, Cat.No:3596), Screw capped conical
tubes 15 mL (Labcon, Cat.No:3131-345008), Mikro pipet (P20, P50,P100 µL)
(Gilson), yellow tip dan blue tip 20 µL, 50 µL, 100 µL (Hydrologix pipet tips,
Cat.No:3920), mikroskop (NICON Eclipse E400 dan NICON Eclipse E600),
gelas obyek (Diagger 4591, Cat.No:615978A), fluorescence plate reader (infinite
200), tissue culture disk, ukuran:60x15mm polystrene 20/slave (Corning,
Cat.No:steril 25010), disposable serological pipet 1mL, 2mL, 5mL, 10mL non
pyrogenic polystrene individually wrapped steril (Costar, Cat.No:4051), pipet
tetes (Brand, Cat.No:747720), tabung sterilisasi pipet tetes (Bellco, Cat.No:B38),
tabung effendorf, Lab count denominator, bejana kromatografi, lempeng KLT.
C. Metode penelitian
1. Identifikasi Ekstrak
a. Penapisan fitokimia terhadap ekstrak
1) Identifikasi golongan alkaloid
Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak dilembabkan dengan 5 mL
ammonia 30 % dan digerus dalam mortir. Setelah itu ditambahkan 20
mL kloroform, gerus kembali dengan kuat, campuran tersebut
disaring dengan kertas saring. Filtrat berupa larutan organik diambil
(sebagai Larutan A). Sebagian larutan A (10 mL) diekstraksi dengan
asam klorida (1:10) dengan pengocokan dalam tabung reaksi,
kemudian ambil fase asam (larutan B). sebagian larutan A diteteskan
beberapa tetes pada kertas saring atau diteteskan dengan pereaksi
Dragendorff, terbentuk warna merah atau jingga menunjukkan adanya
alkaloid. Ke dalam dua tabung reaksi yang berisi 5 mL larutan B
ditambahkan beberapa tetes pereaksi Dragendorff terbentuk warna
jingga atau endapan putih dengan pereaksi Mayer, membuktikan
adanya alkaloid.
2) Identifikasi golongan flavonoid
Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak ditambahkan dengan 100 mL air
panas, didihkan selama 5 menit, kemudian saring dengan kertas
saring, filtrat yang diperoleh akan digunakan sebagai larutan
percobaan. Sebanyak 5 mL larutan percobaan dimasukkan kedalam
tabung reaksi, kemudian ditambahkan serbuk atau lempeng
magnesium secukupnya dan 1 mL amil alkohol dikocok dengan kuat,
dibiarkan hingga memisah, akan terbentuk warna merah, kuning atau
jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya senyawa
golongan flavonoid.
3) Identifikasi golongan saponin
Sejumlah lebih kurang 10 mL yang diperoleh dari percobaan (b)
diatas, dimasukkan kedalam tabung reaksi dan dikocok secara vertikal
selama 10 detik, jika dibiarkan selama 10 menit terbentuk busa yang
stabil dalam tabung reaksi menunjukkan adanya golongan saponin,
bila diteteskan 1 tetes asam klorida 1 % (encer) busa tetap stabil.
4) Identifikasi golongan tanin
Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak ditmabahkan dengan 100 mL air
panas, di didihkan selama 1 menit, didinginkan dan disaring dengan
kertas saring dan filtrat dibagi menjadi dua bagian. Ke dalam filtrat
yang pertama ditambahkan larutan besi (III) klorida 1 %, terbentuk
warna biru tua atau hijau kehitaman menunjukkan adanya senyawa
golongan tannin. Ke dalam filtrat yang kedua jika ditambahkan 15 mL
peraksi stiassny (formaldehid 30 % - asam klorida pekat = 2 : 1),
dipanaskan diatas penangas air, terbentuk endapan warna merah muda
menunjukkan adanya tannin katekuat. Selanjutnya endapan disaring,
filtrate dijenuhkan dengan natrium asetat, ditambahkan beberapa tetes
larutan besi (III) klorida 1 % terbentuk warna biru tinta menunjukkan
adanya tannin galat.
5) Identifikasi golongan kuinon
Sejumlah lebih kurang 10 mL larutan percobaan yang diperoleh dari
percobaan (b), dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan
beberapa tetes larutan natrium hidroksida 1 N, terbentuk warna merah
menunjukkan adanya senyawa golongan kuinon.
6) Identifikasi golongan steroid dan triterpenoid
Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak dimaserasi dengan 20 mL eter
selama 2 jam (dalam wadah tertutup rapat), disaring dan diambil
filtratnya, 5 mL dari filtrat tersebut diuapkan dalam cawan penguap
hingga diperoleh residu atau sisa, ke dalam residu ditambahkan 2 tetes
asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat (pereaksi
Liebermann-Burchard), terbentuk warna hijau menunjukkan adanya
senyawa steroid dan warna merah menunjukkan adanya triterpenoid.
7) Identifikasi golongan minyak atsiri
Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak ke dalam tabung reaksi,
ditambahkan 10 mL pelarut petroleum eter dan dipasangkan corong
gelas (yang diberi lapisan kapas yang telah dibasahi dengan air) pada
mulut tabung, dipanaskan selama 20 menit diatas penangas air
didinginkan, disaring dengan kertas saring, filtrat diuapkan pada
cawan penguap, residu berbau aromatis atau menyenangkan,
menunjukkan adanya senyawa golongan minyak atsiri.
8) Identifikasi golongan kumarin
Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak dimasukkan ke dalam tabung
reaksi dengan 10 mL pelarut kloroform yang dipasang corong (diberi
lapisan kapas yang tekah dibasahi air) pada mulut tabung, selanjutnya
dilakukan pemanasan selama 10 menit diatas penangas air dan
didinginkan disaring dengan kertas saring, filtrat diuapkan pada
cawan penguap sampai kering, sisa ditambah air panas. Sebanyak 10
mL filtrat didinginkan,larutan dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
ditambahkan 0,5 mL larutan ammonia 10 %, diamati di bawah sinar
lampu ultraviolet pada panjang gelombang 366 nm, maka tejadi
fluoresensi warna biru atau hijau menunjukkan adanya golongan
kumarin.
b. Analisa dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Ekstrak yang diperoleh dianalisa menggunakan kromatografi lapis tipis,
dengan menotolkan 10 µL sampel pada lempeng silika gel GF254
kemudian dieluasi. Cairan eluasi untuk ekstrak kloroform adalah n-
heksana : etil asetat = 3 : 2 dan untuk ekstrak metanol adalah kloroform :
etil asetat = 2 : 3. Bercak yang didapat diamati pada sinar biasa, UV 254
nm, dan 366 nm. Kemudian disemprot dengan pereaksi semprot serium
sulfat, Liebermann-Burchardatt, dan uap amoniak. Bercak diamati pada
sinar biasa, UV 254 nm, dan 366 nm.
2. Pembuatan kultur P. falcifarum
Prosedur penelitian berdasarkan Standard Operating Procedure Cultivation Of
Plasmodium falciparum In Vitro (22) dan Malaria SYBR Green I-Based
Fluorescence (MSF) Assay Protocol dari U.S. NAMRU-2 (23).
a. Thawing P. falcifarum
Ampul yang mengandung strain P. falcifarum diambil dari tabung
nitrogen, dicairkan pada water bath 37o C selama beberapa menit. Isi
ampul dipindahkan ke conical tube, ditambahkan larutan natrium klorida
3,5 %. Larutan dipindahkan ke dalam tabung sentrifugasi dan
disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rotasi per menit selama 7 menit.
Supernatan di buang. Ditambahkan 0,15 mL CCM dan disentrifugasi
dengan kecepatan 1500 rotasi per menit selama 7 menit, dihilangkan
supernatan. Kemudian tambahkan CCM dan sel darah merah yang tidak
terinfeksi. Tiap 1 mL suspensi di tambah 5 mL CCM dan dipindahkan 2
mL larutan suspensi kedalam lempeng kultur.
b. Pembuatan kultur P. falcifarum
P. falcifarum dibiakan dengan metode candle jar (Trager dan Jensen,
1976). Sel darah merah yang terinfeksi parasit dibiakan dalam lempeng
kultur yang mengandung 4 mL CCM. Kultur tersebut dilakukan di dalam
LAF dalam kondisi steril, kemudian di inkubasi di dalam inkubator pada
temperatur 37o C.
c. Mempertahankan kultur
Pergantian medium untuk mempertahankan kultur dilakukan tiap 24 jam
dan dilakukan di dalam LAF dalam kondisi steril. Lempeng kultur di
ambil dari dalam inkubator dan dimasukkan kedalam LAF. Medium lama
dibuang dengan menggunakan pipet tetes steril tanpa mengambil sel
darah merah yang terinfeksi. Kemudian dengan menggunakan pipet steril
tambahkan 3,5 mL – 4 mL medium baru kedalam tiap-tiap lempeng
kultur, kemudian homogenkan. Lempeng kultur dimasukkan ke dalam
candle jar kemudian dimasukkan ke dalam inkubator suhu 37o C. Apabila
angka parasitemia mencapai 6 - 8% maka kultur siap untuk di panen,
selanjutnya mengikuti prosedur 4.
3. Preparasi bahan uji
Bahan uji (ekstrak daun asam kandis) sebanyak 5 mg dilarutkan dengan
etanol sebanyak 3 mL sebagai larutan stock. Larutan stock ini kemudian di
encerkan dengan RPMI 1640 sehingga didapatkan satu seri konsentrasi
larutan uji 4, 20, 100, 200, dan 400 µg/mL.
4. Sinkronisasi
Untuk uji aktivitas antiplasmodium, parasit yang dipakai adalah stadium ring.
Untuk proses sikronisasi, dipindahkan sel darah merah yang terinfeksi
kedalam tabung sentrifugasi dan di sentrifugasi dengan kecepatan 1500-2000
putaran per menit selama 10 menit, supernatant dibuang. Larutan sorbitol 5 %
ditambahkan ke dalam endapan parasit, dihomogenkan dan didiamkan selama
5 menit. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1500-2000 putaran per
menit selama 10 menit, supernatan dibuang. Kemudian CCM ditambahkan
untuk membuat suspensi parasit sehingga endapan parasit yang hanya terdiri
dari stadium ring akan di peroleh. Parasit dikembalikan kedalam lempeng
kultur dan di inkubasi pada suhu 37o C selama 48 jam.
5. Uji aktivitas antiplasmodium
Mikrokultur yang digunakan mempunyai 96 sumuran. Pada kolom pertama
dimasukkan RPMI 1640 sebanyak 12,5 µL, pada kolom dua sampai enam
dimasukkan 12,5 µL ekstrak kloroform dan kolom tujuh sampai sebelas
dimasukkan 12,5 µL ekstrak metanol dari konsentrasi rendah ke konsentrasi
tinggi. Masing- masing sumuran diisi dengan 100 µL kultur. Mikrokultur
kemudian diletakkan candle jar. Agar terdapat konsentrasi gas optimal,
candle jar ditutup rapat pada sewaktu nyala lilin di dalamnya akan mati,
kemudian diinkubasi dalam inkubator pada temperatur 37o C selama 48 jam.
Lempeng sumur mikro dikeluarkan, untuk metode mikroskop, suspensi
bagian atas dibuang. Suspensi yang pekat dibuat sediaan apusan darah tebal
dengan cara suspensi pekat dipipet kemudian diteteskan pada objek glass,
apusan yang terbentuk dikeringkan selama 5-10 menit. Setelah kering
ditambahkan pewarna giemsa 10 % pada apusan darah dan dibiarkan 15 - 20
menit, selanjutnya giemsa dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.
Apusan yang terbentuk dapat dilihat pada mikroskop (perbesaran 100 kali)
dengan menambahkan minyak emersi kemudian dihitung sel darah merah
yang terinfeksi P. falcifarum setiap 200 sel darah merah dan dihitung angka
% parasitemia. Untuk metode SYBR Green I, 100 µL lisis buffer yang berisi
SYBR Green I dimasukkan pada tiap-tiap sumuran. Lempeng sumur mikro
diinkubasi dalam kondisi gelap selama 1 jam dan dibaca pada alat fluoresence
plate reader.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Gambar IV.1. gambaran lempeng sumur mikro uji aktivitas antiplasmodium
Keterangan :
= RPMI 1640
= diisi dengan berbagai konsentrasi (fase kloroform)
= diisi dengan berbagai konsentrasi (fase metanol)
A-B = Strain D6
C-D = Strain W2
BAB V HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
1. Identifikasi Ekstrak
a. Penapisan fitokimia
Tabel V.1 senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis.
Senyawa kimia Ekstrak klorofom Ekstrak metanol
Alkaloid - - Flavonoid + + Saponin - + Tanin - -
Kuinon - + Steroid/triterpenoid + +
Minyak atsiri - - Kumarin + +
Keterangan : + : terdapat senyawa dalam ekstrak - : tidak terdapat senyawa dalam ekstrak
Tabel V.1 menunjukkan hasil penapisan fitokimia. Pada ekstrak
kloroform diperoleh senyawa flavonoid, steroid/triterpenoid, dan
kumarin. Sedangkan pada ekstrak metanol diperoleh senyawa
flavonoid, saponin, kuinon, steroid/triterpenoid dan kumarin.
b. Analisis dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Hasil analisis dengan KLT pada ekstrak kloroform dan ekstrak
metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq)
1) Ekstrak kloroform
Gambar V.1 Profil bercak KLT pada ekstrak kloroform Keterangan : fase diam :
Pada Gambar V.1 dapat dilihat terdapat
kloroform jika dilihat dari sinar biasa. Pada sinar UV 245 nm
terdapat 6 bercak, sedangkan pada UV 366 nm terdapat
Ekstrak kloroform
(A) (B)
(D) (E) (F)
Gambar V.1 Profil bercak KLT pada ekstrak kloroform Keterangan : fase diam : silika gel
fase gerak : n-heksana : etil asetat = 3 : 2 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm (D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa(E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm(F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
Pada Gambar V.1 dapat dilihat terdapat 5 bercak pada ekstrak
kloroform jika dilihat dari sinar biasa. Pada sinar UV 245 nm
terdapat 6 bercak, sedangkan pada UV 366 nm terdapat
(B) (C)
(D) (E) (F)
: Pola bercak KLT pada sinar biasa : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
bercak pada ekstrak
kloroform jika dilihat dari sinar biasa. Pada sinar UV 245 nm
terdapat 6 bercak, sedangkan pada UV 366 nm terdapat 6 bercak.
Gambar V.2 PKeterangan : fase diam
Pada gambar V.2 dapat dilihat terdapat 5
kecokelatan dilihat dari sinar biasa, pada sinar UV 254 terdapat
bercak berwarna kuning sedangkan pada sinar UV 366 nm terdapat
(A) (B)
(D) (E) (F)
Gambar V.2 Profil bercak KLT ekstrak kloroform diuapi dengan uap amoniakKeterangan : fase diam : silika gel
fase gerak : n-heksana : etil asetat = 3 : 2 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm
(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa(E) :Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm(F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
Pada gambar V.2 dapat dilihat terdapat 5 bercak
kecokelatan dilihat dari sinar biasa, pada sinar UV 254 terdapat
bercak berwarna kuning sedangkan pada sinar UV 366 nm terdapat
(C)
(D) (E) (F)
rofil bercak KLT ekstrak kloroform diuapi dengan uap amoniak
: Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) :Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
bercak berwarna kuning
kecokelatan dilihat dari sinar biasa, pada sinar UV 254 terdapat 6
bercak berwarna kuning sedangkan pada sinar UV 366 nm terdapat
6 bercak
panah) yang merupakan senyawa flavonoid.
Gambar V.3. Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi
Keterangan : fase diam : silika gel
Pada
Liebermann
bercak, dimana bercak kuning kehijauan ( ditunjukkan oleh
panah) yang merupakan senyawa flavonoid.
(A) (B)
(D) (E) (F)
Gambar V.3. Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi Liebermann-Burchard.
Keterangan : fase diam : silika gel fase gerak : n-heksana : etil asetat = 3 : 2
(A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm
(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 36
Pada gambar V.3 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi
Liebermann-burchard dan dipanaskan di oven suhu 100
( ditunjukkan oleh
(C)
(D) (E) (F)
Gambar V.3. Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi
(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
gambar V.3 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi
burchard dan dipanaskan di oven suhu 100oC selama
10 menit membuat
pada sinar UV 254 nm bercak tidak dapat terlihat dengan jelas
dimana titik
semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm
adanya bercak warna biru muda (ditunjukkan oleh panah)
merupakan senyawa ste
Gambar V.4 Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi serium sulfatKeterangan : fase diam : silika gel
10 menit membuat 4 bercak menjadi warna coklat
pada sinar UV 254 nm bercak tidak dapat terlihat dengan jelas
dimana titik-titik ungu merupakan warna dari pereaksi
semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm
adanya bercak warna biru muda (ditunjukkan oleh panah)
merupakan senyawa steroid-triterpenoid.
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
Gambar V.4 Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi serium sulfatKeterangan : fase diam : silika gel
fase gerak : n-heksana : etil asetat = 3 : 2 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm
(C) : KLT pada sinar UV 366 nm (D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa(E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm(F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
bercak menjadi warna coklat pada sinar biasa,
pada sinar UV 254 nm bercak tidak dapat terlihat dengan jelas
titik ungu merupakan warna dari pereaksi
semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm terdapat 5 bercak,
adanya bercak warna biru muda (ditunjukkan oleh panah)
(B) (C)
(D) (E) (F)
Gambar V.4 Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi serium sulfat
(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
Pada gambar V.4 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi
serium sulfat dan dipanaskan di oven suhu 100oC selama 10 menit
terlihat 4 bercak berwarna abu-abu pada sinar biasa(ditunjukkan
oleh panah), pada sinar UV 254 nm bercak tidak dapat terlihat
dengan jelas dimana titik-titik ungu merupakan warna dari
pereaksi semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm terdapat 1
bercak yang berwarna kuning kehijauan (ditunjukkan oleh panah)
merupakan senyawa flavonoid.
2) Ekstrak metanol
(A) (B) (C)
(D) (E) (F) Gambar V.5 profil bercak KLT ekstrak metanol Keterangan : fase diam : silika gel
fase gerak : kloroform : etil asetat = 2 : 3 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm
(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
Dari gambar V.5 tidak terlihatnya bercak pada sinar biasa dan
sinar UV 254 nm, sedangkan terdapat 1 bercak tipis berwarna
kuning kehijauan (ditunjukkan oleh panah) terlihat pada sinar UV
366 nm.
(A) (B) (C)
(D) (E) (F) Gambar V.6 profil bercak KLT ekstrak metanol diuapi dengan uap amoniak Keterangan : fase diam : silika gel
fase gerak : kloroform : etil asetat = 2 : 3 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm
(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
Dari gambar V.6 tidak didapatkan bercak jika dilihat dari sinar
biasa dan sinar UV 254 nm, sedangkan terlihat 1 bercak tipis
berwarna kuning kehijauan (ditunjukkan oleh panah) yang
merupakan senyawa flavonoid.
(A) (B) (C)
(D) (E) (F) Gambar V.7 Profil bercak KLT ekstrak metanol dengan pereaksi Liebermann-
Burchard. Keterangan : fase diam : silika gel
fase gerak : kloroform : etil asetat = 2 : 3 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm
(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT sinar UV 366 nm
Dari gambar V.7 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi
Liebermann-burchard dan dipanaskan di oven suhu 100oC selama
10 menit tidak terdapat bercak pada sinar biasa. Pada sinar UV 254
nm tidak terlihatnya bercak dan titik-titik ungu merupakan warna
dari pereaksi semprotnya. Pada sinar UV 366 nm terdapat 1 bercak
tipis berwarna biru (ditunjukkan oleh panah) yang merupakan
senyawa steroid/triterpenoid.
(A) (B) (C)
(D) (E) (F) Gambar V.8 profil bercak KLT ekstrak metanol dengan pereaksi serium sulfat Keterangan : fase diam : silika gel
fase gerak : kloroform : etil asetat = 2 : 3 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm
(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
Dari gambar V.8 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi
serium sulfat dan dipanaskan di oven suhu 100oC selama 10 menit
tidak terdapat bercak pada sinar biasa. Pada sinar UV 254 nm tidak
terlihatnya bercak dan titik-titik ungu merupakan warna dari
pereaksi semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm adanya 1
bercak tipis warna kuning kehijauan (ditunjukkan oleh panah)
merupakan senyawa flavonoid.
2. Pengujian aktivitas antiplasmodium
Hasil pengamatan terhadap aktivitas penghambatan pertumbuhan parasit
P. falcifarum strain D6 dan strain W2 secara in vitro dari berbagai ekstrak
daun asam kandis dengan metode mikroskopik dan metode SYBR Green
I.
a. Metode Mikroskopik
1) Ekstrak kloroform dan ekstrak metanol strain D6 ( Sensitif
Klorokuin)
Tabel V.2 Hambatan pertumbuhan P. falcifarum strain D6 (%) dari ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq pada berbagai konsentrasi.
Konsentrasi ekstrak (µg/mL)
% hambat pertumbuhan
Ekstrak kloroform Ekstrak metanol
4 -42,93 14,04
20 36,48 10,49
100 73,55 85,45
200 88,95 93,37
400 96,50 97,88
Pada tabel V.2 dihitung % hambat pertumbuhan P. falcifarum
strain D6 dari berbagai konsentrasi ekstrak kloroform dan ekstrak
metanol, terlihat pada ekstrak kloroform semakin tinggi
konsentrasi maka semakin tinggi nilai % hambat pertumbuhan P.
falcifarum. Sedangkan pada ekstrak metanol terlihat terjadi
penurunan % hambat pertumbuhan pada konsentrasi 20 µg/mL
dan kemudian pada konsentrasi berikutnya akan mengalami
peningkatan. Nilai negatif pada ekstrak kloroform pada
konsentrasi 4 µg/mL menunjukkan bahwa tidak terjadi hambatan
pertumbuhan P. falcifarum.
Gambar V.9 Kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan
probit Untuk memperoleh nilai IC50 dibuat terlebih dahulu kurva
persamaan garis regresi linier (Gambar V.9). Berdasarkan
persamaan garis linier tersebut didapat nilai IC50 dari ekstrak
kloroform daun asam kandis sebesar 33,17 µg/mL dan dari
ekstrak metanol sebesar 32,44 µg/mL.
y = 2,2119 + 1,8333 x
-6-4
-2
02
4
6
810
0 1 2 3
pro
bit
log konsentrasi
ekstrak kloroform
ekstrak metanol
(RPMI 1640) (konsentrasi 4 µg/mL)
(konsentrasi 20 µg/mL) (konsentrasi 100 µg/mL)
(konsentrasi 200 µg/mL) (konsentrasi 400 µg/mL)
Gambar V.10 P. falcifarum Strain D6 (sensitif) ekstrak kloroform daun asam kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq) dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi
Pada gambar V.10. menunjukkan perkembangan P. falcifarum
strain D6 dibandingan dengan kontrol negatif (RPMI 1640),
terlihat semakin tinggi konsentrasi dari ekstrak kloroform maka
perkembangan hidup P. falcifarum semakin berkurang. Daerah
yang ditunjukkan oleh tanda panah merupakan sel darah merah
yang terinfeksi oleh P. falcifarum.
(RPMI 1640) (konsentrasi 4 µg/mL)
(konsentrasi 20µg/mL) (konsentrasi 100 µg/mL)
(konsentrasi 200 µg/mL) (konsentrasi 400 µg/mL)
Gambar V.11 P. falcifarum strain D6 (sensitif) ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi
Dari gambar V.11 menunjukkan perkembangan P. falcifarum
strain D6 dan dibandingan dengan kontrol negatif (RPMI 1640),
terlihat semakin tinggi konsentrasi dari ekstrak metanol maka
perkembangan hidup P. falcifarum semakin berkurang. Daerah
yang ditunjukan oleh panah merupakan sel darah merah yang
terinfeksi P.falcifarum.
2) Ekstrak kloroform dan ekstrak metanol Strain W2 ( Resistensi Klorokuin) Tabel V.3 Hambatan pertumbuhan P. falciparum strain W2 (%) dari ekstrak
kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq) pada berbagai konsentrasi.
Konsentrasi ekstrak (µg/mL)
% hambat pertumbuhan
Ekstrak kloroform Ekstrak metanol
4 -27,98 7,97
20 69,32 -8,84
100 82,87 60,66
200 83,50 90,34
400 92,66 91,28
Pada tabel V.3 dihitung % hambat pertumbuhan P. falcifarum
strain W2 dari berbagai konsentrasi ekstrak kloroform dan ekstrak
metanol, terlihat pada ekstrak kloroform semakin tinggi
konsentrasi maka semakin tinggi nilai % hambat pertumbuhan P.
falcifarum. Sedangkan pada ekstrak metanol terlihat terjadi
penurunan % hambat pertumbuhan pada konsentrasi 20 µg/mL dan
kemudian pada konsentrasi berikutnya akan mengalami
peningkatan. Nilai negatif pada ekstrak kloroform pada
konsentrasi 4 µg/mL dan ekstrak metanol pada konsentrasi 20
µg/mL menunjukkan bahwa tidak terjadi hambatan pertumbuhan
P. falcifarum.
Gambar V.12 kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan
probit Untuk dapat memperoleh nilai IC50 dibuat terlebih dahulu kurva
persamaan garis regresi linier (gambar V.12). Berdasarkan
persamaan garis linier tersebut didapat nilai IC50 dari ekstrak
kloroform daun asam kandis sebesar 0,55 µg/mL dan dari ekstrak
metanol sebesar 41,23 µg/mL.
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
0 1 2 3
pro
bit
log konsentrasi
ekstrak kloroform
ekstrak metanol
(RPMI 1640) (konsentrasi 4 µg/mL)
(konsentrasi 20 µg/mL) (konsentrasi 100 µg/mL)
(konsentrasi 200 µg/mL) (konsentrasi 400 µg/mL)
Gambar V.13 P. falcifarum Strain W2 (resisten) ekstrak kloroform daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dalam sel daram merah pada berbagai konsentrasi
Dari gambar V.13 menunjukkan perkembangan P. falcifarum
strain W2 pada berbagai konsentrasi dan dibandingan dengan
kontrol negatif (RPMI 1640), terlihat semakin tinggi konsentrasi
dari ekstrak kloroform maka perkembangan hidup P. falcifarum
semakin berkurang. Daerah yang ditunjukan oleh panah
merupakan sel darah merah yang terinfeksi P. falcifarum.
(RPMI 1640) (konsentrasi 4 µg/mL)
(konsentrasi 20 µg/mL) (konsentrasi 100 µg/mL)
(konsentrasi 200 µg/mL) (konsentrasi 400 µg/mL)
Gambar V.14 .P. falcifarum strain W2 (resisten) ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq) dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi
Dari gambar V.14 menunjukkan perkembangan P. falcifarum
strain W2 pada berbagai konsentrasi dan dibandingan dengan
kontrol negatif (RPMI 1640), terlihat semakin tinggi konsentrasi
dari ekstrak metanol maka perkembangan hidup P. falcifarum
semakin berkurang. Daerah yang ditunjukan oleh panah
merupakan sel darah merah yang terinfeksi P.falcifarum.
3) Kontrol Positif ( Klorokuin) Tabel V.4 Hambatan pertumbuhan P. falciparum strain D6 dan strain W2 (%)
dari klorokuin pada berbagai konsentrasi Konsentrasi
(ng/mL) % hambat pertumbuhan
strain D6 strain W2
6,25 19,19 -5,78
12,5 32,57 25,91
25 68,04 -49,68
50 88,63 37,04
100 98,19 23,55
200 98,19 40,26
400 96,34 -8,56
800 93,29 38,33
1600 99,04 64,45
Pada tabel V.4 dihitung nilai % hambat pertumbuhan P.
falcifarum strain D6 dari berbagai konsentrasi klorokuin, terlihat
pada konsentrasi 400 ng/mL dan 800 ng/mL mengalami
penurunan % hambat, pada konsentrasi berikutnya akan
mengalami peningkatan. Pada strain W2 terlihat pada konsentrasi
25 ng/mL, 100 ng/mL, 400 ng/mL mengalami penurunan %
hambat. Nilai negatif pada strain W2 menunjukkan bahwa tidak
terjadi hambatan pertumbuhan P. falcifarum.
Gambar V.15 Kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan
probit
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
0 1 2 3 4
pro
bit
log konsentrasi
strain D6
strain W2
Terlihat kurva hubungan antara log konsentrasi dan nilai probit
dari klorokuin. Pada strain D6 terlihat kurva nilai probit
menunjukkan peningkatan aktivitas dengan meningkatnya
konsentrasi, sedangkan pada strain W2 terlihat kurva nilai probit
mengalami penurunan aktivitas dengan meningkatnya konsentrasi.
b. Metode SYBR Green I 1) Ekstrak kloroform
Tabel V.5 Nilai linieritas fluoresensi pada P. falcifarum dari ekstrak kloroform daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) pada berbagai konsentrasi
Konsentrasi (µg/mL)
Log konsentrasi
Linearitas fluoresensi
D6 (I) D6 (II) W2 (I) W2 (II)
4 0,6020 23265 21880 29580 29722
20 1,3010 14450 12848 7313 7343
100 2 9636 9531 6750 6653
200 2,3010 9091 9099 5868 5754
400 2,6020 8379 9790 5124 5286
Pada tabel V.5 menunjukkan semakin meningkat konsentrasi ekstrak
kloroform daun asam kandis maka semakin rendah nilai linieritas
fluoresensi.
2) Ekstrak metanol
Tabel V.6. Nilai linearitas fluoresensi pada P. falcifarum dari ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq ) pada berbagai konsentrasi
Konsentrasi (µg/mL)
Log konsentrasi
Linearitas fluoresensi
D6 (I) D6 (II) W2 (I) W2 (II)
4 0,6020 32822 31574 34271 33555
20 1,3010 26422 26079 32396 29937
100 2 12504 11556 7992 7401
200 2,3010 10208 9954 6481 6234
400 2,6020 9593 8895 5933 6270
Pada tabel V.6 menunjukkan semakin meningkat konsentrasi ekstrak
metanol daun asam kandis maka semakin rendah nilai linieritas
fluoresensi.
c. Kontrol positif (Klorokuin) Tabel V.7 Nilai fluoresensi pada P falcifarum dari klorokuin pada berbagai
konsentrasi Konsentrasi
(µg/mL) Log konsentrasi Linearitas fluoresensi
D6 (I) D6 (II) W2 (I) W2 (II)
6,25 0,7958 38189 36948 35634 35206
12,5 1,0969 37309 39701 34410 34904
25 1,3979 30834 33016 34509 33883
50 1,6989 11501 11486 35111 34337
100 2 11279 11229 34625 33464
200 2,3010 10806 11337 30933 28716
400 2,6020 10782 11309 10009 10714
800 2,9030 10804 11339 8599 8534
1600 3,2041 11759 11424 8886 8842
Pada tabel V.7 menunjukkan semakin meningkat konsentrasi
klorokuin maka semakin rendah nilai linieritas fluoresensi.
Tabel V.8 Nilai IC50 dari tiap ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq)
Ekstrak
Nilai IC50 pada Metode mikroskopik
Nilai IC50 pada metode SYBR Green
strain D6 strain W2 strain D6 strain W2
Ekstrak Kloroform
33,17 µg/mL 0,55 µg/mL 14,29 µg/mL 0,214 µg/mL
Ekstrak Metanol
32,44 µg/mL 41,23 µg/mL 48,00 µg/mL 56,37 µg/mL
Klorokuin 12,48 ng/mL 1083,9 ng/mL 25,62 ng/mL 227,60 ng/mL
Uji efek antiplasmodium secara in vitro dengan menggunakan
kultur P. falcifarum dapat digunakan sebagai uji pendahuluan untuk
mengevaluasi bahan alam hayati yang prospektif sebagai
antiplasmodium. Penelitian dilakukan pada ekstrak kloroform dan
ekstrak metanol dari daun asam kandis dimana ekstrak kloroform
bersifat semi polar sehingga dapat menarik senyawa-senyawa semi
polar, ekstrak metanol bersifat polar yang dapat menarik senyawa
polar. Penelitian dilakukan terhadap P. falcifarum strain D6 (sensitif
klorokuin) dan strain W2 (resisten klorokuin) dimana kedua strain ini
telah ditetapkan oleh W.H.O sebagai standar strain P. falcifarum yang
digunakan untuk menguji kesensitifan suatu obat atau bahan alam
sebagai antimalaria. Pengujian aktivitas antiplasmodium
menggunakan 2 metode yaitu metode mikroskopik dan metode SYBR
Green I. Penggunaan 2 metode ini bertujuan untuk mengetahui nilai
IC50 dimana metode mikroskopik merupakan metode utama dalam
mendiagnosa malaria dan metode SYBR Green I merupakan metode
alternatif untuk menentukan perkembangan parasit secara in vitro.
Selanjutnya aktivitas antiplasmodium dinyatakan dalam dengan IC50
yaitu yaitu kadar senyawa uji yang mampu menghambat pertumbuhan
parasit sampai 50 %. Berdasarkan penggolongan menurut Gessler et
al,(1994), penggolongan senyawa bahan alam berdasarkan aktivitas
antiplasmodium dikelompokan menjadi 3 kategori antara lain sangat
kuat yaitu tanaman dengan nilai IC50 < 10 µg/mL, kuat yaitu tanaman
dengan nilai IC50 10-50 µg/mL, lemah yaitu tanaman dengan nilai
IC50 > 50 µg/mL.
Sebelum melakukan uji aktivitas antiplasmodium, dilakukan
identifikasi ekstrak daun asam kandis dengan penapisan fitokimia dan
KLT untuk mengetahui senyawa-senyawa yang terkandung dalam
ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis. Profil
kromatogram KLT dari ekstrak kloroform menunjukkan adanya
senyawa flavonoid dan steroid/triterpenoid, sedangkan dari ekstrak
metanol menunjukkan adanya senyawa flavonoid dan
steroid/triterpenoid. Hal ini didukung dengan identifikasi KLT
menggunakan uap amoniak yang menyebabkan adanya bercak
berwarna kuning kehijauan yang merupakan senyawa flavonoid,
dengan menggunakan pereaksi semprot Liebermann–burchard yang
menyebabkan adanya bercak berwarna biru muda yang merupakan
senyawa steroid/triterpenoid dan menggunakan pereaksi semprot
serium sulfat yang menyebabkan adanya bercak berwarna kuning
kehijauan yang merupakan senyawa polifenol. Profil KLT ini juga
didukung dengan hasil penapisan fitokimia berdasarkan metode
Fransworth yang diperoleh senyawa flavonoid, steroid/triterpenoid
pada ekstrak kloroform dan diperoleh senyawa flavonoid,
steroid/triterpenoid, saponin, kumarin, dan kuinon pada ekstrak
metanol.
Pengujian aktivitas antiplasmodium daun asam kandis dengan
metode mikroskopik didapatkan nilai IC50 dari ekstrak kloroform
strain D6 adalah 33,17 µg/mL dan strain W2 adalah 0,55 µg/mL.
Sedangkan nilai IC50 dari ekstrak metanol strain D6 adalah 32,44
µg/mL dan strain W2 adalah 41,23 µg/mL. Berdasarkan
penggolongan menurut Gessler et al, (1994), menunjukkan bahwa
ekstrak kloroform strain D6 menunjukkan aktivitas antiplasmodium
kuat dan strain W2 menunjukkan aktivitas antiplasmodium sangat
kuat. Sedangkan ekstrak metanol strain D6 dan strain W2
menunjukkan aktivitas antiplasmodium kuat. Nilai IC50 pada ekstrak
kloroform strain W2 menunjukkan aktivitas antiplasmodium lebih
baik dibandingkan dengan strain D6, hal ini menunjukkan ekstrak
kloroform mempunyai mekanisme kerja yang berbeda yang
menyebabkan ekstrak kloroform lebih sensitif pada strain W2. Tetapi
apabila dibandingkan dengan kontrol positif (klorokuin), ekstrak
kloroform dan ekstrak metanol mempunyai aktivitas antiplasmodium
yang lebih lemah. Hal ini di sebabkan kandungan senyawa dari
klorokuin sudah merupakan bentuk senyawa murni, sedangkan pada
ekstrak kloroform dan ekstrak metanol masih banyak terdapat
campuran senyawa kimia.
Hasil pengujian dari metode SYBR Green I diperoleh nilai
linearitas fluoresensi dari ekstrak kloroform dan ekstrak metanol yang
menunjukkan nilai linieritas fluoresensi dari ke dua ekstrak tersebut
mengalami penurunan dengan semakin meningkatnya konsentrasi.
Hal ini disebabkan karena pada konsentrasi yang tinggi, jumlah
parasit hidup semakin sedikit, dimana prinsip kerja dari metode
SYBR Green I ini adalah berikatan dengan DNA parasit yang masih
hidup dan memberikan fluoresensi berwarna hijau pada DNA parasit.
Pada tabel V.8 terlihat bahwa metode mikroskopik memberikan
hasil IC50 yang berbeda dibandingkan dengan nilai IC50 pada metode
SYBR Green I. meskipun metode SYBR Green I memiliki banyak
keuntungan seperi praktis, memberikan hasil yang cepat,analisa nya
otomatis dan tidak berbahaya tetapi tetapi apabila sampel kurang
homogen maka nilai fluoresensi tidak dapat terbaca dan apabila
kepadatan plasmodium terlalu padat dapat menyebabkan SYBR Green
I tidak dapat mengikat sempurna dengan DNA parasit. Sedangkan
metode mikroskopik merupakan metode utama dalam mendiagnosa
malaria, metode ini sensitif dan spesifik. Mikroskopik dapat
menghitung jumlah parasit dan juga dapat menentukan jenis
Plasmodium malarianya. Cara ini memerlukan keahlian teknik,
kemampuan yang terlatih dalam membaca sediaan malaria,
memerlukan mikroskop yang berfungsi dengan baik tetapi
membutuhkan waktu yang lebih lama dibandingkan dengan metode
SYBR Green I.
BAB VI
SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) memiliki aktivitas
antiplasmodium terhadap P. falcifarum pada strain D6 (sensitif klorokuin)
dan strain W2 (resisten klorokuin) dengan menggunakan metode mikroskopik
dan metode SYBR Green I. Ekstrak kloroform daun asam kandis memiliki
aktivitas antiplasmodium lebih kuat dibandingkan dengan ekstrak metanol.
Nilai IC50 dengan metode mikroskopik dari ekstrak kloroform pada strain D6
adalah 33,17 µg/mL dan strain W2 adalah 0,55 µg/mL sedangkan nilai IC50
ekstrak metanol strain D6 adalah 32,44 µg/mL dan strain W2 adalah 41,23
µg/mL. Nilai IC50 dengan metode SYBR Green I ekstrak kloroform strain D6
adalah 14,29 µg/mL dan strain W2 adalah 0,214 µg/mL sedangkan nilai IC50
ekstrak metanol strain D6 adalah 48,00 µg/mL dan strain W2 adalah 56,37
µg/mL.
B. Saran
1. Dilakukan penelitian lanjutan yaitu isolasi dan fraksinasi ekstrak
kloroform daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq).
2. Dilakukan penelitian uji aktivitas antiplasmodium terhadap daun asam
kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) secara in vivo.
DAFTAR RUJUKAN
1. Sejarah penyakit malaria. Diambil dari : http://www.searo.who.int/en/Section10/ Section21/Section334.htm, Diakses pada tanggal 31 Juli 2009
2. Syamsudin, Soesanto Tjokrosonto, Subagus Wahyuono, Mustofa. Aktivitas
antiplasmodium dari dua fraksi ekstrak n-heksana kulit batang asam kandis (Garcinia parvifolia Miq). Majalah Farmasi Indonesia, 18 (4). 2007. h. 210.
3. Litkhitwitayawuid, K., Chanmahasathein, W., Ruangrungsi, N., Krungkai,J.
Xanthones with antimalarial activity from Garcinia dulcis. Planta Med., 64. 1998. h. 281-282.
4. Syamsudin, Shirly Kumala, Broto Sutaryo. Screening of some extracts from
Garcinia parvifolia Miq (Guttiferae) for antiplasmodial, antioxidant, cytotoxic and antibacterial activities. Asian Journal of Plant Science. 2007. h. 973.
5. Syamsudin, Soesanto Tjokrosonto, Subagus Wahyuono, Mustofa. Invitro and
invivo Antiplasmodial activity of stem bark extract of Garcinia parvifolia Miq (Guttiferae), Internasional Journal of Tropical Medicine. Ed. 22. 2007. h. 41-44.
6. Heyne, K. Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid III. Terjemahan Badan Litbang
Kehutanan. Yayasan Sarana Wana Jaya; 1987. h. 1386 7. Daun asam kandis. Diambil dari : http://www.rimbundahan.org/environment/
plant_lists/guttiferae/Garcinia-parvifolia.jpg, Diakses pada 31 Juli 2009 8. Harbone, J.B.,Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisa
Tumbuhan, terjemahan Padmawinata, K., Soediro, I., Penerbit ITB, Bandung, 1987. h. 99
9. Winholz, M., Budavari, S, R.f., Otterben, E.S. The merck index an encyclopedia
of chemicals, drugs and biological. 14th ed. Merck and CO, inc. Rahway-USA. 1983. h. 10064
10. Sutrisno B., Reverse approach. Edisi I. Jakarta: Fakultas Farmasi Universitas
Pancasila; 1986. h. 13-15. 11. Agoes, Goeswin. Teknologi Bahan Alam. Bandung: Institut Teknologi Bandung;
2007. h. 12-5,24-5 12. Sunkar, S & Pribadi, W., 1992. Resistensi Plasmodium Falcifarum terhadap
obat- obat malaria. Majalah Kedokteran Indonesia 42 (3). h. 155-162
13. Data kematian akibat malaria. Diambil dari :http://apps.who.int/
ghodata/?vid=450. Diakses pada tanggal 6 Agustus 2009. 14. Malaria-Endemic Areas in the World. Diambil dari : http://globalucf.org/ .
Diakses pada tanggal 5 Agustus 2009 15. Anonim, 1993, Malaria Pengobatan, Departemen Kesehatan Republik Indonesia,
Jakarta, Buku 3. 16. Plasmodium falcifarum. Diambil dari :http://www.rph.wa.gov.av/malaria/
diagnostic.html. Diakses pada tanggal 5 Agustus 2009 17. Gandahusada, S., Ilahude, D.H.D., Pribadi, W. (ed), 198. Parasitologi kedokteran
ed. III, Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 2002. h. 173-176. 18. Siklus hidup malaria. Diambil dari : http://www.uni-tuebingen.de/modeling/
malaria_LifeCycle.gif. Diakses pada tanggal 5 Agustus 2009 19. Basco Leonardo K. Field application of in vitro assays for the sensitivity of
human malaria parasites to antimalarial drugs. Geneva: World Helath Organization; 2007. p. 16,22.
20. Budi Leksana, Ika Susanti, J. Kevin Baird. Standard operating procedure
cultivation of plasmodium falcifarum in vitro. Jakarta: US NAMRU-2;1995. p. 1-7
21. Johnson Jacob D. Malaria SYBR Green I-based fluorescence (MSF) assay
protocol. Maryland : Departemen of Parasitology Division of Experimental Therapeutic Walter Reed Army Institute of Research; 2006. p.2-7.
22. Finney DJ. Probit analysis; A statistical treatment of the sigmoid response curve.
Cambridge; 1964 dikutip dari Syamsudin, Budi Prasetyo, Antonius. Efek
antiplasmodium dari ekstrak etilasetat kulit batang asam kandis (Garcinia parvifolia) secara in vitro. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 2007;5(2).
Lampiran 2. Skema pembuatan ekstrak daun asam kandis
Serbuk daun asam kandis (G. parfivolia. (Miq)Miq) ± 300 g
Dimaserasi selama ± 24 jam Dengan kloroform ± 2 liter, Saring, evaporasi
Ampas serbuk ekstrak kloroform kental ( 5, 95 g)
Dimaserasi selama ± 24 jam Dengan metanol ± 2 liter, Saring, evaporasi
Ampas serbuk ekstrak metanol Kental (7,02 g)
Lampiran 3. skema kerja pembuatan kultur P. falcifarum
Dibiakkan dalam kultur plate yang mengandung 4ml CCM
Kultur dilakukan didalam LAF dalam kondisi steril
Medium diganti dengan yang baru setiap 24 jam masa inkubasi didalam inkubator
pada temperatur 37°C
Kultur P. falciparum
Sel darah merah yang telah terinfeksi parasit
Lampiran 4. skema pengujian aktivitas antiplasmodium (metode mikroskopik)
12,5 µL ekstrak
12,5 µL RPMI 1640+ 100 µL kultur
Masukkan dalam sumuran mikrokultur Masing-masing dengan konsentrasi 4; 20; 100; 200; 400 µg/mL Inkubasi 48 jam Dipindahkan ke dalam tabung effendorf Sentrifugasi 10 menit Endapan supernatan Buat hapusan pada objek glass pewarna giemsa biarkan 15 menit siram dengan air keringkan dan tambahkan imersi dilihat dibawah mikroskop
Lampiran 5. skema pengujian aktivitas antiplasmodium (metode SYBR Green I)
12,5 µL ekstrak 12,5 µL RPMI 1640 +
100 µL kultur Masukkan dalam sumuran mikrokultur Masing-masing dengan konsentrasi 4; 20; 100; 200; 400 µg/mL Inkubasi 48 jam Dipindahkan ke dalam tabung effendorf Sentrifugasi 10 menit Endapan supernatan tambahkan 100 µL lysis buffer berisi SYBR Green inkubasi lempeng sumur mikro dalam kondisi gelap selama 1 jam baca pada alat fluorescence plate reader
Lampiran 6. Foto bahan uji antiplasmodium
Larutan uji ekstrak daun asam kandis Sediaan darah tebal pada objek glass dengan berbagai konsentrasi strain D6
Sediaan darah tebal pada objek glass Strain W2
Lampiran 8. Gambar grafik dari metode SYBR Green I D6 (IC50 :14,29)
Grafik hubungan konsentrasi dari ekstrak kloroform daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan linieritas fluoresensi pada strain D6
W2 (IC50 :0,214) Grafik hubungan konsentrasi dari ekstrak kloroform daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan linieritas fluoresensi pada strain W2
D6 (IC50 : 48,0) Grafik hubungan konsentrasi dari ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan linieritas fluoresensi pada strain D6
Transform of AK 2 (D6)
0 1 2 30
5000
10000
15000
20000
25000
Transform of AK 2 (W2)
0 1 2 30
10000
20000
30000
40000
Transform of AK 1 (D6)
0 1 2 30
10000
20000
30000
40000
W2 (IC50 : 56,37) Grafik hubungan konsentrasi dari ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan linieritas fluoresensi pada strain W2
D6 (IC50 : 25,62)
Grafik hubungan konsentrasi dari klorokuin dengan linearitas fluoresensi pada strain D6
W2 (IC50: 227,6) Grafik hubungan konsentrasi dari klorokuin dengan linieritas fluoresensi pada strain W2
Transform of AK 1 (W2)
0 1 2 30
10000
20000
30000
40000
T ransform of Data 1
0 1 2 3 40
10000
20000
30000
40000
50000
Transform of Data 2
0 1 2 3 40
10000
20000
30000
40000
Lampiran 9. Jumlah skizon hidup dalam seluruh jumlah stadium parasit dalam sel darah merah pada area pandang mikroskop
Ekstrak kloroform Konsentrasi
(µg/mL) strain D6 (sensitif)
Strain W2 (resisten)
I II I II
4 72 229 65 269 71 383 71 319 31,44 24,16 18,54 22,26
20 20 215 51 331 16 230 7 249 9,30 15,41 6,96 2,81
100 12 204 9 204 8 223 4 214 5,88 4,41 3,59 1,87
200 5 216 4 202 5 248 7 216 2,32 0,44 2,02 3,24
400 2 220 1 219 2 230 3 204 0,91 0,45 0,86 1,47
Ekstrak Metanol Konsentrasi
(µg/mL) strain D6 (sensitif)
strain W2 (resisten)
I II I II
4 37 329 63 284 47 350 59 371 11,25 22,18 13,43 15,90
20 34 314 89 371 59 343 49 280 10,83 23,99 17,20 17,50
100 9 280 7 287 30 342 10 265 3,21 2,44 8,77 3,77
200 3 279 3 202 4 265 4 254 1,08 1,49 1,51 1,57
400 1 278 1 242 4 238 3 271 0,36 0,41 1,68 1,11
Contoh perhitungan:
Jumlah skizon hidup dalam seluruh sel darah merah dalam area pandang
mikroskopik pada ekstrak kloroform strain D6 konsentrasi 4 µg/mL :
72 x 100 % = 31,44 % 229
72 : jumlah skizon
229 : jumlah ring, tropozoit dan skizon
Contoh perhitungan diatas sama dengan perhitungan ekstrak kloroform dan ekstrak
metanol pada tiap-tiap konsentrasi dan tiap strain.
Kontrol positif Klorokuin Konsentrasi
(ng/mL) strain D6 (sensitif)
Strain W2 (resisten)
I II I II
6,25 68 374 109 443 12 386 42 621 18,18 23,74 3,11 6,76
12,5 91 449 55 374 16 489 25 687 20,27 14,71 3,27 3,64
25 18 264 29 297 50 640 40 647
6,82 9,76 7,81 6,18 50 11 222 2 213 23 678 18 685
4,95 0,94 3,25 2,63 100 1 212 1 218 21 728 27 639
0,47 0,46 2,88 4,26 200 0 206 2 213 23 696 15 656
0 0,94 3,30 2,28 400 2 201 2 222 19 231 4 208
0,99 0,90 8,22 1,92 800 1 201 7 235 6 211 6 206
0,49 2,98 2,84 2,91 1600 0 222 1 203 4 220 3 200
0 0,49 1,81 1,50 Contoh perhitungan:
Jumlah skizon hidup dalam seluruh sel darah merah dalam area pandang
mikroskopik pada klorokuin strain D6 konsentrasi 6,25 ng/mL :
68 x 100 % = 18,18 % 374
68 : jumlah skizon
374 : jumlah ring, tropozoit dan skizon.
Contoh perhitungan diatas sama dengan perhitungan klorokuin pada tiap-tiap
konsentrasi dan tiap strain.
Lampiran 10. Tabel Probit (23)
Persentase
Probit
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 - 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66
10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12
20 4.16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,38 4,39 4,42 4,45
30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72
40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97
50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23
60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50
70 5,52 5,55 5’58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81
80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,06 6,13 6,18 6,23
90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33
99
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
7,33 7,37 7,41 7,48 7,51 7,58 7,66 7,75 7,88 8,09
top related