2º Congreso Nacional de Química Médica Sabanero y col.

ALTERACIÓN DEL CITOESQUELETO Y LA ADHESION CELULAR, POR POTENCIALES

ANTINEOPLASICOS. Myrna Sabanero*, Jesús J. Martin Polo*, Gloria Barbosa Sabanero**, Eva Soriano Bello***, ****Rosa L. Santillan y ****Norberto Farfan. Instituto de Biología Experimental, Facultad de Química, *Instituto de Investigaciones Médicas, Universidad de Guanajuato, **Instituto de Investigaciones Químico Biológicas UMSNH, Dpto. Química del CINVESTAV, Facultad de Química, UNAM. myrna@quijote.ugto.mx

RESUMEN

La respuesta de las células a sus interacciones de adhesión con otras células y la matriz extracelular, incluyen cambios en la proliferación celular, motilidad y la diferenciación. Este trabajo, examina la potencial actividad antineoplásica de nuevos compuestos sintéticos con núcleos de Estaño (NFSn12-16) y Boro (NFB1-6). Se analiza el efecto sobre la adhesión celular y las estructuras del citoesqueleto. Se utilizaron células de fibroblastoma y el antineoplásico Vinblastina para comparar la actividad de los compuestos sintéticos. Además se contrasta con la acción de los Isoflavonoides: Genisteína y Daidzeína, metabolitos secundarios de las plantas asociados a la protección, sobre todo preventiva contra el crecimiento de células cancerosas. Los resultados indican que los compuestos sintéticos con núcleo de Estaño son más activos, presentan una actividad similar a la de la Vinblastina, afectando la adhesión celular y la integridad del citoesqueleto. Consecuentemente, se inhibe la proliferación celular. Sin embargo, otros experimentos son necesarios. Además, desconocemos si el efecto esta asociado con características de apoptosis.

Palabras clave: Adhesión, Citoesqueleto, Neoplasias.

INTRODUCCION

Como todas las patologías, la transformación de una célula sana a una célula neoplásica se debe a numerosos factores, algunos ya conocidos y otros inciertos. Algunos de los factores de riesgo son de origen químico, radioactividad, virus, hábitos de alimentación, hábitos sociales (tabaquismo y alcoholismo), entre otros. Entre los hispanos adultos, el cáncer es la segunda causa principal de muerte, después de las enfermedades del corazón. Los cánceres más comúnmente diagnosticados entre los hombres hispanos son el de la próstata, colon, recto y pulmón; y entre las mujeres hispanas es el cáncer del seno, colon, recto y pulmón. (Martin & Jackson. 2005).Alguno de los tratamientos contra el cáncer, es el uso de los fitoestrógenos y el uso de la vinblastina, como medicamento patentado.

Los fitoestrógenos son metabolitos secundarios de origen vegetal de estructura no esteroídica, con agrupaciones fenólicas, presentes en distintas especies vegetales (soja, trébol rojo, diversas legumbres, cereales, etc.). De entre los distintos tipos de fitoestrógenos destacan las isoflavonas, en particular la genisteína y la daidzeína (Boik J. 2001). El interés en estos compuestos deriva de sus efectos, consecuentes en gran medida tanto de su interacción con los receptores estrogénicos (especialmente con el receptor β), como de su actuación como inhibidores enzimáticos y antioxidantes. Estos

2º Congreso Nacional de Química Médica Sabanero y col.

efectos estarían en relación sobre un posible papel en la terapéutica o profilaxis de los procesos cancerosos.

Vinblastina

La vinblastina es uno de los alcaloides naturales antitumorales más utilizados como antineoplásico, ejerce sus efectos citotóxicos interfiriendo con los microtúbulos que intervienen en varias funciones celulares, entre las que destacan la formación del huso mitótico. Los puntos de fijación de los alcaloides de la vinca en las subunidades de tubulina son diferentes de los que utilizan la colchicina y los taxanos.

La mayoría de los compuestos mencionados para combatir la enfermedad neoplásica son muy agresivos, tanto para las células cancerosas como para el paciente en general, se busca encontrar compuestos que sean efectivos en el tratamiento de las neoplasias, que sean selectivos y que por consiguiente tengan pocos efectos secundarios sobre el paciente, por ello es necesario analizar otras alternativas de anti-neoplásicos, en este aspecto se han sintetizado algunos compuestos organometálicos, que por su configuración molecular pueden combatir las neoplasias, esperando que las alteraciones a las células sanas sean menores que las reportadas al utilizar los clásicos fármacos anti-neoplásicos que actualmente son utilizados. Se hipotetiza que moléculas organometálicas sintéticas, con núcleo de estaño y boro, por la conformación de su estructura molecular son capaces de inhibir el crecimiento de las células cancerosas.

Por lo anterior el objetivo de la presente investigación fue examinar, la actividad

anti-neoplásica de moléculas organometálicas sintéticas sobre células transformadas.

La estrategia experimental utilizada fue: I.- La preparación de los compuestos de estaño se realizó por reacción del metoxisalidaldehído y el aminoácido respectivo (glicina, valina, tirosina, leucina y fenilglicina) en presencia de un equivalente del oxido de dibutiestaño, de acuerdo con el esquema siguiente, la reacción procede con buen rendimiento y los compuestos fueron caracterizados por RMN, IR y espectrometría de masas.

H3CO

OH

O

OHH2N

OR nBu2SnO

OSn

N

O

R

O

R=H, R= CH(CH3)2R=CH2-p-C6H4OHR= CH2CH(CH3)2

R=C6H5

Los boratos se realizaron por reacción del salisaldehído y el aminoácido respectivo (alanita, metionina, glicina, tirosina) para dar la imina la cual fue reducida con boro hidruro de sodio para dar el ligante tridentado el cual se hizo reaccionar con el derivado fenilborrónico, 2,4-diflurofenilborónico, y el 4 metoxifenilborónico, para dar los boratos los cuales fueron caracterizados por métodos espectroscópicos (Beltrán H.I., L.S. Zamudio-Rivera, T. Mancilla, R. Santillan, N. Farfán, J. Organomet. Chem. 657: 194, 2002).

2º Congreso Nacional de Química Médica Sabanero y col.

OH

O

OHH2N

OR

OH

NH

HO

R

O

R=HR=CH3

R= CH2CH2SCH3

R=CH2-p-C6H4OHB(OH)2

R1

R2

O

N

O

R

O

B

R1

R2

R1=F R2=FR1=H R2=HR1=H R2=OCH3

NaBH4

II.- Analizar en las células transformadas si la actividad de las moléculas es concentración y tiempo dependiente, para ello se cultivaron células de fibroblastoma de la línea L929 en medio D-MEM (Dulbecco´s Modified tagle Médium, GIBCO) enriquecido con el 10% de suero bovino fetal bajo una tensión de 5% de CO2 a 37º. Después de 72 horas de crecimiento, las células se expusieron durante 1hr a las moléculas organometálicas con núcleo de Boro y Estaño: 100µg/mll, Genistein y Daidzein: 10 µg/ml y Vinblastina 10 µg/ml durante 15min. Se tuvieron además controles, así como exposición de las células a H2O2.

III.- En las células expuestas a las moléculas organometálicas se analizó la actividad de los compuestos sobre la adhesión celular como ha sido descrito por Lezama y col. Además se analizó su actividad sobre la integridad de los núcleos aplicando la sonda fluorescente DAPI. Y la distribución de los micotúbulos, mediante ensayos de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos monoclonales anti-beta-tubulina (Sigma T4026) y anticuerpos secundarios FITC-GOAT-Anti-Mouse IgG (Zymed 50393310). Las preparaciones se analizaron en el microscopio de epifluorescencia Nikon HFX-II.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN I.- Ensayos de adhesión. La actividad de las drogas fue cuantificada por su acción sobre la adhesión celular: Como se muestra en la gráfica 1, a menor actividad de la droga mayor adhesión; es evidente que los compuestos organometálicos de Estaño (NFSn) son los que muestran mayor actividad con respecto a los organometálicos de boro (NFB). Es evidente la actividad de los flavonoides Genisteína y Daidzeína; en la literatura los describen como efectivos para prevenir la proliferación de líneas celulares cancerosas además de ser efectivos en roedores para inhibir la progresión de cánceres establecidos (Alhasan y cols. 2000) En este sentido los compuestos organometálicos de estaño debido a la actividad que presentan pueden ser potenciales antineoplásicos.

2º Congreso Nacional de Química Médica Sabanero y col.

II.- Análisis de la actividad de los compuestos organometálicos de Boro y Estaño

examinando la acción sobre los microtúbulos, núcleos y la integridad del epitelio. Como se muestra en la figura 1, los compuestos de Boro no muestran alteración; en cambio los de estaño si presentan cambios en las distribución de microtúbulos y en el núcleo.

% A d h e s i ó n

10 0 , 0 0 %

7 , 9 8 %

4 7 , 3 0 %

2 9 , 8 9 %

8 0 , 8 3 %

5 4 , 5 6 %

2 5 ,5 2 %

8 , 0 0 %

0 , 0 0 % 0 ,0 0 %

8 , 3 2 %

0 , 0 0 %

5 6 , 5 9 %

15 , 16 %

3 4 ,9 1%

11, 6 9 %

Contr ol NFB1 NFB2 NFB3 NFB4 NFB5 NFB6 NFSn12 NFSn13 NFSn14 NFSn15 NFSn16 Vb Gen Daz H2O2

Grafica 1.- Actividad de los compuestos sobre la adhesión de las células tumorales

Figura 1.- Distribución de microtúbulos (A, B y C) y núcleos (A´, B´ y C´) en células control (A y A´) y expuestas a los organometálicos de Boro – 2 (B y B´) y de Estaño - 13 (C y C´)

CA B C

A B C

2º Congreso Nacional de Química Médica Sabanero y col.

Como se muestra en las figuras 2 y 3, existen alteraciones por los compuestos de Boro, aunque no son tan dramáticas como la que presenta vinblastina; no obstante, los resultados indican que los compuestos presentan una actividad antineoplásica. Otros experimentos son necesarios para explorar a nivel bioquímico los blancos de estos potenciales antineoplásicos, además desconocemos si el efecto está asociado con características de apoptosis.

Bibliografía Alhasan SA, Ensley JF, Sarkar FH. 2000 Genistein induced molecular changes in a squamous cell carcinoma of the head and neck cell line. Int J Oncol. 16(2):333-338. Animal Cell Culture Methods, Volume 57, (1998) J. Mather and D. Barnes, eds. Methods in Cell Biology Boik J. 2001. Natural Compounds in Cancer Therapy. Oregon Medical Press LLC.Princeton, Minn. pp245-259. Lezama y col. (2001), “Over-Expression of β Tubulin in MDCK Cells and Incorporation of Exogenous β Tubulin into Microtubules Interferes with Adhesion and Spreading”, Cell Motility and the Cytoskeleton; 50: 147-160 Martin R.K. and Jackson T.R. (2005) Centaurin β4 in Cancer. Biochemical Society Transactions 33:1282 -1284.

Figura 2.- Epitelio expuesto a los compuesto de Boro-2 (B), Boro – 3, (C) Boro - 4 (D)

Figura 3.- Epitelios control (A) y expuestos a Daidzeína (B) y Vinblastina (C)

D

B A

C A

B

C