Séminaire de formation continue

Service d’immunologie et allergie

Allergologie

moléculaire: ISAC

jeudi 29.11.2012

Il était une fois …

Les allergènes utilisés pour le diagnostic et

l’immunothérapie représentent des mélanges

mal définis de composés allergiques et non

allergiques

Test cutané faussement positif avec un extrait

commercialisé de poils de chien contaminé par

l’acarien des maisons (D. pter.) Van der Veen MJ et al. JACI 98, 1028-34, 1996

Allergène natif :

provient de la source d’allergènes qui a

été purifiée et dans laquelle les

différentes protéines ont été séparées

Allergène recombinant :

séquence d’acides aminés clonés sur des

bactéries (Escherichia Coli) ou des

levures (Pichia Pastoris)

Chapman MD et al. J Allergy Clin Immunol 2000;106:409-18. Nowak-Wegrzyn A. Immunol Allergy Clin North Am 2007;27:105-27 Pokoj S et al. Protein Expr Purif 2009

Définitions

• spécifique

• à réactivités croisées

• de stabilités différentes

• en quantités différentes

Les composants moléculaires sont des protéines

Oeuf Gal d 1

Fléole Phl p 1

Bouleau Bet v 1

Arachide Ara h 2

Abeille Api m 1

Composants spécifiques - Indiques une vraie sensibilisation

Gal d 1 = Gallus domesticus, allergène # 1

Familles de Composants

PR-10 Protéine

Bet v 1 (Bouleau)

Pru p 1 (Pêche)

Ara h 8 (Arachide)

Gly m 4 (Soja)

Api g 1.01 (Céleri)

Cor a 1 (Noisette)

LTPs

Pru p 3 (Pêche)

Par j 2 (Pariétaire)

Cor a 8 (Noisette)

Ara h 9 (Arachide)

Profilines

Bet v 2 (Bouleau)

Pru p 4 (Pêche)

Phl p 12 (Phléole)

Hev b 8 (Latex)

Tropomyosine

Pen a 1 (Crevette)

Der p 10 (Acariens)

Protéines de stockage

Ara h 1 (Arachide)

Gly m 6(Soja)

L’allergie moléculaire aide à

• Etablir un profil de sensibilisation

• Évaluer le risque clinique de réaction

• Expliquer les symptômes dus aux réactions croisées

• Identifier correctement les patients candidats à une immunothérapie spécifique

Profil de sensibilisation

Asarnoj, A. et al. Allergy 2010: 65; 1189

Ara h1: 7S albumine, viciline

Ara h2: 2S albumine, conglutine

Ara h3: 11S globuline, glycinine

Ara h5: profiline

Ara h6: homologue à Ara h2, réaction croisée

Ara h8: Bet v1 homologue

Ara h9: LTP croise avec LTP de pêche

Représentés dans bcp de graines et noix

peu de réactions croisées

Réactions croisées

Une similarité de structure entre les allergènes d‘inhalation et les allergènes

alimentaires provoque la formation d‘anticorps à réactions croisées

Source: Kopp J, Schwede T (2004). The SWISS-MODEL Repository of annotated three-dimensional protein structure homology models. Nucleic Acids Research 32, D230-D234.

Allergène majeur mal d 1 (Pomme) Allergène majeur Bet v 1 (Bouleau)

Allergie alimentaire associée au pollen de bouleau (SAO)

La protéine PR10 du bouleau à été identifiée comme allergène majeur et présente une similarité de structure

avec les PR-10 de nombreux aliments d‘origine végétale. ( Bet v 1 homologue)

Symptômes printaniers

(Mars/Avril)

Symptômes pré-été

(Mai/Juin)

Allergène majeur:

Bet v1 (t215)

Allergènes mineurs:

Bet v2, Bet v4 (t221)

Bet v1 : positif

Bet v2, 4: négatif

Bet v1 : positif

Bet v2, 4: positif

Bet v1 : négatif

Bet v2, 4: pos / nég

Phl p1, 5b : positif

Phl p7, 12: négatif

Pas de SIT

Tester d’autres pollens d’arbre

p.expl. le frêne nOle e1 (t224)

Allergènes majeurs:

Phl p1, Phl p5 (g213)

Allergènes mineurs:

Phl p7, Phl p12 (g214)

Pas de SIT

Rechercher d’autres sources de

sensibilisation

Phl p1, 5b : positif

Phl p7, 12: positif

Phl p1, 5b : négatif

Phl p7, 12: pos / nég

Indication à une SIT ? Indication à une SIT ?

Bonne

Moyenne

Faible

Bonne

Moyenne

Faible

Adapté selon P. Schmid-Grendelmeier

Réalisation de l’ISAC

Rapport

• Méthode semi-quantitative

• Résultats en unités arbitraires ISU

• Résultats présentés en 4 classes: 0 (non-détectable/très faible) < 0.3 1 (faible) ≥ 0.3 - < 1 2 (moyen à élevé) ≥ 1 - < 15 3 (très élevé) ≥ 15

Caractéristiques techniques

Plant Food Moyenne Ecart-Type CV (%) Tree pollen Moyenne Ecart-Type CV (%)

nAct d2 1.47 0.82 55.83 rBet v1 98.83 29.24 29.58

rBer e1 5.23 5.06 96.79 rAln g1 51.67 17.65 34.16

nCor a9 3.48 1.89 54.14 rCor a1.0101 19.31 8.41 43.54

nSes i1 0.47 0.65 137.76 nOle e1 1.35 1.04 77.07

nAra h1 18.83 12.97 68.85 nPla a2 2.45 1.87 76.30

nAra h2 40.78 18.95 46.48 nCry j1 9.27 4.65 50.19

nAra h3 24.21 16.92 69.87 nCup a1 13.22 6.50 49.15

nGly m6 4.08 2.05 50.35

nTri a18 0.62 0.37 60.74

PR-10 protein Moyenne Ecart-Type CV (%) CCD Moyenne Ecart-Type CV (%)

rMal d1 45.06 14.49 32.17 nAna c2 1.47 0.73 49.47

rPru p1 28.39 13.09 46.12 Tropomyosin

rGly m4 22.00 9.05 41.13 rPen a1 10.33 4.33 41.96

rAra h8 22.79 9.89 43.40 nPen i1 13.28 5.04 37.91

rApi g1 8.48 3.45 40.70 nPen m1 17.18 6.55 38.11

LTP rDep p10 23.22 8.03 34.56

nPru p3 3.05 2.33 76.36 nBla g7 19.77 7.30 36.91

nArt v3 4.96 4.02 81.18 rAni s3 12.77 4.10 32.11

Profilin Serum albumin

rBet v2 12.51 4.08 32.64 nBos d6 4.77 4.90 102.70

nOle e2 9.43 5.00 53.02 nFel d2 125.56 40.73 32.44

rHev b8 14.44 4.01 27.77 nCan f3 101.17 34.60 34.20

rMer a1 16.81 5.35 31.84

rPhl p12 4.34 1.84 42.50

Inter-essais (n=18)

Caractérisitiques techniques ImmunoCAP

• Echelle macroscopique (μg allergène/CAP)

• CV < 15%

• Résultat fourni par méthode quantitative

• Méthode automatisée

• 40 μL de sérum / test

+ 150μL volume mort !

• Haute capacité totale de fixation

• Peu de fixation non-spécifique

• Haute sensibilité => de très faibles quantités

d’IgE peuvent être identifiées.

• 1 test , 1 résultat pour 1 composé

ISAC

• Echelle microscopique (100 picog.

allergène/spot et >100 allergène/cm2)

• CV < 25% au-delà de 1 ISU

• Résultat semi-quantitatif

• Méthode manuelle

• 30μL de sérum = >112 résultats

• Haute capacité totale de fixation

• Peu de fixation non-spécifique

• Bonne sensibilité

• Haute spécificité

• Fournit le profil de sensibilisation du patient

Comparaison Cap vs ISAC

Gadisseur R. et al Clin. Chem. Lab. Med. 2011,49(2)277-80.

• Méthode :

• Comparaison de résultats d’IgEs pour composants allergéniques (ImmunoCAP versus ISAC).

• Sélection de 86 séra de patients (26M/60F)

555 déterminations d’IgE sp dosés par UniCAP (recombinant) avec ISAC.

• Résultats:

• 302/384 résultats positifs (>0,10kUA/L) en UniCAP étaient également

positifs en ISAC (concordance 78,7%),

» Si cut-off de 0,35 kUA/L, concordance 92,2%.

• 160/171 negative results were also found negative with ISAC

(concordance 93,6%),

– 11 discrepant results : mean 1,57 ISU.

Manque de sensibilité en ISAC pour certains allergènes en particulier

(rAsp f 1, rPru p 3, nAna c 2, rApi g 1…)

Allergie au lait

Sokolova, A. et al. (2009) Rev Port Imunoalergologia 17(4):325-42

Groupe 1 (n= 17)

CMPA+

Groupe 2 (n=20)

Tolerant, OTC –

Groupe ctrl (n=4)

Atopique CPMA-

Sensibilité ISAC 100% / CAP 100% Spécificité ISAC 90.2% / CAP 37.5%

ISAC … pour quel patient ?

Patient «problématique» Anamnèse et symptômes pas

clairs

Anaphylaxie idiopathique

Pas de réponse au traitement

Patient polysensibilisé SPT difficile

Nombreux résultats ImmunoCAP

Recherche de sensibilisations

principales versus de réactions croisées

Evaluation du risque

Take home message Les extraits allergéniques disponibles pour le diagnostic in-vitro des allergies

sont préparés à partir de matériel biologique

• Ils contiennent des protéines allergéniques et non-allergéniques

• Leur contenu en allergène majeur/mineur n’est pas toujours bien standardisé...

>130 allergènes naturels purifiés ou recombinants sont disponibles pour le diagnostic des allergies.

• Dosages unitaires traditionnels

• Multiplex

Les composants allergéniques, nombreuses utilités

• ITS, décrire les réactions croisées, prédire la sévérité des allergies...

Le test ISAC est moins sensible que le test UniCAP

ISAC : Utile en pédiatrie