1

EFFECT OF KAWISTA FRUIT PULP (Limonia acidissima L.) ON REDUCING CIRCULATING

ENDOTHELIAL CELLS (CECs) IN RAT INDUCED BY TYPE 2 DIABETES MELLITUS

Alfiani Rosyida Arisanti 1, Yoyon Arif Martino

2, Erna Sulistyowati

2

1Undergraduate Student of Faculty of Medicine, Islamic University of Malang

2Academic Staff of Faculty of Medicine, Islamic University of Malang

ABSTRACT

Introduction Cardiovascular disease is the most common cause of morbidity and mortality in type 2

diabetes mellitus as a result of vascular endothelial cell dysfunction. Hyperglycemic condition in diabetes

is generating reactive oxygen spescies (ROS) and makes vascular oxidative stress happened. It causes

endothelial cell detached. We identify it as increasing circulating endothelial cells (CECs). Kawista fruit

pulp (Limonia acidissima L.) contains flavonoid, glycosides, saponins, tannins, coumarins, tyramine-

derivates, vitamin C and vitamin A. Its function arepotentially as antioxidant and antidiabetic. The aim of

this study are determining the effectivity of Kawista fruit pulp on lowering CECs on rats induced by type

2 diabetes mellitus.

Method Experimental laboratory post-test only group design. The subject of this study was 30 wistar

strain rats which was divided into 5 groups. Negative control group (K0) were given 2 ml of aquades,

positive control (K1) istype 2 diabetes mellitus group (induced by high-fat diet (HFD) and injection of

streptozotocin (STZ)). Treatment groups (P1, P2, and P3) are induced by type 2 diabetes mellitus and

Kawista fruit pulp (each are 150, 300, 600 mg/kgBW a day). The CECs was analysed by flow cytometry.

The Statistical method used one-way ANOVA test and followed by Tukey's test. Significant at p<0.05.

Result The all treatment groups significantly made less number of CECs (p 0.000). Those all doses of

kawista fruit pulp were letting down the number of CECs. The highest dose (600 mg/kgBW) is the most

potential on reducing number of CECs compared to another doses ( 300 and 150 mg/kgBW a day).

Conclusion Kawista fruit pulp could reduce the number of CECs. It means that its has potential effect on

antioxidant especially on improving endothelial cells function.

Keywords Circulating endothelial cells, Limonia acidissima L., type 2 diabetes mellitus model rats.

E-mail: alfiani.arisanti12@gmail.com.

2

EFEK DAGING BUAH KAWISTA (Limonia acidissima L.) TERHADAP

PENURUNAN JUMLAH CIRCULATING ENDOTHELIAL CELLS (CECs)

PADA TIKUS MODEL DIABETES MELITUS TIPE 2

Alfiani Rosyida Arisanti, *, Yoyon Arif Martino, **, Erna Sulistyowati, **

*Mahasiswa Fakultas Kedokteran, Universitas Islam Malang

**Staf Pengajar Fakultas Kedokteran, Universitas Islam Malang

E-mail: alfiani.arisanti12@gmail.com.

ABSTRAK

Pendahuluan Penyakit kardiovaskuler merupakan penyebab kematian dan kesakitan paling umum pada

kondisi diabetes khususnya diabetes melitus tipe 2 (DMT-2) sebagai akibat dari disfungsi sel endotel

pembuluh darah. Kondisi hiperglikemi pada diabetes dapat menyebabkan peningkatan produksi senyawa

reactive oxygen spescies (ROS) sehingga terjadi stres oksidatif pada pembuluh darah dan peningkatan

pelepasan sel endotel menjadi circulating endothelial cells (CECs). Buah kawista (Limonia acidissima L.)

mengandung komponen flavonoid, glikosida, saponin, tanin, kumarin, derifat tiramin, serta vitamin C dan

A yang berpotensi sebagai antioksidan dan antidiabetik. Tujuan penelitian ini adalah membuktikan bahwa

pemberian daging buah kawista dapat menurunkan jumlah CECs tikus model DMT-2.

Metode Metode penelitian ini adalah eksperimental control group post test only, menggunakan 30 ekor

tikus wistar yang terbagi dalam 5 kelompok. Kelompok kontrol negatif (K0) yaitu tikus normal yang

diberi aquades 2 ml, kontrol positif (K1) yaitu tikus model DMT-2 (induksi diet tinggi lemak (HFD) dan

injeksi Streptozotocin (STZ)) yang diberi aquades 2 ml, serta kelompok perlakuan (P1, P2, dan P3) yaitu

tikus model DMT-2 yang diberi daging buah kawista dengan dosis berturut-turut 150, 300, 600

mg/kgBB/hari. Pemeriksaan CECs dengan metode flow cytometry. Analisa data menggunakan uji one

way ANOVA dan dilanjutkan uji Tukey 5%. Dikatakan bermakna apabila signifikansi atau p<0,05.

Hasil Seluruh dosis daging buah kawista pada kelompok perlakuan mampu menurunkan jumlah CECs

secara signifikan. Dosis 600 mg/kgBB/hari lebih potensial dalam menurunkan jumlah CECs dibanding

kedua dosis yang lain.

Kesimpulan Pemberian daging buah kawista dapat menurunkan jumlah CECs. Hal ini berarti bahwa

daging buah kawista dapat berfungsi sebagai antioksidan yang memperbaiki fungsi sel endotel.

Kata Kunci Circulating endothelial cells, tikus model diabetes melitus tipe 2, Limonia acidissima L..

PENDAHULUAN

Penderita Diabetes Melitus (DM) di dunia

setiap tahun terus bertambah, demikian pula

jumlah penderita di Indonesia pada tahun 2005

tercatat oleh World Health Organization (WHO)

menduduki peringkat keempat terbanyak di

dunia. World Health Organization memprediksi

kenaikan jumlah pasien DM di Indonesia dari 8,4

juta di tahun 2000 menjadi + 21,3 juta di tahun

2030. 1 Kementerian Kesehatan Indonesia

menyebutkan bahwa jumlah pasien DM rawat

inap dan rawat jalan di rumah sakit menempati

urutan pertama dari seluruh penyakit endokrin. 2

Seluruh kasus DM, + 90% kasus merupakan

DMT-2. 3

Pada kondisi DM, penyebab kematian

dan kesakitan utama adalah penyakit

kardiovaskuler. Tahun 2008, sedikitnya 17,3 juta

jiwa atau 30% kematian di seluruh dunia

disebabkan oleh penyakit kardiovaskuler yang

diawali dengan disfungsi endotel. 1,4

Disfungsi

endotel pada DMT-2 bersifat multifaktorial yang

melibatkan interaksi kompleks berbagai keadaan

seperti hiperglikemia, hiperlipidemia, stress

oksidatif, penuaan dini, hiperinsulinemia serta

perubahan dalam proses koagulasi dan

fibrinolisis. 5,6

Diabetes Melitus Tipe 2 (DM non-insulin

dependent) adalah bentuk umum DM yang

memiliki karakter kombinasi resistensi insulin

perifer dan sekresi insulin yang tidak adekuat

olehsel β pankreas. Resistensi insulin dapat

diinduksi oleh diet tinggi kalori serta dikaitkan

dengan peningkatan kadar asam lemak bebas dan

sitokin proinflamasi di plasma, sehingga

menyebabkan transpor glukosa ke dalam sel otot

menurun serta peningkatan produksi glukosa

hepar dan pemecahan lemak. 7,8

Kondisi DMT-2

dapat berkembang dengan komplikasi penyakit

kardiovaskular akibat disfungsi sel endotel

pembuluh darah yang akan mengganggu fungsi

organ lain. 9 Kondisi hiperglikemi khususnya

pada kondisi DMT-2 dapat menyebabkan

peningkatan produksi senyawa reactive oxygen

spescies (ROS) dari berbagai jaringan akibat

proses autooksidasi glukosa dan glikosilasi

protein. 10

Peningkatan ROS menyebabkan stres

3

oksidatif yang mengakibatkan kerusakan sel

jaringan khususnya sel endotel pembuluh darah

sehingga meningkatkan pelepasan (detachment)

sel endotel dari tunika intima menuju sirkulasi

dan menjadi sel endotel sirkulasi (CECs). 11

Banyak kendala dalam terapi DMT-2 dan

komplikasinya, yaitu harga obat yang mahal,

efektifitas rendah, dan efek samping yang cukup

banyak. Saat ini mulai dicari obat-obatan dengan

pemanfaatan bahan alami tumbuhan. Tanaman

herbal dirasa lebih efektif karena tubuh manusia

relatif lebih mudah menerima obat dari bahan

tumbuhan dibanding obat-obatan kimia. 12

Salah

satu tanaman herbal yang berpotensi sebagai

antioksidan dan antidiabetes adalah kawista

(Limonia acidissima L.). Tanaman famili

Rutaceae ini banyak tersebar di negara tropis dan

subtropis diantaranya India, China, dan

Indonesia. Dagingnya mengandung komponen

fenolik (glikosida fenolik dan fenolik ester). 13

Studi yang dilakukan oleh Ilango (2009),

membuktikan bahwa buah kawista mengandung

komponen flavonoid, glikosida, saponin, tanin,

kumarin, derifat tiramin, serta vitamin C dan

vitamin A yang berpotensi sebagai antioksidan

dan antidiabetik.14

Berlatar belakang studi tersebut, penelitian

ini diharapkan dapat membuktikan bahwa buah

kawista sebagai antidiabetik dan antioksidan

dapat mengurangi kerusakan pembuluh darah

yang ditandai dengan penurunan jumlah CECs

pada kondisi DMT-2.

METODE PENELITIAN

Prosedur Penelitan

Penelitian ini memakai metode eksperimental

laboratorik secara in vivo dan menggunakan

desain penelitian control group post test only.

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium

Kimia Universitas Muhammadiyah Malang pada

bulan Maret - Juni 2013, dengan lama penelitian

selama empat bulan.

Hewan coba penelitian ini adalah tikus wistar

(Rattus novergicus) jantan, usia +2,5 bulan, berat

badan + 150 gram, biakan lokal, dan berjumlah

30 ekor dengan kondisi sehat (ditandai dengan

gerakan aktif, berbulu halus, dan matanya

berwarna merah jernih). Hewan coba diperoleh

dari Laboratorium Kimia Universitas

Muhammadiyah Malang dan telah disertifikasi

dokter hewan dengan nomor 159/LK-B/V/2013.

Tikus diadaptasikan di laboratorium selama 7

hari serta diberi makan dan minum sesuai standar

laboratorium. Setelah masa adaptasi, dilakukan

penimbangan berat badan tikus yang dianggap

sebagai berat badan prakondisi. Penimbangan

berat badan dilakukan setiap minggu selama

penelitian. Setelah adaptasi, hewan coba dipilih

secara acak (random sampling) dan

dikelompokkan menjadi 5 kelompok, dengan

jumlah sampel tiap kelompok sebanyak 6 ekor.

Pada 30 hari pertama, kelompok kontrol negatif

(K0) diberi diet normal dan 30 hari selanjutnya

diberi aquades 2 ml (tikus normal). Pada

kelompok kontrol positif (K1) dan kelompok

perlakuan (P1, P2, dan P3), tikus dibuat menjadi

model DMT-2 dengan cara induksi diet tinggi

lemak (HFD) selama 30 hari pertama dan injeksi

intraperitoneum Streptozotocin (STZ) single dose

sebanyak 50 mg/kgBB pada hari ke-15. Pada 30

hari berikutnya, seluruh tikus diberi diet normal

serta pada kelompok K1 diberi aquades 2 ml

danpada kelompok P1, P2, dan P3 diberikan

daging buah kawista dengan dosis masing-

masing 150, 300, 600 mg/kgBB/hari selama 30

hari secara oral (per sonde lambung). Pada akhir

penelitian, dilakukan pembunuhan hewan coba.

Tikus diambil berdasarkan urutan kelompok

kemudian dibius dengan cara dimasukkan ke

dalam toples yang telah diberi kapas dan eter.

Kemudian tikus dibedah secara vertikal

mengikuti garis tengah (linea mediana) dari

abdomen menuju ke thorak dengan gunting,

sampai seluruh abdomen dan thorak terbuka.

Darah diambil dari aorta atau jantung tikus

dengan spuit, kemudian disimpan dalam tabung

yang berisi EDTA-antikoagulan dan dilakukan

pemeriksaan marker CECs.

Penelitian ini telah memenuhi syarat atau laik

etik dan mendapatkan surat keterangan kelaikan

etik dengan nomor 088/EC/KEPK-S1/02/2013.

Pembuatan Tikus Model DMT-2 Melalui

Induksi HFD dan Injeksi STZ Dosis Rendah

Tikus model DMT-2 adalah tikus dengan

induksi HFD dan injeksi STZ dosis rendah.

Metode ini didasarkan pada penelitian yang telah

dilakukan oleh Reed MJ dkk. pada tahun 2000

dan penelitian oleh Fadlina CS pada tahun 2007.

Pembuatan HFD sebanyak 30 gram/ekor

dengan komposisi BR1= 59,45% (17,84 gram),

tepung terigu= 10% (3 gram), asam kolat=

0.05% (0,015 gram), kolesterol= 0,5% (0,15

gram), lemak sapi= 10% (3 gram), minyak

kelapa= 10% (3 gram), kuning telur= 10% (3

gram), diberikan setiap hari selama 30 hari. 21,22

Injeksi STZ dosis rendah adalah injeksi STZ

single dose,50 mg/kgBB intraperitoneum, pada

hari ke-15. Pembuatan larutan STZ dengan cara

melarutkan STZ ke dalam buffer sitrat pH 4,5

dan di vortex hingga homogen, stok larutan

disimpan pada suhu 4°C. 21

Setelah itu,

dilanjutkan dengan pemberian HFD selama 15

hari berikutnya.

4

Sediaan Daging Buah Kawista Buah kawista (Limonia aciddicima L.)

diperoleh dari UPT. Balai Konservasi Tumbuhan

Kebun Raya Purwodadi - LIPI, Pasuruan, Jawa

Timur dan telah disertifikasi dengan nomor

0563/IPH.3.04/HM/IV/2013.

Buah kawista sebanyak 4 kg disortir terlebih

dahulu. Buah busuk, terlalu matang, atau

ketidaknormalan lain harus dipisahkan untuk

menjaga kandungan buahnya. Tersisa 2 kg buah

yang memenuhi syarat, kemudian buah dicuci

sampai bersih. Setelah itu diambil satu buah

kawista dengan berat ± 0,25kg. Daging buahnya

dipisahkan dari bijinya menggunakan saringan,

kemudian diambil dagingnya dengan sendok

sebanyak 10 gram. Selanjutnya ditimbang

dengan dosis per ekor tikus yaitu 150

mg/kgBB/hari untuk kelompok P1, 300

mg/kgBB/hari untuk kelompok P2, dan 600

mg/kgBB/hari untuk kelompok P3. Setelah itu

ditambahkan 2 ml aquades untuk memudahkan

penyondean dan dicampur menggunakan batang

pengaduk.

Prinsip Pemeriksaan Circulating Endothelial

Cells (CECs)

Pemeriksaan CECs dapat dideteksi dengan

seperangkat alat yaitu CEC Enrichment dan

Enumeration Kit. Merupakan fitur pemeriksaan

dengan prinsip immunomagnetic separation atau

prinsip flow cytometry untuk pengukuran satu per

satu fluoresensi sel dan hamburan cahaya.

Komponen utama dalam pemeriksaan ini adalah

fluidics (sistem transportasi sel), laser, photo

detectors, dan komputer berbasis sistem

manajemen termasuk perangkat lunak (software).

Aplikasi flow cytometry berupa proses

aktivasi imunofluoresensi dimana antibodi

mengenali molekul tertentu pada permukaan sel

endotel. Antibodi berupa artifisial konjugasi

fluorochromes. Ketika sel dianalisis dengan flow

cytometry, sel mengekspresikan marker yang

sesuai dengan antibodi spesifik bermanifestasi

berupa fluoresensi. Sedangkan sel yang tidak

memiliki marker spesifik tidak akan

terfluoresensi. Data yang dihasilkan dalam flow

cytometry ditampilkan menggunakan Akuisisi

Multiparamater dan Software Platform untuk

melihat ekspresi fluoresensi dalam sub populasi

sel dalam sampel (strategi gating). 23

Sebelumnya, terlebih dahulu dihitung jumlah

sel leukosit, persentase dari original fraktion,

isotype control, dan staining sample. Dari ketiga

data tersebut dapat dihitung jumlah CECs

menggunakan rumus hitung. Hasil akhir

didapatkan jumlah CECs/ml darah tikus. 23

Pada

keadaan normal, tingkat ekspresi CECs sangat

rendah, antara 1 sampai 20 sel/ml (sel per mili

liter) atau 1x10-7

sampai 1x10-5

per leukosit.17

Perhitungan jumlah CECs adalah dengan cara

menentukan jumlah sel CD34+

per 5 ml darah

kemudian menentukan jumlah CECs dalam 5 ml

sampel. Penentuan jumlah sel CD34+

per 5 ml

darah dengan rumus: jumlah absolut leukosit

dalam 5 ml sampel × % viablesel CD34+

(frekuensi sel CD34+

sebelum pengayaan di

fraksi original) / 100. Penentuan jumlah CECs

dalam 5 ml sampel dengan cara menentukan

jumlah pewarnaan non-spesifik di wilayah

isotipe kontrol UL4, kemudian hitung jumlah

absolut CECs dalam 5 ml darah dengan rumus:

(% gated sampel CECs [frekuensi sel

CD34+/CD146

+/CD45

- di staining sample] -%

gated sampel kontrol isotipe [frekuensi sel

CD34+/IgG1

+tikus/CD45

- di kontrol isotipe]) ×

jumlah absolut sel CD34+] / 100.

23

Teknik Analisa Data Tahap pertama adalah entry data dan proses

clearing (uji normalitas dan homogenitas).

Apabila data bersifat terdistribusi normal serta

varian bersifat homogeny (nilai p≥0,05) maka

dapat dilanjutkan dengan analisa data metode

statistik parametrik one way ANOVA karena

lebih dari 2 kelompok uji. Hasil dikatakan

bermakna bila p<0,05. Uji lanjut dengan uji

Tukey 5% (uji beda nyata jujur), uji korelasi dan

uji regresi. Analisa data memakai perangkat

software statistik SPSS versi 16.

HASIL PENELITAN

Karakteristik Populasi

Hewan coba penelitian ini adalah tikus wistar

jantan usia + 2,5 bulan dengan berat badan pra

kondisi + 150 gram dan gerakannya aktif. Berat

badan tikus dievaluasi tiap minggu. Data

menunjukkan adanya kenaikan berat badan di

semua kelompok mulai awal hingga akhir

penelitian. Tetapi, pada kelompok kontrol

negatif, kenaikan berat badan tidak sebesar

kelompok kontrol positif dan perlakuan. Pada

minggu terakhir, rerata berat badan di semua

kelompok hampir sama dan berat badan rerata

paling tinggi ada pada kelompok kontrol positif.

Hasil Hitung dan Analisa Jumlah Circulating

Endothelial Cells (CECs)

Hasil uji normalitas (kolmogorov smirnov)

menunjukkan nilai sig. (p)= 0,187 yang berarti

bahwa distribusi data bersifat normal. Pada uji

homogenitas (levene test) menunjukkan nilai sig.

(p)= 0,114 yang berarti bahwa varian data

bersifat homogen. Data terdistribusi normal dan

varian bersifat homogen, sehingga memenuhi

5

syarat untuk dilakukan uji one way ANOVA, uji

Tukey 5%, uji korelasi dan uji regresi.

Efek induksi HFD dan STZ (tikus model

DMT-2) terhadap jumlah CECs dapat diamati

pada Tabel 1 dan Grafik 1. Hasil menunjukkan

bahwa jumlah CECs tikus meningkat pada

kelompok kontrol positif (K1) yaitu tikus model

DMT-2 dibandingkan dengan kontrol negatif

(K0) yang diinduksi diet normal dan aquades.

Data menunjukkan bahwa kelompok K1 mampu

meningkatkan jumlah CECs secara signifikan

dengan nilai 0.000 dibandingkan kelompok K0.

Peran buah kawista terhadap jumlah CECs

tikus model DMT-2, dinilai dengan uji one way

ANOVA dilanjutkan uji Tukey 5% untuk menilai

pengaruh pemberian daging buah kawista dengan

berbagai dosis. Efek pemberian daging buah

kawista terhadap jumlah CECs dapat diamati

pada Tabel 1 dan Grafik 1. Data menunjukkan

bahwa pada kelompok P1, P2, dan P3 mampu

menurunkan jumlah CECs secara signifikan

dengan nilai 0.000 dibanding kelompok kontrol

positif. Jumlah CECs kelompok P1 lebih sedikit

dibanding kelompok K1. Kemudian jumlah

CECs kelompok P2 lebih sedikit dibanding

kelompok P1. Bahkan jumlah CECs kelompok

P3 lebih sedikit dibanding kelompok P2. Tetapi,

jumlah CECs kelompok P3 masih lebih tinggi

dibanding kelompok K0.

Tabel 1: Rerata Jumlah CECs Darah Tikus

Perlakuan

Rerata CECs (sel/ml) ± SD

K0 Diet normal + aquades 2 ml 21.90 ± 2.86

K1 Tikus model DMT-2 + aquades 2 ml 173.02 ± 10.53*

P1 Tikus model DMT-2 + daging buah kawista 150 mg/kgBB/hari

100.00 ± 8.69 **

P2 Tikus model DMT-2 + daging buah kawista 300 mg/kgBB/hari

68.87 ± 8.37 **

P3 Tikus model DMT-2 + daging buah kawista 600 mg/kgBB/hari

44.08 ± 6.25 **

Grafik1: Rerata jumlah CECs darah tikus.

Keterangan:

*=nilai sig.= 0.000 berbeda signifikan dibanding kontrol negatif.

**=nilai sig.= 0.000 berbeda signifikan dibanding kontrol positif.

K0= Kelompok kontrol negatif K1= Kelompok kontrol positif

P1= Kelompok perlakuan 1 P2= Kelompok perlakuan 2

P3= Kelompok perlakuan 3

Uji dilanjutkan dengan uji korelasi untuk

mengetahui efek jika dosis daging buah kawista

dinaikkan dari jumlah dosis dalam penelitian ini.

Uji korelasi antara perlakuan dan jumlah CECs

akhir penelitian menunjukkan bahwa nilai

signifikansi (2-tailed)= 0.000. Hal ini berarti

kenaikan dosis daging buah kawista akan

menurunkan jumlah CECs tikus model DMT-2

secara signifikan. Dengan kata lain, semakin

tinggi dosis daging buah kawista maka jumlah

CECs semakin turun. Hal ini ditunjukkan dengan

nilai pearson correlation (p)=-0,901.

Uji selanjutnya adalah uji regresi yang

menghasilkan sebuah grafik linieritas, yaitu

Grafik 2. Grafik menunjukkan hubungan antara

penurunan jumlah CECs dengan pemberian

daging buah kawista. Hasil menunjukkan nilai

koefisien determinasi (R square= r2) yang

menyatakan besarnya pengaruh perlakuan yang

diamati (pemberian daging buah kawista)

terhadap jumlah CECs, dan prosentase sisanya

(1-R square) ditentukan oleh faktor lain. Nilai

regresi penelitian ini adalah r2= 0.81 yang berarti

81% perlakuan pemberian daging buah kawista

berpengaruh dalam menurunkan jumlah CECs

tikus model DMT-2. Sedangkan 19% keragaman

jumlah CECs tersebut dipengaruhi oleh faktor

lain selain pemberian daging buah kawista.

Grafik2: Grafik linieritas hubungan penurunan

jumlah CECs dengan pemberian buah kawista.

PEMBAHASAN

Karakteristik Populasi

Pada penelitian ini digunakan tikus wistar

karena organ tubuhnya relatif besar sehingga

mudah dikendalikan dan jumlah darah yang

diambil dapat mencapai 5-6 ml/kgBB. 29

Hewan

ini lebih aktif daripada jenis lain, mudah

diperoleh, mempunyai respon cepat, relatif

murah, dan memberikan gambaran ilmiah yang

mungkin terjadi pada manusia (memiliki struktur

DNA yang mirip). 28,30

Dipilih tikus jantan

karena lebih tingginya angka DM pada laki-laki,

tidak ada kemungkinan hamil, dan tidak

dipengaruhi oleh siklus hormonal yang dapat

6

mempengaruhi hasil penelitian (mengontrol

variabel perancu). Dipilih usia 2,5 bulan dengan

pertimbangan sudah mencapai usia dewasa, dan

berat badannya dapat menggambarkan kesehatan

hewan coba sesuai usianya. Tikus diadaptasikan

selama 7 hari untuk menyesuaikan kondisinya

dengan kondisi lingkungan tempat pelaksanaan

penelitian. Kondisi dan variabel lingkungan

dibuat seragam untuk meminimalisasi bias

penelitian sehingga dapat memberikan hasil yang

relatif seragam pada kelompok yang sama.

Pemberian daging buah kawista secara

personde lambung, mempunyai kelebihan dan

kekurangan yang dapat mempengaruhi hasil

penelitian. Kelebihan teknik ini antara lain, dosis

antar tikus yang telah dihitung berdasarkan berat

badan masing-masing dalam satu kelompok

dapat seragam dan masuk secara maksimal, serta

waktu induksi perlakuan seragam. Kekurangan

metode ini adalah meningkatkan resiko stres dan

aspirasi pada proses pemasangan sonde yang

tidak tepat sehingga resiko kematian lebih tinggi.

Sedangkan injeksi STZ intraperitoneum akan

memudahkan senyawa tersebut masuk ke dalam

tubuh tikus dan segera menuju organ target

(pankreas), tetapi hal ini dapat menimbulkan

stres yang dapat mempengaruhi hasil penelitian

khususnya terhadap kadar kimia darah. 31

Pemberian HFD mudah dilakukan dan tidak

berpotensi menimbulkan stres, tetapi rentan

meninggalkan sisa sehingga dosis konsumsi per

tikus akan berbeda. Pada penelitian ini tidak

terdapat sisa HFD pada tikus di setiap perlakuan.

Perbedaan berat badan tikus pada penelitian

inimasih dalam rentang atau range normal,dan

kemungkinan tidak berpengaruh terhadap hasil

penelitian. Berat badan tikus prakondisi adalah

149,5 - 153,2 gram, sehingga range untuk berat

badannya adalah 3,7 gram.

Efek Induksi Model DMT-2 terhadap Jumlah

Circulating Endothelial Cells (CECs)

Kondisi DMT-2 memiliki karakteristik yaitu

kombinasi resistensi insulin perifer dan sekresi

insulin yang tidak adekuat oleh sel β pankreas.

Sebagai contohnya, seseorang dengan kelebihan

berat badan akan mengalami resistensi insulin,

tetapi berkembangnya diabetes hanya terjadi

pada orang yang tidak mengalami peningkatan

sekresi insulin untuk mengkompensasi terjadinya

resistensi insulin. 8

Pada penelitian ini digunakan

metode induksi diet tinggi lemak (HFD) selama

30 hari dan injeksi Streptozotocin (STZ) single

dose 50 mg/kgBB/ekor untuk mengkondisikan

tikus sebagai model DMT-2. 21

Streptozotocin yang diinjeksikan secara

intraperitoneum akan masuk ke sel β pankreas

melalui glucose transporter 2 (GLUT-2). Aksi

ini dapat menghasilkan perubahan DNA sel β

pankreas (akibat alkilasi DNA oleh STZ melalui

gugus nitrosourea). Pada kerusakan DNA sel β

pankreas akan terjadi aktivasi PARP (poly ADP-

ribosylation) yang mengakibatkan pengurangan

nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)

selular, dan lebih lanjut akan terjadi pengurangan

adenosine triphosphate (ATP). 32

Selain itu, aksi

STZ dalam mitokondria dapat menghambat

siklus Krebs, menurunkan konsumsi oksigen,

dan produksi ATP terbatas yang dapat

mengakibatkan pengurangan jumlah nukleotida

sel β pankreas. Disamping itu, aksi STZ yang

menyebabkan penghambatan degradasi ATP,

akan menginduksi terbentuknya radikal bebas

melalui aktivasi xanthin oxidase, membentuk

superoxide radical (O2-) sehingga terjadi

pengeluaran hydrogen peroxide (H2O2) dan

hydroxyl radical (OH-). Seluruh proses tersebut

menyebabkan kerusakan sel β pankreas yang

akan mengganggu penurunan produksi insulin

dan mengurangi efisiensi penggunaan glukosa di

perifer sehingga dapat meningkatkan glukosa

plasma (hiperglikemi). 15

Injeksi STZ dosis

rendah dalam penelitian ini ditargetkan dapat

menyebabkan kerusakan secara relatif pada sel β

pankreas yang menggambarkan salah satu

kondisi DMT-2. 21

Diet tinggi lemak menyebabkan peningkatan

akumulasi lipid di jaringan, seperti otot, lemak

dan hepar. Kondisi ini akan mengganggu sinyal

reseptor insulin dan mengurangi jumlah reseptor

insulin di otot, hepar, dan jaringan adiposa

sehingga menyebabkan resistensi insulin. 15

Kondisi hiperlipidemi juga mengakibatkan

peningkatan kadar asam lemak bebas (free fatty

acid), hiperglikemi (akibat produksi gliserol

berlebih), serta oksidasi lipoprotein (terutama

small dense LDL cholesterol dan VLDL) yang

dapat memperberat stres oksidatif. 24,25

Hiperglikemi dan hiperlipidemi pada kondisi

DMT-2 menyebabkan peningkatan produksi

ROS. 33

Jumlah radikal bebas yang berlebihan

tanpa diimbangi pertahanan antioksidan yang

memadai, akan menghasilkan stres oksidatif

khususnya pada pembuluh darah. 34

Keadaan

stres oksidatif akan menyebabkan kerusakan

permeabilitas membran plasma, menyebabkan

hilangnya hemostasis kalsium (Ca2+

), sehingga

terjadi masuknya Ca2+

ekstraseluler ke dalam

sitosol. Peningkatan Ca2+

intraseluler merusak sel

melalui aktivasi fosfolipase (menyebabkan

penurunan fosfolipid yang akan menstimulus

kerusakan membran), protease (mengkatabolis

struktur membran protein dan sitoskeletal),

endonuklease (menyebabkan kerusakan kromatin

inti sehingga terjadi fragmentasi DNA), dan

ATPase (menurunkan pembentukan ATP)

7

sehingga akan menyebabkan nekrosis sel dan

terjadilah detachment sel endotel (ditandai

dengan peningkatan CECs dalam darah). 16,26

Selain itu, peningkatan radikal O2-

dapat

bergabung dan menghancurkan peroksinitrat

(penghasil NO), sehingga terjadi efek negatif

terhadap struktur dan fungsi pembuluh darah.

Radikal O2-

juga dapat secara langsung

menginaktifkan NO melalui proses reaksi yang

cepat membentuk peroksinitrit, yang merupakan

komponen sangat kuat (lebih stabil dan memiliki

daya hancur lebih kuat dari pada O2-

). Hal ini

menyebabkan gangguan atau penurunan fungsi

sinyal molekul adesi endotel berupa integrin dan

golongan cadherin, seperti vitronektin dan

fibronektin (protein yang merekatkan sel endotel

ke matriks, mempercepat pembentukan protein

cytoskeletal dan memediasi sinyal kelangsungan

hidup sel) sehingga memicu detachment dan

apoptosis sel endotel. 26,27

Pada penelitian ini, menunjukkan bahwa

jumlah CECs kelompok kontrol negatif lebih

rendah dibandingkan kelompok kontrol positif.

Hal tersebut membuktikan bahwa pada kondisi

DMT-2, jumlah CECs dapat meningkat karena

keadaan hiperglikemi dan hiperlipidemi sebagai

penyebab stres oksidatif.

Efek Daging Buah Kawista terhadap Jumlah

CECs pada Tikus Model DMT-2

Berdasar analisa hasil penelitian, hubungan

antara dosis daging buah kawista terhadap

jumlah CECs kelompok perlakuan berbanding

terbalik. Semakin tinggi dosis, maka jumlah

CECs semakin turun. Pada kelompok P1, P2, dan

P3 mampu menurunkan jumlah CECs secara

signifikan 0.000 dibandingkan kelompok kontrol

positif, meskipun tidak dapat mencapai jumlah

CECs pada kelompok kontrol negatif. Dosis 600

mg/kgBB/hari lebih potensial dalam menurunkan

jumlah CECs dibanding dosis 300 dan 150

mg/kgBB/hari (potensial dosis 600> 300> 150

mg/kgBB/hari). Sedangkan hubungan antara

perlakuan dengan marker penelitian dapat dilihat

dari hasil uji regresi. Nilai regresi penelitian ini

r2= 0.81 yang berarti 81% perlakuan pemberian

daging kawista berpengaruh dalam menurunkan

jumlah CECs. Berdasarkan hasil penelitian,

membuktikan bahwa pada kelompok perlakuan

telah sesuai dengan teori yang ada, bahwa daging

buah kawista mengandung senyawa antioksidan

dan antidiabetes yang berpotensi dalam

menurunkan jumlah CECs akibat hiperglikemi,

hiperlipidemi, dan stres oksidatif yang

ditimbulkan pada kondisi DMT-2.

Pada beberapa studi penelitian, buah kawista

memiliki banyak kandungan yang bermanfaat

bagi kesehatan khususnya sebagai antioksidan

dan antidiabetes, diantaranya senyawa fenolik, 13

protein, vitamin A, dan vitamin C. 18

Penelitian

oleh Ilango (2009), 14

membuktikan bahwa

ekstrak buah kawista mengandung flavonoid,

glikosida, saponin, tanin, beberapa kumarin,

serta derifat tiramin yang berfungsi sebagai

antioksidan dan antidiabetik. Sedangkan dalam

penelitian yang dilakukan Dewi (2013),

membuktikan bahwa aktifitas antioksidan terbaik

adalah pada buah kawista yang matang karena

memiliki kandungan flavonoid, saponin, dan

tanin paling banyak. 42

Zat aktif dalam buah

kawista akan memperbaiki kondisi hiperglikemi

dan hiperlipidemi serta menangkal efek radikal

bebas yang ditimbulkan oleh kondisi DMT-2.

Sehingga kerusakan dan detachment sel endotel

pembuluh darah yang merupakan mekanisme

awal kerusakan jaringan lain, dapat ditekan dan

diperbaiki.

Flavonoid, tanin dan tiramin yang berfungsi

sebagai antioksidan dan dapat meningkatkan

sensitifitas sel terhadap insulin. 36

Robinson

(1995) menyatakan bahwa flavonoid mampu

mengikat radikal OH- dan O

2-.

38 Flavonoid juga

sebagai anti-inflamasi melalui mekanisme

penghambatan metabolisme asam arakidonat dan

sekresi enzim lisosom dari sel neutrofil dan sel

endotelial. Mekanisme ini akan memblok jalur

siklo-oksigenase dan lipo-oksigenase sehingga

menurunkan kadar mediator inflamasi. 36

Penelitian oleh Spasov (2008), membuktikan

bahwa saponin berpotensi sebagai agen

antidiabetik melalui mekanisme regenerasi sel β

langerhans, aktivasi enzim untuk metabolisme

glukosa, serta stimulasi pembentukan dan sekresi

insulin. 40

Saponin juga menghambat biosintesis

kolesterol dengan cara menghambat kerja enzim

yang bekerja pada tingkat fosfolilasi, yaitu

hydrixymethyl glutaryl-CoA reductase atau pada

perpanjangan rantai lemak. 37

Kumarin memiliki kemampuan untuk

mengikat ROS (seperti OH-

dan O2-

). 44

Rajesh

(2011) mengemukakan bahwa kumarin berfungsi

sebagai anti-inflamasi melalui penghambatan

lipo-oksigenase dan siklo-oksigenase serta

menghambat peroksidasi lipid. 45

Vitamin C (asam askorbat) berperan sebagai

antioksidan melalui perannya sebagai agen

pereduksi radikal bebas. 39

Selain itu, asam

askorbat sangat penting dalam pembentukan

serat kolagen di berbagai jaringan, khususnya

pembuluh darah, melalui mekanisme aktifasi

enzim prolyl hydoxylas yang bekerja pada proses

hidroksilasi dalam pembentukan hidroksiprolin,

yaitu unsur lengkap kolagen. Sehingga akan

memperkuat adesi sel endotel melalui fungsi

kolagen sebagai matriks ekstraseluler. 15

Penelitian oleh Jialal (1990), membuktikan

8

bahwa asam askorbat juga dapat mencegah

oksidasi LDL. 35

Beta karoten terdiri dari 2 molekul vitamin A

(retinol). Beta karoten dari diet akan diubah

menjadi retinol di mukosa usus halus, dan

kemudian akan bereaksi dengan radikal bebas

(scavenger O2-

, bereaksi langsung dengan

peroksil (ROO-), dan larut lemak).

19

Penelitian oleh Chuang (2007), 41

membuktikan bahwa protein berpotensi dalam

menstimulasi NO (nitric oxide), sehingga mampu

memperbaikifungsi pembuluh darah yang

membawa nutrisi ke tiap jaringan. Selain itu, NO

juga merangsang produksi hormon pertumbuhan

yang berguna untuk menstimulasi pertumbuhan

dan reproduksi sel yang rusak. 43

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

Daging buah kawista (Limonia acidissima L.)

mampu menurunkan jumlah CECs pada tikus

model DMT-2.

Saran

1. Perlu dilakukan penelitian uji toksisitas (uji

LD50 dan uji toksisitas kronis) daging buah

kawista (Limonia acidissima L.).

2. Perlu dilakukan penelitian tentang uji

farmakologi zat aktif daging buah kawista

(Limonia acidissima L.).

DAFTAR PUSTAKA

1. Kementrian Kesehatan Republik Indonesia.

Tahun 2030 prevalensi diabetes melitus di

Indonesia mencapai 21,3 juta. Jakarta; 2012.

2. Kementrian Kesehatan Republik Indonesia.

Riset kesehatan dasar. Jakarta; 2007.

3. Baynes JW. Role of oxidative stress in

diabetic complications. A new perspective

onan old paradigm. Diabetes; 2003: 48: 1-9.

4. Waller BF. Hurst’s: the Heart 13th

ed. (eds)

dalam Fuster Mc Graw-Hill company; 2010.

5. American Diabetes Association. Standards of

Medical Care in Diabetes 2012. Diabetes

Care, Volume 35, Supplement 1, 2012.

6. Hayat et al. Diabetic cardiomyopathy:

mechanisms, diagnosis and treatment.

Clinical Science; 2004: 107, 539–557.

7. Hansen T et al. At-risk variant in TCF7L2 for

typeII diabetes increases risk of

schizophrenia. Biol Psychiatry 2011; 70: 59.

8. Romesh K. Diabetes and metabolism.

Departemen of Internal Medicine; Estern

Virginia Medical School; 2011.

9. David ES dalam Price SA, Wilson LM.

Patofisiologi konsep klinis proses penyakit:

Pankreas, metabolisme glukosa dan diabetes

melitus. Jilid 2. Jakarta: Penerbit Buku

Kedokteran EGC 2006; 1109-1122.

10. Johansen et al. 2005. Dalam Jena NR. DNA

damage by reactive species: mechanism,

mutation and repair. Department of Physics,

Indian Institute of Information Technology,

2012; 37: 503–517.

11. Boos CJ et al. Circulatingendothelial cells in

cardiovascular disease. J. Am. Coll. Cardiol

2006; 48: 1538-1547.

12. Muhlisah. Empon-empon budidaya manfaat.

Yoyakarta: Kanisius; 2003.

13. Ramdas P, Seema MT. Antioxidant activity

and antimutagenic effect of phenolic

compounds in Feronia limonia (l) swingle

fruit. International Journal of Pharmacy and

Pharmaceutical Sciences 2010; ISSN-0975-

1491 Vol2, Issue 4.

14. Ilango K, Chitra V. Hepatoprotective and

antioxidant activities of fruit pulp of Limonia

acidissima Linn. International Journal of

Health Research: 2009; 2(4): 361-367.

15. Guyton AC, Hall JE. Buku ajar fisiologi

kedokteran. Chapter 67-69,71,74,78. Edisi

XI. Jakarta: EGC; 2007.

16. Robbins SL, Kumar V. Buku Ajar Patologi I-

II. Ed. 4. Jakarta: EGC; 2005.

17. Woywodt SJ et al. Circulating endothelial

cells as a marker of endothelial damage

inallogeneic hematopoietic stem cell

transplantation. J. American Society of

Hematology. 2004; 103: 3603-3605.

18. Verheji EWM, Coronel RE. PROSEA sumber

daya hayati Asia Tenggara 2. Jakarta: PT

gramedia pustaka; 1997.

19. Mayes PA. Struktur dan fungsi vitamin larut

lipid. Dalam Murray RK, Granner DK,

Mayes PA, Rodwell VW. Biokimia Harper.

Edisi 24. Jakarta: EGC; 2003: 613-622.

20. Sa’ad M. Catcher activity test A and B

isolates radical faction ethanol leaf extract

IV Dewandaru (Uniflora eugenia L.) methods

DPPH. Thesis. Muhammadiyah Faculty of

Pharmacy, University of Surakarta; 2009.

21. Reed MJ, Meszaros K, Entes LJ, Claypool

MD, Pinkett JG, Gadbois TM et al. A new rat

model of type 2 diabetes; the fat-fed,

streptozotocin-treated rat. Shaman

Pharmaceuticals, 213 East Grand Aye, South

San Francisco. Copyright @ 2000 by W.B.

Saunders Company. Metabolism, Vol 49, No

11, 2000: pp 1390-1394.

22. Fadlina CS. Efek ekstrak bulbus bawang

putih (Allium sativum) dan rimpang kunyit

(Curcuma domestica V.) terhadap profil

lipoprotein dan glukosa model hewan

9

hiperkolesterolemi - diabetes. Fakultas

Farmasi ITB; 2007.

23. Miltenyi Biotec GmbH. Applications for the

enrichment column of the MACSQuant®

Analyzer Enumeration of circulating

endothelial cells. CEC Enrichment and

Enumeration Kit: January 2012; 1-4.

24. Beckman JA, Libby P, Creager MA.Diabetes

mellitus, the metabolic syndrome, and

atherosclerotic vascular disease. In: Libby P,

Bonow RO, Mann DL, Zipes DP (eds).

BRAUNWALD'S Heart Disease A Textbook

of Cardiovascular Medicine, 9th ed; 2012.

25. Makimattila et al. Chronic hyperglycemia

impairs endothelial function and insulin

sensitivity via different mechanismsin insulin-

dependent diabetes mellitus. Circulation

1996; 94: 1276.

26. Woywodt A, Bahlmann FH, de Groot K,

Haller H, Haubitz M. Circulating endothelial

cells: life, death, detachment and repair of

the endothelial cell layer. Division of

Nephrology, Department of Medicine,

Hannover Medical School, Germany oxford

Journals; 2002;17:1728-1730.

27. Erdbruegger U, Haubitz M, Woywodt A.

Review: Circulating endothelial cells: A

novel marker of endothelial damage.

Department of Medicine, Division of

Nephrology, Hannover Medical School,

Germany. Elsevier: U. Erdbruegger et al./

Clinica Chimica Acta 373: 2006; 17–26.

28. Kusumawati D. Bersahabat dengan hewan

coba. Gajahmada University Press.

Yogyakarta; 2004.

29. Hanafiah MJ, Amir A. Etika kedokteran &

hukum kesehatan. EGC. Jakarta; 1999.

30. UdinMF. Pengaruh pemberian vaksin LDL

yang dioksidasi kombinasi dengan adjuvan

TT terhadap imunoglobulin garteri renalis.

Tesis Program Studi Biomedik Imunologi.

Universitas Brawijaya. Malang; 2005.

31. SteynDG. The effects of cativity stresson the

blood chemical values of the Chacma baboon

(Papio Ursinus). South Africa, University of

Pretoria 9: 1975; 111-120.

32. Szkudelski T, Szkudelska K. Streptozotocin

induces lipolysis in rat adipocytes in

vitro.Department of Animal Physiology And

Biochemistry, University Of Agriculture,

Poznan, Poland 2002; 51: 255-259.

33. Kalaivanam KN, Mala D, Sara RM. Lipid

peroxidation in type 2 diabetes mellitus.

Departments of Biochemistry and

Endocrinology; 2010.

34. Kumalaningsih. Antioksidan alami. Trubus

Agrisana. Surabaya; 2006.

35. Jialal I et al. 1990. Dalam Levine M,

Dhariwal KR, Welch RW, Wang Y, Park JB.

Determination of optimal vitamin C

requirments in humans. The American

Journal of Clinical Nutrition. 62 (Suppl);

2013: 1347S-1356S.

36. Herdiyansyah E, Aidah LY, Rahmita R, Aeni

YN. Makalah fisiologi tumbuhan:

Pembentukan senyawa fenolik dan

fitoaleksin. Program Studi Pendidikan

Biologi, Fakultas Keguruan dan Ilmu

Pendidikan, Universitas Muhammadiyah

Sukabumi; 2011.

37. Goe KP. A novel antidiabetic furostanolic

saponin rich (fsr) fraction from fenugreek

seeds. Publication date: Apr 11, 2012; EP

2437763 A1; Data provided by IFI CLAIMS

Patent Services.

38. Robinson T. 1995. Kandungan organik

tumbuhan tinggi. Penerjemah: Padmawinata

K. Bandung: ITB. Terjemahan dari: The

organic constituents of higher plants 6th

edition.

39. Mayes PA. Struktur dan fungsi vitamin larut

air. Dalam Murray RK, Granner DK, Mayes

PA, Rodwell VW. Biokimia Harper. Edisi

24. Jakarta: EGC; 2003: 598-612.

40. Spasov AA, Maxeiner MP, Bulanov AE,

Antidiabetic properties of Gymnema

sylvestre. Pharma. Chem. J, 2008,42(11):

626-629.

41. Chuang MT, Lin YS, Hou WC. Ancordin, the

major rhizome protein of madeira-vine,with

trypsin inhibitory and stimulatory activitiesin

nitric oxide productions. Elsevier. Peptides

28; 2007: 1311 – 1316.

42. Dewi R. Bioaktivitas buah kawista (Limonia

acidissima) bima dan penentuan sidik jarinya

menggunakan kromatografi lapis tipis.

Departemen Kimia Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam, IPB: 2013.

43. Rubinek T, Rubinfeld H, Hadani M, Barkai

G, Shimon I. Nitric oxide stimulates growth

hormone secretion from human fetal

pituitaries and cultured pituitary adenomas.

Source Institute of Endocrinology, Chaim

Sheba Medical Center, Israel. Endocrine.

2005 Nov; 28(2): 209-16.

44. Gutteridge JMC. Free radicals in disease

processes: a compilation of cause and

consequence. Free radic. 1995; 19: 141.

45. M Rajesh P, J Natvar P.In vitro antioxidant

activity of coumarin compounds by DPPH,

Super oxideand nitric oxide free radical

scavenging methods. Journal of Advanced

Pharmacy Education & Research;2011:52-68.