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Alcuni argomenti trattati sono disponibili in formato PowerPoint al seguente indirizzo web:
www.unipv.it/tslmra22
I recettori a sette domini transmembrana
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Forme di Signaling Cellulare
(A) Gli ormoni prodotti dalle ghiandole endocrine sono secreti nel flusso sanguigno e possono essere distribuiti all’intero organismo. (B) I messaggeri paracrini sono rilasciati dalle cellule nel mezzo extracellulare e possono diffondere e agire localmente. (C) I segnali nervosi sono trasmessi lungo gli assoni a cellule bersaglio remote. (D) Il signaling contatto-dipendente richiede che le cellule siano a contatto l’una con l’altra membrana contro membrana. Le differenze cruciali tra le varie modalità riguardano la velocità e la selettività con cui I segnali sono trasmessi alle cellule bersaglio.
(A) ENDOCRINO (B) PARACRINO
(C) NEUROCRINO (D) CONTATTO-DIPENDENTE
cellula endocrina
Flusso sanguigno
recettore
cellula bersaglio
ormonecellule
bersaglio
mediatore locale
cellula segnalatrice
neuronesinapsi
cellula bersagliocorpo
cellulare
assone
neurotrasmetttore
cellula segnalatrice
cellula bersaglio
messaggero legato alla membrana
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Trasduzione del Segnale da Recettori di Superfice
ormone citochina
fattore dicrescita
recettore accoppiatoa proteina G
recettore tirosin chinasi
recettore per le citochine
via dell’AMPc
via dell’IP3 via del PI 3-kinasi
via delle MAP kinasi
via del JAK-STAT
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recettore
tsqiG proteina
cAMPCa2+
messaggerointracellulare
enzimacanale effettore
Signalling mediante recettori accoppiati a proteine G
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Regioni Idrofobiche e idrofiliche dei lipidi di membrana
Lipide di membrana Idrofobico + Idrofilico = Anfipatico
Glicerofosfolipide
Sfingomielina
Glicosfingolipide
Colesterolo
Diacilglicerolo
Ceramide
Ceramide
Anelli idrocarburici
Alcool fosforilato
Fosforilcolina
Residui glucidici
Gruppo OH di C3
Glicerofosfolipide
Glicosfingolipide
Colesterolo
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Lipidi di Membranasemplice organizzazione di molecole anfipatiche
Lipidi di MembranaSezione di un bilayer di glicerofosfolipidi
idrofilico
idrofobico
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Tutte le membrane biologiche sono bilayers lipidici
Le proteine conferiscono proprietà uniche a ciascun tipo di membrana
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Proteine Acilate e Prenilate
acido grasso legato mediante legame estere a una Cys; aggiunto in fase post-traslazionale
Esempi: recettore per l’insulinarecettore beta-adrenergicorodopsina
Acido palmitico
Isoprenoide (farnesil;geranilgeranil)
Isoprenoide legato mediante legame tioetere a una Cys vicina all’estremità C-terminale; aggiunto in fase post-traslazionale
Esempio: subunutà di proteina G (membrana plasmatica)
Acido miristico
acido grasso legato mediante legame amidico a una Gly; aggiunto in fase co-traslazionaleEsempio: subunutà di proteina G (membrana plasmatica)
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I Recettori Accoppiati a Proteine G (GPCR) rappresentano una famiglia di > 1000 membri strutturalmente correlati. Queste proteine sono anche chiamate Recettori a 7 Domini Transmembrana.
Recettori accoppiati a proteine G (GPCR)
siti di glicosilazione (legame tramite Asn)
siti di fosforilazione
ancoraggio lipidico citosol
extracell.
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Recettori Accoppiati a Proteine G
1. Hanno tutti 7 domini transmembrana (ad es. rodopsina)
2. Ci sono circa 1000 GPCRs nel genoma. (di molti di essi non si conosce ancora il ligando)
3. I singoli recettori rispondono a: un neurotrasmettitore come la serotonina o la dopamina,
una piccola proteina (8-40 amminoacidi, un “peptide”) come le endorfine
uno stimolo olfattorio
la luce, nell’occhio
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Caratteristiche generali dei GPCRs comprendono: domini transmembrana ad -elica, ancoraggio ai lipidi che ne stabilizza la conformazione, siti di fosforilazione citosolici che ne regolano l’attività, e siti di glicosilazione extracellulare che permettono l’interazione con molecole extracellulari e altre cellule.
Struttura Generale dei Recettori a 7 DTsiti di glicosilazione (legame tramite Asn) extracell.
citosol
ancoraggio lipidico
siti di fosforilazione
dominio transmembrana
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Rodopsina PDB 1F88
La Rodopsina è stato il primo membro della famiglia dei recettori a 7 DT ad avere la sua struttura determinata mediante cristallografia ai raggi-x
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Gli effetti di queste interazioni includono alterata affinità per il ligando, dimerizzazione del recettore che può aumentarne o alterarne l’attività, alterata localizzazione del recettore, ecc.
Varie proteine interagiscono con I GPCR o Recettori a 7-DT
per modularne l’attività
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RUOLO DELLA -ARRESTINA NELLA REGOLAZIONE DEI RECETTORI ACCOPPIATI A G-PROTEINE
legame del messaggero
fosforilazione del recettore
interazione con -ARR associazione con
CLATRINAFormaazione della vescicola endocitosi
1. Dopo un certo tempo che si è stabilito il legame dell’agonista al GPCR, una kinasi (GRK) fosforila alcuni residui aminoacidici intracellulari del recettore;
2. La fosforilazione porta a un disaccoppiamento del GPCR dalla G proteina (desensitizzazione) e al reclutamento della -arrestina;
3. La -arrestina a sua volta recluta molecole di clatrina;
4. Le molecole di clatrina favoriscono la formazione di una cavità da cui originerà la vescicola
5. La successiva endocitosi della vescicola provocherà l’internalizzazione del recettore.
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Recettore di classe A
Recettore di classe B
Le Proprietà dell’Internalizzazione definiscono due classi di GPCRs.
Nel caso dei recettori di classe A (-Adre), l’interazione -arrestina–GPCR è transitoria, e la -arrestina non si localizza con i GPCR negli endosomi. Per i recettori di classe B (Vaso2), l’interazione -arrestina–GPCR è più stabile, e recettore e –arrestina co-localizzano negli endosomi.
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Traffico Cellulare della arr2-GFP con i Recettori 2AR (adre) e V2R (vasopr)
Assenza di agonista, la arr2-GFP era omogeneamente distribuita nel citoplasma delle cellule che esprimevano 2AR o V2R. (0 min)
Aggiunta di agonista, viene promossa la rapida redistribuzione dal citosol alla membrana plasmatica. (2 min)
Una esposizione piu prolungata all’ agonista produceva una marcata differenza nel traffico della arr2-GFP (15 min):
2AR : rimaneva nella membrana plasmatica (A)
V2R : nell’arco di 2-3 min, finisce nellevescicole endocitotiche (B)
Cellule HEK-293
Co-transfettate con un plasmide contenente il cDNA per arr2-GFP e il cDNA per ciscun recettore
Per visualizzare la arr2-GFP fluorescente in cellule prima e dopo il trattamento con agonista (10M Isoproterenol, 100nM AVP)
adre
nva
sop
r
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Colocalizzazione della arr2-GFP con i Recettori 2AR e V2R internalizzati
Cellule HEK-293
Co-transfettate con arr2-GFP e ciascun recettore
Pre-marcate con rodamina-conj. Anticorpo che marca I recettori
trattate per 15 min a 37C con l’agonista (10M Isoproterenol, 100nM AVP)
visualizzazione al confocale del recettore (rosso) e della arr2-GFP (verde) nelle stesse cellule. Colocalizzazione (giallo) del recettore con la arr2-GFP
V2R : estesa colocalizzazione 2AR : nessuna colocalizzazione
I recettori 2AR e V2R reclutano arrestin con un meccanismo comune durante le fasi iniziali, ma poi c’è divergenza. Il complesso arrestin- 2AR si dissocia a livello della membrana. arrestin-V2AR viene intenalizzato in vescicole endocitotiche.
adre
nva
sop
r
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esterno
interno
GTP
GDP + Pi
Il neurotrasmettitore o l’ormone si lega al recettore
Attiva unaG proteina
Risposta
Effettore: enzima o canale
Recettori accoppiati a proteine GQuanto veloce?da 100 ms a 10 s
Quanto lontano?probabilmente <1 m