Lietuvos hidrobiologų draugija

TVIRTINU: ………………………

Lietuvos Hidrobiologų draugijos prezidentė

dr. Eugenija Milerienė

2012 m. ……………………mėn. …..d.

AKVAKULTŪROS PLĖTRA

HORMONINIO PREPARATO PREGNILO PANAUDOJIMAS

LYDEKŲ DIRBTINIAM VEISIMUI

2012 M. GALUTINĖ ATASKAITA

Tyrimo vadovas

(dr.Vida Žiliukienė)

Vilnius

2012

2

Vykdytojų sąrašas

Dr. Vida Žiliukienė – atsakingas vykdytojas

Dr. Valdemaras Žiliukas

3

TURINYS

psl.

1. Įvadas 4

2. Tyrimo objektas ir metodai 5

2.1. Gonadotropiniai hormonai ir jų įtaka ikrų vystymuisi 5

2.2. Žmogaus chorioninio gonadotropino paruošimas injekcijoms 6

2.3. Reproduktorių gaudymas 7

2.4. Lydekos patelių subrendimo įvertinimas 8

2.5. Reproduktorių laikymas 10

2.6. Lydekos patelių injekavimas 11

2.7. Ikrų apvaisinimas ir inkubavimas 13

3. Tyrimų rezultatai 14

3.1 Tyrimams panaudotų lydekos reproduktorių biologinė charakteristika 14

3.2. Įvairių pregnilo dozių įtaka skirtingų stadijų oocitų subrendimui 15

3.3 Nesubrendusių patelių laikymo iki pirmos injekcijos trukmės įtaka

pregnilo veikimo efektyvumui

16

3.4. Injekuotų patelių ikrų gyvybingumas ir kokybė 17

4. Išvados 18

5. Rekomendacijos 19

Literatūra 20

Priedas 22

4

ĮVADAS

Oogenezės proceso reguliavimas – vienas svarbiausių uždavinių dirbtinio žuvų veisimo

procese. Jį įvaldžius veislynuose subrendusių ikrų surinkimas vyksta ne tik planingai, bet ir

sinchroniškai. Jau praeito šimtmečio ketvirtame dešimtmetyje buvo žinoma, kad ikrų vystymąsi

galima skatinti hipofizio injekcijomis. Šio metodo pradininkai – Houssay (1931) ir von Ihering

(1935, 1937). Iki šių dienų lytinių produktų subrendimo stimuliavimui patelės injekuojamos

gonadotropino hormonu, išskirtu iš įvairių žuvų, dažniausiai karšio, hipofizio. Nors hipofizio

injekcijos plačiai taikomos visame pasaulyje, tačiau, tobulėjant žuvų dirbtinio veisimo

biotechnikai, vis dažniau pereinama prie naujų hormoninių preparatų, pavyzdžiui ovaprimo,

ovopelo, gonazono, nerestino, žmogaus chorioninio gonadotropino ir kt. Jų panaudojimo

galimybės tiriamos ant įvairių žuvų rūšių (Ohta & Tanaka, 1997; Demska- Zakęś & Zakęś, 2002;

Zakęś & Demska- Zakęś, 2004; Zakęś & Szczepkowski, 2004; Metwally & Eouand, 2008;

Brzuska, 2008).

Žmogaus chorioninis gonadotropinas – sutrumpintai ŽCHG, angl. human chorionic

gonadotropin (hCG), farmacijos pramonės leidžiamas įvairiais pavadinimais „Pregnyl“,

„Choriogonin“, „Biogonadyl“, „Novarel“, „Chorex“, „Ovidrel“, ‚Profasi“. Šis hormonas

sėkmingai naudojamas kai kurių žuvų, tame tarpe sterkų (Zakęś, 2003, Zakęś & Demska- Zakęś,

2004; Zakęś & Demska- Zakęś, 2005; Zakęś & Szczepkowski, 2004; Zakęś, 2007, 2009),

dirbtiniam veisimui. Jo dozės, priklausomai nuo žuvų rūšies, oocitų subrendimo stadijos,

svyruoja nuo 60 iki 6000 tarptautinių vienetų (TV) kg kūno masės. Tačiau yra žuvų, kurioms

ŽCHG injekcijos tik stimuliuoja oocitų vystymąsi, bet nesukelia ovuliacijos, pavyzdžiui baltajam

amūrui (Веригин, 1982).

Lietuvoje lydekos dirbtinai pradėtos veisti beveik prieš keturiasdešimt metų. Pirmieji

žingsniai buvo sunkūs ir ne visada sėkmingi. 1974 m. Žuvininkystei priklausančios žuvivaisos

įmonės išaugino vos 60 tūkst. lydekaičių, o žvejai mėgėjai – 32 tūkst (Juodžius, 1978). Tačiau

2000 m. į valstybinės reikšmės bei neišnuomotinus vandens telkinius jau buvo išleista virš 20

milijonų dirbtinai išveistų lydekos lervučių ir virš 223 tūkst. šiųmetukių (Kindurys ir kt., 2002).

Literatūroje nurodoma, kad lydekos nelaisvėje nesiveisia, todėl jų ovuliacija turi būti

skatinama hormonais (Szabó, 2008). Lietuvoje taip pat tarp lydekų, sugautų neršto sezono metu

tvenkiniuose ar natūraliuose vandens telkiniuose, pasitaiko žuvų neduodančių ikrų , dėl ko

nesurenkamas pakankamas jų kiekis inkubavimui.

Šio darbo tikslas nustatyti hormoninio preparato pregnilo („Pregnyl“), kurio veiklioji

medžiaga yra žmogaus chorioninis gonadotropinas (ŽCHG), panaudojimo lydekos patelių

subrendimui skatinti galimybes bei ištirti jo įtaką ikrų gyvybingumui.

5

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI

2.1. Gonadotropiniai hormonai ir jų įtaka ikrų vystymuisi

Oogenezė tai sudėtingas ir ilgas procesas, lydimas visos eilės fiziologinių ir

biocheminių pokyčių , kuomet iš patelės lytinių ląstelių (oocitų) gonadose išsivysto subrendę

ikrai, tinkami apvaisinimui. Gonadotropiniai hormonai, tame tarpe žmogaus chorioninis

gonadotropinas, skatina ikrų vystymąsi ir sukelia ovuliaciją.

Visa eilė aplinkos veiksnių, kaip dienos ilgumas, vandens temperatūra, meteorologinės

sąlygos, tinkamų nerštaviečių buvimas ir kt., siunčia signalą smegenims gaminti gonadotropiną

atpalaiduojantį hormoną (GnRH). Šis hormonas skatina gonadotropino išsiskyrimą iš hipofizio,

kuris ir kontroliuoja oocitų vystymąsi. Jo veikimo schema parodyta 1 pav. Oocitą supančios

folikulo ląstelės, stimuliuojamos gonadotropino, pradeda gaminti estrogeną, kuris nurodo

kepenims išskirti vitelogeniną (trynio analogą). Jis pamažu kaupiasi oocite. Tai vadinamas

vitelogenezės procesas. Jo pabaigoje oocito diametras labai padidėja. Po vitelogenezės folikulo

ląstelės toliau stimuliuojamos gonadotropino pradeda išskirti jau progesteroną. Jo veikiama suyra

branduolio membrana, oocitas išsilaisvina iš folikulo, įvyksta ovuliacija ir ikrai lengvai pradeda

tekėti iš lytinės angos.

1 pav. Hipofizyje gaminamo gonadotropino veikimo schema

Analogiškai veikia žmogaus chorioninis gonadotropinas (ŽCHG), kadangi jis taip pat

skatina estrogeno ir progesterono išsiskyrimą. Šį gonadotropinį hormoną gamina nėščių moterų

placenta. Nuo hipofizio gonadotropino jis skiriasi amino rūgščių eiliškumu, todėl jo veikimo

efektyvumas įvairių rūšių žuvims yra skirtingas. Pavyzdžiui, dvi dozės po 200 TV ŽCHG

6

sėkmingai naudojamos sterko patelių ikrų vystymuisi skatinti ir sinchroniniam ikrų surinkimui

net ne neršto sezono metu (Zakęś & Demska- Zakęś, 2004; Zakęś & Demska- Zakęś, 2005). Tuo

tarpu maišažiaunio šamo Heteropneustes fossilis subrendusių ikrų gavimui naudojamos gerokai

didesnės dozės – 1000- 2000-3000 TV ( Metwally & Fouad, 2008).

2.2. Žmogaus chorioninio gonadotropino paruošimas injekcijoms

Tiriant žmogaus chorioninio gonadotropino poveikį lydekoms, buvo naudojamas

farmacijos pramonėje gaminamas ir Lietuvoje platinamas pregnilas („Pregnyl“), kuris priklauso

vaistų, vadinamais gonadotropiniais, grupei ir kurio veiklioji medžiaga yra žmogaus chorioninis

gonadotropinas (ŽCHG). Į jo pakuotę įeina dvi ampulės: viena – su milteliais, turinčiais 5000

TV (tarptautinių vienetų) ŽCHG, ir kita – su tirpikliu (9 mg natrio chlorido + 1 ml injekcinio

vandens) injekcijoms ruošti (2 pav.). Viena tokia „ Pregnyl“ pakuotė vaistinėse kainuoja apie 32

Lt. Kaip matyti „Priedo“ 1 pav., tarp pramonės gaminamų įvairių hormoninių preparatų, skirtų

žuvų injekavimui, yra ir žmogaus chorioninis gonadotropinas, tačiau jo kaina apie pusantro karto

didesnė lyginant su pregnilo, t.y. 5000 TV ŽCHG kainuoja 49 lt.

2 pav. Lietuvoje platinamo „Pregnyl“, kurio veiklioji medžiaga žmogaus chorioninis

gonadropinas (ŽCHG), pakuotė

Lydekų ikrų subrendimui skatinti buvo naudojamos įvairios pregnilo dozės – nuo 200,

iki 1600 TV/kg KM (kūno masės). Kad hormoninį preparatą būtų lengviau dozuoti, mes vienos

ampulės miltelius, ištirpintus tirpiklyje (1 ml), dar praskiesdavom fiziologiniu tirpalu (0,9 %

7

NaCl) iki 10 ml. Taigi vienas ml paruošto tirpalo injekcijoms turėjo 500 TV ŽCHG. Pregnilą

laikėme šaldytuve.

2.3. Reproduktorių gaudymas

Lydekos reproduktoriai tyrimams buvo žvejojami Rubikių ež. ir Laukystos žuvų

veislyne kovo-balandžio mėn. Rubikių ež. tinklus pradėdavom statyti dar esant ledui, kad

surinktume kuo daugiau nesubrendusių patelių (3 A pav.). Žvejyba buvo tęsiama ir jam nutirpus.

Tuomet pagrindinai gaudėsi tekančios patelės. Laukystos veislyno tvenkinyje lydekų žvejyba

buvo organizuojama dar neprasidėjus jų nerštui (3 B pav.).

A

B

3 pav. Reproduktorių gaudymas: A – Rubikių ež., B – Laukystos žuvų veislyno tvenkinyje

8

Lydeka yra labai jautri žuvis. Nors jos

nepuola saprolegnija taip kaip sterką, tačiau dėl

aplinkos pokyčių ar mechaninio streso, gali sustoti

oocitų vystymasis ir prasidėti jų rezorbcija.

Literatūroje nurodoma (Кох ir kt.,1980), kad

dirbtiniam veisimui lydekų negalima gaudyti

elektros agregatu, nes patelių lytinė anga elektros

lauke užsidaro, ir ji nebeduoda ikrų. Todėl su

lydekos patelėmis negalima elgtis kaip su

prekinėmis žuvimis (4 pav.). Jas reikia stengtis

kuo mažiau traumuoti. Mes išimtas iš tinklų

lydekas iš kart perkeldavom į gabenimui skirtus

polietileninius maišus su vandeniu.

Eksperimentui panaudotų žuvų kiekis

parodytas 1 lentelėje. Sugautas žuvis pasverdavom

išmatuodavom jų ilgius ir paimdavom žvynus

amžiaus nustatymui. Gauti duomenys buvo surašomi į lentelę (žr. „Priedą“, 1 lent.).

1 lentelė. Eksperimentui panaudotų žuvų kiekis (vnt.)

Lytis

Oocitų subrendimo

stadija

Metai

Viso 2011 2012

Nesubrendusios patelės (injekavimui) I 5 3 8

II 4 12 16

III 6 8 14

IV 2 4 6

Nesubrendusios patelės (kontrolei) I 2 2 4

II 2 2 4

III 2 2 4

IV 2 2 4

Subrendusios patelės (kontrolei) 3 2 5

Patinėliai 22 14 36

2.4. Lydekos patelių subrendimo įvertinimas

Sugautas nesubrendusias pateles iš maišų su vandeniu perkeldavom į vonias su

anestetiku (5 ml 2-phenoxyethanol ištirpinta 10 l vandens). Iš užmigdytų žuvų, prieš tai atlikę

biologinę analizę, kateterio pagalba atsargiai paimdavom nedidelį kiekį ikrų, išsivystymo stadijai

nustatyti (5 pav.). Po to juos supildavom į mėgintuvėlius su Stockardo tirpalu (50 ml formalino,

4 pav. Netinkamas elgesys su lydekų

patelėmis

9

40 ml ledinės acto rūgšties, 60 ml glicerino, 850 ml distiliuoto vandens). Šiame tirpale

nepermatomi ikrai nuskaidrėja, todėl po mikroskopu geriau matosi jų išsivystymo stadija.

5 pav. Ikrų paėmimas iš patelės kateterio pagalba

Lydekos patelių subrendimą vertinome pagal branduolio padėtį ikrelyje (Bruzka,

Bieniarz, 1977). Pasibaigus vitelogenezei, ikrelio vidury esantis branduolys pradeda migruoti

link animaliniame poliuje esančios mikropilės. Išskiriamos 4 ikrų subrendimo stadijos (6 pav.):

I stadija – branduolys yra centre. Ikrai šviesiai gelsvos spalvos, nepermatomi, Stockardo

tirpale nuskaidrėja po 2-5 min.;

II stadija –branduolys pradeda judėti iš centro link periferijos. Ikrai Stockardo tirpale

nuskaidrėja po 2-3 min.

III stadija – branduolys visai priartėja prie periferijos. Ikrai pradeda skaidrėti, todėl

Stockardo tirpale juos pakanka laikyti 1-3 min.;

IV stadija – branduolio nebematyti, nes, pasiekus periferiją, suyra jo membrana. Todėl

ikrai , Stockardo tirpale laikomi 0,5-2 min

Pasibaigus IV stadijai, ikrai išsilaisvina iš folikulo, įvyksta ovuliacija ir patelė pradeda

duoti ikrus.

I-IV subrendimo stadijos ikrai, patalpinti į Stockardo tirpalą išlaiko savo apvalią formą.

Jei ikrai minėtame tirpale subliūkšta, vadinasi prasidėjo ovuliacija arba jų rezorbcija.

Nustatytas patelių ikrų subrendimo stadijas surašydavom į lentelę (žr. „Priedą“, 1 lent.)

kartu su biologiniais rodikliais.

10

6 pav. Ikrų subrendimo stadijos: I stadija – branduolys centre; II stadija– branduolys pradeda

judėti link periferijos; III stadija – branduolys visai arti periferijos ; IV stadija – branduolio

nebematyti, nes, pasiekus periferiją, suyra jo membrana. Po šios stadijos seka ovuliacija

2.5. Reproduktorių laikymas

Po biologinės analizės ir ikrų bandinių paėmimo lydekos buvo perkeliamos į varžas.

Pateles laikėme atskirai nuo patinėlių. Subrendusias pateles iki ikrų paėmimo laikydavom

neilgiau 3-4 dienų, kad neperbręstų ikrai. Kiekvienai nesubrendusiai patelei buvo skirta atskira

varža, kurios numeris sutapo su duomenų lentelėje (žr. priedą) nurodytu žuvies numeriu.

Pav. 7 A parodytos kubo formos varžos skirtos lydekų laikymui, įrengtos viename iš

Laukystos tvenkinių. Kad žuvys neiššokinėtų, jos būdavo uždengiamos vieliniu tinklu (7 pav. B).

7 pav. Lydekos reproduktorių laikymas Laukystos žuvų veislyne: A – varžos įrengtos viename iš

tvenkinių; B – varžos uždengtos tinkline medžiaga, kad neiššokinėtų žuvys

11

Rubikių ežere sugautas lydekas laikėme pailgose tinklinėse varžose (8 pav. A),

pastatytose ežero pakrašty. Kadangi žvejybos pradžioje ežeras dar būdavo užšalęs, jas į vandenį

nuleisdavom per iškirstas eketes (8 pav. B). Atšutus pakraščiams, varžas statydavom įsibridę į

vandenį 0,5–1 m gylyje (8 pav. C).

8 pav. Lydekos reproduktorių laikymas Rubikių ež.: A – varža žuvų laikymui; B – Varžos

statymas eketėje, C – varžos statymas atšutus pakraščiams

2.6. Lydekos patelių injekavimas

Nustačius ikrų subrendimo stadiją, patelės buvo injekuojamos pregnilu. Vieni literatūros

šaltiniai nurodo, kad žuvis geriau injekuoti į raumenis, kiti – į pilvo ertmę. Pavyzdžiui veidrodinį

karpį rekomenduojama injekuoti į raumenis žemiau nugarinio peleko, o paprastąjį – į pilvo ertmę

už pilvinių pelekų. Tačiau literatūroje (Thalathiah ir kt., 1988) nurodoma, kad ŽCHG dažniausiai

leidžiamas į nugaros raumenis virš šoninės linijos. Mes pregnilą leidome taip pat į raumenis.

Lydekos patelės labai ramios, todėl prieš injekcijas jų nebeužmigdydavom. Varžą kartu

su lydeka iškeldavom iš vandens, atsargiai nunešdavom į krantą, kur suleisdavom pregnilą (9

pav.). Didesnių patelių net neišimdavom iš varžos. Po to varžą su injekuota žuvimi vėl

pernešdavom į vandenį. Taip pat darydavom, kai norėdavom patikrinti ar patelės subrandino

ikrus.

12

Priklausomai nuo oocitų

subrendimo stadijos lydekos buvo

injekuojamos įvairiomis pregnilo

dozėmis. Žuvims buvo daroma viena

arba dvi pregnilo injekcijos. Antrą

kartą žuvys buvo injekuojamos po

dviejų dienų. Dozių dydis ir injekcijų

skaičius pateiktas 10 pav. Be to,

norėdami išsiaiškinti, kokią įtaką

pregnilo veikimo efektyvumui turi

sugautų žuvų laikymo trukmė iki

pirmos injekcijos, dalį sugautų patelių

injekuodavom valandos bėgyje, prieš

tai nustatę oocitų subrendimo stadiją, dalį po pusės paros (2 grupė) ir dalį po paros (3 gr.). 2011

m, , laukdami kol vandens temperatūra pakils iki 7OC, nesubrendusias lydekos pateles laikėme

net 12 d. ir tik tada injekavome 800 TV/kg KM pregnilo doze.

10 pav. Pregnilo dozių ir injekcijų skaičius, panaudotas lydekos patelių subrendimui skatinti

Oocitų subrendimo

stadijos

I

II

III

1-ma injekcija

200 TV/kg

1-ma injekcija 200 TV/kg

IV

2-ra injekcija

200 TV/kg

1-ma injekcija 400 TV/kg

1-ma injekcija

400 TV/kg

2-ra injekcija

400 TV/kg

1-ma injekcija 400 TV/kg

2-ra injekcija 800 TV/kg

1-ma injekcija 800 TV/kg

2-ra injekcija 800 TV/kg

2-ra injekcija

400 TV/kg

1-ma injekcija 200 TV/kg

2-ra injekcija 800 TV/kg

1-ma injekcija

400 TV/kg

2-ra injekcija

200 TV/kg

2-ra injekcija

400 TV/kg

1-na injekcija

200 TV/kg

1-na injekcija

200 TV/kg

9 pav. Lydekos patelės injekavimas pregnilu

13

2.7. Ikrų apvaisinimas ir inkubavimas

Subrendusios patelės ikrus apvaisindavom kelių patinėlių pieniais sausuoju metodu.

Apvaisinimui naudojome 0,7% valgomosios druskos HCl (6.5 g HCl ištirpinta 1 litre vandens) ir

karbamido CO(NH2)2 (15 g CO(NH2)2 ištirpinta 10 l vandens) tirpalų mišinį santykiu 1:1. Po

apvaisinimo ikrai kelis kartus buvo perplaunami švariu vandeniu, kad išsiplautų gleivės ir pienių

likučiai. Lipnumui pašalinti naudojome tanino tirpalą (1 g tanino ištirpinta 1 l vandens). Švarius

ikrus užpildavom tanino rūgšties tirpalu santykiu 1:2 lipnumui pašalinti. Šiame tirpale juos

atsargiai maišydavom 2 min. Po to kelis kartus perplaudavom švariu vandeniu.

Dalį taip paruoštų patelės ikrų supildavom į Petri lėkštelę. Juos paskleisdavom vienu

sluoksniu per visą dugną. Kiekviena Petri lėkštelė turėjo atskirą numerį, kuris atitiko tos žuvies,

numerį lentelėje (žr. „Priedą“, 1 lent).

A C

B

11 pav. Ikrų inkubavimas: A – kaskadomis

įrengtos vonelės; B – ant tinkline mežiaga

aptraukto medinio rėmelio išdėliotos Petri

lėkštelės su ikrais; C – tarp dviejų rėmelių

suspaustos Petri lėkštelės, panardintos į vandenį

Ikrus inkubavome kaskadomis įrengtose vonelėse (11 pav. A). Ant tinkline medžiaga

aptraukto rėmelio išdėliodavom neuždengtas Petri lėkšteles su ikrais (11 pav. B). Kad ikrai

14

neišsiplautų, ant viršaus uždėdavom kitą tokį pat rėmelį. Abu rėmelius suspausdavom ir

nuleisdavom į vandenį (11 pav. C). Į voneles pastoviai iš viršaus smulkiomis srovelėmis buvo

tiekiamas vanduo. Jo temperatūra svyravo nuo 9 iki 11OC. Kiekvieną dieną suskaičiuodavom

pabalusius negyvus ikrus, kuriuos pašalindavom, kad neįsimestų saprolegnija. Apie ikrų kokybę

spręsdavom iš jų išeigos akutės stadijoje.

3. TYRIMŲ REZULTATAI

3.1. Tyrimams panaudotų lydekos reproduktorių biologinė charakteristika

Viso tyrimams panaudota 65 patelės ir 36 patinėliai. Žuvų biologiniai rodikliai pateikti

2 lent. Lydekų amžius svyravo nuo 3 iki 12 metų. Didžiausia sugauta patelė svėrė 7600 g.

Kadangi dirbtiniam veisimui tinkamiausi vidutinio dydžio reproduktoriai – patinėliai, sveriantys

1–1,5 kg, patelės – 1-3 kg, daugumos tyrimams atrinktų žuvų amžius buvo 4–6 metai.

2 lentelė. Tyrimams panaudotų lydekos reproduktorių biologiniai rodikliai

Amžius N,

vnt.

Bendras ilgis (L), cm Kūno ilgis (l), cm Masė, g

Vidurkis Min-max Vidurkis Min-max Vidurkis Min-max

Nesubrendusios patelės injekavimui

3 3 44,2 44,0-44,5 39,1 38,5-40,0 492 420-556

4 15 53,5 50,0-59,5 47,5 45,0-52,0 981 820-1200

5 11 57,3 52,0-59,5 50,9 48,0-57,0 1275 1000-1650

6 10 65,1 55,0-70,0 57,5 47,0-62,0 1869 1650-2050

7 2 76,0 73,0-79,0 69,0 66,5-71,5 2600 2500-2700

9 1 84,0 75,0 3700

11 1 100,0 90,0 6000

12 1 107 96 7600

Nesubrendusios patelės kontrolei

3 7 42,7 39,0-44,0 37,3 34,0-38,7 467 400-550

4 9 53,6 51,5-56,0 47,1 45,5-48,5 980 920-1200

Subrendusios patelės kontrolei

3 1 44,0 38,5 500

4 4 53,9 51,5-59,0 48,0 45,5-53,5 940 860-1100

Patinėliai

4 3 45,3 46,0-44,5 40,2 39,0-41,0 667 600-700

5 21 51,3 50,0-56,0 45,2 44,0-49,5 1010 900-1200

6 12 59,6 55,0-64,0 52,9 47,0-58,0 1620 1550-1700

15

3.2. Įvairių pregnilo dozių įtaka skirtingų stadijų oocitų subrendimui

Gauti tyrimų duomenys pateikti 3 lent. Pirmos grupės patelės buvo injekuojamos

valandos bėgyje po sugavimo. Priklausomai nuo oocitų subrendimo stadijos, pregnilo dozės

svyravo nuo 200 iki 1600 TV/kg KM. Lydekų, sugautų kovo mėn. prieš neršto sezoną, oocitai

buvo I-os subrendimo stadijos ir tik viena patelė, sugauta neršto sezono metu balandžio

pradžioje, taip pat dar turėjo šią stadiją. Jų injekavimas dviem pregnilo dozėm, kurių bendra

suma buvo 1200 ir 1600 TV/kg KM nedavė jokių rezultatų. Įtakos galėjo turėti žemos vandens

temperatūros telkiniuose, kurios tyrimo metu neviršijo 5OC. Žuvis laikyti talpose prie aukštesnių

temperatūrų neturėjome galimybės. Taigi, kol neprasidėjusi branduolio migracija link periferijos,

šios tirtos pregnilo dozės patelėms prie minėtų vandens temperatūrų ovuliacijos nesukėlė.

Kadangi vandens temperatūra turi įtakos ikrų vystymuisi, manome, kad po pirmos injekcijos

lydekų laikymas talpose, kur vandens temperatūra yra 7-9OC, gali padidinti pregnilo veikimo

efektyvumą. Tam išsiaiškinti reikalingi papildomi tyrimai.

3 lentelė. Įvairių pregnilo dozių efektyvumas lydekos patelių, turinčių įvairias oocitų subrendimo

stadijas, ovuliacijai

Patelių

grupė

Laiko tarpas tarp

sugavimo ir

pirmos injekcijos,

val.

Oocitų

subrendimo

stadija

Patelių

skaičius,

vnt.

Pirmos

injekcijos

dozė,

TV/kg KM

Antros

injekcijos

dozė,

TV/kg KM

Ovuliavusių

patelių,

%

1 0-1 I 1 400 800 0

3 800 800 0

II 5 200 200 40

6 400 400 83

III 4 200 75

4 200 200 100

IV 4 200 100

2 12 II 2 400 400 0

III 2 200 200 0

2 400 400 50

IV 2 200 100

3 24 II 2 400 400 0

1 200 800

0

III 2 400 400 0

Pirmos grupės patelės, sugautos neršto sezono metu, kurios turėjo II-os subrendimo

stadijos oocitus, buvo injekuotos dviem pregnilo dozėm – po 200 ir 400 TV/kg, t,y, bendroje

16

sumoje jos sudarė atitinkamai 400 ir 800 TV/kg KM. Gauti tyrimų duomenys parodė, kad 40 %

patelių, gavusių 400 TV/kg KM, ir 83 % patelių, gavusių 800 TV/kg KM, subrandino ikrus.

Kaip matyti 3 lent., 75 % patelių, turinčių III–čios subrendimo stadijos oocitus,

ovuliavo po vienos 200 TV/kg KM pregnilo injekcijos, o visos – po dviejų tokio pat dydžio

injekcijų. Tuo tarpu lydekos, kurių oocitai buvo IV-os stadijos, ikrus subrandino po vienos 200

TV/kg KM pregnilo dozės.

Lyginant pregnilo veikimo efektyvumą įvairaus amžiaus patelėms, statistiškai patikimų

skirtumų nenustatyta (p>0,05).

Pažymėtina, kad visos kontrolei paliktos nesubrendusios patelės, kurioms nebuvo

daromos pregnilo injekcijos, ikrų nesubrandino.

Žuvų veislynuose ne visada yra galimybės nustatyti dirbtiniam veisimui sugautų

lydekos patelių oocitų subrendimo stadijas. Praktika parodė, kad jei patelėms stipriau paspaudus

pilvą, kaip ir patinėliams, plona srove ištrykšta šlapimas, oocitai yra dar tik I–os stadijos.

Kuomet paspaudus pilvą, pasirodo keletą matinių gelsvų ikrelių – oocitai yra II–os stadijos. Jei

ikrai dar labai sunkiai spaudžiasi, bet jau nuskaidrėję – oocitai yra III–os ar net IV stadijos.

Taigi atlikti tyrimai parodė, kad pregnilas, gali būti naudojamas lydekos patelių

subrendimui skatinti. Žuvys, turinčios II-ros stadijos oocitus, turi būti injekuojamos dviem

pregnilo dozėm po 400 TV/kg KM; turinčios III-čios stadijos oocitus, – viena 200 TV/kg KM

doze, o jei po jos dar nesubrandina ikrų, antra tokia pat dydžio pregnilo doze; turinčios IV-tos

stadijos oocitus, – viena 200 TV/kg KM doze.

3.3 Nesubrendusių patelių laikymo iki pirmos injekcijos trukmės įtaka pregnilo veikimo

efektyvumui

2011 m. keturios patelės, sugautos prieš nerštą, buvo laikomos varžose kol vandens

temperatūra nuo 5O C pakilo iki 7

O C, t.y. 12 dienų, ir tik tada injekuotos 400 TV/kg KM

pregnilo doze. Po dviejų dienų, joms nesubrandinus ikrų, buvo suleista antra tokio pat dydžio

pregnilo dozė. Nei viena patelė nedavė ikrų, nors varžose buvo laikomos dar visą savaitę, prie

nerštui palankios vandens temperatūros. Gali būti, kad šio hormoninio preparato veikimui

neigiamos įtakos galėjo turėti patelių ilgas laikymas nelaisvėje prieš injekavimą. Norėdami

nustatyti, kokią įtaką pregnilo veikimo efektyvumui turi sugautų žuvų laikymo trukmė iki pirmos

injekcijos, dalį nesubrendusių patelių injekavome ne valandos bėgyje po sugavimo (1-ma grupė),

o praėjus 12 val. (2-ra grupė). Kaip matyti 3 lent., šios lydekos, turinčios II-rą oocitų subrendimo

stadiją, injekuotos dviem pregnilo dozėm po 400 TV/kg KM, ikrų nesubrandino, nors daugumai

1-os grupės patelių tokio pat dydžio injekcijos sukėlė ovuliaciją.

17

Antros grupės patelių, turinčių III-os stadijos oocitus, dvi pregnilo dozės po 200 TV/kg

KM taip pat nepaveikė (3 lent.). Tik dvigubai didesnė dozė (dvi injekcijos po 400 TV/kg KM)

pusei patelių sukėlė ovuliaciją. Tuo tarpu patelėms turinčioms IV-tos stadijos oocitus, 12 val.

laikymas įtakos neturėjo. Jos po vienos 200 TV/kg KM injekcijos pradėjo duoti ikrus.

Trečios grupės lydekos buvo laikomos 24 val iki pirmos injekcijos. Pregnilo dozės,

kurių bendra suma patelėms, turinčioms II-ros stadijos oocitus, siekė 800 ir 1000 TV/kg KM, o

patelėms, turinčioms III-čios stadijos oocitus, – 800 TV/kg KM, teigiamų rezultatų nedavė.

Gauti tyrimų rezultatai parodė, kad sugautos nesubrendusios lydekos patelės pregnilu

turi būti injekuojamos kiek galima greičiau, rekomenduojama valandos bėgyje.

3.4. Injekuotų patelių ikrų gyvybingumas ir kokybė

Injekuotas lydekas tikrinom kiekvieną dieną. Dalies ovuliavusių patelių ikrai buvo

dirbtinai apvaisinti tą pačią dieną, kitų – po dviejų parų. Ikrų, paimtų iš ką tik ovuliavusių

patelių, išeiga akutės stadijoje, buvo mažiausia (svyravo nuo 49 iki 56%, vidutinė – 52,5%). Tuo

tarpu ikrų, paimtų po dviejų dienų, išeiga svyravo nuo 70 iki 74% (vidutinė – 71,8%). Statistinė

duomenų analizė parodė, kad ji nepriklausė nei nuo pradinės oocitų subrendimo stadijos, nei nuo

pregnilo dozės ir statistiškai patikimai nesiskyrė (p > 0,05) nuo neinjekuotų kontrolinių

subrendusių patelių ikrų išeigos, kuri svyravo nuo 70 iki 75% (vidutinė – 72,2%). Gauti tyrimų

rezultatai parodė, kad ikrai iš injekuotų subrendusių patelių turi būti imami po dviejų dienų.

18

4. IŠVADOS

1. Įvairiomis hormoninio preparato „Pregnyl“ dozėmis, kurios svyravo nuo 200 iki 1600

TV/kg kūno masės (KM), buvo injekuotos 44 nesubrendusios lydekos patelės. Nustatyta, kad

pregnilas, kurio veiklioji medžiaga yra žmogaus chorioninis gonadotropinas (ŽCHG), gali būti

naudojamas lydekos patelių II, III ir IV subrendimo stadijų oocitų vystymuisi skatinti ir jų

ovuliacijai sukelti.

2. Gauti tyrimų duomenys parodė, kad pregnilo dozių dydis, sukeliantis oocitų

ovuliaciją, priklausė nuo jų subrendimo stadijos. Ikrus subrandino 83 % patelių, kurių oocitai

buvo II-ros stadijos, injekuotos dviem pregnilo dozėm po 400 TV/kg KM. Viena 200 TV/kg KM

pregnilo dozė sukėlė ovuliaciją 75 % patelių, kurių oocitai buvo III-os stadijos, ir dvi tokio pat

dydžio dozės – visoms patelės. Lydekoms, kurių oocitai buvo IV-os stadijos, ikrus subrandino po

vienos 200 TV/kg KM pregnilo dozės.

3. Nesubrendusių patelių laikymo iki pirmos injekcijos trukmė turi neigiamos įtakos

pregnilo veikimo efektyvumui. Ikrus subrandino 83 % patelių, turinčių III-os stadijos oocitus,

injekuotos valandos bėgyje po sugavimo, 50 % patelių, injekuotų, praėjus 12 val. po sugavimo, ir

nei viena patelė nedavė ikrų, injekuota praėjus 24 val. po sugavimo, kurios buvo gavusios 800

TV/kg KM pregnilo dozę.

4. Ikrų, paimtų iš ką tik ovuliavusių patelių, išeiga akutės stadijoje svyravo nuo 49 iki

56% (vidutinė – 52,5%). Tuo tarpu ikrų, paimtų po dviejų parų, išeiga svyravo nuo 70 iki 74%

(vidutinė – 71,8%).

5. Statistinė duomenų analizė parodė, kad injekuotų patelių ikrų išeiga akutės stadijoje

nepriklausė nei nuo pradinės oocitų subrendimo stadijos, nei nuo pregnilo dozės ir statistiškai

patikimai nesiskyrė (p > 0,05) nuo neinjekuotų kontrolinių subrendusių patelių ikrų išeigos, kuri

svyravo nuo 70 iki 75% (vidutinė – 72,2%).

19

5. REKOMENDACIJOS

Norint paruošti tirpalą injekcijoms, kurio 1 ml turėtų 500 TV žmogaus chorioninio

gonadropino (ŽCHG), „Pregnil“ pakuotėje vienoje ampulėje esančius miltelius reikia sumaišyti

su kitoje ampulėje esančiu 1 ml tirpalu, ir po to dar praskiesti fiziologiniu tirpalu (0,9 % NaCl)

iki 10 ml. Likęs nuo injekcijų tirpalas laikomas šaldytuve, bet neilgiau kaip savaitę.

Reproduktoriai natūraliuose vandens telkiniuose gaudomi prasidėjus lydekų nerštui,

tvenkiniuose – kuomet vandens temperatūra pasiekia 7OC arba pastebėjus neršiančias žuvis.

Kadangi lydekos patelės yra labai jautrios mechaniniams stresams, dėl ko gali sustoti

ikrų vystymasis ir net prasidėti jų rezorbcija, su jomis negalima elgtis, kaip su prekinėmis

žuvimis. Visos operacijos atliekamos kiek galima mažiau traumuojant žuvis.

Sugautas nesubrendusias lydekos pateles rekomenduojama injekuoti pregnilu valandos

bėgyje.

Patelės, kurių oocitai yra II-os subrendimo stadijos, injekuojamos dviem pregnilo

dozėm po 400 TV/kg kūno masės (KM).

Patelės, kurių oocitai yra III-os subrendimo stadijos, injekuojamos viena 200 TV/kg

KM doze, o jei po dviejų parų dar nesubrandina ikrų, antra tokia pat dydžio pregnilo doze;

Patelės, kurių oocitai yra IV-os subrendimo stadijos, injekuojamos viena 200 TV/kg

KM pregnilo doze.

Antrą kartą pregnilu patelės injekuojamos po dviejų parų.

Nesant galimybei nustatyti kokios stadijos yra oocitai, sugautos nesubrendusios patelės

injekuojamos viena 400 TV/kg KM pregnilo doze, o jei po dviejų parų neduoda ikrų – antra 400

TV/kg KM pregnilo doze.

Injekuotas pateles rekomenduojama laikyti 7-9OC temperatūroje. Jas tikrinti reikia kas

antrą dieną. Iš ovuliavusių patelių ikrai imami po dviejų parų.

Esant dabartinėm „Pregnyl“ kainom, vienos patelės, sveriančios 1 kg, injekavimas viena

400 TV/kg KM doze kainuoja apie 2,5 Lt.

20

LITERATŪRA

Brzuska E., 2008. Efektywność rozrodu suma europejskiego (Silurus glanis) po stymulowaniu

owulacji homogenatem przysadki mózgowej karpia, Ovopelem, LHRH-a lub Ovaprimem.

Biotechnologia w akwakulturze.Olsztyn, IRIS:129-137.

Brzuska E., Bieniarz K., 1977. Metoda preżyciowego określania dojrzałości płeiowej samic

karpia w związku z iniekcjami homogenatu przysadki mózgowej karpia. Broszura IRS, nr.

105, Olsztyn.

Demska- Zakęś K., Zakęś Z., 2002. Controlled spawning of pikeperch Stizostedion lucioperca

(L.), in lake cages. Czech J. Anim. Sci., 47 (6): 230-238.

Hodson R., Sullivan C.V., 1993. Induced maturation and spawning of domestic and wild striped

bass, Morone saxatilis (Walbaum), broodstok with implanted GnRH analogue and injected

hCG.Aquacult. Fish Manage. 24: 389-398.

Houssay, B.A., 1931 Action sexuelle de l'hypophyse sur les poissons et les reptiles. C.R. Soc.

Biol. Paris, 106:377-8

Metwally M.A.A., Fouand I.M., 2008. Some biochemical changes associated with injection of

grass carp (Ctenopharyngodon idellus) with Oviaprim and Pregnyl for induction of

artificial spawning. Global Veterinaria 2 (6): 320-326.

Ohta H., Tanaka H., 1997. Relationship between serum levels of human chorionic gonadropin

(hCG) and 11-ketotestoterone after a single injection of hCG and induced maturity in the

Japanese eel, Anquilla japonica. Aquaculture, 153:123-134.

Szabó T., 2008. Use of Carbopol resin for carp pituitary administration improves the fertilization

percentage of northern pike (Esox lucius Linnaeus) eggs in commercial hatcheries.

Hydrobiologia. 601: 91-97.

von Ihering, R., 1935 Die wirkung von hypophyseninjektion auf den laichakt von fischen. Zool.

Anz., 111:273-79

von Ihering, R., 1937. A method for inducing fish to spawn. Prog. Fish-Cult., 34:15-6.

Zakęś Z., 2003. Wybrane aspekty rozrodu I podchowu sandacza w warunkach kontrolowanych.

Ryby drabieżne:rozród, podchów, profilaktyka. Olsztyn, IRS: 7-20.

Zakęś Z., 2007. Out-of+season spawning of cultured pikeperch [Sander lucioperca (L.)].

Aquaculture research. 38: 1419-1427.

Zakęś Z., 2009. Controlled reproduction of pikeperch Sander lucioperca (L.). A review.

Archivesof Polish Fisheries. 17 (4): 153-170.

21

Zakęś Z., Demska-Zakęś K., 2004. Induces spawning in pikeperch, Sander lucioperca (L.), using

GNRH analog and human chorionic gonadotropin. XI European congres of ishthyology.

Estonia. – P. 166-167.

Zakęś Z., Demska-Zakęś K., 2005. Artifical spawning of pikeperch (Sander lucioperca (L.))

stimulated with human chorionic gonadotropin (hCG) and mammalian GnRH analogue

with dopamine inhibitor. Archives of Polish Fisheries. 13:63-75.

Zakęś Z., Szczepkowski M., 2004. Induction of out-of-season spawning of pikerperch, Sander

lucioperca (L.). Aquaculture International. 12:11-18.

Juodžius P., 1978. Ar turėsime daugiau lydekų. Mūsų gamta. 2: 19.

Веригин Б., 1982. Рыбоводство и рыболовство. 8: 15

Кох В., Банк О., Йенс Г., 1980. Рыбоводство. Москва: 216 с.

SUDERINTA: ………………………

Taikomųjų.mokslinių tyrimų priežiūros

komisijos pirmininkas

2012 m. ……………………mėn. …..d.

22

P R I E D A S

23

1 pav. Pramonės gaminami įvairūs hormoniniai preparatai žuvų injekavimui

24

1 lentelė. Duomenys apie lydekos reproduktorius ir injekcijų dozes

Žuvie

s

Nr.

Sugav

imo

dat

a/val

.

Am

žius,

met

ais

Mas

ė,

g

Ilgis

(L

),

cm

Ooci

tų

subre

ndim

o

stad

ija

I injekcija II injekcija Ovuliacija

Dat

a/val

.

Pre

gnil

o

dozė

,

TV

/kg

Dat

a/val

.

Pre

gnil

o

dozė

,

TV

/kg

Įvyko

Neį

vyko

Nesubrendusios patelės

Subrendusios patelės

Patinėliai