Principio del formularioAISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE SHIGELLA SPP

Apartados de este ejercicio

A. Caractersticas generales de ShigellaB. MaterialC. Medios de cultivo y reactivosD. Fases del aislamiento e identificacin de ShigellaE. Fase 1.-Filtracin de Membrana y Preenriquecimiento en medio lquido lquidoF. Fase 2.-Aislamiento diferencial en medios slidos selectivosG. Fase 3.-Identificacin BioqumicaH. Expresin de los resultadosI. ResumenJ. Introduccin del comentarioK.- Envo al servidor de los resultados del ejercicio

A. Caractersticas generales de Shigella. Shigella es un gnero bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, integrado por bacterias de forma bacilar, no esporuladas, inmviles, pero animados de movimiento pendular (oscilacin) in situ.

Son gramnegativos, aerobios-anaerobios facultativos. Citocromo-oxidasa negativos. Fermentan la glucosa sin produccin de gas; no obstante, se han encontrado algunos biotipos que producen gas de la glucosa. No decarboxilan la lisina. No fermentan la lactosa. No utilizan el citrato como nica fuente de carbono. No crecen en el medio cianuro potsico. Su actividad bioqumica es muy reducida.

El gnero Shigella se divide en cuatro especies: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei.

B. Material Matraces Erlenmeyer. Pipetas estriles de 10 mL y 1 mL. Gradillas. Tubos de ensayo de 16 x 160 mm. Asa de cultivo. Placas de Petri de 90 mm. Estufa de cultivo. Bao Maria.

C. Medios de cultivo y reactivos Caldo de cultivo pH 8 Agar Salmonella-Shigella (S-S) Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (Xylose Lysine Desoxycholate: XLD) Agar MacConkey Agar lisina hierro (Lysine Iron Agar: LIA) Agar TSI Kligler Caldo Urea

D. Fases del aislamiento e identificacin de Shigella 1. Filtracin de Membrana y Preenriquecimiento en medio lquido. 2. Aislamiento diferencial sobre medios slidos selectivos. 3. Confirmacin bioqumica de las colonias sospechosas. E. Fase 1.-Filtracin de Membrana y Preenriquecimiento en medio lquido lquido (Ver vdeo de Filtracin y Preenriquecimiento) Se utiliza la filtracin de membrana para concentrar las bacterias existentes en 100 mL de agua.

En condiciones aspticas, se utiliza un filto de membrana de 0,45 m de tamao de poro que se coloca en el portafiltros de la rampa de filtracin de vaco.

Se coloca el embudo del filtro previamente esterilizado.

Se inicia la filtracin de los 100 mL de agua.

Una vez finalizado, se recoge el filtro con unas pinzas estriles y se coloca dentro de un matraz con Caldo de Cultivo pH 8.

Se incuba el matraz a 37C durante 1-5 das.

F. Fase 2.-Aislamiento diferencial en medios slidos selectivos (Ver vdeo Aislamiento Diferencial) En esta etapa se utilizan medios de cultivo diferenciales que por su composicin permiten que las colonias de Shigella crezcan con un aspecto caracterstico en cada uno de ellos (colonias tpicas)

A partir del cultivo obtenido en el preenriquecimiento sembrar, por duplicado, con asa de cultivo sobre: Agar Salmonella-Shigella (S-S)

Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (Xylose Lysine Desoxycholate: XLD)

Agar MacConkey

AGAR SALMONELLA-SHIGELLA (S-S): CRECIMIENTO CARACTERSTICO (Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

Las colonias sospechosas de Shigella crecidas en Agar Salmonella-Shigella son transparentes, translcidas u opacas y suelen ser lisas. En este medio las colonias de otros microorganismos que fermentan la lactosa (coliformes) son colonias rojizas y en muchos casos mucoides.

COLONIAS SOSPECHOSAS

AGAR XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO (XLD): CRECIMIENTO CARACTERSTICO (Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

Las colonias sospechosas de Shigella crecidas sobre Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) son transparentes y del mismo color que el medio de cultivo (rojo).

Este gnero bacteriano al no fermentar la xilosa, la lactosa ni la sacarosa, no da lugar a que vire a amarillo el rojo fenol. Como tampoco decarboxilan la lisina, no se produce color rojo prpura alrededor de las colonias, al no haberse producido cadaverina.

COLONIAS SOSPECHOSAS

AGAR MAC CONKEY: CRECIMIENTO CARACTERSTICO (Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

Las colonias sospechosas de Shigella en Agar MacConkey son incoloras y transparentes. En este medio las colonias de otros microorganismos que fermentan la lactos (coliformes) son colonias rojizas.

COLONIAS SOSPECHOSAS

Le aconsejamos que se ejercite en la interpretacin de las imgenes comprobando su correcta interpretacin haciendo clic en cada pregunta en la letra azul que antecede a la opcin que le parezca correcta.

Debe selecionar las placas de los distintos medios selectivos en las que observe un crecimiento tpico de Shigella.

Ejemplo 1 Ejemplo 2 Ejemplo 3

Agar S-S

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

Agar XLD

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

Agar MacConkey

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

En este caso:a) Placa seleccionadab) Placa no selecionadaEn este caso:a) Placa seleccionadab) Placa no selecionadaEn este caso:a) Placa seleccionadab) Placa no selecionada

Ejemplo 4 Ejemplo 5 Ejemplo 6

Agar XLD

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar) Agar MacConkey

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar) Agar XLD

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

En este caso:a) Placa seleccionadab) Placa no selecionadaEn este caso:a) Placa seleccionadab) Placa no selecionadaEn este caso:a) Placa seleccionadab) Placa no selecionada

Lectura de resultados sobre agar Salmonella-Shigella del supuesto prctico Se trata de interpretar los resultados obtenidos en las siembras sobre agares selectivos en busca de colonias sospechosas de Shigella. Para ello: 1. Observe las placas buscando colonias sospechosas de Shighella 1. Observe tambin las placas buscando colonias no sospechosas de Shigella 2. Conteste a las preguntas

AGAR SALMONELLA-SHIGELLA (S-S)(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

Placa S-S1 Placa S-S2

Placa S-S3 Placa S-S4

Contestacin a las preguntas 1. Se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de "agar Salmonella-Shigella": a) S-S4b) S-S3, S-S2c) S-S6, S-S4, S-S5 2. No se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de Salmonella-Shigella: a) S-S1, S-S4b) S-S1, S-S2, S-S3c) S-S3

AGAR XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO (XLD)(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

Placa XLD1 Placa XLD2

Placa XLD3 Placa XLD4

Contestacin a las preguntas 3. Se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de Xilosa-Lisina-Desoxicolato: a) XLD4, XLD3 b) XLD1, XLD2c) XLD1 4. No se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de Xilosa-Lisina-Desoxicolato: a) XLD1b) XLD2, XLD3, XLD4c) XLD4, XLD3

AGAR MAC CONKEY(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

Placa Mac1 Placa Mac2

Placa Mac3 Placa Mac4

Contestacin a las preguntas 5. Se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de MaConkey: a) Mac2, Mac3, Mac4b) Mac2c) Mac2, Mac4 6. No se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas deMaConkey: a) Mac1b) Mac4, Mac2c) Mac4, Mac3, Mac1

G. Fase 3.-Identificacin Bioqumica Esta identificacin se suele realizar en 2 subfases: Subfase 4A: Identificacin bioqumica inicial con unas pruebas determinadas: Generalmente, fermentacin de glucosa y lactosa (TSI), descarboxilacin de la lisina (LIA) y utilizacin de la urea.

Subfase 4B: Identificacin bioqumica final con un sistema multipruebas: Generalmente con las 20 pruebas de la galera API20E. Esta subfase slo se realiza con las cepas seleccionadas en la subfase anterior. Subfase 4A. Identificacin bioqumica inicial (Ver vdeo Identidficacin Bioqumica Inicial)

Aislar, como mnimo, dos colonias con aspecto tpico de Shigella de cada uno de los medios de aislamiento selectivo utilizados.

Sembrar cada colonia en Agar Hierro Triple Azcar (TSI), con aguja de cultivo, primero en el fondo por picadura y luego, en la superficie inclinada por estra.

Sembrar, por picadura en el fondo y por estra en la superficie inclinada del medio Agar Lisina Hierro (LIA).

Sembrar, con asa de siembra en Caldo Urea.

Incubar los tubos de TSI y Urea a 37 C durante 24 horas y los de agar LIA a 37 C durante 24-48 horas.

REACCIONES POSITIVAS DE LAS PRUEBAS BIOQUMICAS:

AGAR TRIPLE-AZUCAR-HIERRO

Shigella da la siguiente reaccin sobre TSI:

- Alcalina (rojo) en la superficie inclinada.

- cida (amarillo) en el fondo.

- Sin produccin de SH2 (sin ennegrecimiento del fondo del tubo).

Lactosa (-), Glucosa (+), SH2 (-) con o sin gas

AGAR LISINA-HIERRO

Shigella da la siguiente reaccin sobre LIA:

- Alcalina (color prpura) en la superficie inclinada.

- cida (amarillo) en el fondo.

- Sin Produccin de SH2 (ennegrecimiento del fondo del tubo).

LCD (-), SH2 (-)

CALDO UREA

Las Shigella no son capaces de utilizar urea.

El medio urea continen contiene un indicador de pH que vira a color rosa fuerte cuando la reaccion es positiva.

La reaccin debe ser negativa: urea (-). Permanece el mismo color que antes de la incubacin

REACCIN NEGATIVA

REACCIN POSITIVA

Seleccionar todos los cultivos que muestren crecimiento caracterstico de Shigella sobre agar TSI, se correspondan o no con la reaccin de dichos cultivos en agar LlA.

No desechar los cultivos atpicos sobre agar TSI cuando la reaccin sobre agar LIA es tpica.

Desechar los cultivos que no se correspondan con el crecimiento tpico de las Shigella sobre agar TSI ni con el de agar LIA.Caso 1 Caso 2 Caso 3 Caso 4

TSITpico Tpico Atpico Atpico

LIATpico Atpico Tpico Atpico

Seleccionar Seleccionar Seleccionar Desechar

Desechar todos los cultivos que den urea positivosTSI LIA Urea

Caso 1Tpico Tpico Negativo Seleccionar

Caso 2Tpico Tpico Positivo Desechar

Caso 3Tpico Atpico Negativo Seleccionar

Caso 4Tpico Atpico Positivo Desechar

Caso 5Atpico Tpico Negativo Seleccionar

Caso 6Atpico Tpico Positivo Desechar

Caso 7Atpico Atpico Negativo Desechar

Caso 8Atpico Atpico Positivo Desechar

Le aconsejamos que se ejercite en la interpretacin de las imgenes comprobando su correcta interpretacin haciendo clic en cada pregunta en la letra azul que antecede a la opcin que le parezca correcta.

Debe selecionar los tubos de las distintas prubas bioqumicas en las que observe una reaccin tpica de Shigella.

Ejemplo 1 Ejemplo 2 Ejemplo 3 Ejemplo 4

Agar TSI

Agar TSI

Agar TSI Agar TSI

En este caso:a) Tubo seleccionadob) Tubo no selecionadoEn este caso:a) Tubo seleccionadob) Tubo no selecionadoEn este caso:a) Tubo seleccionadob) Tubo no selecionadoEn este caso:a) Tubo seleccionadob) Tubo no selecionado

Ejemplo 4 Ejemplo 5 Ejemplo 6

Agar LIA Agar LIA Agar LIA Agar LIA

En este caso:a) Tubo seleccionadob) Tubo no selecionadoEn este caso:a) Tubo seleccionadob) Tubo no selecionadoEn este caso:a) Tubo seleccionadob) Tubo no selecionadoEn este caso:a) Tubo seleccionadob) Tubo no selecionado

Lectura de resultados de la confirmacin bioqumica inicial del supuesto prctico

Colonias TSI LIA Urea ContestacinPreguntas

Colonia 1 7. Esta colonia debe ser:

SeleccionadaDesechada

Colonia 2

8. Esta colonia debe ser:

SeleccionadaDesechada

Colonia 3 9. Esta colonia debe ser:

SeleccionadaDesechada

Colonia 4 10. Esta colonia debe ser:

SeleccionadaDesechada

Colonia 5 11. Esta colonia debe ser:

SeleccionadaDesechada

Colonia 6 12. Esta colonia debe ser:

SeleccionadaDesechada

Colonia 7 13. Esta colonia debe ser:

SeleccionadaDesechada

Subfase 4B. Identificacin bioqumica final (Ver vdeo galera API)

Con las colonias seleccionadas en la identificacin bioqumica inicial se efecta lo siguiente:

A partir de los tubos positivos de TSI o LIA, sembrar una galera de identificacin bioqumica partiendo de los cultivos seleccionados.

Habitualmente se hace una galera API 20E que consiste en 20 pruebas bioqumicas y que permite identificar el microorganismo al menos a nivel de Gnero y en muchos casos tambin a nivel de Especie.

Lectura de resultados de la confirmacin bioqumica final del supuesto prctico

Cepas API20EAyuda Interpretacin Resultados Contestacin preguntas

Seleccionada 1 Ver perfiles numricos

14. La codificacin corresponde a:

0104140 Shigella flexneri0104521 Yersinia enterocolitica2504752 Salmonella spp.3005573 Enterobacter cloacae0776000 Proteus mirabilis.5044124 Vibrio cholerae5306761 Serratia marcescens6504750 Salmonella spp. 7704752 Salmonella spp.1104112 Shigella sonnei

Seleccionada 2 Ver perfiles numricos

15. La codificacin corresponde a:

0104452 Salmonella paratyphi A1104112 Shigella sonnei4104100 Salmonella gallinarum4504010 Salmonella pullorum5100100 Yersinia ruckeri0676001 Proteus vulgaris5306761 Serratia marcescens5704552 Salmonella arizonae6004540 Salmonella typhi0104140 Shigella flexneri

Seleccionada 3 Ver perfiles numricos

16. La codificacin corresponde a:

5044560 Escherichia coli1104112 Shigella sonnei7004743 Klebsiella ozaenae0206042 Acinetobacter calcoaceticus0104452 Salmonella paratyphi A0774000 Proteus mirabilis0676001 Proteus vulgaris0104140 Shigella flexneri5204024 Pseudomonas cepacea6704752 Salmonella sp

Seleccionada 4 Ver perfiles numricos

17. La codificacin corresponde a:

5044560 Escherichia coli0104140 Shigella flexneri7004743 Klebsiella ozaenae0104452 Salmonella paratyphi A1104112 Shigella sonnei0774000 Proteus mirabilis0676001 Proteus vulgaris5346761 Serratia marcescens5204024 Pseudomonas cepacea6704532 Salmonella sp

H. Expresin de los resultados Expresion final delos resultados de la investigacin de Salamonelas en la muestra

Criterios Contestacin a las preguntas

Si la confirmacin bioqumica ha resultado positiva para alguna de las cepas : Expresar los resultados como Presencia de Shigella en 100 mL de agua En casi contrario, expresar los reultados como: Ausencia de Shigella en 100 mL de agua 18. El aislamiento e investigacin de Shigella en la muestra del supuesto prctico ha dado como resultado: a) Presencia de Shigella en 100 mL de agua

b) Ausencia de Shigella en 100 mL de agua

I. Resumen 1 Filtracin de Membrana y Preenriquecimiento en medio lquido100 mL de agua + 100 mL de Caldo de Cultivo pH 8

Incubar 37C/1-5 das

2 Aislamiento diferencial sobre medios slidos selectivos.- Agar Salmonella-Shigella (S-S)

- Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (Xylose Lysine Desoxycholate: XLD)

- Agar MacConkey

Seleccionar colonias tpicas

3 Confirmacin Bioqumica- Agar TSI. Incubar 37C/24 horas

- Agar LIA. Incubar 37C/24 horas

- Citrato de Urea

Si dan resultados tpicos de Shigella, realizar Galeria API 20E.

4 Expresin de los resultadosExpresar los resultados como:

Presencia de Shigella en 100 mL de agua

Ausencia de Shigella en 100 mL de agua