Agregacija proteinov

Avtor: Uros Markoja

Mentor: doc. dr. Miha Ravnik

Ljubljana, Maj 2014

Povzetek

Agregacija proteinov je danes eno najbolj vrocih raziskovalnih podrocij. Z obravnavotega pojava je moc razumeti nastanek nekaterih neurodegenerativnih bolezni in preprecitiobarjanje proteinov v bioloskih zdravilih. Fokus seminarja je na razumevanju osnovnihinterakcij med proteini, kot so van der Waalsova sila, hidrofobni efekt in vodikova vez.Preko razumevanja teh interakcij je moc objasniti tudi kontroliranje obarjanja proteinov sspreminjanjem pH, ionske moci in dielektricne konstante raztopine.

1

Kazalo

1 Uvod 2

2 Medmolekulske interakcije 32.1 Van der Waalsova sila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42.2 Hidrofobni efekt in hidrofobna interakcija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

3 Osnove kontroliranja agregacije proteinov 10

4 Zakljucek 11

1 Uvod

Agregacija proteinov je ena od najbolj pomembnih in zanimivih problemov v farmakologiji inmedicini [1]. Le ta je del obicajnega delovanja narave, zato ima pomembno vlogo pri vsakemorganizmu. Ceprav bi ta problem lahko bil uporaben, ce ne celo potreben v nekaterih bioloskihprocesih, pa raziskovanje tega procesa motivirajo predvsem negativne posledice. Agregacijeproteinov, kot so amiloid-β, poliglutaminske, α-sinukleinskem in prioni, pogosto povezujejo znevrodegenerativnimi motnjami, kot so Alzheimerjeva bolezen, Huntingtonova, parkinsonovebolezni in prionske bolezni [1]. Del farmacevtske industrije, ki se v tem trenutku najboljrazvija, pripada razvoju bioloskih oz. biotehnoloskih zdravil. Splosna razlika med klasicnimioz. konservativnimi in biotehnoloskimi zdravili je v kolicini in tudi velikosti aktivne snovi.Na primer zelo znano zdravilno ucinkovino, acetilsalicilno kislino, ki je aktivna snov zdravilaAspirin farmacevtskega podjetja Bayer Pharmaceutics, sestavlja 21 atomov z molekulsko maso180 g/mol. Po drugi strani pa so znani predstavniki biotehnoloskih zdravil, protitelesa tipa IgG,sestavljeni iz priblino 200 000 atomov z molekulsko maso nad 18 000 kg/mol. Ce lahko manjsemolekule poimenujemo s pomocjo glavne funkcionalne skupine, kot v primeru acetilsalicilnekisline, pa to pri res velikih molekulah enostavno ni vec mogoce. Le te makromolekule sonamrec sestavljene iz stevilnih manjsih aminokislin, ogljikovih hidratov in mascob, ter so zatokar nasplosno pogosto poimenovane kot proteini. Ker so meje, ki dolocajo molekulo kot proteinslabo dolocene in se razlikujejo od literature do literature, je lahko ta termin zavajujoc. Kljubtemu bom v tem seminarju uporabljal izraz protein za makromolekulo z molekulsko maso nad10 000 daltonov (en Dalton ustreza masi enega atoma vodika) [2].

Na tej tocki bi se lahko vprasal, zakaj zamenjati majhne zdravilne ucinkovine z vecjimi, cele te tezje proizvajamo, kontroliramo in navsezadnje shranjujemo. Odgovor se skriva v idejio specificnem zdravljenju [1]. Bioloska zdravila namrec delujejo neposredno na posameznotarcno celico ali tkivo, in zato zmanjsujejo stranske ucinke in povecujejo efektivnost zdravlje-nja. To je se posebej pomembno pri zdravljenju rakavih obolenj. Eden od najpomembnejsihpodrocij raziskav biotehnoloske industrije, so protitelesa razlicnih podrazredov IgG (IgG1, IgG2in IgG4). Le ta so trenutno odobrena za uporabo v terapevtske namene pri razlicnih vrstahraka, kronicnih vnetnih boleznih, transplantacijskih in infekcijskih boleznih. Protitelesa pred-stavljajo 14 milijard $ trznega deleza ZDA in so bila oznacena kot najbolje prodajana bioloskazdravila v letu 2007 [4]. Vendar pa je ena izmed vecjih tezav pri terapiji s protitelesi ta, da leta tezijo k agregaciji pri formulacijah z visoko koncentracijo, ki je potrebna za zdravljenje s toterapijo. Agregacija vodi do zmanjsanja aktivnosti protiteles in zato do zmanjsanja imunskegaodziva. Z drugimi besedami, taksno zdravilo na splosno postane manj ucinkovito.

V biofarmacevtiki in biomedicini je torej glavni cilj prepreciti agregacijo proteinov ali vsaj

2

Slika 1: Makroskopski prikaz variabilnega dela IgG protitelesa iz skupine IgGA protiteles. Variabilnidel je sestavljen iz priblizno 100 000 atomov in od dalec zgleda kot gnezdo spleteno iz tankih filamentov[5].

zmanjsati verjetnost tega pojava. Kljuc za nadziranje se skriva v razumevanju mehanizma inkinematike proteinske agregacije, vendar pa je pojav agregacije na svetovnem nivoju se slaboraziskan. Z razumevanjem tocno dolocenih predelov, ki so nagnjen k agregaciji proteinov,bi omogicilo nekomu, da oblikuje strategijo za proteinsko stabilnost [5]. V zvezi s tem jebistvenega pomena poznavanje interakcije med in znotraj proteinov. V tem seminarju se bomoosredotocili na opisovanje medmolekulskih in znotraj molekulskih sil na splosno. Na podlagitega razumevanja lahko opisemo in nadzorujemo agregacijo.

2 Medmolekulske interakcije

S pravo kombinacijo analiticnega pristopa in simulacije, lahko izpeljemo uporabno metodo,ki se uporablja za dolocanje parametrov agregacije. V primeru, ko imamo veliko molekul, jesimulacija vseh atomov casovno in denarno potratna. Torej je opis interakcije v visjih redihskoraj nujen. Sprva se bomo osredotocili na medatomske in medmolekulske vezi, da bi dobiliobcutek, katere interakcije so pomembne za opis agragacije proteinov. Slika 2 prikazuje najpo-membnese vezi, njihov doseg in moc. Z uporabo splosnega koncepta delimo sile v dve kategoriji:fizikalne (medmolekulske) in kemijske (medatomske) vezi. Kemijske vezi so v majhnem obseguodgovorne za vezavo dveh atomo, da se tvori molekula. Te medatomske vezi so oznacene zvalencnimi elektroni, ki si jih delita dva atoma. S tem je izgubljena diskretna narava atoma.Glede na stevilo valencnih elektronov, lahko atom sodeluje v dolocenem stevilu kemijskih veziz drugimi atomi. Kemijske vezi so nadalje delijo v ionske ali kovalentne vezi. Ionska vez jedejansko poseben primer kovalentne vezi. V tem primeru se valencni elektron premakne odenega atoma do drugega in pojavi se ioni. Kot lahko razberemo iz tabele na Sliki 2, so ionskevezi mocnejse od kovalentnih. Tukaj je potrebno omeniti, da je izvor vezi povsem elektrostatski[3] .

Druga skupina so medmolekulske interakcije majhnih molekul oz. fizikalne vezi. Na splosnoso razdeljene na nabojno interakciji in van der Waalsove sile. Prva je podobna ionski kemijskivezi, ampak je manj mocna in deluje le na vecjem obsegu. Ce zanemarimo sencenje jo lahkoenostavno opisemo s Coulombsko interakcijo med dvema nabojema Q1 and Q2:

w(r) =Q1Q2

4πε0εr=z1z2e

20

4πε0εr, (1)

3

Slika 2: Prikaz osnovnih medatomskih in medmolekulskih vezi in njihove jakosti na primeru tipicnihsnovi, v katerih delujejo. Zapisane so tudi temperature talisc teh snovi.

kjer je ε dielektricna konstanta medija, r razdalja med dvema nabojema in z1 in z2 valenciatoma. Po drugi strani izvor van der Waalsovih sil izhaja iz elektrostatske interakcije meddvema dipoloma. Zato lahko delimo van der Waalsovo silo v dipol-dipol, dipol-induciran dipol,induciran dipol-induciran dipol. Slednja je pogosto poimenovana kot Londonova disperzija silain je verjetno najpomembnejsa medmolekulska interakcija, ceprav je najsibkejsa. To je zaraditega, ker prihaja do nje med vsemi molekulami, bodisi so neto nabite ali ne. Iz Slike 2 lahkoopazimo, da so na splosno medmolekulske interakcije veliko sibkejse kot medatomske, ampakdelujejo na mnogo vecjem obsegu. Ker je nas primarni cilj opisati interakcije znotraj in medvelikimi molekulami kot so proteini, lahko ze sklepamo, da bodo van der Waalsove sile velikobolje sluzile opisu agregacije kot medatomske.

Obstaja se ena pomembna interakcija imenovana vodikova vez, ki je po jakosti med me-datomskimi in medmolekulskimi silami. V nekaterih primerih se je ze izkazalo, da vodikovavez igra pomembno vlogo pri vplivanju na obliko in obnasanje proteinov [1], [5], [4]. Polegteh osnovnih medmolekularni interakcij, katere pravilno napovedujejo interakcije med majh-nimi molekulami poznamo tudi hidrofobno interakcijo in vpliv hidrofilnih delov, ki so zlastipomembni pri vecjih molekulah kot so proteini. Enotni model, ki bi opisoval te ucinke pa se nibil predlagan.

2.1 Van der Waalsova sila

Kot smo ze omenili, so van der Waalsove sile razdeljen v tri kombinacije interakcij trajnihin induciranih dipolov. Najbolj osnovna interakcija je dipol-dipol. Ta interakcija je analognainterakciji med dvema palicastima magnetoma. Ce sta dipola orientirana drug glede na drugega,kot je prikazano na Sliki 3, bo energija interakcije med dipoloma podana z:

w(r, θ1, θ2, φ) = − µ1µ24πε0εr3

(2cosθ1cosθ2 − sinθ1sinθ2cosφ). (2)

Maksimalno interakcijo bomo dobil, ko bosta dipola v zaporednem polozaju, tako da je θ1 =θ2 = 0. V tem primeru je interakcijska energija enaka w(r, 0, 0, φ) = − 2µ1µ2

4πε0εr3. Iz enacbe (2)

lahko hitro naredimo oceno moci te interakcije. Pri dveh enakih dipolih z momentom 1D =

4

Slika 3: Opis medsebojnega polozaja dveh dipolov µ1 in µ2 na medsebojni razdalji r, s kotoma zasukaθ1, θ2 v ravnini lista. Kot Φ predstavlja zasuk enega izmed dipolov iz ravnine lista [3].

3, 336∗10−30Asm bo njihova interakcijska energija (ε = 0) enaka kbT pri sobni temperaturi, prirazdalji r = 0.36 nm ko sta dipola v zaporednem polozaju in pri r = 0.29 nm ko sta v vzporednimedsebojni legi. Slika 4 prikazuje odvisnost moci interakcije od razdalje med dipoloma, ce stata postavljena vzporedno oz. zaporedno. Polne crte predstavljajo tocno interakcijo izracunanokot vsoto vseh Coulombskih prispevkov med naboji, medtem ko crtkane prikazujejo energijeizracunane po enacbi (2). Vidimo, da med modeloma prihaja do precejsnjega odstopanja zarazdalje r < 3l. To je posledica tega, da je enacba (2) izpeljana na podlagi predpostavke, da jedolzina dipolov l precej manjsa od medsebojne razdalje med dipoloma [3].

Slika 4: Dipol-dipol interakcija v odvisnosti od razdalje za dva dipola z momentom 1D v vakuumu.Crtkane crte opisujejo interakcijo izracunano po enacbi (2), medtem ko polne tocno resitev s sestevkomCoulombskih prispevkov [3].

Poleg tega enacba (2) nakazuje, da dva dipola tezita k temu, da se orientirata zaporedno,vendar to velja le za konstantno vrednost r. Ce se osredotocimo na resnicen primer, kjer je rspremenljivka, je za nekatere molekule v obliki cigare preferirana vzporedna orientacija. To jezato, ker se lahko taksne molekule priblizajo precej blizje skupaj, ce so poravnane vzporedno.

5

Pri tem se precej zmanjsa energija. Vendar pa je pri velikih locitvah ali v mediju z visokodielektricno konstanto, kjer interakcijska energija pade nizje od kbT , treba upostevati nakljucnogibanje molekul. S povprecenjem interakcije po vseh kotih in pozicijah molekule v prostoru,obtezeno z Boltzmannovim obtezitvenim faktorjem e−w(r)/kT , dobimo Boltzmannovo interakcijodipol-dipol, povpreceno po kotu:

w(r) = − µ1µ23(4πε0ε)2kTr6

, za kT >µ1µ2

4πε0εr3(3)

Ce primerjamo enacbi (2) in (3), se potenca razdalje spremeni iz 3 v 6 [6]. Kot bomo videlikasneje, si vse osnovne van der Waalsove sile delijo isto r−6 odvisnost [3].

Naslednja v vrsti van der Waalsovih sil, je interakcija med dipolom in induciranem dipolom.V tem primeru elektricno polje permanentnega dipola inducira odgovor nevtralne molekule s po-larizacijo α0. Pri tem pride do privlacne interakcije. Za dipol z momentum µ orientiranim podkotom θ glede na ravnino, ki tece med dipolno in nepolarizirano molekulo je moc elektricnegapolja, ki deluje na to nevtralno a polarizabilno molekulo enaka: E = µ(1 + 3cos2θ)1/2/4πε0εr

3.Neposredno iz tega lahko izpeljemo, da je ob tem energija interakcije, ki nastane enaka:

w(r, θ) = −1

2α0E

2 =−µ2α0(1 + 3cos2θ)

2(4πε0ε)2r6(4)

Za tipicne vrednosti µ in α0, ki jih ponavadi srecamo v manjsih molekulah, je moc te interakcijepresibka, da bi se pri sobnih pogojih molekuli rotirali tako, da bi dosegli minimum te interakcije.Zaradi tega je za efektivni zapis te sile, potrebno upostevati izotropno povprecenje po kotu,pri cemer noben kot ni preferiran s kaksnim utezitvenim faktorjem. Ker povprecitev po cos2θznese 1/3, se gornji izraz poenostavi v koncno obliko:

w(r) =−µ2α0

(4πε0ε)2r6(5)

Za to interakcijo med trajnim in induciranim dipolom, podano z enabo 5 se je uveljavilo tudiime Debyeva interakcija in predstavlja drug prispevek celotnih van der Waalsovih sil [6].

Tretji po vrsti in najsibkejsi po moci, vendar morda celo najpomembnejsi prispevek k vander Waalsovi interakciji so Londonove ali disperzijske sile. Njihova pomembnost izhaja iz dej-stva, da delujejo med vsemi vrstami molekul. Niso namrec odvisne od specificnega dipolnegamomenta ali polarizabilnosti posamezne molekule, temvec delujejo tudi med povsem nevtral-nimi molekulami. Zaradi tega so pomembne predvsem pri obravnavi interakcij med povrsinamina mikroskopskem nivoju. Med te fenomene spadajo povrsinske napetosti snovi, adhezija, ab-sorpcija,... Izkazalo se je tudi, da prav te sile igrajo najpomembnejso vlogo pri opisu strukturein interakcij med proteini in drugimi sinteznimi polimeri. Zaradi tega je zelo pomembno, dase zavedamo njihovih tipicnih lastnosti. Imajo relativno dolg doseg delovanja napram kovalen-tnim vezem, saj le ta v nekaterih primerih znasa 10 nm ali vec. So odbojne ali privlacne in vsplosnem jih ni mozno opisati s preprostim potencnim modelom. Lastnost disperzijskih sil jetudi, da v molekul ne le priblizajo ali odbijajo, temvec vplivajo tudi na njihovo orientacijo vprostoru. Zadnja in tehnicno najpomembnejsa lastnost Londonovih sil pa je, da na interakcijomed dvema delcema vpliva tudi prisotnost drugih teles v prostoru. To pomeni, da v vecdelcnemsistemu, ne moremo preprosto izbrati parske modela, ki bi opisoval Londonove sile in potemsesteti to po vseh parih delcev, da bi dobili celotno energijo sistema. Interakcije se namrec medsamo ne sestevajo [3].

6

Formalno kvantnomehansko je leta 1930 s pomocjo teorije pertubacije do te interakcije priselLondon, ki je opisal interakcijo med dvema razlicnima nevtralnima atomoma kot:

w(r) = − 3α01α02

2(4πε0)2r6I1I2I1 + I2

. (6)

Pri cemer α0 in I oznacujeta polarizabilnost in prvo ionizacijsko energijo posameznega atoma.Kvalitativno lahko ta pojav razumemo tako, da zaradi nedolocenosti polozaja in gibalne kolicinevalencnega elektrona, le ta zaradi gibanja ustvarja nek kratkotrajni dipolni moment med njimin jedrom. Ta dipolni moment potem inducira dipol v drugem nevtralnem atomu, in takoza kratek cas pride do klasicne dipol-inducirani dipol interakcije. Za oceno moci interakcijepredpostavimo, da je priblizna vrednost α0/4πε0 enaka 1.5 ∗ 10−3 nm3, tipicne vrednosti ioni-zacijskih energij pa so nekje 2 ∗ 10−18 J. Za dva atoma v kontaktu (r ≈ 0.3 nm) je pri sobnitemperaturi disperzijska energija enaka kT [3].

Celotno van der Waalsovo interakcijo lahko povzamemo v izrazu:

wV DW (r) =−CV DW

r6=−(Corien + Cind + Cdisp)

r6, (7)

kjer Corien, Cind, Cdisp predstavljajo posamezne koeficiente v zgoraj opisanih interakcijah. Kotje razvidno iz enacbe 7, sta glavni znacilnosti celotne van der Waalsove interakcije privlacnost(−) in r−6 krajevna odvisnost. Kot tudi to da nasplosno za van der Waalsove sile ne veljaaditivnost. Kljub temu, pa so na primeru alkanov v vakuumu raziskovalci pokazali, da jeaditivnost disperzijskih sil moc uporabiti [3]. Alkane s splosno formulo CH3-(CH2)n-CH3, soobravnavali kot cilindre z nekim premerom, na katerih so na doloceni razdalji razporejene CH2 skupine.Cilindri ob tem zavzamejo heksagonalno strukturo, kjer vsak cilinder obdaja 6 drugih najblizjih cilindrov.Modelsko so celotno energijo ene molekule dolocili tako, da so sesteli Londonove interakcije med vsemiCH2 skupinami teh sestih sosedov. Nato so te rezultate primerjali z eksperimentalnimi, ki so jih dolocilipreko meritve temperature vrelisca. Presenetljivo so se meritve ujemale na procent natancno. Za enoCH2 skupino so tako dobili rezultat, da je povprecna energija ene CH2 skupine v tem sistemu enakaU ≈ 6.9kJ/mol. Na zalost to velja samo za alkane, ki se ne nahajajo v mediju. Ne aditivnost Londonovihsil, pa pride mocno do izraza v vecjih sistemih in v mediju, kot je npr. voda. Za opis interakcij v takihsistemih, med katere spadajo tudi proteini, so zato bolj primerne splosne a hkrati tudi kompleksnejseinterakcije, kot so hidrofobni in hidrofilni efekt [3].

V sklopu o van der Waalsovih silah je pomembno omeniti se nekaj primerov v katerih se danes upo-rabljajo. Kot prvo lahko opazimo, da za popoln opis interakcije med dvema molekulama, potrebujemopoleg privlacnega se odbojni potencial. Ideja odbojnosti se skriva v tem, da ce molekulo obravnavamokot nek togi delec, se dva toga delca ne moreta priblizati blize, kot je vsota tipicnih dolzin teh delcev.Kvantnomehanski pogled na to stvar pa nam razkriva, da delcev naceloma ne smemo obravnavati kottoge, zaradi nacela nedolocenosti, vendar prav tako med njimi deluje nek odboj, zaradi Paulijevegaizkljucitvenega nacela. Za intermolekularne simulacije vecjih sistemov, se tako velikokrat uporablja vander Waalsova interakcija, ki se ji doda nek odbojni potencial: v splosnem w(r) = +(σ/r)n, kjer je npoljuben. Tako poznamo veliko teh odbojnih potencialov, med katerimi sta najbolj znana, tako ime-novani hardcore potencial, z n = ∞ (za r > σ je potem odbojni potencial 0, medtem ko za r ≤ σje neskoncen) in Lennard-Jones potencial z n = 12. Medtem ko lahko prvega preprosto razlozimo zmodelom togih delcev, saj ne dovoli priblizanje delcev na manj, kot dolzino σ, pa ima drugi popolnomaprakticen pomen. Z velikim stevilom simulacij, so namrec raziskovalci ugotovili, da Lennard-Jonesovpotencial daje najboljse rezultate [6].

Na podlagi van der Waalsovih interakcij so bili ze v 40tih letih prejsnjega stoletja narejeni izracuniprivlacnostnih interkacij med makroskopskimi delci razlicnih oblik. Velja namrec, da na velikih razdaljahvan der Waalsove sile, poleg stericnih igrajo najpomembnejso vlogo pri opisu sistemov. Predpostavimotorej, da je nek makroskopski delec poljubne oblike sestavljen iz enakih molekul, ki so enakomerno zgostoto ρ razporejene po celotnem delcu in potem obravnavamo interakcijo med dvema takima del-cema(poljubnih oblik) tako, da predpostavimo additivno van der Waalsovo interakcijo w = −C/r6 med

7

Slika 5: Prosta energija med dvema telesoma razlicnih geometrij izracunana na podlagi aditivne vander Waalsove interakcije. Hamakerjeva konstanta A je definirana kot A = π2Cρ1ρ2, kjer sta ρ1 inρ2 stevilski gostoti molekul, ki sestavljajo makroskopsko telo, C pa je konstanta v parskem van derWaalsovem potencialu.[3]

posameznimi molekulami. Ce privzamemo, da so delci pravilnih oblik, potem lahko makroskopsko in-terakcijo preprosto izracunamo preko integrala. Slika 4 prikazuje izracunane interakcije za primer dvehsfer, atoma in povrsine, sfere in povrsine, dveh molekulskih verig, dveh valjev v razlicnih polozajihin dveh povrsin. Pri vseh primerih D predstavlja razdaljo med dvema delcema, ostali geometrijskiparametri pa so oznaceni na sliki. Veliko interakcij je zapisanih s pomocjo Hamakerjeve konstante:

A = π2Cρ1ρ2, (8)

ki je dobila ime po Hamakerju, ki je skupaj z Bradleyem, Derjaguinom in de Boerom naredil vecinozacetnega dela na podrocju razumevanja sil med makroskopskimi delci. V tej konstanti ρ1 in ρ2 predsta-vljata stevilski gostoti molekul v makroskopskem delcu. C pa je konstanta v van der Waalsovi interakcijiw = −C/r6 med molekulami.

2.2 Hidrofobni efekt in hidrofobna interakcija

V splosnem smo hidrofilne in hidrofobne interakcije ze opisali z van der Waalsovimi silami. Tam smougotovili, da van der Waalsova interakcija zelo dobro opise privlak med inertnimi molekulami v vakuumu,v mediju pa nikakor ni veljala. Ce bi torej z aditivno van der Waalsovo interakcijo obravnavali primerdveh nepolarnih molekul v vodi, bi izracunali, da je privlak med tema molekulama manjsi. Nasprotno paiz eksperimentov vemo, da v vodi pride do velikega privlaka med nepolarnimi molekulami. To imenujemohidrofobna interakcija in je posledica hidrofobnega efekta [3].

Kar nekaj casa so bili znanstveniki prepricani, da je hidrofobni efekt posledica neke posebne vezi oz.privlaka med nepolarnimi molekulami, ki nastane v vodi. To misljenje so kmalu zavrgli in se osredotocilina vlogo vode v tem fenomenu. Vse posebne lastnosti vode, kot je relativno visoko talisce in vrelisce

8

glede na molsko maso, vecja gostota kapljevine od trdne faze itd., izhajajo iz vodikovih vezi(H-vezi). Kotsmo ze omenili v uvodu o medmolekularnih interakcijah ima H-vez lastnosti, ki ne ustrezajo popolnomakovalentnim in ne van der Waalsovim silam. Njihova tipicna moc namrec ustreza 10 do 40 kJ/mol,medtem ko energija kovalentih oz. van der Waalsovih sil znasa 500 oz. 1 kJ/mol. Za njih je znacilno,da nastanejo intermolekularno med H vezanim na O, N, F ali Cl in O, N, F, ali Cl druge molekule. Vtekoci fazi tako ena molekula vode tvori 3.0− 3.5 H vezi.

Ce torej damo neko nepolarno molekulo (npr. kaksen ogljikovodik) med molekule vode, se bodo le teposkusale urediti v taksno strukturo, da bodo lahko tvorile cimvec vodikovih vezi. Ker so molekule vodetetraedricne, imajo sposobnost, da se lahko povezejo skupaj okoli katerekoli inertne molekule, ne gledena njeno velikost ali obliko. Tako molekule vode tvorijo nekaksno kletko (resetko) okoli te nepolarnemolekule. Na ta nacin dejansko pride do taksne ureditve, da povprecno ena molekula vode tvori stirivodikove vezi. Entalpicni prispevek k prosti energiji je tako celo ugodnejsi kot v primeru ciste vode.Ampak ob tem, ko se molekule vode uredijo okoli tega delca (inertne molekule), se njihova entropija zelozmanjsa. To pomeni, da je entropicni prispevek neugoden. Izkaze se, da entropicni prispevek krepkoprevlada. Enostavno se to vidi v tem, da npr. olje ni topno v vodi. Za n-butan, je sprememba prosteenergija pri raztapljanju v vodi enaka +24 kJ/mol, in je tako razdeljena na entalpicni in entropicniprispevek:

∆G = ∆H − T∆S = −4.3kJ/mol + 28.7kJ/mol = +24.5kJ/mol (9)

Kot vidimo je entropicni prispevek kar 85%, za veliko vecino ostalih ogljikovodikov, pa je se vecji. Biloje tudi opazeno, da je za razlicne ogljikovodike, sprememba proste energije v grobem proporcionalnapovrsini molekule. Tako je za metan, ki ga lahko opravnavamo kot krogelni delec z van der Waalsovimradijem a = σ/2 = 0.2nm ta povrsina enaka 4πa2 = 0.5nm2. Sprememba proste energije pa je enaka∆G = 14.5kJ/mol. Ce to preracunamo na enoto povrsine dobimo 48mJ/m2. Ko podobno obravnavamon-butan, kot cilinder z istim radijem a in dolzino l = 3 ∗ 0.1275, ki ustreza trikratniku dolzine vezimed ogljikovimi atomi v n-alkanih, dobimo za povrsino priblizno 1.0nm2. Ko s tem delimo izmerjenospremembo proste energije ∆G = 24.5 kJ/mol, dobimo rezultat 41mJ/m2. Ta dva rezultata sta zelomedfaznim napetostim med plastema ogljikovodika in vode, ki se gibljejo med 40 in 50mJ/m2 [3].

Slika 6: Hidrofobna interacija med dvema hidrofobnima delcema (z ukrivljeno crto je predstavljenasticna povrsina delcev) obdana z molekulami vode (∆). Ker je entropijski prispevek molekul vodev prosti energiji bistveno pomembnejsi od entalpijskega, se molekule vode umaknejo iz meddelcnegaprostora (zvisanje S), van der Waalsove sile pa nato potegnejo hidrofobna delca skupaj.

Kot ze prej omenjeno je hidrofobna interakcija mocno povezana s hidrofobnim efektom. Njenaglavna lastnost je namrec ta, da je privlak med hidrofobnimi molekulami in povrsinami v vodi precej

9

mocnejsi od privlaka v prostem prostoru. Za molekulo metana je npr. van der Waalsova interakcijskaenergija v prostem prostoru enaka −2.5 ∗ 10−21 J, medtem ko v vodi znasa −14 ∗ 10−21 J. Ta ocenaje bila najverjetneje narejena na podlagi kalorimetricnih merjenj enkrat pri stalnem tlaku in enkrat prikonstantni temperaturi. Podobno tudi povrsinske napetosti cistih ogljikovodikov znasajo 15−30mJ/m2,medtem ko z vodo znasajo 40−50mJ/m2. Le te je mozno v danasnjem casu relativno preprosto izmeritipredvsem s tenziometricnimi metodami ali z neposrednim merjenjem sticnega kota kapljice na povrsini.Prav povrsinske oz. medfazne napetosti so zato najboljsi pokazatelj hidrofilnosti oz. hidrofobnostiposameznih snovi.

Ta pojav je preko razumevanja hidrofobnega efekta zelo preprosto obrazloziti. Prej smo ugotovili, daje raztapljanje inertnih molekul vodi zelo neugodno, saj obcutno zmanjsa entropijo molekul vode, ki seuredijo okoli nepolarne molekule. In ta entropicni faktor je mocno prevladajoc. Ce torej imamo sistemvecih hidrofobnih molekul (delcev) v vodi, bo sprememba proste energije zelo neugodna, ce se bo vodaorientirana okoli vsakega delca posebej in bodo ti popolnoma loceni. Z vidika entropija je tako velikobolj ugodno, ce se dva hidrofobna delca obdana z molekulami vode, in ki sta na dovolj majhni razdaljipovezeta in izzeneta molekule vode v vmesnem prostoru. Te molekule vode namrec tako spet postanejoproste in se njim entropija poveca. Ta fenomen prikazuje tudi slika 5. Na sliki so z ∆ predstavljenemolekule vode, ki se umaknejo iz medprostora med hidrofobnima delcema, saj je to mocno entropijskougodnejse. Na ta nacin se sprosti vmesni prostor med delcema, in van der Waalsove sile ju potegnejoskupaj [3].

Ceprav je bilo za opis hidrofobne interakcije predstavljenih ze kar nekaj modelov, se noben ni dalzadovoljivega odgovora. Tudi razni poskusi z racunalniskimi simulacijami niso bili najbolj uspesni, sajje preko eksperimentov ugotovilo, da ima hidrofobna sila zelo dolg doseg. To namrec hkrati pomeni,da je za analizo potrebno upostevati ogromno stevilo molekul, kar pa je precej casovno zahtevno. Takoso bili raziskovalci bolj kot na teoreticnem podrocju, uspesni na eksperimentalnem. V prejsnjih letih jebilo namrec narejenih ogromno meritev sil med razlicnimi hidrofobnimi podlagami v vodnih raztopinah,ki jih sestavljajo hidrofobne molekule. Rezultati, ki so jih dale te meritve so pokazali, da je hidrofobnainterakcija presenetljivo dolgega dosega, saj pada v razdalji od 0 − 10 nm eksponentno z razpadnodolzino λ0 = 1 − 2 nm in se naprej po neki odvisnosti, ki pa ni splosna. Prav tako se je izkazalo, daje hidrofobna sila lahko precej mocnejsa od van der Waalsovega privlaka. Se posebej je to prislo doizraza pri povrsinah sestavljenih iz samih ogljikovodikov. Pricakovano so raziskovalci tudi ugotovili, damoc interakcije pada s padajoco hidrofobnostjo snovi v vodi. Le to kvantitativno predstavlja medfaznanapetost z vodo γ, ki se da dolociti tudi preko sticnega kota kapljice vode na povrsini hidrofobnepovrsine. Na podlagi eksperimentov se je uveljavil empiricni model za zapis interakcije med ukrivljenimahidrofobnima povrsinama v vodi:

W = −2γ exp−D/λ0 , (10)

kjer je D razdalja med hidrofobnima povrsinama in so tipicne vrednosti γ = 10−50mJ/m2 in λ0 = 1−2nm [3]. Za vecje razdalje od 10 nm se je izkazalo, da je sila v splosnem zacela oscilirati z razdaljo inje bila precej odvisna od koncetracije hidrofobnih molekul in ostalih elektrolitov v vodni raztopini. Navecjih razdaljah tako ta model ni bil vec uporaben. Za razliko pe je bil pri manjsih razdaljah od 10 nm,vpliv koncentracije in ostalih elektrolitov prakticno zanemarljiv [7].

Prav tako na podlagi eksperimentalnih opazanj sta Israelachvili in Pashley predlagala model [8],po katerem je za majhne hidrofobne molekule raztopljene v vodi, sprememba proste energije zaradihidrofobne interakcije proporcionalna s tipicnim premerom molekule σ. Tako sta zapisala enacbo:

∆G(hidrofobni parski potencial) ≈ −20σkJ/mol, (11)

kjer ima σ enoto nm. Ta enacba da npr. za cikloheksan z σ = 0.57 nm vrednost ∆G ≈ −11.4 kJ/mol,kar se zelo dobro sklada z eksperimentralno vrednostjo −11.3 kJ/mol [8].

3 Osnove kontroliranja agregacije proteinov

Agregacija oziroma obarjanje proteinov je pojav, ki si ga ponavadi ne zelimo, saj le ta inaktivira proteine,tako v bioloskih sistemih, kot tudi v zdravilih. Kljub temu, pa se obarjanje ze kar nekaj let intenzivnouporablja v biokemiji, kot metoda izolacije posameznih vrst proteinov iz kompleksnejsih sistemov kot

10

so tkiva oz. celice. Za nadaljno analizo proteina, ga je namrec potrebno najprej pridobiti iz vecjegasistema. Iz prakticnega dela izolacije proteinov, so raziskovalci prisli tudi do nekaterih zakljuckov oobnasanju proteinov pri razlicnih pogojih [9].

Metoda izolacije proteina preko obarjanja, temelji na razlicnih pogojih, pri katerih se razlicni proteiniagregirajo. V splosnem lahko na agregacijo proteinov vplivamo s spreminjanjem pH, ionske moci (I),dielektricne konstante (ε) in temperature raztopine. Pri tem se v primeru zvisevanja temperature proteiniireverzibilno oborijo. Zaradi tega ta nacin uporabljamo samo, ce v nadaljevanju teh proteinov vec nepotrebujemo. Ker pa vecinoma zelimo ohraniti aktivnost proteinov, se najvec uporabljajo ostali trijepostopki. Kot vemo je obarjanje neke molekule, obratno sorazmerno njeni topnosti. Ce so namrecinterakcije med topilom in proteinom vecje od interakcij med proteini, se bo vecji del proteinov oborilo,in obratno. S spreminjanjem pH, ionske moci in dielektricne konstante, spreminjamo moc teh interakcijin s tem tudi topnost [9].

Ko spremenimo pH raztopine se stevilo pozitivnih oz. negativnih nabojev na povrsini proteina spre-minja. Pomembno merilo pri tem je izoelektricna tocka pI. Ko namrec pH raztopine ustreza izoelektricnitocki, je stevilo pozitivo in negativno nabitih skupin na povrsini proteina enako. Takrat je molekulanevtralna, in hkrati pa pride tudi do najvecjega privlaka med molekulami. Zaradi izenacitve negativnihin pozitivnih nabojev namrec ni vec elektrostatskega odboja in prevladujejo hidrofobne interakcije. Vizoelektricni tocki je tako topnost proteinov najmanjsa. S premikanjem pH raztopine izven izoelektricnetocke se topnost priblizno kvadraticno zmanjsuje. Ce je namrec pH nizji od pI, imamo v raztopini vecjokoncetracijo H+ ionov, ki se vezejo na negativno nabite skupine na proteinu, kar pomeni, da neto nabojna proteinu ni vec nevtralen temvec pozitiven. Podobno se zgodi, ce pH raztopine povecamo nad pI.V tem primeru imamo prebitek negativnih hidroksilnih ionov, ki vezejo nase H+ iz proteinov in takoustvarijo neto negativen naboj proteina. Zaradi elektrostatskega odboja med istovrstno nabitimi delcji,pri obeh spremembah pH pride do zmanjsane interakcije med molekulami. Posledicno se agregacijazmanjsa [9].

Drugi nacin manipularanja z medmolekulskimi interakcijami je s spremembo ionske moci. Ionskamoc je podana z enaco:

I =1

2

∑i

Ciz2i , (12)

pri cemer je Ci koncentracija iona, zi pa naboj iona. Pri tem procesu je obnasanje nekoliko bolj zapletenokot v zgornjem primeru. Pri nizki zacetni ionski moci, z vecanjem le te, topnost proteina obicajnonarasca. Ti ioni namrec v majhnih koncentracijah, uspesno sencijo oz blazijo ionske interakcije medproteinskimi molekulami. Zaradi tega je privlak med njimi manjsi in manj se jih obori. Pri visokizacetni ionski moci pa z vecanjem le te, topnost proteina pada. To je posledica zmanjsane solvatacijeproteinskih molekul: ioni namrec odtegnejo molekule vode, ki tvorijo hidratacijski ovoj okoli proteinov.S tem postanejo interakcije med molekulami proteina mocnejse, tudi zaradi hidrofobnega efekta. Taodteg molekul vode iz med proteinskega prostora, je klasicen primer hidrofobne interakcije. Iz tega sleditudi logicna opazka, da se proteini z vecjo hidrofobno povrsino oborijo prej kot tisti z manjso [9].

Pomebna metoda kontroliranja obarjanja proteinov je tudi spreminjanje dielektricne konstante raz-topine. Iz Coulombovega zakona vidimo, da je pri nizji dielektricni konstanti privlacna sila med nabitimadelcema vecja. Elektrostatska sila je tudi gonilna sila obarjanja proteinov v tem primeru. Nizjo diele-ktricno konstanto dosezemo ponavadi z dodatkom organskih topil, ki so topne v vodi (etanol, aceton,propanol, itd.). Pri tem je mehanizem obarjanja podoben, kot v primeru spreminjanja pH in ravnonasproten spreminjanju ionske moci. Z dodatkom organskih topil, namrec postanejo hidrofobni deliproteina vedno bolj zasciteni z molekulami organskega topila, privlacne sile med nasprotno nabitimi delipa prevladujoce. To je ravno nasprotno od prejsnjega primera, kjer je mocno povecanje ionov, povzrociloodmik vode iz okolice proteina. Metoda dodajanja organskega topila ima sicer eno slabost, saj z njone moremo oboriti proteine z veliko hidrofobno povrsino. Ti so namrec zaradi tega zelo dobro topni vorganskih topilih [9].

11

4 Zakljucek

Agregacija proteinov je predvsem s pojavom bioloskih zdravil postalo zelo pomembno raziskovalno po-drocje. Obarjanje predstavlja velik problem pri stabilizicaji bioloskih zdravil. Poleg tega je dokazanopovrzocitelj nekaterih bolezni kot so Alzheimerjeva in Parkisonova bolezen. Zaradi kompleksne zgradbeproteinov, je tezko razviti splosen model, ki bi napovedal pod kaksnimi pogoji in v katerem delu boprislo do agregacije. Za razumevanje le tega je potrebno najprej razumeti med molekulske interakcijena manjsem molekularnem nivoju. Skozi prizmo van der Waalsovih sil, vodikove vezi in hidrofobneinterakcije smo opisali, kaksne sile delujejo med posameznimi deli proteina. Pri modeliranju interakcijnas omejuje predvsem ne aditivnost van der Waalsovih interakcij in neopisljivost hidrofobne interakcije znekim potencialom. Le ta je namrec se najbolje definirana s termodinamskim obnasanjem molekul topilav okolici proteina. Kljub temu, se da vsaj na opisnem nivoju opisati kolicino obarjanja proteinov podpogoji spreminjanja pH, ionske moci, dielektricne konstante in temperature raztopine. Z razumevanjempojava agregacije, bi namrec lahko precej pripomogli k zdravljenju najtezjih bolezni.

Literatura

[1] Morris, A. M., Watzky, M. A., & Finke, R. G. (2009). Protein aggregation kinetics, mechanism,and curve-fitting: a review of the literature. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins andProteomics, 1794 (3), 375-397.

[2] http://www.britannica.com/

[3] Israelachvili, J. N. (2011). Intermolecular and surface forces: revised third edition. Academic press.

[4] Chennamsetty, N., Helk, B., Voynov, V., Kayser, V., & Trout, B. L. (2009). Aggregation-pronemotifs in human immunoglobulin G. Journal of molecular biology, 391 (2), 404-413.

[5] Chennamsetty, N., Voynov, V., Kayser, V., Helk, B., & Trout, B. L. (2010). Prediction of aggre-gation prone regions of therapeutic proteins. The Journal of Physical Chemistry B, 114 (19), 6614-6624.

[6] Myers, D. (1999). Surfaces, interfaces, and colloids (pp. 295-316). New York etc.: Wiley-Vch.

[7] Israelachvili, J., & Pashley, R. (1982). The hydrophobic interaction is long range, decaying expo-nentially with distance. Nature 300, 341-342

[8] Israelachvili, J. N., & Pashley, R. M. (1984). Measurement of the hydrophobic interaction betweentwo hydrophobic surfaces in aqueous electrolyte solutions. Journal of colloid and interface science,98(2), 500-514.

[9] Boyer, R. F., Abram, V., Cigi, B., Dolinar, M., Drobni-Koorok, M., Gubenek, F., ... & akelj-Mavri,M. (2005). Temelji biokemije. tudentska zaloba.

12