agilent herramientas lcms para el...carbaryl (q) 202.1 117 5.734 carboxin 236.1 143 5.836 carboxin...

AgilentSolutions

Herramientas LCMS para el

análisis de residuos

1

Jaume C. Morales

MS Product Specialist

Principales Aplicaciones LC/MS en

Seguridad Alimentaria

7/22/20112

Pesticidas

• Cuantificación de pesticidas conocidos.

• Identificación/cuantificación de nuevos pesticidas

y metabolitos

Fármacos Veterinaria

• Identificación/cuantificación de antibióticos, esteroides,

y otras hormonas de crecimiento

Micotoxinas (más de 3.000 conocidas; efectos tóxicos inmediatos)

• Típicamente por LC/MS

Biotoxinas Marinas (compuestos producidos por el marisco)

• LC/QQQ (cuantificación de toxinas conocidas)

• LC/TOF y LC/QTOF (descubrimiento de toxinas desconocidas)

http://www.chem.agilent.com/en-US/Solutions/Food-Testing-Agriculture/Pages/default.aspx

Soluciones Agilent para el sector Alimentario

http://www.chem.agilent.com/en-US/Solutions/Food-Testing-Agriculture/Pages/default.aspx

AGILENT LC/MS Portfolio

•6100 Single Quadrupoles

•6200 TOF

•iFunnel

•6400 Triple Quadrupoles

•DMRM, tMRM

•6500 QTOF

•RapidFire

•Qual/Quan

•MassHunter Software

Nueva serie

LC Agilent

1200 Infinity

Presentación de los

instrumentos LC de la nueva

plataforma

Agilent – 1220, 1260 y 1290

Nueva Serie Agilent 1200 InfinityElevando el Estandard en HPLC – UHPLC para el Laboratorio

1260

Infinity LC

Modular

600 bar

80 Hz

2x ó 10x Sensivilidad UV

100% HPLC Compatible

Precio HPLC

Capacidades UHPLC

1220

Infinity LC

Integrado

600 bar

80 Hz

El más económico

HPLC y UHPLC

Tecnologia 1260/1290

1290

Infinity LC

Modular

1200 bar

160 Hz

Máximo rendimiento UHPLC

Máxima Flexibilidad

Coste Servicio HPLC

¿Que es UHPLC ?

UHPLC es :

Ultra High Perfomance Liquid Chromatography.

ó

Cromatografía de alto rendimiento en columnas con relleno de

partículas sub-2-micron (STM) o de superficie porosa.

UHPLC NO es :

Ultra Alta presión. La alta presión NO es ninguna ventaja, sino un

efecto colateral indeseado. La Alta Presión no separa nada !!

ni

Cromatografía con columnas de 2.1mm. Cualquier diámetro de

columna puede empaquetarse con partículas de STM. (4.6 , 4.3,…)

¿Que es UHPLC ?

1. Las partículas más pequeñas permiten una menor altura de

plato teórico mostrando pues una mayor resolución

cromatográfica.

2. La resolución cromatográfica sufre menos al incrementar el

flujo cuanto más pequeña es la partícula

Características de UHPLC

Resolución y Flujo

Nueva Serie Agilent 1200 InfinityElevando el Estandard en HPLC – UHPLC para el Laboratorio

1260

Infinity LC

Modular

600 bar

80 Hz

2x ó 10x Sensivilidad UV

100% HPLC Compatible

Precio HPLC

Capacidades UHPLC

1220

Infinity LC

Integrado

600 bar

80 Hz

El más económico

HPLC y UHPLC

Tecnologia 1260/1290

1290

Infinity LC

Modular

1200 bar

160 Hz

Máximo rendimiento UHPLC

Máxima Flexibilidad

Coste Servicio HPLC

LC/MS Portfolio

Triple Cuadrupolos

Serie 6400

La herramienta definitiva en

cuantificación / confirmación

La determinación de compuestos residuales puede abordarse con dos enfoques :

• Dirigido. Número acotado de compuestos a confirmar.

• Más sensible (*)

• El nº de compuestos depende principalmente del sistema cromatográfico y de la velocidad del MS.

• Sin capacidad de determinar NO esperados.

• Sin capacidad de análisis retrospectivo.

• NO Dirigido. Adquisición indiscriminada de Full Scan y/o MS/MS.

• El nº de compuestos a detectar es mucho mayor (casi ilimitado).

• La detección del compuesto se realiza a través algoritmos de deconvolución.

• La acotación de compuestos detectados viene limitada por la base de datos o librerías de los posibles compuestos a identificar

• Menos sensible (*)

Dos enfoques de Screening

11

(*) Depende del modelo de QQQ y TOF/QTOF

Innovation Tour

February 17, 2014

Dos enfoques de Screening

12

Dirigido

No dirigido

Innovation Tour

February 17, 2014

170 210 250 290

210

222

268 280165

Espectro con

iones del

“fondo” (API: ESI,

APCI,…)

SQ sólo deja

pasar el ión 210

190 210

210

Características del diseñoCuadrupolo Simple

1º Cuadrupolo

Detector

Capilar dielectrico frio

Cuadrupolo hiperbolico

Guía de iones octopolar


Único Cuadrupolo

Características del diseñoCuadrupolo Simple


Cuadrupolos hiperbolicos


Triple Cuadrupolo

170 210 250 290

210

222

268 280165

Espectro con

iones del

“fondo” (API: ESI,

APCI,…)

Q1 sólo deja

pasar el ión

“precursor” 210

pass

190 210

210

Celda Colisión

rompe el ión 210 (y sus productos)

150 170 190 210

210158

191

Q3 monitoriza sólo

los fragmentos 158 y

191 característicos

del ión 210 para

cuantificar y cualificar

con máx. sensibilidad

160

158

190

191

Características del diseñoTriple Cuadrupolo


1º Cuadrupolo

Celda de colisión (hexapolo)

3º Cuadrupolo

Detector


Cuadrupolos hiperbolicos


Celda de colision hexapolar

Detección Off-axis

Una bomba turbo

TRANSICIONES (MRM) : 210 -> 158 (Quant) y 210 -> 191 (Qual)

¿Cuándo usar MS/MS?

¿SQ ó QQQ?

17/02/2014

Muestra

Cuando la Matriz es compleja se pueden producir

Interferencias por coincidencia de los iones de

cuantificación del analito con los de la matriz

Permite la cuantificación selectiva de compuestos CONOCIDOS

en muestras que presentan un elevado fondo químico

Mejor S/N en matrices complejas que el que puede

obtenerse por tecnologías que trabajan en Scan o SIM.

Las exigencias de las normativas más actuales resultan más

fáciles de cumplir gracias al poder de la confirmación MS/MS

¿Es más sensible MS/MS?

Manzana

Naranja

Espinaca

Ginseng

Col

SIM - EIC (246) MRM (246->176,175)

S/N = 448

S/N = 456

S/N = 260

S/N = 446

S/N = 241

http://images.google.com/imgres?imgurl=http://www.h4x3d.com/feat/themes/fresh-apple.jpg&imgrefurl=http://www.h4x3d.com/themes/fresh-apple/&usg=__6qEFI2opZAWqq5VTO6zQxUDQbNM=&h=414&w=400&sz=38&hl=en&start=1&tbnid=NRHT1TtifhKitM:&tbnh=125&tbnw=121&prev=/images?q=site:www.h4x3d.com+apple&gbv=2&ndsp=20&hl=en

http://images.google.com/imgres?imgurl=http://www.h4x3d.com/feat/themes/fresh-apple.jpg&imgrefurl=http://www.h4x3d.com/themes/fresh-apple/&usg=__6qEFI2opZAWqq5VTO6zQxUDQbNM=&h=414&w=400&sz=38&hl=en&start=1&tbnid=NRHT1TtifhKitM:&tbnh=125&tbnw=121&prev=/images?q=site:www.h4x3d.com+apple&gbv=2&ndsp=20&hl=en

6460

Triple

Quad

6460 ESI

Triple

Quad

6420

Triple

Quad

6490

Triple

Quad

6460 AJS

Triple

Quad

Ren

dim

ien

toLa última tecnología en LC Triple Quads

6420

Análisis de Rutina Rango medio

Análisis de trazas en rutina,

compuestos complicados6460ESI

6460AJS

Cuantificación Rutinaria

Tecnología

iFunnel

R&D, Análisis de

Ultra-trazas y alta

velocidad

6490

MRM dinámico (DMRM)

Mejora de la sensibilidad basado en la

especificidad de la transición a su tiempo

tMRMConfirmación espectral de los target sin barrido

ni perdida de sensibilidad

Optimizer

Si no se dispone de Kits de Agilent permite

buscar los valores de adquisición óptimos

para la cuantificación

Counts vs. Acquisition Time (min)

x105

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Segmento 1Segmento 2

Segmento 3

Segmento 4

Análisis por segmentos vs. MRM dinámico

MRM Dinámico: No hay segmentos de tiempo

La lista de MRM se confecciona de modo dinámico basándose en el RT de los compuestos de interés

Menor tiempo de ciclo/Mejor definición de pico

x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1Nº de TransicionesConcurrentes =

Rt

Selección de 24 transiciones de analitosPara ilustrar la eficacia de los Tiempos de Ciclo usando dynamic MRMs.

Tiempo de Ciclo

MRM dinámico

x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1

Selección de 24 transiciones de analitosPara ilustrar la eficacia de los Tiempos de Ciclo usando dynamic MRMs.

Nº de TransicionesConcurrentes =

Tiempo de Ciclo

MRM dinámico

Time >>>

Abundance

>>

>

Concurrent

Compounds

MRM dinámico - Simulación

Time (min) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Compounds (10/block)

Cycle Time (sec)

Max Coincident

Cycle Time (sec)

MRM

50 80

0.4 0.4 0.4 0.4

20 40 40

Dynamic MRM

0.5 0.8 1

30

Time Segment 1 Time Segment 2 Time Segment 3 Time Segment 4

0.7

100 70

Ciclos 2 x menores permiten manejar picos cromatográficos más estrechos,

más analitos y dwell times mayores por compuesto

Principios de funcionamiento de Dynamic

MRM

Dynamic MRM at the 10 pg level for 100 pesticides

1 min ΔR.T.- based acquisition window for each MRM transition

Dynamic MRM 11 Compounds (22 MRMs) eluting in about 1

min window

Compound Name Precursor Ion Product Ion Retention Time

Cinosulfuron 414.1 183 5.579

Cinosulfuron (Q) 414.1 157 5.579

Chlorotoluron 213.1 72 5.642

Chlorotoluron (Q) 213.1 140 5.642

Atrazine 216.1 174 5.682

Atrazine (Q) 216.1 132 5.682

Carbaryl 202.1 145 5.736

Carbaryl (Q) 202.1 117 5.734

Carboxin 236.1 143 5.836

Carboxin (Q) 236.1 87 5.836

Chlorsulfuron 358.0 167 5.896

Chlorsulfuron (Q) 358.0 141 5.896

Ethiofencarb 226.1 107 5.937

Ethiofencarb (Q) 226.1 164 5.936

Dodemorph 282.3 116 6.073

Dodemorph (Q) 282.3 98 6.074

Diuron 233.0 72 6.101

Diuron (Q) 233.0 160 6.101

Cyprodinil 226.1 108 6.245

Cyprodinil (Q) 226.1 93 6.246

Difenoxurone 287.1 123 6.509

Difenoxurone (Q) 287.1 72 6.509

Typical results: 10 pg Atrazine on-column using Dynamic MRM

6460A QQQ with Jet Stream Technology

Avg. Signal Height: 15,650

Avg. Signal Area: 50,966

RSD: 3.2 %

Estimated LOQ: 100 fg or less

6-7 data points above FWHM

3 sec FWHM, 6 sec @10% valley

20 data points baseline-to-baseline

•

•

•

•

•

•

••

•••

••

•

• • •

•

•• • •

3 sec FWHM

10% valley

Pesticides LC/MS method

Jet stream conditions

Drying gas temperature 275 ºC

Drying gas flow (nitrogen) 6 L/min

Nebulizer gas pressure (nitrogen) 35 psig

Capillary voltage 4000 V

Sheath gas temperature 325 ºC

Sheath gas flow 12 L/min

Nozzle voltage Off

6460A QQQ

settings

MS1 and MS2 resolution Unit

Time Filtering pk width = 0.03

min

Dynamic MRM transitions up to 4000

Constant cycle time 373 ms

Delta EMV 400 V

1200 LC parameters

Column Eclipse Plus-C18, 2.1 x 100mm, 1.8 µm

Column temperature 35 ºC

Injection volume 5.0 mL

Autosampler temp 6 ºC

Needle wash flushport (MeOH:H2O 75:25), 5 secs

Mobile phase A = 0.01% formic acid in water

B =5 mM ammonium formate 0.01% formic acid in 95:5 acetonitrile:water

Flow rate 0.3 mL/min

Gradient 0 min 6% B

15 min 95% B

Stop time 20 min 6% B

Post time 1 min

Dynamic MRM of 300 Pesticides two Transitions Each

Run with 1200-SL LC 2.1 x 100 C18 Eclipse PLUS 1.8 u

Fragmentor Voltage Collision Energy

QQQ Analyte Optimizer: Máxima Sensibilidad

Optimización Automática de 2 Settings clave

Aflatoxin B1

220 V200 V

180 V160 V100 V80 V60 V40 V 140 V120 V

Maximum transmission of AFL B1 [M+H]+ = 130 VFragmentor Voltage Optimization

25 eV

20 eV

35 eV

30 eV

40 eV

15 eV

10 eV

5 eV

Product Ion Spectra Overlaid;

(All Collision Energies)

Collision Energy = 20 eV

5 eV

15 eV

10 eV

25 eV

20 eV

FIA TIC – AFL B1

Collision Energy Optimization

Fundamentos del tMRM

y aplicaciones

Screening Dirigido

32

Innovation Tour

17 de febrero de 2014

Mayor confianza en la confirmación

La Solución Analítica Ideal

para compuestos conocidos

tMRM

CualitativoCoste

EfectivoCuantitativo

POINT

POINT

POINT

POINT

POINT

POINT

Fast Cycle Time

Single Instrument

Accurate

Sensitive

High Throughput

Short Run Time

Product Ion Spectrum

Library Searching

Confirmation

Innovation Tour



¿Para qué sirve el triggered MRM?Cuantificación y Confirmación : Fingerprinting

34

Enfoque de barrido:

Barrido de la huella del compuesto

Estrategia tMRM:

Foco en las características (fragmentos)

del compuesto

Dos posibles escenarios:

- Confirmación de positivos con información adicional

(confirmación espectral)

- Eliminación de negativos debido a interferencias de la matriz

Innovation Tour



“Triggered MRM (tMRM) Data Dependent”: ~“Scan”

Especifico con la Sensibilidad y Rapidez de un MRM

Cuantificar e Identificar con la sensibilidad y rapidez de un MRM

1 MRM de monitorización por compuesto dispara hasta 8 MRM de

confirmación de cada uno de los compuestos detectados

Muy útil para cuantificación y confirmación masiva de analitos con Triple

Cuadrupolo: análisis multiresiduos, metabolitos …

Página 35

Threshold

Secondary MRM

Transitions are “Triggered”

Primary cycle (below threshold)

Triggered cycle (above threshold)

tMRM Product Ion Spectrum

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

080 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340

334.2171.1

145.0

132.1

117.0

105.191.176.0

tMRM Product Ion

Spectrum

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

080

76.0

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

080 100

91.1

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

080 100 120

105.1

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

080 100 120

117.0

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

0100 140

132.1

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

080 100 120

119.0

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

0100 140 180

145.0x103

8

7

6

5

4

3

2

1

0100 140 180

147.0

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

080 100 120 140 160 180

171.1

334 > 76 334 > 91 334 > 105 334 > 117 334 > 119

334 > 132 334 > 145 334 > 147 334 > 171

tMRM Library Searching

Tebufenpyrad Standard 50 ppb

Library match score: 96.75

LC/MS Application

Kits

Method

Standards

On Site Training

LC Column

tMRMDatabase

tMRM LC/MS Application KitsTargeted Screening with QQQ

38

Pesticides

-Test Mix: 253 compounds

-DB: ~700 compounds

-Library: ~250 compounds

Veterinary Drugs


-DB: ~1,000 compounds


Forensic Toxicology


-DB: ~2,500 compounds


Innovation Tour



tMRM Prevents False Positive Identification

39

Acquired tMRM Spectrum

Native Ginger Compound

tMRM Library Spectrum

Tebufenpyrad

Comparison Acquired vs.

tMRM Library Spectrum

Match Score = 70

0 .1 .2 .3 .4 .5 .6 .7 .8 .9 1.0

tMRM Product Ion Scan < 50ms

Acquisition Time (seconds)

tMRM Scanning

40

Trigger

tMRM

tMRM Scans

Ideal situation: 1 Peak 1 sec wide, no Matrix

UHPLC compatible, good peak

shape, good quantitation

0 .1 .2 .3 .4 .5 .6 .7 .8 .9 1.0

QTrap Product Ion Scan = 200ms

Acquisition Time (seconds)

_Trap Scanning

41

Trigger

Full Scan

Full Scan

Full Scan

Full Scan

Trap/Wave Solution?

LONGER RUN TIME WITH WIDER

PEAKS

Ideal situation: 1 Peak 1 sec wide, no Matrix

Poor peak shape,

poor quantitation

tMRM From The Customer’s Perspective

42

1. Inject Sample

2. Read tMRM Report

Compound

RT

Concentration

Library Match

Score

Nuevos parámetros de tMRM

Funciones de Triggering en MH Acquisition

Permiten centrar los tMRM en el centro del pico

43Innovation Tour


Acephate as example

• Entrance delay 2

• Trigger delay 1

• Trigger Window 0.5

• Threshold 500

• Repeat 5

48Innovation Tour


Comparación de rendimiento del método con

tMRM respecto al MRM “tradicional”

• Se comparan con un método de más de 120 pesticidas

• En modo tMRM se determinaron 2 MRM primarias

• El Triggering actúa por encima de un threshold especificado

para cada compuesto

• Para poder comparar el rendimiento cuantitativo de ambos

métodos, el método tradicional de dynamic MRM se

programó también con 2 MRM

• La comparación se hizo en análisis efectuados sobre

muestras reales

49Innovation Tour


Parámetros de método

UHPLC method

MS method

Electrospray ionization

Triggered MRM: 2 MRM primarias más 8 MRM adicionales de confirmación

Dynamic MRM: 2 MRM por compuesto

50

UHPLC columnAgilent ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD

2.1 x 150 mm, 1.8 µm @ 30°C

Mobile phaseA: 5 mM NH4 formate + 0.1% formic acid

B: 5 mM NH4 formate + 0.1% formic acid in methanol

Gradient

program

Min % B

0 5

0.5 5

3.0 40

17 100

19 100

19.1 5

Stop time 22 min

Flow rate 0.40 ml/min

Injection volume 3 µl

Innovation Tour


Cromatograma UHPLC-MS/MS a 10ng/mL en

extracto de limón

51Innovation Tour


0

20

40

60

80

100

120

< 0.1 0.1 to 0.25 0.25 to 0.5 0.5 to 1 >1

Nu

mber

of

pest

icid

es

Limit of quantitation in µg/kg

Solvent

Lemon extract

Validación del método – Límites de cuantificación

54Innovation Tour


Rendimiento cuantitativo - Oxamyl

55

Curva de calibración dMRM Curva de calibración tMRM

Innovation Tour


y = 0.9987x

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 180000

Calib

rati

on s

lopes

Trig

gere

d M

RM

Calibration slopes Dynamic MRM

Rendimiento cuantitativo - Comparación

56

Pendientes de la curva de calibración para todos los pesticidas en el método

Innovation Tour


+ MRM (14.865-15.031 min, 13 scans) (334.2 -> * …

Mass-to-Charge (m/z)

50 100 150 200 250 300

Coun

t s 3x10

-1.4

-1.2

-1

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2117.0

117.0

147.1

145.091.1

76.0

57.1334.2

Lib Match Score=55.9

Muestras Reales– Tebufenpyrad en extracto de

gengibre

57

Reference spectrum

Acquisition Time (min)

14.6 14.8 15 15.2 15.4

Co

un

t s 5x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

334.2 -> 117.0 , 334.2 -> 145.0

Ratio = 46.9 (209.9 %)

Innovation Tour


Muestras Reales– Tebufenpyrad en extracto de

gengibre

58

Reference spectrum

Innovation Tour


Muestras reales – Tebuthiuron en extracto de

camamilla

59

Reference spectrum


9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 10

Co

un

ts 4x10

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

229.1 -> 172.1 , 229.1 -> 116.0

Ratio = 40.3 (204.3 %)

Innovation Tour


Muestras reales – Tebuthiuron en extracto de

camamilla

60

Reference spectrum


9 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8

Co

un

ts 4x10

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

229.1 -> 172.1 , 229.1 -> 116.0

Ratio = 19.8 (100.6 %)

Innovation Tour


Library match score

Pesticide Matrix Target compound Matrix interference

Dichlovos Lemon 94.5 % 78.1 %

Thifensulfuron-methyl Green Tea 96.6 % 71.5 %

Tebufenpyrad Ginger 99.8 % 55.9 %

Tebuthiuron Chamomile 97.8 % 58.0 %

Imazalil Chamomile 99.8 % 58.1 %

Terbutylazin Chamomile 99.6 % 82.1 %

Muestras reales– ejemplos por interferencia de

matriz

Innovation Tour


Compounds at a glanceEficaz herramienta gráfica y rápida de revisión de resultados

62Innovation Tour


Resumen del tMRM

63

• El Triggered MRM epermite confirmación espectral a niveles de LOQ

• Mismo rendimiento cuantitativo que los métodos MRM tradicionales

• Integration única con las nuevas triggered MRM databases y librerías

• La comprobación automática con la librería de espectros permite una eficaz

revisión de los resultados y “etiquetado” de los casos sospechosos.

• Utilizando una sola transión primaria en tMRM, nos prmite afrontar un método con

mayor número de compuestos en multiresiduo.

Innovation Tour


Application notes para su información

64

5990-8461EN 5991-1183EN

LC/MS Application

Kits

Method

Standards

On Site Training

LC Column

tMRMDatabase

tMRM LC/MS Application KitsTargeted Screening with QQQ

65

Pesticides


-DB: 700+ compounds

-Library: 250+ compounds

Veterinary Drugs


-DB: 600+ compounds


Forensic Toxicology


-DB: 2500+ compounds


Innovation Tour


February 17, 201466 Innovation Tour

Mass Spectrometry

Technology

Products

Solutions

NEW

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Muchas Gracias por su

Atención

agilent herramientas lcms para el...carbaryl (q) 202.1 117 5.734 carboxin 236.1 143 5.836 carboxin...

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