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Agilent GC/MS Triple Cuadrupolo.
Sensibilidad y robustez en
aplicaciones en matriz compleja –
Parte II
Juan AybarEspecialista de Producto
GCMS LCMSAGILENT TECHNOLOGIES
901.11.68.90
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Agenda1. Principales aplicaciones de interés con sistemas
GC Triple Cuadrupolo
2. Importancia del backflush y los sistemas de flujo capilar
3. Determinaciones de anabolizantes en laboratorios de dopaje
4. Screening de dioxinas
5. Conclusiones
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Notas de aplicación GC Triple Cuadrupolo
• Aplicaciones medioambiente, alimentación, toxicología, clínica …
• Alta sensibilidad
• Elevada presencia de material coextraído de la matriz
• Importancia de la confirmación MS/MS
• Aplicaciones básicamente cuantitativas
• Entorno regulado
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Principales aplicaciones emergentes en mercado alimentario
Hormonas Esteroideas (difíciles de medir con técnicas convencionales)
• GC/QQQ
Micotoxinas (más de 3,000 conocidas; efectos tóxicos inmediatos)
• Típicamente LC/MS
Dioxinas en alimentos (tradicionalmente requiere high-res y personal especializado)
• GC/QQQ – Rápido, simple, más sensible que convencional GC
Toxinas marinas (pequeña molécula producida por mariscos)
• LC/QQQ (cuantificación de targets conocidos)
• LC/TOF (descubrimiento de desconocidos)
Alérgenos (aspectos químicos de la identificación)
• LC/MS, LC/Q-TOF, GC/QQQ – Alérgenos de pequeña molécula
GCQQQ
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7890A GC y 7000 Series Triple Cuadrupolo GC/MS Características dirigidas al alto rendimiento
Todos los beneficios del Agilent 7890
Las capacidades del GC son aún más valiosasen análisis MS/MS de trazas en matriz compleja:
• Nuevo 7693 Automatic Liquid Sampler (ALS)
• Nuevo Multi-mode Inlet (MMI)
• Nuevas configuraciones de backflush usando la Pressure-Controlled Tee (PCT)
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7890A-7000B GC/MS/MSCaracterísticas dirigidas al alto rendimiento
El único sistema MS/MS del mercadodotado de una celda de colisión de altapresión, dotada de aceleración lineal y “quenching por helio” para reduccióndel ruido por neutros
Nueva Extraction Source de altasensibilidad. La mayor temperatura de trabajo (hasta 350 ºC) fabricada con el material más inerte
El único MS/MS del mercado con dos analizadores cuadrupolares e hiperbólicosde cuarzo y trabajando a alta temperatura(hasta 200 º C)
Dotado del neuvo software MassHunter para datosGC/MS/MS
El único sistema MS/MS del mercadocon las novedosos ramped-iris, detección de triple eje y EM de triple canal
Todos los beneficios del
7890 GC
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Pérdida de señal en inyecciones replicadas con alta presencia de matriz
Multi-baffled liner –Típico de PTV clásicos
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Backflush minimiza el efecto memoria, lasinterferencias provenientes de la matriz y los cambiosen RT disminuyendo las necesidades de mantenimiento
Extractos de lechuga y pimiento inyectados 3 veces con 2 min backflush y 3 veces sin backflush.Se muestra la primera/tercera inyección de cada serie. Sin backflushing, la tercera inyección (B) muestra carryover y cambios en RTs comparado con la primera inyección (A).
MEZCUA ET AL.: JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL VOL. 92, NO. 6, 2009
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Nuevas configuraciones paraGC/MS Backflush
Vent
EPC
Column 1 Column 2
Purged Ultimate Union (PUU)
Agilent MS System
5975C MSD7000A QQQ
Agilent 7890A GC
Injection Port
Z ml/min
Z+ ml/min
P
Control integrado en software
Purged UltimateUnion
Horno GC 7890
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Análisis de esteroides
anabolizantes en
laboratorios de dopaje
P. Van Eenoo, W. Van Gansbeke, N. De Brabanter, K. Deventer, F.T. DelbekeDoCoLab, Ghent University (UGent),
Technologiepark 30, B-9052 Zwijnaarde, Belgium
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Quantitative•Steroid Profile
•Testosteron, epitestosterone (d3-Tgluc, d3-EpiTgluc)
•Androsterone, etiocholanolone (d4-Agluc, d5-E)
•DHT, 5a-androstane3a,17b-diol, 5b-androstane3a,17b-diol (d3-DHTgluc, d5-bab)
•DHEA, androstenedione (d3-DHTgluc)
•11b-OH-androsterone, 11b-OH-etiocholanolone (d4-Agluc, d5-E)
• 5a-androstanedione, 5b-androstanedione (MT)
•Norandrosterone (MT)
•THC-COOH (MT)
•Salbutamol (salb-d3)
Qualitative• anabolic agents
• beta-2-agonists
• hormone antagonists and modulators
• narcotics
• beta-blockers
• stimulants
• diuretics/masking agents/corticosteroids
Qualitative
• 52 Anabolic agents (or metabolites)
• 6 Beta-2-agonists• 11 Hormone antagonists and modulators (or metabolites)
• 12 Narcotics (or metabolites)
• 18 Beta-blockers • 32 stimulants (or metabolites)
• 2 diuretics/masking agents & 2 corticosteroids
Objetivo: Quant + Qual cumpliendo con los requerimientos de la WADA (MRPLs)
135 compuestos
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MRM-transitions
Establecimiento de los MRMs necesario para QUANT/QUAL
Hasta 500 MRM/sDwell time MRM de
hasta 1 ms
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Norandrosterone: 1 ng/ml Clenbuterol: 0.1 ng/ml
Boldenone metab.: 0.5 ng/ml Epimetenediol: 0.1 ng/ml
O
HHO
Cl
NH2
Cl
CH CH2 NH C
CH3
CH3
CH3OH
HHO
OH
HO
OH
Cromatogramas - Validación
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Resultados cuantitativosNecesidades cuantitativas6 points, r2>0.98, RSD<2/3RSDmax, bias<15%
• Perfil de esteroides– Testosteron, epitestosterone : 1-200 ng/ml– Androsterone, etiocholanolone : 48-4800 ng/ml– 5a-androstane3a,17b-diol, 5b-androstane3a,17b-diol : 4-400 ng/ml– DHT, DHEA, androstenedione : 4-400 ng/ml– 11b-OH-androsterone, 11b-OH-etiocholanolone : 40-4000 ng/ml– 5a-androstanedione, 5b-androstanedione: 4-400 ng/ml
•Norandrosterone : 1-20 ng/ml
• THC-COOH : 5-100 ng/ml• Salbutamol : 100-2000 ng/ml
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El cambio: el detector
Agilent 7000 QqQ MS• MS/MS – increased selectivity/sensitivity
• higher scan rate – more substances in SRM than SIM on 5975
• tested for H2
Objetivo: 1 single method• quantitative: SP, THCA, Salbutamol, NA
• qualitative: all conjugated doping agents
• with a fast turn-around
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DIOXINAS, FURANOS y
PCBs
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Determinación de dibenzo-p-dioxinas policloradas (PCDDs) ydibenzo-p-furanos policlorados (PCDFs) en alimentos usando elsistema 7000B Tandem Cuadrupolo GC-MS/MS
Chris SandyEMEA GC-MS Food Segment Scientist
Agilent Technologies UK
AgradecimientosDr Karl Petitt, Ms Karolina Songin
Marchwood Scientific Services, UKProf. Peter Fuerst, Dr Thorsten Bernsmann
CVUA-MEL, Munster, Germany
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Introduccion / Background
¿Qué son las dioxinas?
• Las dioxinas son un grupo de contaminantes orgánicos altamente tóxicos y persistentes• No se fabrican de manera deliberada, siendo subproductos de la incineración de residuos, fabricación de pesticidas y productos químicos y fabricación de papel• 80% de la exposición en humanos proviene a través de la alimentación• Las dioxinas se acumulan en los tejidos grasos de ternera, pollo, cerdo y pescado• Legislación admite análisis GCMS, pero precisa confirmación HR-GCMS
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EC 1881/2006Establecimiento de los nivelesmáximos de contaminantes en alimentos
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7890-7000B GC-MS/MS Configuracion para análisis de dioxinas
7000BTQ
7890A
MS-TeeG3186B
PCM2uL cold pulsed splitless injectionCO2 MMI
2.0m x 0.25mm ID Uncoated deactivated Fused silica
60m x 0.25mm ID x 0.25umDB5-MSUI (122-5662UI)
0.9 ml/minConstant flow
1.0 ml/minConstant flow
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MS-Tee
0.9 ml/minConstant flow
1.0 ml/minConstant flow
QQQ
PCMMMI
MS-Tee
5.0 ml/minConstant flow
QQQ
PCMMMI
1.0 ml/minConstant flow
Concurrent Back Flush
15 minutos después de la inyección, la pre-columna se ventea en backflushmientras que el análisis sigue en la
columna principal
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TSSegment Start Time
(min.)Peak Number Analyte RT (min.) Pre-cursor 1 Product 1 CE (V) Pre-cursor 2 Product 2 CE (V)
1 25.00
1 1 13C-2378-TCDF 35.43 317.8 254 35 315.8 252 35
1 2 2378-TCDF 35.47 305.8 243 35 303.8 241 35
1 3 13C-1234-TCDD 35.77 333.8 270 20 331.8 268 20
1 4 13C-2378-TCDD 36.79 333.8 270 20 331.8 268 20
1 5 2378-TCDD 36.80 321.8 259 20 319.8 257 20
2 40.00
2 6 13C-12378-PCDF 42.55 351.8 288 30 349.8 286 30
2 7 12378-PCDF 42.56 339.8 277 30 337.8 275 30
2 8 13C-23478-PCDF 44.00 351.8 288 30 349.8 286 30
2 9 23478-PCDF 44.02 339.8 277 30 337.8 275 30
2 10 13C-12378-PCDD 44.45 367.8 304 21 365.8 302 21
2 11 12378-PCDD 44.48 355.8 293 21 353.8 291 21
3 46.00
3 12 13C-123478-HxCDF 48.04 385.8 322 35 383.8 320 35
3 13 123478-HxCDF 48.06 373.8 311 35 371.8 309 35
3 14 13C-123678-HxCDF 48.21 385.8 322 35 383.8 320 35
3 15 123678-HxCDF 48.22 373.8 311 35 371.8 309 35
3 16 13C-234678HxCDF 48.96 385.8 322 35 383.8 320 35
3 17 234678-HxCDF 48.97 373.8 311 35 371.8 309 35
3 18 13C-123478-HxCDD 49.17 403.8 340 22 401.8 338 22
3 19 123478-HxCDD 49.19 389.8 327 22 387.8 325 22
3 20 13C-123678-HxCDD 49.30 403.8 340 22 401.8 338 22
3 21 123678-HxCDD 49.32 389.8 327 22 387.8 325 22
3 22 13C-123789HxCDD 49.63 403.8 340 22 401.8 338 22
3 23 123789-HxCDD 49.65 389.8 327 22 387.8 325 22
3 24 13C-123789-HxCDF 50.04 385.8 322 35 383.8 320 35
3 25 123789-HxCDF 50.06 373.8 311 35 371.8 309 35
4 51.00
4 26 13C-1234678-HpCDF 51.84 421.8 358 30 419.8 356 30
4 27 1234678-HpCDF 51.86 409.8 347 30 407.8 345 30
4 28 13C-1234678-HpCDD 53.11 437.8 374 20 435.8 372 20
4 29 1234678-HpCDD 53.13 425.8 363 20 423.8 361 20
4 30 13C-1234789-HpCDF 53.69 421.8 359 30 419.8 357 30
4 31 1234789-HpCDF 53.70 421.8 358 30 419.8 356 30
5 55.00
5 32 13C-OCDD 56.23 471.7 408 20 469.7 406 20
5 33 OCDD 56.24 459.8 397 20 457.8 395 20
5 34 13C-OCDF 56.41 453.7 389.9 35 455.8 391.8 40
5 35 OCDF 56.42 443.7 381 25 441.7 378.6 30
Full GC-QQQ MRM Settings
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Isómeros de PCDDs/PCDFs nativosTetra Penta Hexa Hepta Octa
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Curva de: 2378-TCDD 100fg – 10pg inyectados
Fuente : CVUA-MEL
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Curva de : 12378-PCDD 100fg – 10pg Inyectados
Fuente : CVUA-MEL
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Reproducibilidad en area de pico (n=15)Extracto de cerdo añadido - nativas - 200 fg inyectados
Inj # 2378-TCDF 2378-TCDD 12378-PCDF 23478-PCDF 12378-PCDD
Acq. Date-Time Area* Area* Area* Area* Area*
1 09/04/2010 13:39 1039 668 791 898 480
2 09/04/2010 14:43 1189 702 891 877 565
3 09/04/2010 15:47 1104 728 882 879 606
4 09/04/2010 16:51 1035 756 789 852 563
5 09/04/2010 17:55 993 704 806 948 587
6 09/04/2010 18:58 1071 661 834 897 623
7 09/04/2010 20:02 1013 654 799 1012 568
8 09/04/2010 21:06 975 635 864 953 610
9 09/04/2010 22:10 1085 618 792 835 565
10 09/04/2010 23:13 1076 709 829 873 531
11 10/04/2010 00:17 942 799 745 1003 554
12 10/04/2010 01:21 957 679 853 834 540
13 10/04/2010 02:24 1050 584 877 914 579
14 10/04/2010 03:28 935 606 802 923 666
15 10/04/2010 04:32 1051 661 855 891 642
Mean 1034 678 827 906 579
Stdevn 68 57 42 54 46
%RSD 6.60 8.48 5.11 5.98 8.02
* Raw (uncorrected) peak area
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Reproducibilidad en área de pico (n=15) Extracto de cerdo añadidoNativas - 200 fg inyectados , 13C-ISTDs - 2pg Inyectados
* Raw (uncorrected) peak area
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
Peak
Are
a %
RS
D
Native
13C-ISTD
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Conclusiones1. GCQQQ buena elección para
aplicaciones de alta sensibilidad en presencia de matriz
2. Capacidad de implementar métodos Quant/Qual –pesticidas, drogas y esteroides anabolizantes … - gracias al gran número de transiciones/unidad de tiempo que son capaces de manejar
3. Screening de dioxinas (y compuestos similares) como alternativa a los sistemas de alta resolución
4. Más de notas de aplicación: