advances in biochemistryrcin.org.pl/content/33444/wa488_24040_p939_t48-z3-pb.pdf · stat1.5 —...
TRANSCRIPT
POLSKIE TOWARZYSTWO BIOCHEMICZNE
Advances in BiochemistryTOM 48, NR 3, 2002
Chromosom Filadelfia . ............. 156Zagadka histonu H I ....................... 167Prion [ PSI] 175Wyciszanie ekspresji genów u roślin . 182Procesy komórkowe aaRS................. 189Niedobór cholesterolu — SREBP . . . 200Rola lipidów w MDR........................... 208Receptory nukleotydowe.................... 220Adenozyna — neuromodulatorem . . 230Recenzja.......................................... 239
http://rcin.org.pl
http://rcin.org.pl
WYDAWCAEditorPOLSKIE TOWARZYSTWO BIOCHEMICZNE Polish Biochemical Society ul. Pasteura 3,02-093 Warszawa, Polandtel/fax 658-20-99e-mail — [email protected]
REDAKTOR SENIORSenior Editor ZOFIA ZIELIŃSKA tel. 831-24-03
REDAKTOR NACZELNYEditor in chiefGRAŻYNA PALAMARCZYK tel. 658-47-02
REDAKTORZYEditorsKRYSTYNA GRZELAK DANUTA HULANICKA ANDRZEJ JERZMANOW SKI ANDRZEJ KASPRZAK LILIANA KONARSKA ANNA SZAKIEL ADAM SZEW CZYK
BIURO REDAKCJIEditorial oiYiceSEKRETARZSecretaryHANNA LASKOWSKA poniedziałki, czwartki monday— thursday 14— 16tel. 659-85-71 w. 441 SKŁAD I ŁAMANIE TypesettingMAŁGORZATA BASAJ
RECENZENCI ZESZYTUReferees of this issue EWA BROJER (Warszawa) TADEUSZ CHOJNACKI (Warszawa) ANNA DYG AS (Warszawa) MICHAŁ KOMOSZYŃSKI (Toruń) BARBARA NAWROT (Łódź) ANDRZEJ PASZEWSKI (Warszawa) SŁAWOMIR PI KULA (Warszawa) PAWEŁ SABALA (Warszawa) KRZYSZTOF STAROŃ (Warszawa)
ADRES REDAKCJIAddressREDAKCJA KWARTALNIKA „POSTĘPY BIOCHEMII” ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa e-mail: [email protected]
Kwartalnik „Postępy Biochemii" wydawany z pomocą finansową Komitetu Badań Naukowych Indeksowany w Medline i Agrolibrex
S P I S T R E Ś C I
C O N T E N T S
Chromosom FiladelfiaPhiladelphia chromosomeIRENEUSZ MAJSTEREK, JANUSZ BŁASIAK.......................................................... 156
Zagadka histonu H IThe histone H I mysteryANDRZEJ T. W IERZBICKI.......................................................................................... 167
Prion [PSI] i jego wpływ na terminację translacji u drożdży Saccharomyces cerevisiaePrion [PSI] and its effect on termination o f translation in the yeast Saccharomyces cerevisiaeMAŁGORZATA JAKUBIEC, M AGDALENA B O G U T A ..................................... 175
Wyciszanie ekspresji genów i nowe narzędzia biologii molekularnej roślinG ene silencing and new tools in p lant m olecular b io logyMAREK KOTER, JACEK H E N N IG .......................................................................... 182
Udział syntetaz aminoacylo-tRNA w procesach komórkowychParticipation o f am inoacyl-tRNA synthetases in ce llu lar processesM O N IK A KAM IŃSKA, A D R IA N N A ZAKRZEWSKA, M ARIA MADAJKA,JAN BARCISZEWSKI................................................................................................... 189
Niedobór cholesterolu sygnałem dla transdukcji informacji z endoplazmatycznego retikulum do jądra komórkowego — procesy proteolitycznego odszczepienia czynników transkryp- cyjnych z błon ERDepletion o f cholesterol in signal transduction from endoplasm ic to the cell nucleus — the proteolytic c leavage o f transcription factors from the ER membranesBOŻENA WIECZOREK, JADW IGA G N IO T-S Z U LŻY C K A ............................. 200
Rola lipidów błony komórkowej w zjawisku oporności wielole- kowej MDR i jego modulacjiThe role o f cell membrane lipids in multidrug resistance and its m odulationKRYSTYNA MICHALAK, ANDRZEJ B. H E N D R IC H ......................................... 208
Receptory nukleotydoweN ucleo tide receptorsEDYTA GENDASZEW SKA-DARMACH.................................................................. 220
Adenozyna — neuroprzekaźnik i neuromodulator w centralnym układzie nerwowymAdenosine — neurotransmitter and neurom odulator in central nervous systemMAŁGORZATA R O M AN O W S KA, M ICHAŁ K O M O S Z Y Ń S K I..................... 230
RecenzjaReviewKRZYSZTOF Z A B Ł O C K I.......................................................................................... 239
155http://rcin.org.pl
Chromosom Filadelfia
Philadelphia chromosome
IRENEUSZ MAJSTEREK1, JANUSZ BŁASIAK2
Spis treści:
I. W prowadzenieII. Klonalny charakter białaczekIII. Chromosom Filadelfia
III-l.O b szar pęknięć chrom osom u 22 (BCR)III-2. Protoonkogen c-ABL
IV. Gen fuzyjny BCR/ABLV. Rola BCR/ABL w procesach kom órkowych
V-1. Stym ulowana przez BCR/ABL naprawa DNAV-2. Oddziaływ anie BCR/ABL z genem supresorowym
P53VI. Rola BCR/ABL w regulacji apoptozy V H .U wagi końcowe
Contents:
I. IntroductionII. Clonal nature o f leukem iasIII. Philadelphia chrom osom e
III-l. Breakpoint cluster region o f chrom osom e 22 (BCR)
III-2. Proto-oncogene c-ABLIV. BCR/ABL fusion geneV. Role of BCR/ABL in cellular processes
V-1. BCR/ABL-sûmw\2itt<\ DNA repairV-2. Interaction o f BCR/ABL with P53 tumour
suppressor geneVI. Role o f BCR/ABL in regulation of apoptosis VILConcluding remarks
W ykaz stosowanych skrótów: 14-3-3 — białko z rodziny BAP-1; ABL — kinaza tyrozynowa; ALL — ostra białaczka limfoblastyczna; AML — ostra białaczka szpikowa; ATM — mutacja genu AT (ang. ataxia-teleangiectasia)\ BAD, BAK, BAX — inhibitory apoptozy; Bap-1 — białko towarzyszące BCR; BCL-2, BCLXL, BCL-W — promotory apoptozy; BCR — region złamań chromosomu 22; CML — przewlekła białaczka szpikowa; CLL — przewlekła białaczka limfocytama; CRKL, CRK, CBL, GRB-2, SHC — białka adaptorowe; DNA-PK — zależna od DNA kinaza białkowa; Doc-1 — białko przewodzące sygnał z receptora czynnika wzrostu KIT; GAP — białko aktywujące GTPazę; GEF — czynnik regulujący wymianę GDP/GTP; ICSBP — bjałka wiążące interferon; IFN -a — inter- feron-a; JAK — kinazy cytoplazmatyczne z rodziny Janus; Kit — międzybłonowy receptor kinaz tyfozynowych; MAP — białka stowarzyszone z mikrotubulami; M-bcr — główny region złamań chromosomu 22; m -bcr— mniejszy region złamań chromosomu 22; MDR — oporność wielolekowa; NLS — sekwencje lokalizacji jądrowej; OTK — onkogenna kinaza tyrozynowa; Ph — chromosom Filadelfia; PI3K — kinaza fosfatydylo- inozytolowa; RAC, RHO — białka o aktywności GTPazy;
'Dr, 2prof. dr hab., Katedra Genetyki Molekularnej Uniwersytetu Łódzkiego, ul. Banacha 12/16, 90-237 Łódź, e-mail: [email protected]
RAD51 — białko biorące udział w naprawie przez rekombinację homologiczną; RAD52/RAD5 l/RPA — kompleks rekombi- nacyjny; RAF-1, AKT, MEK1/MEK2, ERK — kinazy seryno- wo-treoninowe; SH — domena homologiczna z SRC (ang. Src Homology); SRC, MYC, RAS —- protoonkogeny komórkowe; STAT1.5 — czynniki transkrypcyjne; VDAC — napięciowo zależne kanały anionowe.
I. Wprowadzenie
Białaczkom towarzyszy na ogół niestabilność ge- nomowa, będąca skutkiem zaburzeń funkcjonowania układów endokrynologicznego i immunologicznego oraz oddziaływania czynników chemicznych i fizycznych, a także wirusów. U chorych na białaczki obserwuje się aberracje chromosomalne oraz re- aranżacje protoonkogenów, genów supresorowych i genów białek naprawy DNA [1-6]. Zmiany w proto- onkogenach, będące wynikiem mutacji punktowych, integracji wirusowego DNA, amplifikacji oraz trans- lokacji, m ogą prowadzić do ich aktywacji. Mutacje punktowe w protoonkogemie N -RA S wykrywane są u chorych w stanach ostrych białaczek, a także u chorych ze stanami przedbiałaczkowymi [7, 8]. W białaczkach i chłoniakach obserwuje się także akty
156 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
wację protoonkogenów C-M YC i BC L-2 [9-13]. Za udziałem czynników genetycznych w powstawaniu białaczek przemawia także wysoka częstość pojawiania się ostrej białaczki mieloblastycznej u chorych z zespołem Downa (trisomia chromosomu 21) oraz z genetycznie uwarunkowanym i syndromami towarzyszącymi niestabilności genomowej — niedokrwistości Fanconiego i zespole Blooma [14-16]. W komórkach białaczkowych wykryw a się różne nieprawidłowości chromosomalne, z których najczęstszą określa się mianem chromosomu Filadelfia, powstającego na skutek translokacji z udziałem chromosomów 9 i 22 [17-19].
II. Klonalny charakter białaczek
Białaczki są nowotworami krwi i charakteryzują się akumulacją nieprawidłowych krwinek białych w szpiku. Komórki te przedostają się często do krwi obwodowej i naciekają narządy. Białaczki są chorobami klonalnymi, wyw odzą się zazwyczaj z jednej komórki, która uległa transformacji nowotworowej. W niektórych białaczkach kom órką przechodzącą transformację jes t w ielopotencjalna komórka m acierzysta, która może dać początek wszystkim liniom komórkowym krwi. W innych przypadkach białaczka jes t związana z transformacją bardziej zróżnicowanej komórki, która może zapoczątkować tylko jedną linię. Zmieniona kom órka daje początek klonowi potomnych kom órek nowotworowych. W białaczkach ostrych klon nowotworowy charakteryzuje się wysoką zdolnością do progresji, a w białaczkach przewlekłych — niską [20].
Podstawą klinicznego podziału białaczek jes t stopień dojrzałości komórek dominującego typu w szpiku i we krwi. Cztery najczęściej występujące odm iany białaczek, to: ostra białaczka limfoblastyczna (ALL), ostra białaczka szpikowa (AML), przewlekła białaczka szpikowa (CML) i przewlekła białaczka limfocytarna (CLL) [21-24].
III. Chromosom Filadelfia
W 1960 roku N o v e l l i H u n g e r f o r d opisali pierwszą specyficzną nieprawidłowość chromoso- m alną nowotworów krwi, nazw aną od miasta dokonania odkrycia chromosomem Filadelfia (Ph). Został on zidentyfikowany w komórkach szpiku pobranego od pacjentów z CML. W 1973 roku wykazano, że Ph jes t wynikiem translokacji fragmentu chromosomu 22 do chromosomu 9 ( t(9q+ ;22q-)(q34;q l 1)) [25]. Translokacja jest zapoczątkowana pęknięciami w dłuższych ramionach chromosomu 9 (9q34) i 22
(22q 11) i powoduje przeniesienie fragmentu genu BCR z chromosomu 22 do locus protoonkogenu C-ABL w chromosomie 9 [26-28]. W rezultacie zostaje utworzony gen fuzyjny BCR/ABL, kodujący cy- tozolowe białko charakteryzujące się aktywnością onkogennej kinazy tyrozynowej [29-31].
Chromosom Filadelfia występuje w 95% CML oraz w około 5% ALL u dzieci i 15-25% ALL u dorosłych; jes t także w ykryw any w AML [32, 33]. W CML translokacja ma miejsce w wielopotencjalnych macierzystych komórkach mieloidalnych i limfo- idalnych, a w ALL — prekursorowych komórkach B lub T, niekiedy także w wielopotencjalnych kom órkach pnia [33]. Translokacje BCR-ABL w CML i ALL różnią się punktem pęknięcia w BCR, a powstałe geny fuzyjne kodują białka różnych wielkości (190 kDa i 210 kDa) [33, 34]. Z klinicznego punktu widzenia identyfikacja Ph u dzieci z CML jest bardzo ważna, gdyż są one kwalifikowane do leczenia typowego dla CM L u dorosłych i rokowanie jes t u nich lepsze niż w postaci bez Ph [29, 30]. W ALL w ystępowanie Ph związane jes t z niekorzystnym rokow aniem i kwalifikuje chorych do przeszczepu szpiku. Szczególnie źle rokujące dla pacjentów z ALL jes t występowanie Ph łącznie z monosom ią chromosomu 7 [32, 33, 35].
Ostrej fazie choroby w CML towarzyszą wtórne zmiany chromosomalne: dodatkowy Ph, trisomia chromosomu 19, brak chromosomu Y [36]. W tym stadium w około połowie komórek wykrywa się w ięcej niż jeden chromosom Filadelfia, powstający prawdopodobnie w wyniku duplikacji lub triplikacji pierwotnego Ph, a nie w wyniku nowych, niezależnych translokacji [36-39]. Zmiany chromosomalne pojawiają się dużo wcześniej przed wystąpieniem klinicznych objawów tej fazy. Opisano także złożone translokacje Ph, w których oprócz chromosomów 9 i 22 biorą udział dodatkowe chromosomy, na przykład chromosom 20 [31].
III-l. Obszar pęknięć chromosomu 22 (BCR)
Pęknięcie w chromosomie 22, zapoczątkowujące translokację Ph, ma miejsce w genie BCR [40]. Gen ten liczy 130 kpz, zawiera 25 eksonów i koduje białko o masie 160 kDa, P160BCR [41-43] (Ryc. 1). Ekson pierwszy genu BCR koduje A-końcowy region białka charakteryzujący się aktywnością kinazy se- rynowo-treoninowej [44, 45]. Eksony 3-10 m ają sekwencje homologiczne z onkogenem DBL, który koduje białko z rodziny białek GEF (czynnik wymiany GDP/GTP). Białko GEF pełni razem z białkiem wspomagającym GAP (białko aktywujące GTPazy)
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 157http://rcin.org.pl
P145 c-ABLP210/185
BP P203 BP
SH3 SH2 SH1 (kinaza)
COOH
DNA BD AKTYNA BD
P160 c-BCR
NH
P210/203 P230
COOH
Oligomeryzacja 14-3-3/BAP-1 Rho-GEF Ca**-Lipidy Rac-GAPBD BD
Aktywność kinazy SERYNOWO/TREONINOWEJ
Ryc. 1. Struktura białek c-ABL (P145) i c-BCR (P160). NLS — sekwencje lokalizacji jądrowej, PPPP — sekwencje bogate w prolinę, BD — domeny wiążące, BP — punkty pęknięć w A-końcowym obszarze c-BCR i C-końcowym obszarze c-ABL prowadzące do translokacji, powodującej powstawanie chromosomu Filadelfia z genem fuzyjnym BCRJABL, którego ekspresja prowadzi do powstania białek P I 85, P203 i P210 BCR/ABL występujących w białaczkach człowieka (na podstawie [1, 18])
rolę regulatora enzymów charakteryzujących się aktywnością GTPazy [46], Białko BCR zbudowane jest w sposób domenowy — zawiera domenę oligomery- zacji, zależne od wapnia miejsce wiązania lipidów, miejsce wiązania czynnika 14-3-3 z rodziny BAP-1 (białka stowarzyszone z BCR), domenę hom ologiczną z RHO-GEF oraz C-końcow ą domenę RAC-GAP, wykazującą aktywność GTPazy [47-49]. M echanizm działania BCR w hematopoezie nie został jeszcze dokładnie poznany, jednak wyniki badań na myszach z wyłączonym genem BCR sugerują związek pomiędzy P160BCR i regulacją w ytw arzania rodników tlenowych przez układ oksydazy NADPH w komórkach m ieloidalnych i B-limfoidal- nych [50]. Myszy BCR~'~ w ykazują normalne czynności życiowe, podobnie ich system hematopoetycz- ny funkcjonuje bez zaburzeń, jednak w obecności en- dotoksyn rozwija się u nich szok septyczny. W neu- trofilach tych zwierząt następuje nadmierne w ytw arzanie rodników tlenowych, które zaburzają kontrolę nad białkiem P 2 1rac2 aktywującym neutrofilowy w y buch oddechowy [51].
III-2. Protoonkogen c-ABL
c-ABL występuje u wszystkich zwierząt kręgowych oraz bezkręgowców i charakteryzuje się filogenetyczną konserwatywnością [52]. Ludzki c-ABL zawiera 12 eksonów z sekwencjami hom ologiczny
158
mi z sekwencją onkogenu v-ABL rozłożonymi nieciągłe w obszarze 300 kpz [41, 53, 54]. Dwa pierwsze eksony c-ABL, a l i b l , są transkrybowane alternatywnie, co prowadzi do syntezy dwóch cząsteczek mRNA o długości 6 kpz i 7 kpz, ulegających translacji na białka liczące 1122 i 1142 am inokwasów [54]. Ludzki c-ABL koduje kinazę tyrozynow ą o masie 145 kDa, (P 145c ABL) (Ryc. 1). P145C'ABL jest jedną z niereceptorowych kinaz tyrozynowych spokrewnionych z białkiem SRC, pierw szą scharakteryzowaną onkogenną kinazą tyrozynową (OTK) [17, 55]. Białko c-ABL zawiera domeny homologiczne z SRC: SH1, SH2 i SH3. Domena SH1 wykazuje ak tywność kinazową, SH2 wiąże ufosforylowaną tyrozynę a SH3 wykazuje powinowactwo do sekwencji bogatych w prolinę i bierze udział w regulacji aktyw ności SH1 [56-58]. P145°'ab l zawiera C-końcowy fragment z domenami sekwencji lokalizacji jądrowej (NLS) i sekwencji bogatych w prolinę, domenę wiążącą DNA, miejsce wiązania P53 i domenę wiążącą aktynę. Lokalizacja kom órkow a P145c ABL umożliwia jego udział w procesach zachodzących zarówno w jądrze jak i cytoplazmie [56].
IV. Gen fuzyjny BCR/ABL
Translokacja fragmentu genu BCR z chromosomu 22 do locus protoonkogenu c-ABL w chromosomie 9 (t(9q+;22q-)(q34:ql 1)) prowadzi do powstania genu
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
fuzyjnego BC R/ABL (Ryc. 2), którego ekspresja sprzyja proliferacji i stwarza przewagę komórek Ph+ nad otaczającymi je prawidłowymi komórkami szpiku [17, 48, 59]. W komórkach Ph+ ekspresji ulegają zarówno gen fuzyjny BC R/ABL jak i c-BCR oraz c-Abl [60-61].
m-bcr < ►
t
W chromosomie 22 pęknięcia następują wewnątrz intronów genu BCR, głównie w trzech regionach: M-bcr, m-bcr i p-bcr [66-68]. W regionie M-bcr pęknięcia m ają miejsce w obszarze o długości 5,8 kpz, obejmującym 5 eksonów e 12-e 16 (b l-b5 ) i występują zazwyczaj pomiędzy eksonami e l3 (b2) i e 14
Chromosom 22M-bcr u-bcr
< ►
t t t tc-BCR
Chromosom 9
Hl— HIt It
a3—a11 C-ABL
a2-a11 P230 BCR/ABL
P210 BCR/ABL
P203 BCR/ABL
P185-190 BCR/ABL
a3-a11 P180 BCR/ABL
EKSONY
INTRONY
tt
punkty złam ań w ALL
punkty złam ań w CML
Ryc. 2. Molekularne konsekwencje translokacji t(9q+;22q-) prowadzącej do powstania chromosomu Filadelfia. Lokalizacja punktów pęknięć w chromosomach 22 i 9 oraz główne mRNA białek fuzyjnych występujących w białaczkach człowieka (na podstawie [8, 15, 17, 18, 19])
Region chromosom u 9, w którym następują pęknięcia prowadzące do powstania chromosomu Filadelfia obejmuje obszar ponad 200 kpz. Najczęściej pęknięcia w ystępują w pierwszym eksonie od końca 5 ’ genu c-ABL, co powoduje, że translokacji do chromosomu 22 ulega prawie cały ten gen (eksony a2-al 1), a wycięciu ulegają eksony la i lb [59, 62]. Ekson 2 odgryw a k luczow ą rolę w składaniu BCR/ABL [63]. Pęknięcia pomiędzy eksonami b l i a l pow odują translokację dłuższego fragmentu ABL (a 1-a 11), a w ycięciu ulega tylko wewnętrzny ekson b l [62]. W chromosom ie 9 stwierdza się również zw iększoną częstość pęknięć w intronie przedzielającym eksony a2 i a3. W ówczas translokacji ulega krótszy region a 3 - a l l [64, 65].
(b3) lub e l4 (b3) i e l5 (b4) [59, 64]. Gdy fragmenty BCR u legają fuzji z eksonami a 2 -a l l ABL, podczas transkrypcji powstaje hybrydowy mRNA b2a2/b3a2, zawierający 8,5 kz z sekwencją pochodzącą z BCR na końcu 5 ’ i sekwencją z ABL na końcu 3 ’ [31, 62]. Białko BCR/ABL o masie 210 kDa, (P210), zawiera 902 lub 927 aminokwasów kodowanych przez gen BCR oraz 426 aminokwasów kodowanych przez gen ABL [59, 69]. Ekspresję P210 stwierdza się u większości pacjentów z CM L oraz u około połowy ALL z Ph [31 ]. W kilku przypadkach ALL Ph+ i CML obserwowano ekspresję białka 203 kDa (P203) z tran- skryptu b2a3/b3a3 B C R/ABL [64, 65].
W ponad 75% przypadków ALL i nielicznych przypadkach CML Ph+, ekspresja genu fuzyjnego
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 159http://rcin.org.pl
BCR/ABL prowadzi do syntezy mniejszego białka o masie 185-190 kDa, P185-190 [17, 48]. W genie BCR miejsca pęknięć znajdują się w regionie m-bcr, pomiędzy dwoma pierwszymi eksonami e l i e2 [62, 64]. W wyniku połączenia eksonów a 2 - a l l genu ABL z eksonem e l genu BCR powstaje mRNA BCR/ABL liczący 7,5 kz [62]. Ze względu na alternatywne składanie białko P I 85-190 może występować razem z białkiem P210 [70]. W ALL Ph+ można obserwować także ekspresję białka o masie 180 kDa, będącego produktem translacji e la3 mRNA, powstającego w wyniku połączenia eksonu e l BCR i eksonów a 3 - a l l ABL [64, 65]. Geny fuzyjne BCR/ABL z miejscem pęknięcia w obszarze p-bcr pomiędzy eksonami e 19 i e20 genu BCR rzadko towarzyszą CML. Połączenie eksonów e 1-e 19 BCR z obszarem a 2 - a l l ABL prowadzi do powstania tran- skryptu c3a2 mRNA, ulegającego translacji na białko o masie 230 kDa [65, 71, 72],
tywność przypisuje się b iałku P I 85 B C R /A B L [32 ,73 ] .0 ile białko c-ABL występuje zarów no w jąd rze jak1 cytoplazmie, to białka fuzyjne B C R /A B L w ykry wane sąn iem al wyłącznie w cy toplazm ie [25]. Taka lokalizacja BCR/ABL m oże mieć udział w onko- gennej aktywności genu B C R /A B L , na k tórą wpływać także m ogą zw iększona aktyw ność kodowanego przez niego enzym u i zdolność BCR/ABL do fosforylacji substratów nie rozpoznaw anych przez c-Abl [74-76].
V. Rola BCR/ABL w procesach komórkowych
BCR/ABL uczestniczy w aktywacji wew nątrzkomórkowych kaskad przesyłania sygnałów w szlakach: RAS [77-79], JAK/STAT [80-83] oraz kinazy PI3K [84-85] (Ryc. 3). Proliferacja komórek B C R /A B L+ wymaga aktywności k inazy fosfatydylo- inozytolu PI3K [86, 87], jednakże to B CR/ABL two-
Ryc. 3. Niektóre formy aktywności BCR/ABL w komórce. Kolorem czarnym zaznaczono białka w postaci nieaktywnej, kolorem białym - aptorowe. Szczegółowy opis procesów przedstawionych na rycinie umieszczono w tekście (na podstawie [84])
białka ad-
Tak więc ekspresja genu fuzyjnego BC R/ABL, w zależności od miejsca pęknięc ia w BCR i ABL, p o woduje syntezę kilku białek: P I 80, P I 85-190, P203, P210 lub P230, zw iązanych z różnymi pos taciami białaczek u ludzi. W szystkie b iałka fuzyjne w ykazują k ilkakrotnie w yższą aktyw ność kinaz ty-rozynowych niż białko P I 45 c -A B L N ajw yższą ak-
rzy multimeryczny kom pleks z białkami adaptoro- wymi CBL, CRK oraz CRKL, uczestniczącymi w aktywacji kinazy PI3K [88]. Przekaźnikiem w kaskadzie PI3K jes t kinaza serynowo-treoninowa AKT, której substratem jes t białko proapoptotyczne BAD — stwarza to możliwość udziału BC R/ABL w regulacji apoptozy [89-92].
160 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
Wzrost komórek hematopoetycznych kontrolują cytokiny, których receptory przekazują sygnał poprzez aktywację kinaz cytoplazmatycznych JAK, fosforylujących i aktywujących czynniki transkryp- cyjne z rodziny STAT. W komórkach BC R /AB L+ ma miejsce stała aktywacja szlaku JAK/STAT. Może być ona spowodowana nieza leżną od JAK fosforylacją STAT5, wykazującego aktywność antyapoptotyczną w obecności B CR/A BL [48, 81, 93, 94], W odróżnieniu do naturalnych m echanizm ów aktywacji szlaku JAK/STAT, B C R /A B L może bezpośrednio wpływać na czynniki STAT1 i STAT5, bez uprzedniej fosforylacji kinaz JAK. W konsekwencji, ekspresja genu BC R/ABL uniezależnia komórki od czynników wzrostu. Proces ten może być także zależny od białka RAS, będącego produktem protoonkogenu R A S [95, 96]. W aktywacji RAS biorą udział białka adaptorowe GRB-2, SHC i CRKL. GRB-2 razem z białkami SOS stabilizuje RAS w jego formie aktywnej, co pozwala na przyłączenie GTP. Białka GRB-2, SHC oraz CRK L są substratami BCR/ABL biorącego udział w aktywacji RAS [48]. Współdziałanie B CR /A B L i RAS może prowadzić do aktywacji kinazy RAF-1, inicjującej kaskadę sygnałów regulujących transkrypcję i apoptozę [84].
Nadekspresja onkogenu M YC towarzyszy wielu nowotworom u ludzi, także białaczkom. BCR/ABL może aktywować protoonkogen c-M YC, jednakże mechanizm tego procesu nie został jeszcze poznany [99-101], Białko M YC pochodzi z rodziny czynników transkrypcyjnych, do której należą również białka JUN i FOS, a heterodimer JUN/FOS ma właściwości plejotropowego aktywatora transkrypcji. BCR/ABL m oże fosforylować JUN, przyczyniając się do ekspresji M Y C [102].
BCR/ABL m oże stym ulow ać proliferację kom órek, jednakże aktywność ta może być hamowana przez białko P27. Białko to jes t inhibitorem zależnych od cyklin kinaz i odgrywa kluczową rolę w regulacji wzrostu kom órek hematopoetycznych. Taki charakter działania BCR /A B L może wynikać z j e d noczesnej aktywacji cyklu komórkowego i zależnych od cyklin kinaz przez oddziaływanie z czynnikami hamującymi cykl kom órkow y [103]. S tymulacja proliferacji kom órek przez BCR/ABL może się odbywać z wykorzystaniem szlaków działania czynników wzrostu: B C R /A B L może oddziaływać z pod- jednostką Bc receptora interleukiny-3 (IL-3) oraz m iędzybłonowym receptorem kinaz tyrozynowych, KIT. Fosfoproteina Dok-1 (P26DOK2), biorąca udział w przesyłaniu sygnału z receptora KIT, może tw orzyć kompleks z CRKL, RAS-G A P i BCR/ABL [84]. BCR/A BL może także fosforylować i aktywować
fosfolipazę Cy (PLCa), fosfatazę inozytolową SHIP-2, białka VAV i FAK, kinazy ERK i SRC [104-110] (Tabela 1).
Komórki BC R /A B L+ charakteryzują się obniżoną zdolnością adhezji. Ponieważ adhezja hamuje proliferację, to ta właściwość komórek BC R/ABL+ może mieć znaczenie dla ich zwiększonej aktywności pro- liferacyjnej, mającej kluczowe znaczenie w progresji nowotworów [111, 112]. Zdolności adhezyjne kom órek BC R/A B L+ m ogą zostać zwiększone przez inter- fe ron-a (IFN-a), który jes t stosowany w terapii CML[113].
V -l. Stymulowana przez BCR/ABL naprawa DNA
Kluczow ą rolę u człowieka w procesie naprawy rekombinacyjnej odgrywa białko RAD51, biorące także udział w innych systemach naprawy DNA [114-120]. RAD51 może oddziaływać z produktami genów supresorowych P53, BRCA1 i BRCA2 [120, 122]. Białka rodziny R A D 5 1 m ogą także bezpośrednio kontrolować wzrost komórek [123].
Uszkodzenia DNA w komórce mogą powodować aktywację białka c-ABL, które może fosforylowć Tyr54 białka RAD51 [84, 124, 125], Fosforylacja RAD51 stymuluje jego wiązanie z RAD52 i tworzenie kompleksu rekombinacyjnego RAD52/RAD51/ RPA [126]. RAD51 może być także fosforylowany przez zależną od DNA kinazę białkową, DNA-PK, b iorącą udział w naprawie przez rekombinację nie- hom ologiczną [127]. BCR/ABL może bezpośrednio aktywować RAD51 [23, 57, 128] (Ryc. 4). Wzrost aktywności RAD51 w komórkach BC R/ABL+ może być wynikiem stymulowanej przez BCR/ABL trans- aktywacji promotora genu RAD51 przy udziale czynnika transkrypcyjnego STAT5 [58].
N apraw a przez rekom binację hom ologiczną z udziałem R A D 5 1 odgryw a główna rolę w usuwaniu dw uniciowych pęknięć DNA, które, gdy nie są naprawiane, m ogą prowadzić do śmierci komórki. BCR/ABL, poprzez oddziaływ anie z RAD51, może pow odow ać zw iększenie efektywności naprawy pęknięć dw uniciow ych DNA. Takie uszkodzenia są w yw oływ ane przez wiele leków przeciw now otw o- rowych oraz prom ieniow anie jon izu jące stosowane w celach terapeutycznych, a ich efektywniejsza n a prawa w kom órkach B C R /A B L + może indukować oporność tych kom órek na prom ieniow anie i cy to statyki [129]. BC R/A B L m oże s tym ulow ać naprawę DN A w kom órkach poddanych działaniu leków przeciw now otworow ych: cisplatyny, mitom ycyny C oraz prom ieniow ania y; w kom órkach tych następować może wyraźny wzrost poziom u ekspresji
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 161http://rcin.org.pl
RAD51 [128, 130]. Dane te sugerują, że zależna od RAD51 napraw a przez rekom binację hom ologiczną, je s t jednym z m echanizm ów biorących udział w indukcji oporności kom órek B C R /A B L + na leki i prom ieniow anie [128]. B CR /A B L może także indukować lekooporność poprzez inne m echan izmy: blokow anie cyklu kom órkow ego w fazie G2/M czy prow adzące do b lokow ania apoptozy sty-
Tabela 1
Substraty BCR/ABL3
S u bstra t Funkcja
CBL Białko adaptorowe
Grb-2 Białko adaptorowe
CRKL Białko adaptorowe
CRK Białko adaptorowe
SHC Białko adaptorowe
Ras-GAP GTPaza aktywująca białko RAS
Paksylina Białko strukturalne (cytoszkielet/błona komórkowa)
Talina Białko strukturalne (cytoszkielet/błona komórkowa)
FAK Białko strukturalne (cytoszkielet/błona komórkowa)
PLC-( Fosfolipaza fosfatydyloinozytolowa
P13K podjcdnostka p85 Kinaza serynowo-treoninowa
VAV Różnicowanie komórek hematopoetycznych
FES Różnicowanie komórek mieloidalnych
STAT1/STAT5 Czynnik transkrypcyjny
P62DOK Białko adaptorowe
3 na podstawie [84]
mogą mieć związek z powstawaniem chromosomu Filadelfia, będącego jednym z wyznaczników CML[139].
BCR/ABL może brać udział w regulacji ekspresji P53, wpływając na procesy związane z indukcją apoptozy oraz przejściowym blokowaniem cyklu komórkowego przed wyjściem z fazy G1 (Ryc. 4). Ekspresji BCR/ABL może towarzyszyć obniżenie
mulowanie ham owania aktywności kaspazy 3 przez białka z rodziny BCL-2 (Ryc. 4) [111, 128, 131, 132]. Do oporności kom órek B C R /A B L + na p rom ieniowanie i cytostatyki może też przyczyniać się zwiększona efektywność naprawy uszkodzeń DNA przez rekom binację niehom ologiczną. Zachodzi ona w skutek bezpośredniego oddziaływ ania BCR/ ABL z k inazą D NA -PK, m ającą k luczow e znaczenie dla tego rodzaju napraw y [133].
V-2. Oddziaływanie BCR/ABL z genem supresoro- wym P53
Mutacje P53 tow arzyszą wielu nowotworom złośliwym, jednakże w białaczkach ich częstość jest stosunkowo niska w porównaniu z innymi now otw orami [134, 135]. Wyjątkiem jes t CML, gdzie mutacje wykrywa się u około 30% pacjentów w fazie ostrej choroby [136-138]. Sugeruje to, że mutacje P53
wewnątrzkomórkowego poziomu P53, co sugeruje udział BCR/ABL w hamowaniu aktywności P53[140], M echanizm tego procesu nie jest znany, je d nak w odpowiedzi na uszkodzenia DNA prawidłowe białko c-ABL może być aktywowane przez białko ATM. Jest ono produktem zmutowanego genu A T (ang. ataxia teleangiectasia ) i tworzy kompleks z P53. Wiązanie P53 poprzedza fosforylacja Ser465 c-ABL przez ATM [100]. Być może podobny proces zachodzi także w odniesieniu do domeny ABL białka BCR/ABL. Na hamowanie aktywności P53 przez BCR/ABL wskazują także wyniki doświadczeń przeprowadzonych na myszach z wyłączonym genem P53, u których stwierdzono podwyższoną zdolność do proliferacji i zmniejszoną podatność na apoptozę komórek B C R/ABL+ [141-143]. Zatem hamowanie aktywności P53 przez BCR/ABL może być elem entem transformacji komórek BC R /A B L+ do stanu charakterystycznego dla ostrej fazy białaczek.
162 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
Ryc. 4. Udział RAD51 i P53 w procesach komórkowych stymulowanych przez BCR/ABL. L ligand, R błonowy receptor komórkowy, BCL-2/BCLXl białka hamujące apoptozą, BAD/BAX białka proapoptotyczne. Grubość strzałek odzwierciedla stopień aktywacji lub hamowania
VI. Rola BCR/ABL w regulacji apoptozy
Jak już wspominano, ekspresji genu BCR/ABL może towarzyszyć hamowanie apoptozy [144-151] (Ryc. 4). Uszkodzenia DNA w komórkach BCR/ABL+ wywołują aktywację szlaku RAS prowadzącego do zwiększenia tempa proliferacji i b lokowania apoptozy [111, 129], BCR/ABL może hamować apoptozę poprzez blokowanie uwalniania cy- tochromu C z mitochondriów; cytochrom może się łączyć z białkiem APAF-1 oraz proenzymem kaspa- zy-9 [131, 132]. Utworzenie takiego kompleksu prowadzi do aktywacji kaspazy-9, uruchomienia kaskady innych kaspaz i apoptozy. Białka z rodziny BCL, w tym inhibitory apoptozy: BCL-2, BCL X l , BCL-W oraz promotory apoptozy: BAD, BAK, BAX mogą funkcjonować jako integratory na drodze przekazywania sygnału apoptozy [152, 153]. Białka BAX i BAK wraz z białkami VDAC (białka napięciowo-za- leżnych kanałów anionowych) tworzą duże kanały błonowe, przez które przedostają się cząsteczki cyto- chromu C z mitochondrium do cytoplazmy. BCR/ABL może także hamować apoptozę przez
zmianę aktywności genów należących do rodziny BCL: B CL X l i BCL-2 [89, 154-157]. Oddziaływaniu BCR/ABL z BCL-2 towarzyszyć może aktywacja szlaków RAS lub kinazy PI3K [158]. BCR/ABL może hamować apoptozę również przez fosforylację proapoptotycznego białka BAD przy udziale RAS [159-162]. Fosforylowane białko BAD tworzy kom pleks z białkami frakcji cytoplazmatycznej z rodziny 14-3-3 i w takim stanie jes t nieaktywne [92], BCR/ABL może blokować uwalnianie cytochromu C z mitochondriów i aktywację kaspazy 3, hamując proapoptotyczną aktywność BAD [132, 154,155, 163].
VII. Uwagi końcowe
Odkrycie chromosomu Filadelfia i poznanie m echanizmów translokacji t(9q+;22q-) stworzyło nowe perspektywy molekularnej analizy białaczek. Identyfikacja sekwencji regionów pęknięć w chromosomach biorących udział w powstawaniu Ph otwiera nowe możliwości prowadzenia badań nad jego znaczeniem biologicznym i rozwojem nowych
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 163http://rcin.org.pl
strategii diagnozowania oraz terapii. Określono rolę Ph i genu fuzyjnego BC R/ABL w patogenezie białaczek. BCR/ABL może brać udział w transformacji nowotworowej kom órek hematopoetycznych przez zwiększenie tempa proliferacji, zaburzenie adhezji, hamowanie apoptozy, aktywację białek MAP, aktywację protoonkogenów C-M YC i BC L-2, oddziaływanie z genami supresorowymi i aktywację genów, których produkty uczestniczą w naprawie DNA.
Znajomość molekularnych podstaw translokacji Ph stwarza nowe perspektywy w leczeniu białaczek. Ekspresja BCR/ABL może być ham owana na etapie transkrypcji przez użycie antysensowych cDNA lub RNA. Zastosowanie specyficznych inhibitorów kinaz tyrozynowych pozwala na hamowanie aktywności BCR/ABL, w szczególności jego działania anty- apoptycznego, wynikającego ze zdolności do fosforylacji białek regulujących apoptozę. Pomimo obiecujących efektów terapii genowej z zastosowaniem strategii antysensowej, inhibitory kinaz tyrozynowych wzbudzają największe nadzieje. W 1998 roku wprowadzono do zastosowania klinicznego związek o nazwie STI571, hamujący aktywność BCR/ABL, poprzez blokowanie jego domeny ATP, niezbędnej dla aktywności kinazy BCR/A BL [164], STI571 jest obecnie stosowany w leczeniu ALL i CML, w których stwierdza się translokacje Ph [165].
Artykuł otrzymano 13 września 2001 Zaakceptowano do druku 11 kwietnia 2002
Piśmiennictwo
1. F e r r a r a F, V i c a r i L , F e s t a B , Di N o t o R, P a n e F, S e b a s t i o L, C i m i n o R (1995) Haematologica 80: 434-436
2. S e b a s t i o L, F e r r a r a F , V i c a r i L, di N o t o R, d e l V e c c h i o L, P a n e F, F a s a n a r o A, C i m i n o R, S a - l v a t o r e F , V e n t r u t o V (1995) Am J Hematol 50: 49-52
3. G u i n B , P a d u a R A (1995) Cancer J 8: 195-2004. S h e e r D , S q u i r e J (1996) Cancer Biology 7: 1-325. D e A n g e l i C, G a n d i n i D, C u n e o A, M o r e t t i S, B i -
g o n i R, R o b e r t i M G, B a r d i A, C a s t o l d i G L, d e l S e n n o L (2000) Haematologica 85: 913-921
6. l i d a S, H a n a m u r a I , S u z u k i T , K a m i y a T, K a t o M, H a y a m i Y, M i u r a K, H a r a d a S, T s u b o i K, W a - k i t a A, A k a n o Y, T a n i w a k i M, N i t t a M, U e d a R (2000) Int J Hematol 72: 85-91
7. S c h a i c h M, R i t t e r M, I l l m e r T , L i s s k e P , T h i e d e C, S c h ä k e l U, M o h r B, E h n i n g e r G, N e u b a u e r A (2001 )B rJ H a em a to l 112: 300-307
8. S c h e e l e J S, R i p p l e D, L u b b e r t M (2000) Celi Mol Life Sei 57: 1950-1963
9. B o t t i A C, V e r m a R S (1990) Anticancer Res 10: 519-5261 0 . B r u c k e r t P , K a p p l e r R , S c h e r t h a n H, L i n k H,
H a g m a n n F, Z a n k l H (2000) Cancer Genet Cytogenet 120: 73-79
1 1 . B a r t o v a E , K o z u b e k S, K o z u b e k M, J i r s o v a P, L u k a s o v a E, S k a l n i k o v a M, C a f o u r k o v a A, K o - u t n a I (2000) Gene 244: 1-11
12. W u Y, M e h e w J W, H e c k m a n C A, A r c i n a s M, B o x e r L M (2000) Haematologica 85: 913-921
1 3 . S t a m a t o u l l a s A, B u c h o n n e t G, L e p r e t r e S, L e n a - i n P, L e n o r m a n d B, D u v a l C, C a l l a t M P , G a u i a r d P, B a s t a r d C, T i l l y H (2000) Leukemia 14: 1960-1966
14. Perera F P (1996) J Natl Cancer Inst 88: 469-5091 5 . G r i g n a n i F , F a g i o l i M, A l c o y M (1994) Blood 83:
10-2516. P a s t e r n a k G, H o c h h a u s A, S c h u l t h e i s B, H e h l
m a n n R (1998) J Cancer Res Clin Oncol 124: 643-6601 7 . K o l i b a b a K S, D r u k e r B J (1997) Biochim Biophys Acta
1333: 217-24818. C l a r k S S, M c L a u g h l i n J , T i m m o n s M, P e n d e r -
g a s t A M, B e n - N e r i a h Y, D o w L W, C r i s t W, R o v e r a G, S m i t h S D, W i t t e O N (1988) Science 1: 775-777
19. S h t i v e l m a n E, L i f s h i t z B, G a l e R P, R o e B A, C a n a a n i E (1986) Cell 2: 277-284
20. F i n c h S C, L i n e t M S (1992) Clin Haematol 5: 27-562 1 . B e n n e t t J M, C a t o v s k y D, D a n i e l M T, F l a n d r i n
G, G a l t o n D A G , G r a l n i c k H R, S u l t a n C (1976) Br Haematol 33: 451-459
22. B e n n e t t J M, C a t o v s k y D, D a n i e l M T, F l a n d r i n G, G a l t o n D A G, G r a l n i c k H R, S u l t a n C (1980)B rJ Haematol 44: 169-170
2 3 . C o p l e a n A E, M c G u i r e E A (1995) Blood 85: 1151-116824. D a m e s h e c W (1967) Blood 29: 566-58425. R o w l e y J D (1973) Nature 243: 290-29326. R o w l e y J D (1990) Cancer 65: 2178-21842 7 . B a r t r a m C R, d e K l e i n A, H a g e m e i j e r A, v a n
A g t h o v e n T , G e u r t s v a n K e s s e l A, B o o t s m a D, G r o s v e l d G, F e r g u s o n - S m i t h M A, D a v i e s T, S t o n e M (1983) Nature 306: 227-280
28. H e i s t e r k a m p N, S t e p h e n s o n J R, G r o f f e n J , H a n s e n P F, d e K l e i n A, B a r t r a m C R, G r o s v e l d G (1983) Nature 306: 239-242
29. H a r b o t t J , R i t t e r b a c h J , J a n k a - S c h a u b G, L u d w i g W D, R e i t e r A, R i e h m H, L a m p e r t F (1990) Hamatol Bluttransfus 33: 451-458
30. K a l w i n s k y D K, R a i m o n d i S C, S c h e l l M J , M i r r o J J r , S a n t a n a V M, B e h m F, D a h l G V, W i l l i a m s D (1990) J Clin Onkol 8: 75-83
3 1 . M o r r i s C, K e n n e d y M, H e i s t e r k a m p N, C o l u m - b a n o - G r e e n L, R o m e r i l K, G r o f f e n J , F i t z g e r a l d P (1991) Genes Chromosomes Cancer 3: 263-271
32. L a m p e r t F, H a r b o t t J , R i t t e r b a c h J (1991) Klin P a d i a t r 2 0 3 : 3 1 1 - 3 1 8
3 3 . P u i C H, C r i s t W M, L o o k A T (1990) Blood 76: 1449-1463
34. R o w l e y J D (1990) Semin Hematol 27: 122-1363 5 . F l e t c h e r J A K i m b a l l V M, L y n c h E, D o n n e l l y M,
P a v e l k a K, G e l b e r R D, T a n t r a v a h i R, S a l l a n S E(1989) Blood 74: 2130-2135
3 6 . R a i K R, S a w i t s k y A, C r o n k i t e E P, C h a n a n a A D, L e v y R N, P a s t e r n a k B S (1975) Blood 46: 219-234
3 7 . S o k o l J E, B a c c a r i n i M, R u s s o D, T u r a S (1988)Semin Hematol 25: 49-61
38. C o l l i n s S J (1991) W: Deisseroth AB, Arlinghaus RB (red) Chronic myelogenous leukemia. Dekker, NY, str. 3-72
39. Collins S J (1986) J Clin Invest 78: 1392-139640. G r o f f e n J , S t e p h e n s o n J R, H e i s t e r k a m p N, d e
K l e i n A, B a r t r a m C R, G r o s v e l d G (1984) Cell 36: 93-99
4 1 . C h i s s o e S L , B o d e n t e i c h A, W a n g Y F, W a n g Y P, B u r i a n D, C l i f t o n S W, C r a b t r e e J , F r e e m a n A, I y e r K , J i a n L (1995) Genomics 27: 67-82
42. Heisterkamp N, Stam K, Groffen J, de Klein A, Grosveld G (1985) Nature 315: 758-761
43. M e l o J V (1996) Leukemia 10: 751-75644. M a r u Y W i t t e O N (1991) Cell 67: 459-46845. M u l l e r A J , Y o u n g J C , P e n d e r g a s t A M, P o n d e l
M, L a n d a u N R, L i t t m a n D R, W i t t e O N (1991)M ol Cell Biol 11: 1785-1792
164 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
46. E v a A , A a r o n s o n S A (1985b) Nature 316: 273-27547. P e t e r s K L, S m i t h g a l l T E (1999) CellSignal 11: 507-5144 8 . R a i t a n o A B, W h a n g Y E (1997) Biochim Biophys Acta
1333:210-21649. S k o r s k i T , W ł o d a r s k i P, D a h e r o n L, S a l o m o n i
P, N i e b o r o w s k a - S k o r s k a M, M a j e w s k i M, W ą s i k M, C a l a b r e t t a B (1998) Proc Natl Acid Sci USA 29: 11858-11862
50. V o n e k e n J W , v a n S c h a i c k H, K a a r t i n e n V, D e - e m e r K, C o a t e s T, L a n d i n g B, P a t t e n g a l e P , D o r - s e u i l O, B o k o c h G M, G r o f f e n J (1995) Cell 80: 719-728
51. G r o f f e n J (1997) W: Abstracts J M ol Med 75: B 15052. P e n d e r g a s t A M, T r a u g h J A, W i t t e O N (1987) Mol
Cell Biol 7: 4280-428953. A b e I s o n H T, R a b s t e i n L S (1970) Cancer Res 30:
2213-222254. H e i s t e r k a m p N , S t a m K, G r o f f e n J , d e K l e i n A,
G r o s v e l d G (1985a) J Mol Appl Genet 2: 57-6855. K o n o p k a J B, W i t t e O N (1985) M ol CellB iolS: 3116-312356. W a n g J Y J (1993) Curr Opin Gen Rev 3: 35-4357. S k o r s k i T, N i e b o r o w s k a - S k o r s k a M, W ł o d a r s k i
P, W a s i k P, T r o t t a R, K a n a k a r a j P, S a l o m o n i P, A n t o n y a k M, M a r t i n e z R, M a j e w s k i M, W o n g A, P e r u s s i a B, C a l a b r e t t a B (1998) Blood 15: 406-418
58. N i e b o r o w s k a - S k o r s k a M, W a s i k M A, S l u p i a - n e k A, S a l o m o n i P, K i t a m u r a T, C a l a b r e t t a B, S k o r s k i T (1999) J Exp M ed 19: 1229-1242
59. Z a m e c n i k o v a A (2000) Neoplasma 47: 269-27360. M e 1 o J V , G o r d o n D E, C r o s s N C , G o l d m a n J M
(1993) Blood 81: 158-165ó l . I s s a a d C, A h m e d M, N o v a u l t S, B o n n e t M L,
B e n n a r d o T, V a r e t B, V a i n c h e n e r W, T u r h a n A G (2000) Leukemia 14: 662-610
62. B e r n a r d s A, R u b i n C M, W e a t b r o o k C A, P a - s k i n d M, B a l t i m o r e D (1987) M ol Cell B io l l \ 3231-3236
63. L i c h t y B D, K a m e l - R e i d S (2000) Biochem J 15: 63-6964. I w a t a S, M i z u t a n i S, N a k a z a w a S, Y a t a J (1994)
Leukemia 8: 1696-170265. M a r t i n e l l i G, A m a b i l e M, T e r r a g a n a C, T e s t o n i
N, O t t a v i a n i E, M o n t e f u s e c o V, d e V i v o A, B a c - c a r a n i M, R i c c i P , S a g i l o G, T u r a S (1999) Leukemia 13: 1463-1472
66. H e r m a n s A, H e i s t e r k a m p N , v o n L i d e n M, v a n B a a a l S, M e i j e r D, v a n d e r P l a s D, W i e d e m a n n L M G r o f f e n J , B o o t s m a D, G r o s v e l d G (1987) Cell 51: 33-40
67. S h t i v e l m a n E, L i f s h i t z B, G a l e R P, C a n a a n i E (1985) Nature 315: 550-554
68. S a g l i o G, G u e r r a s i n o A, R o s s o C, Z a c c a r i a A, T a s s i n a r i A, S e r r a A, R e g e - C a m b r i G, M a z z a U, G a v o s t o F (1990) Blood 76: 1819-1824
69. G u o J Q, L i a n J Y, X i a n Y M, L e e M S, D e i s s e - r o t h A B, S t a s s S A, C h a m p l i n R E, T a l p a z M, W a n g J Y, A r l i n g h a u s R B (1994) Blood 83: 3629-3637
70. W i n t e r S S, G r e e n e J M, M c C o n n e l l T S, W i l l - m a n C L (1999) Leucemia 13: 2007-2011
71. P a n e F, F r i g e r i F, S i n d o m a M, L u c i a n o L, F e r r a r a F , C i m i n o R, M e l o n i G, S a g l i o G, S a l v a t o r e F, R o t o l i B (1996) Blood 88: 2410-2414
72. R o t o l i B , P a n e F, S a l v a t o r e F , S a g l i o G (2000)B r J Haematol 110: 493-649
73. L u g o T G, P e n d e r g a s t A M, M u l l e r A J , W i t e O N(1990) Science 247: 1041 -1044
74. R e y n o l d s C H, W i l l s o n M G, G r o f f e n J , H e i s t e r k a m p N , P e a k m a n T C , P a g e M J (1993) Biochim Biophys Acta 1181: 122-130
75. D e i n i n g c r M W, V i e r a S, M e n d i o l a R, S c h u l t h e - i s B, G o l d m a n J M (2000) Cancer Res 1: 2049-2055
76. T a k e d a N, S h i b u y a M, M a r u Y (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96: 203-207
77. M a n d a n a s R A, L e i b o w i t z D S, G h a r e h b a g h i K, T a u c h i T , B u r g e s s G S, M i y a z a w a K, J a y a r a m H N , B o s w e l l H S (1993) Blood 82: 1838-1847
78. M a t s u g u c h i T, S a l g i a R, H a l l e k M, E d e r M, D r u - k e r B, E r n s t T J , G r i f f i n J D (1994) J Biol Chem 7: 5016-5021
79. P u i l L, L i u J , G i s h G, M b a m a l u G, B o w t e l l D, P e - l i c c i P G, A r l i n g h a u s R, P a w s o n T (1994)EM BOJ13: 764-773
80. C a r l e s s o N, F r a n k D A, G r i f f i n J D (1996) J Exp Med 183: 811-820
8 1 .1 1 a r i a R L J , V a n E t t e n R A (1996) J Biol Chem 271: 31704-31710
82. S h u a i K, H a l p e r n J , t e n H o e v e J , R a o X, S a w y e r s C L (1996) Oncogene 13: 247-254
83 . C o r t e z D, R e u t h e r G W, P e n d e r g a s t A M (1997) Oncogene 15: 2333-2342
84. D e i n i n g e r M W N , G o l d m a n J M, M e l o J V (2000) Blood 96: 3343-3356
8 5 . V a r t i c o v s k i L, D a l e y G Q, J a c k s o n P, B a l t i m o r e D, C a n t l e y L C (1991) M ol Cell B iol 11: 1107-1113
86. M a r a i s R, L i g h t Y, P a t e r s o n H F, M a r s h a l l C J (1995) EMBO J 14: 3136-3145
87. S k o r s k i T, K a n a k a r a j P , N i e b o r o w s k a - S k o r s k a M (1995) Blood 86: 726-736
88. S a t t l e r M, S a l g i a R, O k u d a K, U e m u r a N , D u r - s t i n M A, P i s i c k E, X u G, Li J L, P r a s a d K V, G r i f f i n J D (1996) Oncogene 12: 839-846
89. S k o r s k i T , B e l l a c o s a A, N i e b o r o w s k a - S k o r s k a M, M a j e w s k i M, M a r t i n e z R, C h o i J K, T r o t t a R, W l o d a r s k i P, P e r r o t t i D, C h a n T O , W a s i k M A, T s i c h l i s P N , C a l a b r e t t a B (1997) EMBO J 16: 6151-6161
90. S l u p i a n e k A, N i e b o r o w s k a - S k o r s k a M, H o s e r G, M o r r i o n e A, M a j e w s k i M, X u e L, M o r r i s S W, W a s i k M A, S k o r s k i T (2001) Cancer Res 61: 2194-2199
91. C o n s t a n t i n o R S S, L a c r o n i q u e V, B o u c h a r e t I, M o n n i R, B e r n a r d O, G i s s e l b r e c h t S, G o u i l l e u x F (2001) Oncogene 20: 2080-2090
92. d e l P e s o L, G o n z a l e s - G a r c i a M, P a g e C , H e r r e r a R, N u n e z G (1998) Science 278: 687-689
9 3 . H o r i t a M, A n d r e u E J , B e n i t o A A r b o n a C, S a n zC, B e n e t I , P r o s p e r F, F e r n a n d e z - L u n a J L (2000) J Exp Med 191: 977-984
94. S i l l a b e r C, G e s b e r t F, F r a n k D A, S a t t l e r M, G r i f f i n J D (2000) Blood 95: 2118-2125
95. K a b a r o w s k i J H, A l l e n P B, W i e d e m a n n L M (1994) EMBO J 13: 5887-5889
96. A l e y G Q , B a l t i m o r e D (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 9312-9316
97. O d a T , H e a n e y C, H a g o p i a n J R, O k u d a K, G r i f - f i n J D, D r u k e r B J (1994) J Biol Chem 269: 22925-22928
98. P e l i c c i G, L a n f r a n c o n e L, S a l c i n i A E, R o m a n o A, M e i e S, G r a z i a B o r r e l l o M, S e g a t t o O, Di F i o r e P P, P e l i c c i P G (1995) Oncogene 11: 899-907
99. S a w y e r s C L , C a l l a h a n W, W i t t e O N (1992) Cell 70: 901-910
100. B i s s o n n e t t e R P, E c h e v e r r i F , M a h b o u b i A, G r e e n D R (1992) Nature 359: 552-554
101. E v a n G I , W y l l i e A H, G i l b e r t C S, L i t t l e w o o d T D, L a n d H, B r o o k s M, W a t e r s C M, P e n n L Z, H a n c o c k D C (1992) Cell 69: 119-128
102. R a t i n o A B, H a l p e r n J R, H a m b u c h T M, S a w y e r s C L (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92: 11746-11750
1 0 3 . J o n u l e i t T , K u i p v a n d e r H, M i e t h i n g C, M i c h e l s H , H a l l e k M, D u y s t e r J , A u l i t z k y W E(2000) Blood 96: 1933-1939
104. G o t o h A , M i y a z a w a K, O h y a s h i k i K, T o y a m a K(1994) Leukemia 8: 115-120
105. T a u c h i T , F e n g G S, S h e n R, S o n g H Y , D o n n e rD, P a w s o n T , B r o x m e y e r H E (1994) J Biol Chem 269: 15381-15387
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 165http://rcin.org.pl
106. M a t s u g u c h i T , I n h o r n R C, C a r l e s s o N , X u G, D r u k e r B, G r i f f i n J D (1995) EMBO J 14: 257-265
107. S a l g i a R, B r u n k h o r s t B, P i s i c k E, Li J L, L o SH, C h e n L B, G r i f f i n J D (1995)Oncogene 11: 1149-1155
108. S a l g i a R, Li J L, L o S H, B r u n k h o r s t B , K a n s a s G S, S o b h a n y E S, S u n Y, P i s i c k E, H a l l e k M, E r n s t T (1995) J Biol Chem 270: 5039-5047
109. D a n h a u s e r - R i e d l S, W a r m u t h M, D r u k e r B J, E m m e r i c h B, H a l l e k M (1996) Cancer Res 56: 3589-3596
1 1 0 . W a r m u t h M, B e r g m a n n M, P r i e s s A, H ä u s l m a n n K, E m m e r i c h B, H a l l e k M (19979JB io l Chem 272: 33260-33270
111. B e d i A, Z e h n b a u e r B A, B a r b e r J P, S h a r k i s S J, J o n e s R J (1994) Blood 83: 2038-2044
112. V e r f a i l l i e C M, H u r l e y R, L u n d e l l B I , Z h a o C, B h a t i a R (1997) Acta Haematol 97: 40-52
113. B h a t i a R, W a y n e r E A, M c G l a v e P B, V e r f a i l l i e C M (1994) J Clin Invest 94: 384-391
114. T r z e c i a k A, B ł a s i a k J (1999) Post Biol Kom 26: 707-729115. N e w J H, S u g i y a m a T, Z a i t s e v a E, K o w a l c z y -
k o w s k i S C (1998) Nature 391: 407-410116. Y u Z, C h e n J , F o r d B N B r a c k l e y M E, G l i c k m a n
B W (1999) Environ Mol Mutagen 33: 3-20117. D y c k v a n E, S t a s i a k A Z, S t a s i a k A, W e s t S C
(1999) Nature 398: 728-731118. S c h i l d D, L i o Y C, C o l l i n s D W, T o s o m o n d o T,
C h e n D J (2000) J B io l Chem 275: 16443-16449119. S o n g B, S u n g P (2000) J Biol Chem 275: 15895-15904120. S h a r a n S K, M o t i m a s u M, A l b r e c h t U, L i m D - S ,
R e g e l E, D i n h C, S a n d s A, E i c h e l e G, H a s t y P, B r a d l e y A (1997) Nature 386: 804-810
121. S t u r z b e c h e r H - W , D o n z e l m a n n B, H e n n i g W, K n i p p s c h i l d U, B u n c h l o p S (1996) EMBO J 15: 1992-2002
122. S c u l l y R, C h e n j , P l u g A, X i a o Y, W e a v e r D, F e u n t e u n J , A s h l e y T, L i v i n g s t o n D M (1997) Celi 88: 265-275
123. H a v r e P A, R i c e M C, N o e M, K m i e ć E B (1998) Cancer Res 58: 4733-4739
124. T a k a o N, M o r i R, K a t o H, S h i n o h a r a A, Y a m a m o t o Ki (2000) J B io l Chem 275: 725-728
125. Y u a n Z M, H u a n g Y, I s h i k o T, N a k a d a S, U t s u - g i s a w a T, K h a r b a n d a S, W a n g R, S u n g P, S h i n o h a r a A, W e i c h s e l b a u m R, K u f e D (1998) J Biol Chem 273: 3799-802
126. C h e n G, Y u a n S S, L i u W, X u Y, T r u j i l l o K, S o n g B, C o n g F , G o f f S P, W u Y, A r l i n g h a u s R, B a l t i m o r e D, G a s s e r P J , P a r k M S, S u n g P, L e c E Y (1999) J Biol Chem 274: 12748-12752
127. K h a r b a n d a S, Y u a n Z M, W e i c h s e l b a u m R, K u f e D (1998) O ncogenell: 3309-3318
128. S l u p i a n e k A, H o s e r G , M a j s t e r e k I , B r o n i s z A, M a ł e c k i M, F i s h e l R , B l a s i a k J , S k o r s k i T (2002) M ol Celi Biol 22: 4189-4201
129. B e d i A, B a r b e r J P , B e d i G C, e l - D e i r y W S, S i - d r a n s k y D, V a l a M S, A k h t a r A J , H i l t o n J , J o n e s R J (1995) Blood 1: 1148-1158
130. B ł a s i a k J , T r z e c i a k A, K a c z y ń s k i K, M a j s t e r e kI, H o s e r G, G l o c E, M ł y n a r s k i W, S k o r s k i T(2001) Leukemia 15: 483
131. A m a r a n t e - M e n d e s G P, N a e k y u n g K C, L i u L, H u a n g Y, P e r k i n s C L, G r e e n D R, B h a l l a K (1998) Blood 91: 1700-1705
132. D u b r e z L, E y m i n B M, S o r d e t O, D r o i n N, T u r - h a n A G, S o l a r y E (1998) Blood 91: 2415
133. D e u t s c h , E, D u g r a y A, A b d u l K a r i m B, M a r a n - g o n i E, M a g g i o r e l l a L, V a g a n a y S, M ’ K a c h e r R, R a s y S D, E s c h w e g e F, V a i n c h e n k e r W, T u r - h a n A G, B o u r h i s J (2001) Blood 97: 2084
134. B e a c h D, S t i l l m a n B, W a t s o n J D (1991) 96: Cold Spring Harbor Press, New York, 1991
135. S k u z e G R, L u d l o w J W (1995) Lancet 345: 902-9061 3 6 . R o v i r a A, U r b a n o - 1 s p i z u a A, C e r v a n t e s F,
R o z m a n M, V i v e s - C o r r o n s J L , M o n t s e r r a t E, R o z m a n C (1995) Ann Hematol 70: 129-133
1 3 7 . 0 k a b e M, K u n i e d a Y, N a k a n e S, K u r o s a w a M, I t a y a T, V o g l e r W R, S h o j i M, M i y a z a k i T (1995) Leuk Lymphoma 16: 493-503
138. N e u b a u e r A, H e M, S c h m i d t C A, H u h n D, L i u E T (1993) Leukemia 7: 593-600
139. G u e r r a s i o A, S e r r a A, G o t t a r d i E, C i l l o n i D, V i s c h i a F, P a r v i s G, C i l l i V, S a g i l o G (1997) Leukemia 11 (Suppl 3): 519-521
140. P i e r c e A, S p o o n c e r E, W o o l e y S, D i v e C, F r a n c i s J M, M i y a n J, O w e n - L y n c h P J, D e x t e r T M, W h e t t o n A D (2000) Oncogene 19: 5487-5497
141. S k o r s k i T, N i c b o r o w s k a - S k o r s k a M, W l o d a r - s k i P, P e r r o t t i D, M a r t i n e z R, W a s i k M A, C a 1 a - b r e t t a B (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93: 13137-13142
142. H o n d a H, H i r a i H (2001) Blood Cells Mol Dis 27: 265-278143. H o n d a H, U s h i j i a m a T, W a k a z o n o K, O d a Y,
A i z a w a S, I s h i k a w a T, Y a z a k i Y, H i r a i H (2000) Blood 95: 1144-1150
144. A l d e e r m a n E M, F u d e n b e r g H H, L o v i n s R E (1980) Blood 55: 817-822.
145. A l n e m r i E S, L i v i n g s t o n D, N i c h o l s o n D, S a - l v e s e n G, T h o r n b e r r y N, W o n g W, Y u J (1996) Cell 8 7 :171
146. A l l s o p p T E, W y a t t S, P e t e r s o n H F, D a v i e s A M(1993) Cell 73: 295-307
147. A l n e m r i E S, R o b e r t s o n N M, F e r n a n d e s T F, C r o c e C M, L i t w a c k G (1992,) Proc Natl Acad Sei USA 89: 7295-7299
148. C o t t e r T G (1995) Leukemia lymphoma 18: 231-236149. W a n g J Y (2000) Oncogene 2019: 5643-5650150. D a l e y G Q, B a l t i m o r e D (1992) Proc Natl Acad Sei U SA
85: 9312-9316151. S i r a r d C, L a n e u v i l l e P, D i c k J E (1994) Blood 83:
1575-1585152. A d a m s J M, C o r y S (1998) Science 281: 1322-1226153. M a k i n G, H i c k m a n J A (2000) Cell Tissue Res 301:
143-152154. A m a r a n t e - M c n d e s G P, M c G a h o n A J, N i s h i o k a
W K, A f a r D E, W i t t e O N, G r e e n D R (1998) Oncogene 16: 1383-1390
1 5 5 . S a l o m o n i P, C o n d o r l l i F, S w e e n e y S M, C a l a - b r e t t a B (2000) Blood 96: 676-684
156. G r o s s A, M c D o n n e l l J M, K o r s m e y e r S J (1999) Gens Dev 13: 1899-1911
157. K a r n i R, J o v e R, L e v i t z k i A (1999) Oncogene 18: 4654-4662
158. S a n c h e z - G a r c i a I , M a r t i n - Z a n c a D (1997) J M ol Biol 267: 225-228
159. W a n g H G, R a p p U R, R e e d J C (1996) Cell 87: 629-638160. Z h a J , H a r a d a H, Y a n g E, J o c k e l J , K o r s m e y e r
S J (1996) Cell 87: 619-628161. N e s h a t M S, R a i t a n o A B, W a n g H G, R e e d J C,
S a w y e r s C L (2000) Mol Cell Biol 20: 1179-1186162. M a j e w s k i M, N i e b o r o w s k a - S k o r s k a M, S a l o -
m o n i P , S l u p i a n e k A, R e i s s K, T r o t t a R, C a l a - b r e t t a B, S k o r s k i T (1999) Cancer Res 59: 2815-2819
163. J o h n s o n B W, C e p e r o E, B o i s e L H (2000) J Biol Chem 275: 31546-31553
164. B u c h d u n g e r E, Z i m m e r m a n n J, M e t t H (1995)Proc Natl Acid Sei USA 92: 2558-2562
165. L e C o u n t r e P, M o l o g o n i L, C l e r i s L (1999) J Natl Cancer Inst 91: 163-168
166 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
Zagadka histonu HI
The histone HI mystery
ANDRZEJ T. WIERZBICKI
Spis treści:
I. W stępII. Chromatyna uczestniczy w regulacji ekspresji genówIII. Powszechność w ystępow ania i rola strukturalna suge
rują istotną rolę histonu HIIII-I.H iston HI w ystępuje u wszystkich grzybów, roślin
i zwierzątIII-2. Histon HI ulokow any jest w krytycznym miejscu
na nukleosom ieIV. Brak histonu H I nie w pływ a na żyw otność organizm ów
\\- \.T e tra h ym en a therm ophilaIV -2. K om órki kręgow ców in vitro IV-3. GrzybyIV-4. Zwierzęta IV-5. Rośliny
V. Sprzeczność m iędzy danym i strukturalnym i a funkcjonalnymi
VI. Pierwszym kluczem do zagadki histonu H I jest redundancjaVI-1. Redundancja jest pow szechną cechą układów bio
logicznychVI-2. M echanizm y działające na poziom ie chrom atyny
tworzą sieć w zajem nych powiązańVI-3. Histon HI jest elem entem sieci m echanizm ów
chrom atynowychVI-4. Zasada redundancji tłum aczy sprzeczność danych
strukturalnych i funkcjonalnychVII. Drugim kluczem do zagadki histonu HI jest jego dyna
miczne zachow anie w chrom atynieVII-1. Procesów biologicznych nie należy rozumieć
m echanistycznieVII-2. Chrom atyna jest układem dynam icznymVII-3. Histon HI m oże m odyfikow ać w łaściwości
dynam iczne chrom atynyVII-4. Dynam ika tłum aczy sprzeczność danych
strukturalnych i funkcjonalnychVIII. Jak rozwikłać paradoks histonu H I?
VIII-1. R edundancja VIII-2. Dynam ika
IX. Podsum owanie
Contents:
I. IntroductionII. Chrom atin participates in the regulation o f gene
expressionIII. Com m on occurrence and structural function suggest a
significant role for histone HIIII-l. H istone HI is found in all fungi, plants and
anim alsIII-2. H istone HI occupies a critical position on the
nucleosom eIV. The absence o f histone H I does not influence viability o f
organism sIV-1. Tetrahymena thermophila IV-2. Vertebrate cell lines in vitro IV-3. FungiIV-4. Anim alsIV-5. Plants
V. C ontradiction between structural and functional dataVI. The first key to the histone HI m ystery is redundancy
VI-1. Redundancy is a com m on feature o f biologicalsystem s
VI-2. Chrom atin processes constitute a network of interactions
VI-3. H istone HI is an elem ent o f the chromatin networkVI-4. Redundancy explains the contradiction between
structural and functional dataVII. The second key to the histone HI m ystery is its dynamic
behaviour in chrom atinVII-1. B iological processes should not be explained
m echanisticallyVII-2. Chrom atin is a dynam ic systemVII-3. H istone HI may m odify the dynam ic properties o f
chrom atinVII-4. D ynam ics explains the contradiction between
structural and functional dataVIII. How to solve the histone H I paradox?
V III-1. RedundancyVIII-2. Dynam ics
IX. C onclusion
I. Wstęp
Histon HI jes t białkiem w ystępującym w dużej ilości w jądrach komórkowych praktycznie wszyst-
Mgr, Uniwersytet Warszawski, Pracownia Biologii Molekularnej Roślin, ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa, e-mail: [email protected]
kich organizmów eukariotycznych. Dlatego pytanie o jego funkcję od wielu lat przyciąga uwagę badaczy. Pomimo to rola histonu H I pozostaje do dzisiaj zagadkowa. W artykule tym przedstawiam aktualny stan wiedzy na temat funkcji histonu HI ukazujący głęboką sprzeczność między danymi pochodzącymi z różnych podejść badawczych oraz proponuję dwa hipotetyczne wyjaśnienia roli histonu HI wraz ze sposobami ich weryfikacji.
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 167http://rcin.org.pl
II. Chromatyna uczestniczy w regulacji ekspresji genów
DNA w jądrach komórkowych organizmów eukariotycznych pozostaje stale związany z białkami, tworząc chromatynę. Odkrycie niespełna 30 lat temu podstawowej, nukleosomowej struktury chromatyny zapoczątkowało intensywne badania nad ro lą organi- zacji strukturalnej materiału genetycznego. Początkowo przypuszczano, że połączenie DNA z białkami jes t statyczne i m a znaczenie wyłącznie strukturalne. Z czasem okazało się, że pogląd ten był błędny [1]. Organizacja chromatyny ma istotne znaczenie dla regulacji procesów takich jak replikacja [2], rekombinacja [3], naprawa DNA [4], a przede wszystkim transkrypcja. Wydaje się, że struktura chromatyny jest ważnym czynnikiem w regulacji ekspresji genów, a przez to w regulacji różnicowania i rozwoju oraz odpowiedzi organizmów na warunki środowiska [5-9].
DNA nawinięty jes t na rdzenie utworzone z ośmiu cząsteczek histonów, po dwie cząsteczki każdego rodzaju: H2A, H2B, H3 i H4. Są to tak zwane histony rdzeniowe. Podjednostka zbudow ana z rdzenia histo- nowego wraz z niemal dwukrotnie owiniętym wokół niego odcinkiem DNA o długości około 150 par zasad została nazwana nukleosomem. Sąsiadujące nu- kleosomy połączone są odcinkiem DNA (tak zw anym łącznikiem) o długości kilkudziesięciu par zasad [1] (Ryc. 1).
Ryc. 1. Struktura nukleosomowa chromatyny.
Uważa się, że struktura nukleosom owa w swoim podstawowym stanie stanowi zawadę steryczną, k tóra uniemożliwia lub silnie utrudnia wiązanie innych białek z DNA. Tam gdzie niemożliwy jes t dostęp białek do DNA, niemożliwe staje się zachodzenie procesów związanych z DNA, przede wszystkim transkrypcji. Wykazano, że struktura chromatyny ulega zmianom oraz opisano m echanizmy j ą m odyfikujące, regulujące przez to procesy zależne od DNA [1]. Najistotniejsze z nich to: aktywne, zależne od
hydrolizy ATP, przesuwanie nukleosomów i zmiany oddziaływań histony-DNA [6, 10, 11], acetylacja, metylacja i inne modyfikacje histonów rdzeniowych [7, 12], a także metylacja DNA [13].
III. Powszechność występowania i rola strukturalna sugerują istotną rolę histonu HI
III-l. Histon HI występuje u wszystkich grzybów, roślin i zwierząt
Histon H I , zwany również histonem łącznikowym, występuje u praktycznie wszystkich grzybów, roślin oraz zwierząt [14, 15] i pozostaje zw iązany z większością nukleosomów w jądrze kom órkowym[1], U roślin i zwierząt z reguły występują liczne nie- alleliczne warianty histonu HI różniące się n ieznacznie sekwencją am inokw asow ą [14, 16].
Histon HI jes t białkiem silnie zasadowym, bogatym w aminokwasy lizynę i argininę. Ma budowę trójczęściową. Składa się z centralnej domeny globu- larnej oraz krótkiej domeny N-końcowej i dłuższej C-końcowej (Ryc. 2). Domeny końcowe są słabo
N-końcowa Globularna C-końcowa
50 aa
Ryc. 2. Histon H 1 składa się z trzech domen: N-końcowej, globulamej i C-końcowej.
ustrukturalizowane i słabo konserwowane ew olucyjnie. Domena globularna jest za to silnie konserw owana ewolucyjnie i przyjmuje dobrze określoną strukturę trzeciorzędową [14, 17] (Ryc. 3).
III-2. Histon HI ulokowany jest w krytycznym miejscu na nukleosomie
Histon HI zajmuje w strukturze nukleosomowej miejsce odmienne niż histony rdzeniowe, przyłącza się bowiem do nukleosomu od zewnątrz [ 1 ]. Podczas gdy szczegółowa budowa samego nukleosomu została poznana dzięki zastosowaniu metod krystalograficznych [18] (Ryc. 4a), lokalizacja histonu HI pozostaje przedmiotem kontrowersji. Za najbardziej prawdopodobne uważa się ułożenie domeny globu- larnej w miejscu, gdzie DNA wchodzi i schodzi z nukleosomu pomiędzy nicią w chodzącą a przebie-
168 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
Ryc. 3. Struktura krystalograficzna domeny globulamej histonu HI według [17].
gającą przez środek nukleosomu [14, 19, 20] (Ryc. 4b). Domena C-końcowa może wtedy oddziaływać z DNA łączącym nukleosomy. Taka lokalizacja histonu HI sugeruje jego bardzo istotną funkcję. Spina on bowiem i stabilizuje strukturę nukleosomu od zewnątrz.
Wykazano, że funkcja strukturalna histonu HI nie ogranicza się do budowania nukleosomu. Bierze on
(a)
histonowy
udział w organizowaniu wyższego rzędu struktur chromatyny, czyli tak zwanego włókna 30 nm [14, 21-23]. Wyraźnie w idoczną strukturę ponadnukle- osom ową przyjm ują obszary chromatyny nieaktywnej transkrypcyjnie [23]. A zatem histon HI może utrudniać dostęp do DNA co najmniej na dwa sposoby: stabilizując strukturę nukleosomu oraz biorąc udział w organizacji struktury ponadnukleosomowej chromatyny. To właśnie dlatego uznano histon HI za białko o kluczowym znaczeniu dla hamowania ekspresji genów, najprawdopodobniej niezbędne do życia komórek i organizmów.
IV. Brak histonu HI nie wpływa na żywotność organizmów
IV-1. Tetrahymena termophila
Równolegle do badań nad ro lą histonu H 1 w strukturze nukleosomowej, w miarę pojawiających się nowych możliwości metodycznych prowadzono badania funkcjonalne. Pierwsze doświadczenia przeprowadzono na orzęsku Tetrahymena therm ophila. Ku wielkiemu zaskoczeniu szczep T. therm ophila po zbawiony całkowicie białka uznanego za histon HI nie wykazywał żadnych istotnych zaburzeń [24], Z aobserwowano co prawda niewielkie zmiany w strukturze jądra komórkowego oraz drobne zmiany w ekspresji genów, jednak wzrost komórek był całkowicie normalny. Również ogólna ekspresja genów nie była zaburzona [24, 25]. Wyniki te pozwoliły po raz pierwszy zakwestionować tezę, jakoby histon HI był niezbędny do funkcjonowania organizmów. Badania te miały jednak pewien słaby punkt. Otóż białko
Rdzeńhistonowy
Ryc. 4. Struktura krystalograficzna nukleosomu według [18] (a), umiejscowienie histonu HI na nukleosomie według [19] (b).
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 169http://rcin.org.pl
uznane przez autorów za histon H I jes t w rzeczywistości podobne jedynie do C-końcowej domeny klasycznych histonów HI wyższych eukariontów, przy czym podobieństwo to dotyczy wyłącznie składu aminokwasowego. Brak domeny globularnej pozw ala wątpić, czy białko to jes t w rzeczywistości histo- nem HI i czy T. therm ophila i pozostałe orzęski w ogóle mają histon H I.
IV-2. Komórki kręgowców in vitro
Następny cykl badań funkcjonalnych pośw ięconych roli histonu HI przeprowadzono na hodow anych in vitro komórkach kręgowców. Otrzymano linie komórkowe z podwyższonym [26] lub obniżonym [27, 28] poziomem wybranych wariantów histonu H I. Wyniki były podobne do opisanych wyżej: drobne zmiany nie wpływające na żywotność kom órek. Za pom ocą elektroforezy dwuwymiarowej w ykazano pewne zmiany w ekspresji genów. W kom órkach pozbawionych w ybranych wariantów histonu HI zaburzenia w ekspresji genów były obecne, dotyczyły jednak tylko bardzo niewielkiej liczby genów [27]. Ugruntowało to tezę, że histon H 1 nie pełni k luczowej roli w podstawowych procesach życiowych, a co najwyżej jakąś funkcję ograniczoną i specyficzną. Niestety również te badania miały swój słaby punkt. Nadekspresji lub wyłączeniu określonego w ariantu histonu HI towarzyszył efekt kompensacyjny czyli zawartość pozostałych wariantów odpowiednio spadała lub wzrastała. Sumaryczna zawartość histonu HI zmieniała się najwyżej o 50 procent.
IV-3. Grzyby
Aby ominąć problem kompensacji sięgnięto po organizmy mające tylko jeden gen histonu H 1 - grzyby. Trzem niezależnym grupom badawczym udało się uzyskać szczepy trzech różnych gatunków grzybów pozbawione histonu H I . Pomimo wnikliwych analiz fenotypowych nie znaleziono żadnych nieprawidłowości w drożdżach Saccharom yces cerevisiae [29] ani w Aspergillus n idulans [30]. W A scobolus imm ersus zaobserwowano pewne nieprawidłowości, podstawowy wzrost nie był jednak zakłócony [31]. Wydaje się zatem, że histon HI nie jes t niezbędny do zachodzenia podstawowych procesów życiowych na poziomie komórkowym. Funkcja jego może być bardziej subtelna niż sądzono i może dotyczyć raczej funkcjonowania organizmu jako całości. Kwestię tę rozstrzygnąć mogły tylko badania na organizmach wielokomórkowych.
IV-4. Zwierzęta
Podjęto próby zbadania funkcji histonu HI u zwierząt. Pierwszą było pokazanie, że w początkowym etapie rozwoju w zarodku Drosophila nie ma histonu HI [32]. Później rozpoczęto serię eksperymentów na myszach, mających na celu wyłączenie kolejnych wariantów histonu H I. Opublikowane dotychczas dane potwierdzają brak jakichkolwiek zaburzeń spowodowanych przez usunięcie części wariantów histonu HI [33]. Udało się za to znaleźć interesującą, choć bardzo specyficzną funkcję histonu HI we wczesnym rozwoju zarodkowym płaza Xenopus laevis. Wykazano, że wymiana wariantów histonu H 1 powoduje istotną w rozwoju utratę zdolności komórek do różnicowania w tkankę mezodermalną [34],
IV-5. Rośliny
Do badania funkcji histonu HI wykorzystano również rośliny. Pierwszym znaczącym rezultatem było uzyskanie roślin tytoniu z silnie podwyższoną zawartością histonu H I [35]. Nadm iar tego białka nie upośledzał żywotności roślin, obserwowane zaburzenia były niewielkie. Podobnie jak u zwierząt, również w przypadku roślin żadna z dotychczas przeprowadzonych prób wyłączenia histonu HI nie przełamała mechanizmu kompensacji. Zmiany proporcji wariantów histonu HI w tytoniu nie zaburzyły żywotności roślin, a obserwowane defekty były ograniczone i specyficzne [36, 37]. Dotychczas dostępne dane z eksperymentów na organizmach wielokomórkowych potwierdzają zatem wcześniej w ysnute wnioski. Histon HI nie jes t niezbędny dla przeżycia. Jego rola jest raczej ograniczona i dotyczy tylko wybranych procesów [14].
V. Sprzeczność między danymi strukturalnymi a funkcjonalnymi
Jak zatem pogodzić wnioski płynące z różnych podejść eksperymentalnych? Z jednej strony powszechność występowania, istotne miejsce w strukturze nukleosomowej i rola w tworzeniu wyższego rzędu struktur chromatyny. Z drugiej, brak pow ażniejszych defektów w organizmach pozbawionych histonu H I lub z zaburzonymi proporcjami wariantów bądź nadekspresjąh is tonu H I. Czy to możliwe, by białko tak silnie konserwowane ewolucyjnie było jednocześnie zbędne dla przeżycia? Czy białko w ystępujące na powierzchni każdego nukleosomu może nie pełnić żadnej istotnej funkcji?
170 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
VI. Pierwszym kluczem do zagadki histonu HI jest redundancja
VI-1. Redundancja jest powszechną cechą układów biologicznych
Wydaje się, że pierwszym kluczem do rozwiązania zagadki histonu H I jes t redundancja m echanizmów biologicznych, czyli istnienie więcej niż j e d nego mechanizmu odpowiedzialnego za konkretną funkcję. W razie uszkodzenia jednego mechanizmu pozostałe przejm ują jego rolę. Redundancja jes t jed n ą z podstawowych cech układów biologicznych, a jej najlepszym przykładem jes t istnienie dwóch kopii wszystkich genów w większości organizmów eukariotycznych.
VI-2. Mechanizmy działające na poziomie chromatyny tworzą sieć wzajemnych powiązań
Różne procesy regulujące funkcjonowanie chromatyny są ze sobą silnie powiązane a jednocześnie ich funkcje w dużym stopniu pokryw ają się. Wykazano, że acetylacja histonów rdzeniowych i przesuwanie nukleosomów, mechanizmy uważane za k luczowe dla aktywacji ekspresji genów, są od siebie zależne [38]. Jednoczesne usunięcie acetylazy histono- wej oraz czynnika przesuwającego nukleosomy wywołuje efekt letalny, podczas gdy usunięcie tylko jednego z nich nie zaburza żywotności [38, 39], Oznacza to, że ich funkcje m uszą przynajmniej częściowo się pokrywać.
Podobnie, trzy najistotniejsze mechanizmy odpowiedzialne za hamowanie transkrypcji na poziomie struktury chromatyny: metylacja lizyny 9 histonu H3, deacetylacja histonów rdzeniowych i metylacja DNA są od siebie nawzajem zależne [12, 13, 40, 41]. Jednocześnie istnieją organizmy pozbawione jed n ego lub nawet dwóch z nich [13,41]. Pozostające m echanizmy przejm ują funkcje brakujących, co świadczy o ich przynajmniej częściowej redundancji.
Istnienie sieci m echanizmów zależnych od siebie i również częściowo się pokrywających zapewnia niezawodność regulacji ekspresji genów. Jednocześnie uszkodzenie jednego mechanizmu nie uniemożliwia działania całego układu.
VI-3. Histon HI jest elementem sieci mechanizmów chromatynowych
Skoro struktury i m echanizm y chromatynowe tworzą sieć wzajemnych powiązań, czy histon HI może być elementem tej sieci? Liczne dane w ska
zują, że tak. Wykazano, że obecność histonu HI silnie hamuje acetylację histonów rdzeniowych [42]. Wydaje się, że histon HI ma podobny wpływ na działanie czynników przesuwających nukleosomy [43]. Oba te procesy są uważane za bardzo ważne dla aktywacji ekspresji genów. Zaobserwowano również związek histonu HI z m etylacją DNA. Z jednej strony jego obecność zapobiega nadmiernej metylacji DNA [31], z drugiej zaś histon H I jest odpowiedzialny za kondensację chromatyny w odpowiedzi na me- tylację DNA [22]. Nie bez znaczenia wydaje się również zdolność do oddziaływania histonu HI z białkami strukturalnymi odpowiedzialnymi za inak- tyw ację transkrypcyjną obszarów chromatyny [44].
VI-4. Zasada redundancji tłumaczy sprzeczność danych strukturalnych i funkcjonalnych
Wydaje się zatem, że histon HI rzeczywiście jes t elementem sieci m echanizmów chromatynowych. Dostępne dane wskazują, że powiązany jes t raczej z hamowaniem transkrypcji. Jest to zgodne z w nioskami z badań strukturalnych, które sugerują, że histon HI hamuje dostęp do DNA przez stabilizowanie struktury nukleosomu i skondensowanych struktur chromatyny wyższego rzędu. Jednocześnie jego funkcja pokrywa się w dużej mierze z innymi m echanizmami, które m ogą kompensować brak histonu HI (Ryc. 5). Jest to zgodne z wynikami badań funkcjo-
Otwarty stan chromatyny
Zamknięty stan chromatyny
Ryc. 5. Redundancja mechanizmów chromatynowych odpowiedzialnych za hamowanie transkrypcji. Brak jednego mechanizmu może zostać skompensowany przez pozostałe.
nalnych, które pokazują, że jego brak nie zaburza podstawowych procesów życiowych. Tak więc spojrzenie na rolę histonu HI uwzględniające redundancję procesów biologicznych zdaje się wyjaśniać paradoksalną sprzeczność między danymi strukturalnymi a funkcjonalnymi.
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 171http://rcin.org.pl
VII. Drugim kluczem do zagadki histonu HI jest jego dynamiczne zachowanie w chromatynie
VII-1. Procesów biologicznych nie należy rozumieć mechanistycznie
Drugim kluczem do rozwiązania zagadki histonu HI może być bardziej realistyczne rozumienie procesów biochemicznych. Istnieje tendencja, aby procesy te rozpatrywać w kategoriach mechanistycz- nych. Cząsteczki chemiczne często traktuje się jak tryby w maszynie, ich oddziaływanie jako popychanie, a modyfikacje strukturalne jako przestawianie elementów. Tymczasem na poziomie molekularnym rządzi dynamika i prawa statystyczne. Aktualny stan każdego układu sprowadza się zawsze do równowagi dynamicznej różnych stanów przejściowych.
VII-2. Chromatyna jest układem dynamicznym
Klasyczne badania nad strukturą i funkcją chromatyny interpretowane były w kategoriach mechani- stycznych. Wraz ze wzrostem wiedzy na ten temat, podejście to okazuje się coraz mniej użyteczne. D obrze ilustrują to wyniki doświadczeń, w których dwukrotnie zmniejszono gęstość nukleosomów w chromatynie drożdży, a następnie analizowano ekspresję wszystkich genów [45]. Ponieważ organizacja nukleosomowa postrzegana jes t jako kluczowy czyn-
0&'ETCLayto
CLt/i
Eo
Li_
|t
It
W obecności histonu H1
Bez histonu H1
Ryc. 6. Przyłączanie histonu HI może zmieniać równowagę dynamiczną między różnymi stanami konformacyjnymi nukleosomów przez stabilizowanie jednego stanu (po lewej). Bez histonu H 1 mogą spontanicznie powstawać stany o zmienionej konformacji (po prawej).
nik hamujący transkrypcję, spodziewano się ogólnego wzrostu ekspresji genów. Wynik był jednak zaskakujący. Ekspresja trzech czwartych ogólnej liczby genów wcale się nie zmieniła, a spośród pozostałej jednej czwartej ekspresja połowy genów była podwyższona, a połowy obniżona [45]. Okazuje się więc, że znaczenia struktury nukleosomowej dla ekspresji genów i ogólnie dla zachodzenia procesów w chromatynie nie można wytłumaczyć w kategoriach czysto mechanistycznych.
Ostatnio zaproponowano, aby otwarty lub zamknięty (w odniesieniu do ekspresji genów) stan chromatyny rozpatrywać jako układ w równowadze dynamicznej. W takim rozumieniu nukleosom może przyjmować stany konformacyjne różniące się dostępnością do DNA (Ryc. 6). Stany te różnią się energią swobodną, a przejście między nimi może wym agać osiągnięcia stanu pośredniego o wysokiej energii swobodnej [10, 46].
VII-3. Histon HI może modyfikować właściwości dynamiczne chromatyny
Rolę histonu HI również trudno jest wyjaśnić w kategoriach mechanistycznych. Nie dość, że lokalizacja w krytycznym miejscu na nukleosomie nie pociąga za sobą niezbędności dla zachodzenia podstawowych procesów życiowych, to ostatnie badania wskazują, że histon HI jes t białkiem bardzo ruchliwym. Wykazano, że cząsteczki histonu HI występują w jądrze komórkowym w stanie dynamicznej równowagi między formą w olną a przyłączoną do nukleosomu [47]. Bardzo możliwe zatem, że histon HI nie jes t statycznym elementem żadnej struktury. Można spekulować, że jes t on niezbędny dla utrzymywania określonej równowagi między różnymi stanami konformacyjnymi nukleosomów. Może on stabilizować pewien stan i tym samym przesuwać rów nowagę na jego korzyść (Ryc. 6). Może również przez przyłączanie się do nukleosomów zwiększać energię swobodną stanu przejściowego między stanem otwartym a zamkniętym chromatyny.
VII-4. Dynamika tłumaczy sprzeczność danych strukturalnych i funkcjonalnych
Przedstawiona wyżej interpretacja roli histonu HI mogłaby wskazywać na jego niezwykle istotne znaczenie dla funkcjonowania organizmu. Stabilizując jeden z możliwych stanów konformacyjnych nukleosomów, histon HI zapobiegałby nieuprawnionemu samoistnemu przechodzeniu nukleosomów w inny stan (Ryc. 6). To z kolei redukowałoby nieupraw
172 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
nioną ekspresję genów i tym samym zmniejszałoby straty energetyczne wywołane niedoskonałością procesów regulacyjnych oraz dawałoby przewagę selekcyjną organizmom posiadającym histon H I. W ten sposób zbędność histonu HI dla przeżycia organizmów staje się możliwa do wyjaśnienia. Być może histon H 1 nie jest potrzebny dla procesów elementarnych, jes t za to niezbędny dla uzyskania odpowiednio precyzyjnej regulacji ekspresji genów. Defekt wywołany brakiem histonu H 1 jes t przez to niewielki i może ujawniać się tylko w szczególnych warunkach lub po długim okresie czasu.
Przyjęcie, że histon H I pełni rolę czynnika m odyfikującego właściwości dynamiczne chromatyny, pozwala więc wyjaśnić sprzeczność między danymi strukturalnymi a funkcjonalnymi.
VIII. Jak rozwikłać paradoks histonu HI?
VIII-1. Redundancja
Jeśli paradoks histonu HI wynika z pokrywania się jego funkcji z funkcjami innych białek chromaty- nowych, kluczem do jego rozszyfrowania będą w nikliwe badania funkcjonalne. Po pierwsze, konieczne jest zbadanie wpływu całkowitego usunięcia histonu H 1 na funkcjonowanie organizmów roślin i zwierząt. Przypuszczalnie efekt całkowitej eliminacji histonu H 1 może się ujawnić dopiero w skomplikowanym organizmie eukariotycznym [48], Po drugie, konieczne jes t sprawdzenie, czy w organizmach pozbawionych histonu HI nie są zaburzone procesy chromatynowe potencjalnie powiązane z histonem H I. Na uwagę w pierwszej kolejności zasługują acetylacja i metylacja histonów rdzeniowych oraz metylacja DNA. Po trzecie wreszcie, należałoby sprawdzić efekty jednoczesnego wyłączenia histonu HI oraz białek odpowiedzialnych za istotne procesy chromatynowe. Defekt obserwowany w organizmie z podwójnym wyłączeniem histonu HI oraz wybranego innego białka może być dużo silniejszy niż suma defektów wynikających z pojedynczych wyłączeń. Gdyby tak było, sugerowałoby to, że obecność histonu H 1 jes t istotna dla zachodzenia określonego procesu. W tym wypadku, oprócz białek odpowiedzialnych za modyfikacje histonów rdzeniowych i metylację DNA, na uwagę zasługują też czynniki przebudowujące chromatynę oraz białka strukturalne chromatyny.
VIII-2. Dynamika
Wyjaśnienie paradoksu histonu H I w kategoriach dynamiki chromatyny będzie trudniejsze. Tutaj rów
nież kluczowe jest uzyskanie rośliny lub zwierzęcia całkowicie pozbawionego histonu H I, a następnie ich wnikliwa analiza. Szczególnie istotne może być sprawdzenie zachowania takich organizmów w w arunkach stresowych, a także zbadanie koordynacji ekspresji genów w różnych tkankach i różnych w arunkach środowiska. Rozstrzygające znaczenie miałyby bezpośrednie badania dynamiki struktur chromatynowych przy braku histonu H I. Obecnie możliwe jes t to wyłącznie in vitro [46], jednak niewykluczone, że wkrótce pow staną techniki pozw alające badać to zjawisko bezpośrednio w żywych organizmach.
IX. Podsumowanie
Od czasu poznania struktury nukleosomowej, wiedza na temat mechanizmów rządzących chroma- tyną ogromnie posunęła się naprzód. Histon HI p o został ostatnim z głównych składników chromatyny, którego funkcja jes t nieznana. Pojawiające się obecnie nowe hipotezy na temat jego funkcji stwarzają nadzieję, że już wkrótce zagadka histonu HI zostanie rozwiązana.
Podziękowania
Dziękuję prof. Andrzejowi Jerzmanowskiemu za cenne uwagi w czasie redagowania pracy.
Artykuł otrzymano 14 marca 2002 Zaakceptowano do druku 27 maja 2002
Piśmiennictwo
1. K o r n b e r g R D , L o r c h Y (1999) Celi 98: 285-2942. M e l e n d y T, Li R (2001) Front Biosci 6: 1048-10533. R o t h D B , R o t h S Y (2000) Celi 103: 699-7024. M o d e s t i M, K a n a a r R (2001) Curr Biol 11: R229-R2325. F a r k a s G , L e i b o v i t c h B A , E l g i n S C (2000) Gene 253:
117-1366. S u d a r s a n a m P, W i n s t o n F (2000) Trends Genet 16:
345-3507. C h e u n g P, A l l i s C D , S a s s o n e - C o r s i P (2000) Cell
103: 263-2718. V e r b s k y M L , R i c h a r d s E J (2001) Curr Opin Plant Biol 4:
494-5009. M i i l l e r C , L e u t z A (2001) Curr Opin Genet Dev 11: 167-17410. K i n g s t o n R E , N a r l i k a r G J (1999) Genes Dev 13:
2339-235211. C a l i k o w s k i TT (2001) Post Bioch 47: 129-13712. Z h a n g Y, R e i n b e r g D (2001) Genes Dev 15: 2343-236013. B i rd A (2002) Genes Dev 16: 6-2114. J e r z m a n o w s k i A (2002) W: Z 1 a t a n o v a J , L e u b a S H
(red) New Comprehensive Biochemistry, Elsevier, Holland (w druku)
15. K a s i n s k y H E , L e w i s J D , D a c k s J B , A u s i o J (2001) F A SE B J 15: 34-41
16. K h o c h b i n S (2001) Gene: 271: 1-12
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 173http://rcin.org.pl
17. R a m a k r i s h n a n V , F i n c h J T , G r a z i a n o V , L e e P L , S w e e t R M (1993) Nature 362: 219-223
18. L u g e r K , M a d e r A W , R i c h m o n d R K , S a r g e n t D F , R i c h m o n d T J (1997) Nature 389: 251-260
1 9 . Z h o u Y B , G e r c h m a n S E , R a m a k r i s h n a n V, T r a v e r s A, M u y l d e r m a n s S (1998) Nature 395: 402-405
20. T h o m a s J O (1999) Curr Opin Cell Biol 11:312-3172 1 . B e d n a r J , H o r o w i t z R A , G r i g o r y e v S A , C a r r u -
t h e r s L M , H a n s e n J C , K o s t e r A J , W o o d o c k C L (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 14173-14178
22. K a r y m o v M A , T o m s c h i k M, L e u b a S H , C a i a f a P, Z l a t a n o v a J (2001) FASEB J. 15: 2631-2641
2 3 . W o o d c o c k C L , D i m i t r o v S (2001) Curr Opin Genet Dev 11: 130-135
24. S h e n X, Y u L, W e i r J W , G o r o v s k y M A (1995) Cell 82: 46-56
25. S h e n X, G o r o v s k y M A (1996) Cell 86: 475-48326. B r o w n D T , A l e x a n d e r B T , S i t t m a n D B (1996)Nuleic
Acid Res 24: 486-49327. T a k a m i Y, N i s h i R , N a k a y a m a T (2000) Biochem
Biophys Res Commun 268: 501-50828. T a k a m i Y, N a k a y a m a T (1997) Genes Cells 2: 711-72329. P a t t e r t o n H G , L a n d e l C C , L a n d s m a n D, P e t e r
s o n C L , S i m p s o n R T (1998) J Biol Chem 273:7268-727630. R a m o n A, M u r o - P a s t o r M I , S c a z z o c c h i o C, G o n
z a l e z R (2000) M ol Microbiol 35: 223-23331. B a r r a J L , R h o u n i m L , R o s s i g n o l J L , F a u g e r o n G
(2000) M ol Cell Biol 20: 61 -6932. N e r S S , T r a v e r s A A (1994) EMBO J 13: 1817-18223 3 .F a n Y, S i r o t k i n A, R u s s e l l R G , A y a l a J , S k o u l -
t c h i AI (2001) M ol Cell Biol 21: 7933-7943
3 4 . S t e i n b a c h O C , W o l f f e A P , R u p p R A W (1997)Nature 389: 395-399
35. P r y m a k o w s k a - B o s a k M, P r z e w l o k ą M R , I w k i e - w i c z J , E g i e r s z d o r f f S , K u r a s M, C h a u b e t N , G i - g o t C, S p i k e r S, J e r z m a n o w s k i A (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 10250-10255
36. P r y m a k o w s k a - B o s a k M, P r z e w l o k ą M R , Ś l u s a r c z y k J , K u r a s M, L i c h o t a J , K i l i a n c z y k B, J e r z m a n o w s k i A (1999) Plant Cell 11: 2317-2329
37. P r z e w ł o k a M R , W i e r z b i c k i A T , Ś l u s a r c z y k J, K u r a ś M, G r a s s e r K D , S t e m m e r C, J e r z m a n o w s k i A (2002) Planta 215: 371-379
38. N a r l i k a r G J , F a n H Y , K i n g s t o n R E (2002) Cell 108: 457-487
39. R o b e r t s S M , W i n s t o n F (1997) Genetics 147: 451-46540. T a m a r u H, S e l k e r E U (2001) Nature 414: 277-28341. R i c h a r d s E J , E l g i n S C R (2002) Cell 108: 489-50042. H e r r e r a J E , W e s t K L , S c h i l t z R L , N a k a t a n i Y,
B u s t i n M (2000) M ol Cell Biol 20: 523-52943. H i l l D A , I m b a l z a n o A N (2000) Biochemistry 39:
11649-1165644. N i e l s e n A L , O u l a d - A b d e l g h a n i M, O r t i z J A ,
R e m b o u t s i k a E, C h a m b o n P, L o s s o n R (2001) Mol Cell 7: 729-739
45. W y r i c k J J , H o l s t e g e F C P , J e n n i n g s E G , C a u s t o n H C , S h o r e D, G r u n s t e i n M, L a n d e r E S , Y o u n g R A (1999) Nature 402: 418-421
46. N a r l i k a r G J , P h e l a n M L , K i n g s t o n R E (2001) Mol Cell 8: 1219-1230
47. Mi s t e l i T , G u n j a n A, H o c k R, B u s t i n M, B r o w n D T (2000) Nature 408: 877-881
48. A u s i o J (2000) Bioessays 22: 873-877
174 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
Prion ffiSY] i jego wpływ na terminację translacji u drożdży Saccharomyces cerevisiae
Prion [P5Y] and its effect on termination of translation inthe yeast Saccharomyces cerevisiae
MAŁGORZATA JAKUBIEC1, MAGDALENA BOGUTA2
Spis treści:
I. WstępII. Odkrycie prionu [PSY]III. Wpływ [PSI] na fizjologię komórkiIV. Indukcja prionu [PSY]
IV-1. Rola domen Sup35 w indukcji [PSY]IV-2. Inne priony wpływające na indukcję [PS1/]IV-3. Białka opiekuńcze a [PS1/]
V. Podsumowanie
Wykaz stosowanych skrótów: Cox2 — białko podjednostki oksydazy cytochromu c drożdży S. cerevisiae; H spl04, Hsp70, Hsp40 — białka opiekuńcze, wpływające na tworzenie i propagację prionu [PS1/] u drożdży S. cerevisiae; Nam9 — białko rybosomów mitochondrialnych u drożdży S. cerevisiae; N ew l, Rnql — białka, które tworzą priony u drożdży; Pde2 — fosfo- diesteraza cAMP u drożdży S. cerevisiae; [PIN] — prion dro- żdżowy, wpływający na indukcję [AST]; PrP — białko komórkowe ssaków, które ulega przemianie konformacyjnej tworząc prion; [PSI] — prion drożdżowy, zagregowana forma białka Sup35; Sup35 — czynnik terminacji translacji (eRF3) u drożdży S. cerevisiae; Sup45 — czynnik terminacji translacji (eRFl) u drożdży S. cerevisiae\ Ure2 - represor katabolizmu związków azotu u drożdży S. cerevisiae\ [URE3] — prion drożdżowy, zagregowana forma białka Ure2.
I. Wstęp
Prion ssaczy był początkowo opisany jako patogenne białko, które powoduje neurodegenerację i śmierć komórki [1]. Obecnie terminem prion określa się niekonwencjonalny, zakaźny czynnik powstający w wyniku zmiany konformacji białka komórkowego PrP, które atakuje mózg ssaków. Zmiana konformacji PrP uważana jes t za proces autokatalityczny, gdyż
’Mgr, 2doc. dr hab, Zakład Genetyki, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa, tel. 659 7072 w. 1312, email: [email protected]
Contents:
I. IntroductionII. [ASY] discoveryIII. The effects of [PSY] on cell physiologyIV. [PSY] induction
IV-1. The role of Sup35 domainsIV-2. Other prions effect the induction of [AST]IV-3. Chaperones and [PSY]
V. Summary
prion jes t zdolny do przekazania swojej konformacji na natywne cząsteczki białka. Jest to reakcja łańcuchowa, która rozprzestrzenia się w mózgu i pow oduje degenerację neuronów. Choroby wywołane przez prion u ssaków to: encefalopatia gąbczasta krów (choroba szalonych krów, BSE), scrapie u owiec i muflonów, a u człowieka — zespół Creutzfelda-Ja- coba (CDJ), kuru, choroba Gertsmanna-Straussle- ra-Scheinkera oraz śmiertelna rodzinna bezsenność
[2].Priony, w szerszym sensie oznaczają białka ist
niejące przynajmniej w dwóch różnych alternatywnych, stabilnych konformacjach. Priony zidentyfikowano również u grzybów, a ich istnienie objawia się jako cechy fenotypowe, które dziedziczą się niezgodnie z prawami Mendla. Priony u grzybów nie prowadzą do śmierci komórki, ale są elementem dziedzicznym, w ażnym w regulacji procesów komórkowych i potencjalnie w ażnym w ewolucji. N a jlepiej scharakteryzowano priony [PSI] i [URE3] u drożdży Saccharom yces cerevisiae [3]. [URE3] jest formą konform acyjną białka Ure2 — negatywnego regulatora w metabolizmie azotu. [PSI] jes t alternatywną form ą konform acyjną białka Sup35 — czynnika terminacji translacji. Priony [PÓ7] i [URE3] m ożna wyeliminować z komórek drożdży w wyniku traktowania chlorowodorkiem guanidyny (GuHCl) dodanym do pożywki w niskim stężeniu. Po przeniesieniu takich komórek na pożyw kę bez GuHCl, agre
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 175http://rcin.org.pl
gaty prionu tworzą się ponownie w wyniku nadprodukcji odpowiednio Sup35 i Ure2. Białka opiekuńcze, szczególnie H sp l04 , b iorą udział w tworzeniu prionu. Wiadomości ogólne o prionach u drożdży S. cerevisiae zostały zamieszczone poprzednio na łamach „Postępów Biochem ii” w artykule pt. „Prio- ny u drożdży i grzybów nitkowatych” [4].
Mechanizm dziedziczenia [PST] i [URE3] polega prawdopodobnie na propagacji określonej konformacji białka komórkowego. Zarówno drożdżowe jak i ssacze priony to nierozpuszczalne, oporne na prote- azy agregaty, przyjmujące strukturę (3-kartki. Spontanicznemu przejściu aktywnych białek do formy prionu zachodzącemu z niską częstotliwością (10"5- 10‘7), tow arzyszą zmiany fenotypowe. Zaproponowano różne modele tworzenia prionu. Najbardziej zgodny z wynikami doświadczalnymi model zakłada, że priony są regularnymi polimerami służącymi jako „zarodki” do polimeryzacji [5]. Agregaty prionów służą jako „zarodki” do rozm nażania, czyli propagacji prionów i są dziedziczone przez cytoplazmę. „Zarodki” powodują przemianę nowo zsyntetyzowanych białek Sup35 i Ure2 w prion. Analogiczny m echanizm zaproponowano dla przemiany komórkowego PrP do prionu u ssaków. Natura i specyfika „zarodków” jes t obecnie tematem dyskusji na łamach wiodących czasopism naukowych [6, 7].
Tworzenie agregatów prionu zależy od domen białkowych bogatych w glutaminę i asparaginę, zw anych domenami prionowymi [8]. Przyłączenie domeny prionu może nadawać innemu białku zdolność do agregacji [9].
Przemiany konformacyjne Sup35 i Ure2 zaobserwowano także in vitro. Białka Sup35 i Ure2 syntetyzowane w E. coli i przetrzym ywane w roztworze tworzą bardzo regularne agregaty w postaci włókien amyloidowych. Szybkość powstawania włókien drastycznie wzrasta po dodaniu wcześniej utworzonych agregatów [3, 10].
II. Odkrycie [P*S7]
Supresja mutacji nonsens jes t m ożliwa w szczepach drożdżowych ze zm utowanym tRNA, zdolnym do odczytania kodonów stop: UAA, UAG czy UGA. [P57] był odkryty przez B r i a n a C o x a w 1965 r., jako czynnik dziedziczenia nie związany z chromo- somalnym DNA drożdży, który zwiększa wydajność odczytywania kodonów stop przez supresorowe tRNA. [Pis'/] um ożliwia również słabą supresję nonsens w szczepie pozbawionym supresorowego tRNA[11]. Forma [PSI] dziedziczy się w sposób dom i
nujący i niezgodny z prawami Mendla, tj. segreguje w potomstwie m ejotycznym 4:0. Próby powiązania czynnika [-P5Y] z pozachrom osom alnym DNA były nieudane [12].
Oprócz zmutowanego tRNA, również mutacje w genach kodujących białka rybosomalne i czynniki translacyjne są odpowiedzialne za wierność procesu translacji [13]. W latach 60-tych wyizolowano i scharakteryzowano recesywne mutanty supresorowe sup35 i sup45 [14]. Geny SU P35 i SU P45 były następnie klonowane i wykazano, że są one niezbędne do życia komórki. W ostatnim czasie stwierdzono, że białka Sup35 i Sup45 są czynnikami terminacji translacji [15]. Sup45 (eR F l) jes t odpowiedzialny za rozpoznawanie kodonu stop w m RNA i za uwalnianie peptydów z rybosomu po zakończeniu jego syntezy. Sup35 jes t drożdżowym homologiem czynnika eukariotycznego eRF3, który jes t G TP-azą i funkcjonuje razem z Sup45 [16].
Niezależne eksperymenty wykazały, że mutacja P N M zlokalizowana w genie SU P35, eliminuje zdolność do tworzenia [PSI] [17, 18]. Wyjaśnienie tego zjawiska było możliwe dzięki skojarzeniu przez R e e d a W i c k n e r a prionu PrP i czynnika [PSI] [19]. Zgodnie ze sformułowaną przez niego hipotezą, [PSI] jes t formą konformacją Sup35. Do utworzenia prionu [T\S7] konieczne jes t natywne, niezmutowane białko Sup35. Występowanie Sup35 w formie zagregowanej jako prion [PSY], powoduje defekt w terminacji translacji i supresję kodonów stop. Tak więc, [PSI] pozwala na regulację terminacji.
III. Wpływ [P57] na fizjologię komórki
[PST] obniżając wierność terminacji translacji, może mieć wpływ na morfologię, jak również m odyfikuje metabolizm komórki [20]. Tworzenie nowych fenotypów związanych z indukcją prionu stanowi nowy, ewolucyjnie ważny mechanizm dziedziczenia, który może ułatwić adaptację komórek drożdży do wzrostu i rozwoju w zmieniających się warunkach środowiska. W szczególnych przypadkach obniżenie wydajności terminacji zależne od [PÓ7] może posłużyć do tworzenia polipeptydów wydłużonych od C-końca, co prowadzi do zmiany funkcji i lokalizacji powstałych białek. Obecność wydłużonego białka lub zmniejszenie poziomu produktu białka „normalnego” może w istotny sposób wpłynąć na funkcję komórki. Poniżej przedstawione zostaną konkretne przykłady takich efektów.
Głównym parametrem wpływającym na wydajną terminację jes t lokalna sekwencja otaczająca kodon stop. Analiza statystyczna genów z różnych organi
176 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
zmów wskazuje, że sekwencje otaczające kodonu stop nie są przypadkowe [21]. Określony kontekst nukleotydów wokół kodonu stop może umożliwić odczyt takiego kodonu jako sensowny [22, 23]. Poziom błędności odczytu kodonu stop jest dodatkowo zwiększony w obecności prionu [PS/]. Ostatnio stwierdzono, że w szczepach zawierających prion [PS/] rzeczywiście pewne białka są syntetyzowane w formie wydłużonej od C-końca. Przykładem jest białko Pde2, które jes t fosfodiesterazą cAMP, działającą globalnie na fizjologię komórki [24]. W komórkach zawierających [PS/] zaobserwowano dwudziestokrotny wzrost poziomu odczytu kodonu stop w mRNA PD E2 jako sensowny. Mylny odczyt wpłynął na syntezę dłuższej formy białka Pde2 o zmienionej funkcji wskutek dodatkowej sekwencji na C-końcu [24]. Ekspresję dłuższej formy Pde2 stwierdzono w 25% komórek w szczepie zawierającym [PSI] (Ryc. 1). Dłuższa forma Pde2 nie jest
Zaobserwowano, że prion [PS/] wpływa na funkcje mitochondrialnych białek rybosomalnych. Przykładem jest Nam9, białko małej podjednostki rybosomu mitochondrialego [26]. M utacja punktowa w genie N AM 9 nazywana n a m 9 -l, powoduje zakłócenia w translacji genów kodowanych w mito- chondriach, a w następstwie defekt oddechowy drożdży. Zastosowanie metod biochemicznych pozw oliło na sprecyzowanie przyczyny defektu oddechowego n a m 9 -l jako zależnej od [AST] niestabilności białek syntetyzowanych przez rybosomy mitochon- drialne, posiadające zmienione białko Nam9. Pokazano to bezpośrednio na przykładzie białka Cox2, podjednostki oksydazy cytochromu c. Obniżona stabilność prowadziła do degradacji Cox2 i znacznego obniżenia poziomu innych białek syntetyzowanych w mitochondriach. Analiza genetyczna szczepu z m utacją n a m 9 -l potwierdziła rolę prionu [PS/] jako czynnika odpowiedzialnego za n iekom petencję od-
75%
25%nieaktywne białko Pde2
idegradacja w cytoplazm ie
R yc.l. Wpływ [PS/] na ekspresję genu PDE2
aktywna w hydrolizie cAMP i ulega degradacji w cytoplazmie. W konsekwencji w komórkach zawierających [PS/] hydroliza cAMP jest ograniczona, co powoduje dwukrotny wzrost poziom u cAMP. cAMP reguluje wiele funkcji w komórce, stąd tak znaczna zmiana jego poziomu może mieć związek z różnymi fenotypami powodowanymi przez [PS/] [25].
dechową i niestabilność Cox2. Jest to pierwszy, po znany dotychczas przykład wpływu [PS/] na funkcjonowanie mitochondriów [27] (Ryc. 2).
Opisane zależności kompetencji oddechowej ko mórki drożdży od prionu [PS/] sugerują istnienie specyficznych powiązań pomiędzy translacją cyto- p lazm atyczną i translacją m itochondrialną lub/i wy-
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 177http://rcin.org.pl
prion [PS/] luzpuszczdiiidforma Sup35
aktywne białko X ***
lîmitochondria
Ryc. 2. Hipotetyczny model wpływu [PSI] na funkcję mitochondriów. Zagregowane białko Sup35 (prion [PS/]) umożliwia kontynuację translacji mimo kodonu stop w mRNA białka X. Białko X, którego ekspresja zależałaby od [PS/] importowane do mitochondriów, mogłoby stanowić przekaźnik między prionem a funkcją oddechową komórki.
darzeniami post-translacyjnymi, prowadzącymi do włączenia Cox2 w w ew nętrzną błonę mitochon- drialną i kompleks oksydazy cytochromowej [27].
IV. Indukcja [P57j
IV-1. Rola domen Sup35
Sup35 jes t drożdżowym homologiem czynnika terminacji translacji eRF3. Białko to ma budowę domenową [28]. Domena C Sup35 (od 254 do 685-ami- nokwasu białka Sup35) jes t odpowiedzialna za ter- minację translacji i warunkuje wzrost. Sekwencja domeny C konserwowanej w ewolucji, jes t hom ologiczna do czynnika elongacji translacji ( E F l - a ) i zawiera cztery miejsca wiążące GTP [29]. W odróżnieniu, domena N a także środkowa domena białka (N i M, do 253 aminokwasu) nie jes t ważna z punktu w idzenia wzrostu i ewolucji [30]. Domena M o nieznanej funkcji, jest łącznikiem domeny N i C. Domena N, złożona z 113 am inokwasów jest odpowiedzialna za tworzenie [PS/] [18]. Co więcej, nadekspresja domeny N jes t wystarczająca do indukcji [PS/] [31]. Zaobserwowano wzajemne oddziaływania między domenami. Delecja określonego fragmentu domeny C białka Sup35 powoduje wzrost wydajności tworzenia prionu przez domenę N [32]. N-terminalna dom ena jes t bogata w glutaminę i asparaginę i zawiera czterokrotnie powtarzający się układ dziewięciu aminokwasów PQ G GY QQYN. Delecja tych sekwencji powodowała zmniejszenie częstości powstawania komórek [PSY], zaś wprowadzenie dodatkowych traktów zwiększenie tej częstości, połączone ze zwiększeniem szybkości tworzenia agregatów prionu [33]. Fuzja domeny N z GFP (białko fluory
zujące zielonym światłem) powodowała agregację hybrydu Sup35-GFP, co było m onitorowane z uży ciem mikroskopu fluorescencyjnego. Domena N odgrywa także k luczow ą rolę w konwersj i białka Sup3 5 do formy prionu [PSY] w warunkach in vitro [31]. Tak więc, domena N białka Sup35 jes t decydująca w regulacji wydajności terminacji translacji zależnej od [PSY] [30].
IV-2. Inne priony wpływające na indukcję [PSI]
[PS/] może być indukowane w określonych, lecz nie wszystkich szczepach drożdżowych. Wykazano, że kolejny prion, nazwany [PIN] dziedziczący się niezgodnie z prawami Mendla, jes t potrzebny do indukcji prionu [PS/] [34]. [PIN] jest konieczny do spontanicznej indukcji [PS/], jak również do indukcji [PS/] przez nadmiar białka Sup35, ale nie jes t po trzebny w propagacji [PS/] (Ryc. 3). [PS/] może być przekazywany wraz z cytoplazmą do komórki p o tomnej w obecności i nieobecności [PIN] [35], [PIN] scharakteryzowano jako prion, ponieważ znika wskutek traktowania komórek GuHCl i może pojawiać się de novo po usunięciu GuHCl [35]. Nie zaobserwowano bezpośredniego związku [PIN] z białkiem Sup35. W wyniku klonowania [PPV] otrzymano różne geny z prionow ą domeną, co sugeruje, że więcej niż jeden prion wpływa na fenotyp [PIN] [7]. Niezależnie, stosując metody komputerowe, zidentyfikowano białka drożdżowe, które zawierają domeny bogate w glutaminę i asparaginę, a także w ykazują podobieństwo do domeny N białka Sup35. Jednak tylko niektóre agregaty bogate w glutaminę i asparaginę powodują cechę [PIN] czyli są zdolne do indukcji [PS/]. Wykazano, że fenotyp [PIN] wiąże
178 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
♦ ♦
Sup35-N domena [P/A]-Newl, R nql, Ure2 Hsp70-Ssal
indukcja [PSI]
^Hsp70-Ssal
H spl04 propagacja [PSI]
,zarodki” piionu
rozpuszczalna forma Sup35 prion [PS/]
Hsp 104 T GuHCl H sp 7 0 -S sb l t
eliminacja [PSI]
Ryc. 3. Udział białek opiekuńczych w tworzeniu i degradacji prionu [T\S7]
się z agregacją białek: R n q l , Ure2 i N e w l. N atomiast analogiczna domena białka P an i , bogata w glutaminę i asparaginę, nie powodowała indukcji [PSI] [6].
Dziewięć innych genów niosących domeny prionu jest także potencjalnie odpowiedzialna za fenotyp [PIN]. Takie obserwacje wskazują na powszechnie istniejący mechanizm kaskadowej indukcji prionu [T\SY] przez inne priony [7].
Funkcje komórkowe białek R nql i N ew l są nieznane, ponieważ inaktywacja genów RNQ J i NEW1 nie daje widocznego efektu fenotypowego. Obydwa białka mają domeny prionu bogate w glutaminę i asparaginę. W wyniku fuzji domeny N białek N ew l i R nql z dom enąC białka Sup35 obserwowano indukcje [PSY] [36]. Białko R nql spełnia in vivo wszystkie kryteria prionu [37], Fuzja domeny C prionu R nql z GFP powoduje zależną od Hsp 104 agregację hybrydu R nq l-G F P [37], Agregaty R nql dziedziczą się w sposób niezgodny z prawami M endla i korelują z indukcją fenotypu [P/A7] [7]. Ponadto, obecność białka R nql w szczepie biorcy jes t konieczna do powstania [PIN].
IV-3. Białka opiekuńcze a [PSI]
Zastosowanie metod genetycznych umożliwiło wykrycie białek opiekuńczych, które kontrolują zw ijan ie białek. Udział białek opiekuńczych w pow stawaniu [PS/] jest zrozumiały, gdyż właśnie proces zwijania białka towarzyszy tworzeniu prionu. Propagacja [PS/] jest możliwa dzięki białkom: Hsp 104,
Hsp70 i Hsp40 [38]. H sp l0 4 pełni k luczową rolę w dziedziczeniu [PS/]. W utrzymaniu stabilnej konformacji prionu wymagana jest określona ilość tego białka. Białko Hsp 104 jes t także odpowiedzialne za przenoszenie prionów [URE3], [PIN] i R nql do komórek potomnych [34,37,39]. Wśród znanych prionów drożdżowych tylko nowo wykryty prion [ISP] wydaje się być niezależny od H sp l0 4 [40]. H sp l0 4 nie jes t konieczne do normalnego wzrostu, ale jes t potrzebne do reaktywacji komórek po stresie [41]. Nadekspresja, jak również brak białka Hsp 104, prowadzi do eliminacji prionu [PS/] z drożdży.
Zaproponowano dwa alternatywne modele interpretujące udział Hsp 104 w powstawaniu prionu. Według modelu wcześniejszego, Hsp 104 oddziałuje bezpośrednio z Sup35 tworząc konformację przejściową, która służy jako substrat do formowania prionu [42], Drugi model zakłada, że Hsp 104 jes t niezbędny w propagacji prionu i tworzeniu „zarodków” prionu [30]. Model ten był potwierdzony przez szczegółową analizę eksperymentalną wyników rozpadu prionu po inaktywacji Hsp 104. Obniżenie poziomu lub aktywności Hsp 104 i wzrost rozmiaru agregatu prionu prowadzi do akumulacji dużych aglomeratów, które w nieobecności Hsp 104 nie są przekazywane do kom órek potomnych i w ten sposób eliminowane z populacji. Hsp 104 wydaje się więc być niezbędny do rozpadu agregatów i tworzenia „zarodków ”, które są przenoszone do komórki potomnej i zapoczątkowują w niej propagację prionu [43]. Wynik ten wskazuje na zasadniczą funkcję Hsp 104 w propagacji prionu.
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 179http://rcin.org.pl
W przemianach konformacyjnych prionu [PS/] u drożdży oprócz H sp l04 , uczestniczą białka z rodziny Hsp70: H sp70-Ssal i H sp 7 0 -S sb l . Ssał jes t indukowane w warunkach stresowych, podczas gdy Ssbl jes t związane z rybosomami, a jego ekspresja jest hamowana w warunkach stresowych. Wpływ Hsp70-Ssal na propagację [PSI] jes t przeciwny do efektu H sp l04 . Zgodnie z aktualnym stanem wiedzy, Ssał sprzyja gromadzeniu nowych agregatów i propagacji [PSr\ [43]. N admiar Ssał zapobiega eliminacji [PSi\ przez nadekspresję H sp l0 4 [44]. Mutacja w genie SSA1 prowadzi do obniżenia stabilności [PS/] [45]. Przeciwnie, nadprodukcja H sp70-Ssbl sprzyja eliminacji [PS/] [46] i powoduje zwiększenie skuteczności eliminacji prionu przez nadmiar H sp l0 4 [47]. Inaktywacja H sp70-Ssbl prowadzi do wzrostu indukcji [PS/]. Prawdopodobnie Ssbl wpływa na [PS/], jako białko kontrolujące konformację, które przeciwdziała n iewłaściwemu zwijaniu Sup35 [47].
Dotychczasowe badania pozw alają na identyfikację H sp l0 4 i Hsp70-Ssbl jako białek zdolnych do eliminacji prionu [PS/]. Dokładna analiza eliminacji prionu z komórek drożdży jes t szczególnie przydatna do badań prionów ssaczych, które m ogą być aktywnie leczone w podobnych warunkach. Jednak nie stwierdzono istnienia hom ołogów H sp l0 4 u takich organizmów wyższych jak nicienie i muszka owocowa. Wiadomo natomiast, że białko Hsp70-Ssbl jes t homologiczne w 61% do białka obecnego w kom órkach ludzkich.
V. Podsumowanie
Obecność prionu [PS/] modyfikuje terminację translacji powodując zmianę funkcji wybranych białek i określonych cech fenotypowych. Ponieważ zmiany te są dziedziczne, [PS/] może być traktowany jako nowy epigenetyczny m echanizm dziedziczenia. Mechanizm ten jest kontrolowany na różnych poziomach. Zdolność tworzenia [PS/] jes t zależna od obecności i udziału komórkowej domeny prio- nu-Sup35. Indukcja [PS/] jes t również modulowana przez inne czynniki komórkowe: kodowane chromo- somalnie białka opiekuńcze oraz kolejny prion komórkowy zwany [PIN]. Prawdopodobnie w regulację indukcji [PS/] są zaangażowane także inne procesy, jednak zrozumienie tego zagadnienia wydaje się być odległe.
Podziękowania
Dziękujemy Pani doc. Teresie Żołądek za krytyczne uwagi pomocne przy pisaniu pracy.
Praca została zrealizowana w ramach grantu KBN 3 P 0 4 A 03922 oraz grantu Polsko-Francuskiego Centrum Biotechnologii Roślin.
A rty ku ł o trzym ano 25 lutego 2002 Z aakcep tow ano do druku 13 czerw ca 2002
Piśmiennictwo
1. P r u s i n e r S B , S c o t t M R , D e A r m o n d S J , C o h e n F E (1998) Celi 93: 337-348
2. H o r w i c h A L , W e i s s m a n J S (1997) Celi 89: 499-5103. W i c k n e r R B , T a y l o r K L , E d s k e s H K , M a d d e l e i n
M L , M o r i y a m a H , Roberts B T (1999) Microbiol Mol Biol Rev 63: 844-861
4. B o g u t a (2000) Postępy Biochemii 46(2): 108-1155. S e r i o T R , C a s h i k a r A G , K o w a l A S , S a w i c k i G J ,
M o s l e h i J J , S e r p e l l L, A r n s d o r f M F , L i n d q u i s t SL(2000) Science 289: 1317-1321
6. O s h e r o v i c h L Z , W e i s s m a n J S (2001) Celi 106: 183-1947. D e r k a t c h I L , B r a d l e y M E , H o n g J Y , L i e b m a n S W
(2001) Celi 106: 171-1828. D e P a c e A H , S a n t o s o A, H i l l n e r P , W e i s s m a n J S
(1998) Celi 93:1241-12529. T u i t e M F (2000) Celi 100: 289-29210. G l o v e r J R , K o w a l A S , S c h i r m e r E C , P a t i n o M M ,
L i u J J , L i n d q u i s t S L (1997) Cell 89: 811-81911. C o x B S , T u i t e M F , M c L a u g h i n C S (1988) Yeast 4:
159-17812. W i c k n e r R B , M a s i s o n D C , E d s k e s H K (1995) Yeast 11:
1671-168513. L i e b m a n S W , C h e r n o f f Y O , L i u R (1995) Blochem Celi
Biol 73: 1141-114914. I n g e - V e c h t o m o v S G , A d r i a n o v a M V (1970) Genetika
6:103-11515. S t a n s f i e l d I, J o n e s K M , K u s h n i r o v W , D a g k e s a m
a n s k a y a A R , P o z n y a k o v s k i A l , P a u s k h i n S V, N i e r a s C R , C o x B S , T e r - A v a n e s y a n M D , T u i t e MF(1995) E M B O J 14: 4365-4373
16. Z h o u r a v l e v a G, F r o l o v a L, G o f f X L , G u e l l e c R L , I n g e - V e c h t o m o v S G , K i s e l e v L, P h i l i p p e M (1995) E M B O J U : 4065-4072
17. D o e l S M , M c C r e a d y S J , N i e r a s C R , C o x B S (1994) Genetics 137: 659-670
18. T e r - A v a n e s y a n M D , D a g k e s a m a n s k a y a A R , K u s h n i r o v V V , S m i r n o v V N (1994) Genetics 137: 671-676
19. W i c k n e r R B (1994) Science 264: 566-56920. T r u e H L , L i n d q u i s t S L (2000) Nature 407: 477-4832 1 . B r o w n C M , D a l p h i n M E , S t o c k w e l l P A , T a t e W P
(1993) Nucleic Acids Res 21: 3119-31232 2 . B o n e t t i B , F u L, M o o n J , B e d w e l l D M (1995) JM o l
Biol 251: 334-3452 3 . M o t t a g u - T a b a r S, T u i t e M F , I s a k s s o n L A (1998)E ur
J Blochem 257: 249-25424. N a m y O , H a t i n I , R o u s s e t J P (2001) EMBO Rep 2:
787-7932 5 . N a m y O, D u c h a t e a u - N g u y e n G M , R o u s s e J P (2002)
M ol Microbiol, in press.26. B o g u t a M, D m o c h o w s k a A, B o r s u k P, W r ó b e l K,
G a r g o u r i A, Ł a z o w s k a J , S ł o n i m s k i P P , S z c z ę ś n i a k B, K r u s z e w s k a A (1992J Mol Celi Biol 12(1): 402-412
27. C h a c i ń s k a A , B o g u t a M, K r z e w s k a J , R o s p e r t S(2000) M ol Celi Biol 20: 7220-7229
28. T e r - A v a n e s y a n M D , K u s h n i r o v W , D a g k e s a m a n s k a y a A R , D I d l c h e n k o S A , C h e r n o f f Y O , I n g e - V e c h t o m o v S G , S m i r n o v V N (1993) M ol Microbiol 7: 683-6929
29. K u s h n i r o v V V , T e r - A v a n e s y a n M D , T e l c k o v M V , S u r g u c h o v A P , S m i r n o v V N , I n g e - V e c h t o m o v S G (1988) Gene 66: 45-54
180 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
30. K u s h n i r o v VV, T e r - A v a n e s y a n M D (1998) Cell 94: 13-16
3 1 . P a u s h k i n S V , K u s h n i r o v V V , S m i r n o v V N , T e r - A v a n e s y a n M D (1997) M ol Cell Biol 17: 2798-2805
32. K o c h n e v a - P e r v u k h o v a N V , P o z n y a k o v s k i A I , S m i r n o v V N , T e r - A v a n e s y a n M D (1998) Curr Genet 34: 146-151
33. L i u J J , L i n d q u i s t S (1999) Nature 400: 573-57634. D e r k a t c h I L , B r a d l e y M E , Z h o u P, C h e r n o f f Y O ,
L i e b m a n S W (1997) Genetics 147: 507-51935. D e r k a t c h I L , B r a d l e y M E , M a s s e S V , Z a d o r s k y
SP, P o l o z k o v G V , I n g e - V e c h t o m o v S G , L i e b m a n S W (2000) EMBO J 19: 1942-1952
36. M i c h e l i t s c h M D , W e i s s m a n J S (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97: 11910-11915
37. S o n d h e i m e r N , L i n d q u i s t S (2000) M ol Cell 5: 163-17238. K u s h n i r o v V V , K r y n d u s h k i n D S , B o g u t a M, S m i r
n o v V N , T e r - A v a n e s y a n M D (2000) Curr Biol 10: 1443-1446
39. M o r i y a m a H, E d s k e s H K , W i c k n e r R B (2000) M ol Cell Biol 20: 8916-8922
40. V o l k o v K V , A k s e n o v a A Y , S o o m M J , O s i p o v K V , S v i t i n A V , K u r i s c h k o C, S h k u n d i n e I S , T e r - A v a n e s y a n M D , I n g e - V e c h t o m o v S G , M i r o n o v a L N(2002) Genetics 160(1): 25-36
41. P a r s e 11 D A , K o w a l A S , S i n g e r M A , L i n d q u i s t S(1994) Nature 372: 475-478
42. C h e r n o f f Y O , L i n d q u i s t S L , O n o B, I n g e - V e c h t o m o v S G , L i e b m a n S W (1995) Science 268: 880-884
43. W ę g r z y n R D , B a p a t K, N e w n a m G P , Z i n k A D , C h e r n o f f Y O (2001) M ol Cell Biol 21: 4656-4669
44. N e w n a m G P , W ę g r z y n R D , L i n d q u i s t S L , C h e r n o f f Y O (1999) M ol Cell B iol 19: 1325-1333
45. J u n g G, J o n e s G, W ę g r z y n R D , M a s i s o n D C (2000) Genetics 156: 559-570
46. C h a c i ń s k a A, S z c z ę ś n i a k B, K o c h n e v a - P e r u k o v a N, K u s h n i r o v V, T e r - A v a n e s y a n M D , B o g u t a M(2001) Curr Genet 39: 62-67
47. C h e r n o f f Y O , N e w n a m G P , K u m a r J , A l l e n K, Z i n k A D (1999) M ol Cell Biol 19: 8103-9112
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 181http://rcin.org.pl
Wyciszanie ekspresji genów i nowe narzędzia biologii molekularnej roślin
Gene silencing and new tools in plant molecular biology
MAREK KOTER1, JACEK HENNIG2
Spis treści:
I. W stępII. Kosupresja
III-l.P otranskrypcyjne w yciszanie genów (ang. Post- Transcriptional Gene Silencing)
III-2. Przykłady praktycznego zastosowania w yciszania genów indukow anego przez infekcję w irusa (ang. Virus Induced Gene Silencing)
IV. W irusowe supresory potranskrypcyjnego wyciszania genów
V. Am plikonyV -l. Am plikony, a wysoce w ydajna ekspresja transge-
nów w roślinachVI. Uwagi końcowe
W ykaz stosowanych skrótów: CaMV (ang. cauliflower mosaic virus); chs — syntaza chalkonowa (ang. chalcone syntase); CP — wirusowe białko płaszcza (ang. coat protein); GFP — zielone białko fluoryzujące (ang. Green Fluorescent Protein); GUS — P-glukuronidaza; Hc-Pro — proteaza (ang. Helper compo- nent-Protease); LAS — miejscowe wyciszenie ekspresji genu (ang. Localised Acquired Silencing); Nia — gen reduktazy azotanowej; PDS — desaturaza fitoenowa (ang. phytoene desatu- rase); PTGS — potranskrypcyjne wyciszanie ekspresji genów (ang. Post-Transcriptional Gene Silencing); PVX (ang. potato virus X); PVY (ang. potato virus F); RYMV (ang. rice yellow mottle sobemovirus); SAS — systemowe wyciszenie ekspresji genu (ang. Systemie Acquired Silencing); TBRV (ang. tomato black ring nepovirus); TBSV (ang. tomato bushy stunt tombu- svirus); TEV (ang. tobacco etch potyyirus); TEV (ang. tobacco etch virus); TGS — transkrypcyjne wyciszanie ekspresji genów (ang. Transcriptional Gene Silencing); TMV (ang. tobacco mosaic tobamovirus); TRSV (ang. tomato ringspot nepovirus); TRV (ang. tobacco rattle virus); uidA — gen (3-glukuronidazy; UTR — region nie ulegający transkrypcji (ang. untranscribed region); VIGS — indukowane przez wirus wyciszanie ekspresji genowej (ang. Virus 1nduced Gene Silencing).
'D r ,2 Doc. dr hab., Zakład Biochemii Roślin, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, ul. A. Pawińskiego 5A, 02-106 Warszawa, e-mail: 1 koterm@ megapolis.pl,2 [email protected]
Contents:
I. IntroductionII. Cosuppression
III-l. Post-Transcriptional Gene Silencing III-2. Practical applications o f Virus Induced Gene Si
lencingIV. Viral Suppressors o f Post-Transcriptional Gene
SilencingV. A m plicons
V -l. Am plicons and high level transgene expression in plants
VI. Final remarks
I. Wstęp
Opracowanie technik transformacji genetycznej roślin umożliwiło nowe podejście do genetyki, fizjologii a także biotechnologii tej grupy organizmów. W Stanach Zjednoczonych w 1999 roku ponad 40% kukurydzy, 50% bawełny i 45% soi pochodziło z odmian transgenicznych, charakteryzujących się w iększą odpornością na choroby łub ulepszoną w artością odżyw czą niż odmiany otrzymane w wyniku tradycyjnych krzyżówek [1]. Postuluje się, że zm odyfikowane genetycznie rośliny m ogą również stać się wygodnymi i tanimi bioreaktorami do syntezy substancji mających zastosowanie w różnych dziedzinach życia. Chociaż z metodycznego punktu w idzenia transformacja roślin jes t dobrze opracowana, często poziom ekspresji transgenu jes t zmienny w różnych liniach roślin transgenicznych [2]. Nie jest też łatwo uzyskać wydajne i stabilne wyrażanie w prowadzonych do roślin genów ze względu na częste wyciszanie ich ekspresji (ang. gene silencing ). Proces ten można podzielić na dwie grupy: wyciszanie na etapie transkrypcyjnym oraz potranskrypcyj- nym (ang. PTGS). W ostatnich latach potranskrypcyjne wyciszanie genów w ykorzystano dla o trzym ania roślin odpornych na infekcje wirusowe oraz dla badania funkcji nieznanych genów roślinnych. W
182 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
tym artykule ze względu na obszerność tematu ograniczymy się do opisania zjawisk związanych z PTGS. Om ówione zostaną również amplikony, nowe obiecujące narzędzie biologii molekularnej roślin, pozwalające na identyfikację funkcji genów oraz na tworzenie wysoce wydajnego systemu do nadprodukcji białek w roślinach.
II. Kosupresja
H omologiczne wyciszanie ekspresji genów zaobserwowano po raz pierwszy podczas doświadczeń, mających na celu zwiększenie intensywności barwy kwiatów petunii Petunia hybrida [3, 4]. Eksperymenty te polegały na transformacji roślin dodatkowymi kopiami genu syntazy chalkonowej (chs), enzymu ze szlaku syntezy antocyjanów odpowiedzialnego za zabarwienie kwiatów. Przeciwnie jednak do założeń doświadczenia, otrzymane rośliny charakteryzowały się kwiatami biało nakrapianymi lub j e d nolicie białymi, a oznaczenia poziomu mRNA syntazy chalkonowej w transformantach wykazały niski poziom w porównaniu do m RNA uzyskanego z ro ślin kontrolnych. Tak więc wprowadzenie transgenu przyczyniło się do redukcji jego ekspresji oraz endogennej syntazy chalkonowej w transformowanych roślinach. Zjawisko to nazwano kosupresją [5]. Nasunęło się w związku z tym pytanie, czy niski poziom transkryptu jes t rezultatem zmniejszonej syntezy czy zwiększonej degradacji mRNA.
Dalsze badania pozwalające na odróżnienie aktywności syntetyzowanego de novo mRNA na m atrycy DNA od całkowitego poziomu mRNA w komórce (ang. , ,ru n -o n ” experim ents) wykazały identyczną aktywność syntezy m RNA w obydwu obszarach kwiatów. A więc niski poziom lub brak mRNA syntazy chalkonowej w białych sektorach kwiatów jest wynikiem specyficznej degradacji [6, 7].
III-l. Potranskrypcyjne wyciszanie genów(ang. Post-Transcriptional Gene Silencing)
Interesujące obserwacje przeprowadzono podczas badań linii transgenicznego tytoniu N icotiana taba- cum wyrażającego gen białka płaszcza wirusa TEV (ang. tobacco etch virus) [8, 9]. Po zainfekowaniu roślin wirusem TEV początkowo obserwowano wszystkie typowe objawy zakażenia, jednakże w miarę wzrostu roślin pojawiały się młode zdrowe liście, które w ykazywały odporność na ponow ną infekcję przez TEV. Proces ten nazwano ,,ozdrowieniem” (ang. recovery). Hybrydyzacyjna analiza poziomu m RNA dla białka płaszcza TEV w liściach przed za
każeniem i po zaniku objawów infekcji, wykazała niski poziom transkryptu w młodych liściach, na których nie zaobserwowano objawów infekcji w irusowej. Ponieważ brak m RN A może świadczyć o jego degradacji lub też braku transkrypcji, wykonano doświadczenia „ run-on” [8] pozwalające stwierdzić, czy na matrycy DNA następuje synteza mRNA de novo. W ykazały one, że zarówno w liściach z objaw am i infekcji wirusowej jak też w młodych liściach roślin, u których zanikły objawy porażenia, gen białka płaszcza wirusa TEV ulegał transkrypcji, a wydajność syntezy jego m RNA była w obydwu przypadkach identyczna. Tak więc wyniki eksperymentów świadczą o tym, że w roślinach z fenotypem „recovery” nastąpiła specyficzna degradacja w irusowego RNA. Jednak, pomimo że rośliny uzyskały odporność na TEV, były nadal wrażliwe na infekcje pokrewnym wirusem ziemniaka Y (PVY). Świadczy to o dużej specyficzności zjawiska, które nazwano po- transkrypcyjnym wyciszaniem genów (ang. Post Transcriptional Gene Silencing, PTGS).
Obecność transgenu nie jes t warunkiem niezbędnym dla wyciszenia ekspresji genu [9]. Infekcja tytoniu N icotiana clevelandii szczepu W22 wirusem TBRV (ang. tom ato black ring nepovirus) pow odowała silne objawy porażenia na liściach. Jednakże liście, które rozwinęły się po inokulacji były wolne od jakichkolwiek objawów porażenia oraz w ykazywały odporność na powtórne zakażenie tym wirusem na skutek degradacji w irusowego RNA [9]. Ponadto roślin tych nie infekował specjalnie zmodyfikowany wirus PVX, jednak pod warunkiem, że do jego genomu włączono odcinek RNA wirusa TBRV szczepu W 22 [9]. Otrzymana w ten sposób odporność jest wysoce specyficzna wobec zakażającego wirusa: ro śliny inokulowane spokrewnionym wirusem TRSV (ang. tomato ringspot nepovirus) lub PVX w ykazywały silne objawy porażenia. Na podstawie tego typu doświadczeń wysunięto hipotezę, że infekcja w irusem może indukować naturalną odporność roślin polegającą na wysoce specyficznym degradowaniu obcego RNA [9].
Do indukcji odporności roślin przeciwko wirusom m ogą służyć nie tylko geny pochodzenia w irusow ego. Transgeniczny tytoń N. tabacum , w którym nastąpiło wyciszenie genu uidA kodującego pochodzący z bakterii enzym (3-glukuronidazę (GUS) infekowano zm odyfikowanym wirusem mozaiki tytoniu TMV, do genomu którego dołączono gen uidA. Po kilkunastu dniach po infekcji rośliny kontrolne wykazały wszystkie objawy charakterystyczne dla porażenia przez TMV, podczas gdy rośliny transge- niczne pozostały odporne na infekcję [10]. Tak więc
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 183http://rcin.org.pl
można domniemywać, że warunkiem niezbędnym do wystąpienia odporności na infekcje w irusowe jest homologia sekwencji występującej w czynniku infekcyjnym do sekwencji znajdującej się w genomie gospodarza, a źródło jej pochodzenia nie odgrywa żadnej roli.
Sygnał indukujący PTGS rozchodzi się w roślinie systemowo. Liście transgenicznego tytoniu N icotia- na bentham iana wyrażającego gen białka GFP (ang. Green F luorescent P rotein ), infiltrowano zawiesiną bakterii A grobacterium tum efaciens wyrażających gen reportero wy GFP. Tkanki, w których ma miejsce ekspresja tego genu charakteryzują się z ieloną flu- orescencją po naświetleniu ich UV. Już po dwóch dniach od infiltracji można było obserwować inten-
je s t szczególnie użyteczny w tego typu ekspe ry mentach, gdyż brak jego ekspresji m anifestu je się występowaniem charakterystycznej ch lorozy liści. Tak więc gdy zaszczepiono zraz pochodzący z roś liny z funkcjonalnym genem reduktazy azotanowej na podkładce z w yciszonym genem N ia, po trzech tygodniach również w zrazie obserw ow ano p o ja wienie się chlorozy. N atom iast zaszczepien ie chlo- ro tycznego zrazu na podkładce z genem aktywnym nie wywoływało w yciszenia genu reduk tazy azo tanowej w podkładce. Św iadczy to jednoznaczn ie , że transport sygnału w yciszania odbyw a się w k ierunku od korzeni do m erystem u w ierzcho łkow ego ro śliny [12]. Schemat opisanych pow yżej badań przedstawia rycina 1.
Ryc. 1. Schemat przedstawiający kierunkowe rozchodzenie się sygnału dla wyciszenia ekspresji genu Nia. A — roślina z wyciszonym genem Nia, B - roślina z aktywnym genem Nia. ★Ekspresja genu Nia uległa wyciszeniu.
sywną fluorescencję w okolicy liścia, gdzie w prow adzono Agrobacterium . Sygnał ten, pochodzący z bakterii był znacznie intensywniejszy niż fluore- scencja będąca wynikiem ekspresji transgenu roślinnego. Jednak na granicy strefy infiltrowanej liścia fluorescencja zanikła świadcząc o zachodzącym tam wyciszeniu ekspresji GFP.
Strefa lokalnego w yciszenia (ang. L o ca l A cq u ired S ilencing) rozszerzała się, by po 18 dniach osiągnąć górne liście infiltrowanej rośliny [11]. Efekt ten nazwano w yciszeniem system ow ym (ang. System ie A cqu ired S ilencing) [12]. Dośw iadczenia z w ykorzystaniem transgenicznych roślin tytoniu charakteryzujących się w yciszeniem genu reduk tazy azotanowej N ia w ykazały k ierunek rozprzestrzeniania się sygnału PTGS w roślinie [12]. Gen Nia
Jak pokazują wyniki przedstawionych doświadczeń, w roślinach może istnieć system obrony zabezpieczający przed infekcjami w irusowym i polegający na specyficznej degradacji w irusowego RN A zdolny do szybkiej odpowiedzi w przypadku ponownej infekcji.
III-2. Przykłady praktycznego zastosowania wyciszania genów indukowanego przez infekcję wirusa (ang. Virus Induced Gene Silencing)
Potranskrypcyjne wyciszanie ekspresji genów (PTGS) może być wykorzystane do wywoływania wyciszania ekspresji genów gospodarza. Rośliny tytoniu A. benthamiana, do których wprow adzono gen
184 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
GFP po infekcji rekombinowanym wirusem PVX-GFP wykazywały normalne objawy porażenia. Jednakże proces namnażania się wirusa prowadził do włączenia się mechanizmu potranskrypcyjnego w y ciszania, który dotyczył zarówno ekspresji transge- nu, jak i ekstrachromosomalnie replikującego się w irusa, co w rezultacie doprowadziło do całkowitej eliminacji PVX z rośliny [13]. Zjawisko to nazwano wyciszaniem ekspresji genów indukowanym przez wirus (ang. Virus Induced Gene Silencing, VIGS). Może być ono również wywoływane przez wirusy zawierające w swoim genomie odcinki DNA hom ologiczne do genów rośliny [14, 15]. Ma to duże zastosowanie praktyczne: dysponując wektorem w irusowym z wklonowanym genem roślinnym można zakażając podatne rośliny wywołać wyciszenie ekspresji homologicznego genu roślinnego. Otrzymuje się w ten sposób efekt fenotypowy mutacji (fenokopie) tego genu w roślinie.
Jednym z najbardziej spektakularnych przykładów wykorzystania zjawiska VIGS jes t całkowite zablokowanie ekspresji desaturazy fitoenowej (PDS) [13, 16], manifestujące się w tytoniu całkowitym w ybieleniem górnych liści. W zakażonych zrekombino- wanym wirusem PVX-PDS roślinach tytoniu proces ten spowodował obniżenie poziomu mRNA tran- skrybowanego z chromosomalnej kopii genu desaturazy, co w konsekwencji doprowadziło do zablokowania produkcji karotenoidów, niezbędnych do ochrony przed niszczącym w pływem światła [17].
Metoda ta ma duże perspektywy zastosowań przy analizie funkcjonalnej genów roślinnych. Znając choćby część sekwencji badanego genu sprawdzać można zmiany fenotypowe pojawiające się po upływie kilkunastu dni, to jes t po okresie, gdy na górnych liściach pojaw ią się pierwsze symptomy VIGS. Tak więc zależność miedzy sekwencją n ieznanego genu a odpowiadającym mu fenotypem można ustalić w ciągu zaledwie kilku tygodni [17]. Z pew nością łatwiejsza będzie teraz analiza funkcjonalna genów wielokopijnych oraz takich, których mutacje są letalne już we wczesnych stadiach rozw ojow ych roślin.
Technika ta może służyć również do ustalenia odwrotnej relacji: od fenotypu do odpowiadającego mu genu. W tym celu należałoby skonstruować biblioteki cDNA badanej rośliny z wykorzystaniem PVX jako wektora i analizować dużą liczbę infekowanych roślin [17].
Jednakże pomimo wielu zalet, technologia oparta na VIGS jes t zjawiskiem zależnym od liczby i organizacji transgenów, oraz od regionu chromatyny, gdzie nastąpiło ich wbudowanie do chromosomu.
IV. W irusowe supresory potranskrypcyjnego wyciszania genów
Obserwacja przebiegu infekcji u roślin zakażonych dwom a gatunkami wirusów dała podstawy do przypuszczeń, że niektóre wirusy mogą kodować czynniki będące naturalnymi supresorami w yciszania genów. Taka podwójna infekcja w wielu przypadkach prowadzi do synergizmu symptomów chorobowych i do akumulacji jedynie jednego z infekujących w irusów [18, 19]. Zaobserwowano również, że wiele z takich przypadków dotyczy wirusów z rodziny Po- tyviridae, a infekowane rośliny transgeniczne, w yrażające geny zlokalizowane w rejonie 5 ’ genomu w irusa TEV należącego do tej rodziny, w ykazują znacznie ostrzejsze objawy chorobowe niż rośliny nie transgeniczne [19, 20]. Doświadczenia te sugerowały, że kompleks białkowy P l/H C -P ro kodowany przez tę cześć genomu wirusa inhibuje system ochrony antywirusowej u roślin. Istniało przypuszczenie, że systemem tym może być potranskrypcyjne w yciszanie genów PTGS [19],
Dla weryfikacji doświadczalnej tej hipotezy p rzeprowadzono dwa typy doświadczeń. W pierwszym eksperymencie skrzyżowano transgeniczne rośliny wyrażające P l/H C -P ro z roślinami transgenicznymi, u których gen reportero wy kodujący GUS uległ po- transkrypcyjnemu wyciszeniu. U roślin potomnych tej krzyżówki gen ten ulegał wydajnej ekspresji [21, 22]. W wyniku dalszych doświadczeń w ykazano, że genem odpowiedzialnym u potywirusów za inhibicję PTGS jes t wielofunkcyjne białko HC-Pro, odpowiedzialne również za przemieszczanie się w irusa w roślinie, przenoszenie wirusa przez mszyce i m odyfikow anie białek [23, 24].
Drugim typem doświadczeń były eksperymenty, w których udowodniono, że wektor wirusowy PVX w yrażający gen reporterowy GFP nie wywołuje zjawiska VIGS w roślinach transgenicznych w yrażających GFP w obecności P l /H C -P ro [21].
W laboratorium profesora D a v i d a B a u l - c o m b a opracowano test umożliwiający poszukiwanie supresorów PTGS z wykorzystaniem transgenicznych roślin tytoniu N. bentham iana w yrażających GFP [23, 24]. W roślinach tych wyciszanie ekspresji transgenu indukowane było poprzez infiltrację liści zawiesiną bakterii A. tumefaciens n iosącą plazm id z GFP [23]. Następnie rośliny takie zakażane są różnymi wirusami i monitorowane pod względem ekspresji GFP. Dzięki tej metodzie odkryto kilka kolejnych białek, mających zdolność do su- presji roślinnego systemu ochrony przed infekcjami wirusowymi, jak im jes t PTGS. Przykładem może tu
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 185http://rcin.org.pl
być białko P I 9 wirusa TBSV, A C2 gem iniwirusa czy PI z RYM V [24]. W szystkie te białka uniem ożliwiają skuteczną obronę przed infekcjami w irusow ymi.
Aby nie pozostać bezbronnymi, rośliny zastosowały inną strategię obrony przed w irusami mającymi zdolności do inaktywacji systemu chroniącego przed patogenami: supresory PTGS są często tak zwanymi białkami awirulencji (avr), z którym i oddziałują p ro dukty roślinnych genów odporności R [25, 26]. In terakcja dwu białek, produktów genów avr i R, p row adzi do uaktywnienia całego łańcucha reakcji p ro wadzących do zwalczania infekcji [27].
V. Amplikony
Przeprowadzane dośw iadczenia nad ekspresją transgenów w roślinach doprow adziły do skonstruowania amplikonów. Są to samoreplikujące się w komórkach roślinnych zm odyfikow ane cząsteczki w irusowego RNA [28]. Schemat ekspresji amplikonów w transgenicznych roślinach przedstawia rycina 2. Pierwszy etap ich cyklu replikacyjnego polega na transkrypcji przez roślinną polim erazę RNA cDNA amplikonu, znajdującego się pom iędzy prom otorem 35S wirusa mozaikowatości kalafiora (CaMV), a sekwencją 3 ’ UTR nos odpow iedzia lną za poliadeny- lację cząsteczek mRNA. Taka konstrukcja transgenu zapewnia stabilne namnażanie replikujących się w roślinach cząsteczek amplikonów (etap 1). Tran- skrypt, po przejściu z jądra kom órkow ego do cyto- plazmy (etap 2), ulega translacji i powstaje wirusowa RNA-zależna polimeraza RN A odpowiedzialna za replikację wirusa (etap 3). Synte tyzow ana przez nią ujemna nić RNA (etap 4) pełni rolę m atrycy do syntezy potomnych (dodatnich) nici RNA obejmujących cały genom wirusa (etap 5), jak rów nież do syntezy tak zwanego subgenomowego RNA, z którego u le gają translacji geny w irusowe (etap 6). Do konstrukcji amplikonów wykorzystano dobrze poznany wirus ziemniaka X (PVX), gospodarzem którego jes t m iędzy innymi tytoń N. tabacum. Is to tną dla p rzeprow adzanych doświadczeń cechą tego w irusa jest m ożliwość zastąpienia przez obcy gen wirusowego genu białka płaszcza bez jakiegokolw iek w pływ u na rep likację. Pierwotnie amplikony m iały służyć jako w y dajny system do ekspresji genów i produkcji obcych białek w roślinie [28], N ieoczekiw anie dośw iadczenia wykazały, że są one bardzo dobrym narzędziem do wyciszania ekspresji genów roślinnych. Przykładem może być eksperyment, w którym rośliny tytoniu transformowano am plikonam i zaw ierającymi pełen genom PVX, bądź też zm odyfikow a
ny w ten sposób, że gen reporterowy GUS wklono- wany był zamiast białka płaszcza wirusa (PVX-GUS) lub jako gen przylegający do genu białka płaszcza (PVX-GUS-CP). Rośliny w yrażające amplikony z PVX pomimo obecności w pełni infekcyjnych wirionów nie w ykazywały objawów porażenia tym wirusem i były także odporne na w tórne infekcje tym samym szczepem wirusa. Obecność genu GUS w amplikonach powodowała wysoce specyficzne jego wyciszanie [28]. Zastosowanie am plikonów charakteryzuje specyficzność i pow tarzalność wyników, jakiej nie osiągnięto w dośw iadczeniach z żadnym innym układem roślinnym, w którym zachodziło wyciszanie ekspresji genów. Każda z roślin wyrażających pojedynczy transgen wykazywała podobny, wysoki poziom odporności na infekcje w irusowe [9].
Do tej pory nie wyjaśniono zjawiska wysokiej w ydajności indukowanego przez amplikony wyciszania ekspresji genów. Pewnym pozostaje tylko fakt, że odpornością na wirusy charakteryzowały się jedynie rośliny, w których zachodzi wydajna replikacja tran- skrybowanych z transgenu amplikonów. Rośliny zawierające konstrukty amplikonów ze zm utow aną re- plikazą nie były odporne na zakażenie wirusowe. Najprawdopodobniej w tym przypadku homologia sekwencji pomiędzy transgenem a RNA infekującego wirusa PVX wydaje się być nie wystarczająca do indukcji PTGS. Być może aktywacja w yciszania genów przez amplikony zachodzi jedynie w pewnym okresie rozwojowym roślin [9]. A utor pionierskich prac dotyczących amplikonów D a v i d B a u l c o m b e sugeruje, że zjawisko ustępowania objawów chorobowych (ang. recovery) występujące tylko w młodych liściach może być związane z bezpośrednim oddziaływaniem wirusowego RNA z jądrow ym DNA. A sytuacja taka może mieć właśnie miejsce w dzielących się komórkach bez otoczki jądrowej w młodych pędach roślin [9].
V-1. Amplikony, a wysoce wydajna ekspresja transgenów w roślinach
Amplikony stworzono poszukując narzędzia do wydajnej ekspresji obcych genów w roślinach. By wykorzystać je w tym celu, niezbędne jes t równoczesne stosowanie amplikonów z wirusowymi supreso- rami potranskrypcyjnego wyciszania genów. Potwierdzają to doświadczenia z roślinami zawierającymi gen reporterowy GUS w amplikonie, w których potranskrypcyjne wyciszanie tego genu zostało zniesione w obecności białek P l/H C -P ro będących supresorami PTGS. Rośliny te charakteryzowały się
186 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
Ryc. 2. Schemat ekspresji amplikonów w roślinach transgenicznych.
wysokim poziomem ekspresji GUS, w których białko to stanowiło do 3 % wszystkich białek kom órkowych [26].
VI. Uwagi końcowe
W pracy tej przedstawiono jedynie zarys bardzo obszernego zagadnienia, jakim jes t wyciszanie ekspresji genów. Ostatnia dekada przyniosła w tej dziedzinie wiele nowych odkryć: wykazano, że w yciszanie ekspresji genów może zachodzić na dwóch jej etapach (transkrypcyjnym i potranskrypcyjnym), udowodniono, że kosupresja jes t formą potranskryp- cyjnego wyciszania ekspresji genów a także odkryto wirusowe supresory potranskrypcyjnego wyciszania ekspresji genów [24], Wykazano również doświadczalnie, że infekcja wirusowa może być przezwyciężana w roślinie na skutek specyficznej degradacji w irusowego RNA [8]. Zwłaszcza te dwa odkrycia dostarczają dowodów, że PTGS jes t najprawdopodobniej naturalnym systemem obrony roślin przed infek
cjami wirusowymi. Jednakże odkrycia związane z wyciszaniem genow ym m ają nie tylko znaczenie czysto poznawcze.
Infekcja roślin wirusami niosącymi sekwencje homologiczne z genami gospodarza prowadzić może do wyciszenia ich ekspresji w roślinie. Jest to proces wyciszania genów indukowany przez wirusy (VIGS). Stanowi on nowe narzędzie, pozwalające biologom roślin na wyciszanie ekspresji genów na żądanie, manifestujące się fenotypowymi efektami mutacji.
Wadą tej metody jes t konieczność przebadania dużej liczby roślin w celu znalezienia stabilnie w yciszanego genu. Problem ten można ominąć stosując amplikony dające 100% pewność wyciszania ekspresji genów [9, 28].
Nadchodzące lata przyniosą z pew nością w iadomości o odkryciu wielu nowych genów u roślin, do czego przyczyni się zastosowanie amplikonów.
Artykuł otrzymano 25 marca 2002 Zaakceptowano do druku 15 kwietnia 2002
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 187http://rcin.org.pl
Piśmiennictwo
1. S t e c W J (2000) Biotechnologia 48: 15-302. H o b b s S L A, K p o d a r P , D e l o n g C M O ( l 990) Plant Mol
Biol 15: 851-8643. N a p o l i C, L e m i e u x C, J o r g e n s e n R (1990) Plant Celi 2:
279-2894. V a n d e r K r o i AR, M u r LA, B e l d M , M o l J N M ( 1 990)
Plant Celi 2: 291-2995. M a t z k e M , M a t z k e A i M (\9 9 3 )A n n u Rev Plant Physiol Plant
M ol Biol 44: 53-766. V a n B l o k l a n d R , v a n d e r G e e s t N , M o l J N M , K o o t e r
J M (1994) Plant J fi. 861-8777. M e t z l a f f M , O ’ D e l l M, C l u s t e r PD, F l a v e l l R B (1997)
Celi 88: 845-8548. L i n d b o JA, D o u g h e r t y W G (1992) Virology 189: 725-7339. v a n K a m m e n A (1997) Trands Plant Sci 2: 409-41110. E n g l i s h JJ, M u e l l e r E, B a u l c o m b e D C (1996) Plant Celi
179-1881 1 . V o i n n e t O, B a u l c o m b e D C (1997) Nature 389: 55312. P a 1 a u q u i J-C, E l m a y a n T, P o l l i e n J-M, V a u c h e r e t FI
(1997) EMBO J 16: 4738-474513. R u i z M T , V o i n n e t O, B a u l c o m b e D C (1998) Plant Celi
10: 937-94614. K u m a g a i MH, D o n s o n J, D e l l a-C i o p a G, H a r v e y D,
H a n l e y K , G r i l l L K (1995) Proc Natl Acad Sci 92: 1679-1683
15. K j e m t r u p S, S a m p s o n K S . P e e l e CG, C o n k l i n g MA, T h o m p s o n W F , R o b e r t s o n D (1998)PlantJXA: 91-100
16. K u m a g a i M H , T u r p e n T H , W e i n z e t t l N, D e l l a-C i o p p a G, T u r p e n A M, D o n s o n J, H i l f M R , G r a n t h a m GL, D a w s o n WO , C h o w TP, P i a t a k Mj , G r i l l L K (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 427-430
17. B a u l c o m b e D C (1999) Curr Opin Plan Biol 2: 109-11318. R o c h o w WF , R o s s A F (1955) Virology 1: 10-2719. P r u s s G, G e X, S h i X M, C a r r i n g t o n J C, V a n c e V B
(1997) Plant Cell 9: 859-86820. V a n c e V B (1991) Virology 182: 486-49421. A n a n d a l a k s h m i R, P r u s s GJ , G e X, M a r a t h e R,
M a 11 o r y AC, S m i t h T H, V a n c e V B ( 1 998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 13079-13084
22. K a s s c h a u K D , C a r r i n g t o n J C (1998) C ell95: 461-47023. B r i g n e t i G, V o i n n e t O, W a n-X i a n g L, L i a n g H u i J,
D i n g S - W , B a u l c o m b e D C (1 9 9 8 )£ 'M 5 0 J1 7 : 6739-674624. V o i n n e t O, P i n t o YM, B a u l c o m b e D C (1 999) Proc Natl
Acad Sci USA 96: 14147-1415225. L i H-W, L u c y AP , G u o H-S, L i W-X, J i L-H, W o n g SM,
D i n g S-W (1999) EMBO J 18: 2683-269126. M a r a t h e R, A n a n d a l a k s h m i R, S m i t h TH, P r u s s GJ,
V a n c e V B (2000) Plant M ol Biol 43: 295-30627. F 1 o r H H (1971) Annu Rev Phytopatol 9: 275-29628. A n g e l l S M , B a u l c o m b e D C (1997)E M B O J16: 3675-3684
188 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
Udział syntetaz aminoacylo-tRNA w procesach komórkowych
Participation of aminoacyl-tRNA synthetases in cellularprocesses
MONIKA KAMIŃSKA1, ADRIANA ZAKRZEWSKA2, MARIA MADAJKA2. JAN BARCISZEWSKI3
Spis treści:
I. W stępII. W łaściwości syntetaz am inoacylo-tRN AIII. Procesy kom órkowe kierowane przez syntetazy am ino
acylo-tRNAIV. Udział syntetaz am inoacylo-tRN A w powstawaniu cho
rób autoim m unologicznychV. Poszukiwanie antybiotyków skierowanych przeciwko
bakteryjnym syntetazom am inoacylo-tRN AVI. Perspektywy
Contents:
I. IntroductionII. Properties o f am inoacyl-tRN A synthetasesIII. Cellular processes o f am inoacyl-tRNA synthetasesIV. Role o f am inoacyl-tRNA synthetases in autoim m unolo-
gical diseases etiologyV. Searching for antibiotics for bacterial am inoacyl-tRNA
synthetasesVI. Perspectives
W ykaz stosowanych skrótów: aa — aminokwas; aa-AMP- aminoacyloadenylan; aaRS — syntetaza aminoacylo-tRNA; Adt — amidotransferaza; AlaRS — syntetaza alanylo-tRNA; ArgRS — syntetaza arginylo-tRNA; AsnRS — syntetaza aspa- raginylo-tRNA; AspRS — syntetaza aspartylo-tRNA; ATP-ade- nozynotrifosforan; CysRS — syntetaza cysteinylo-tRNA; GlnRS — syntetaza glutaminylo-tRNA; GluProRS — syntetaza gluprolilo-tRNA; GluRS — syntetaza glutamylo-tRNA; GlyRS— syntetaza glicylo-tRNA; IleRS- syntetaza izoleucylo-tRNA; HisRS — syntetaza histydylo-tRNA; LeuRS — syntetaza leucy- lo-tRNA; LysRS — syntetaza lizylo-tRNA; MDa-mega Dalton; MetRS — syntetaza metionylo-tRNA; mRNA — informacyjny kwas rybonukleinowy; mtDNA — mitochondrialny kwas deok- syrybonukleinowy; PheRS — syntetaza fenylo-tRNA; PPi — pirofosforan; ProCysRS — syntetaza procysteinylo-tRNA; ProRS — syntetaza prolilo-tRNA; SerRS — syntetaza sery- lo-tRNA, tRNA — transferowy kwas rybonukleinowy; TrpRS— syntetaza tryptofanylo-tRNA; TyrRS — syntetaza tyrozy- lo-tRNA.
'M gr inż., 2mgr, 3prof. dr hab., 'Akademia Rolnicza, ul. Wojska Polskiego 28, 60-637 Poznań; e-mail: [email protected]; 2,3Instytut Chemii Bioorganicznej PAN, ul. Noskowskiego 12, 61-704 Poznań; e-mail: [email protected], [email protected]
I. W stęp
Proces translacji informacji genetycznej zawartej w DNA polega na przepisaniu „języka kwasów nukleinowych” (4 nukleotydy) na „język białka” (21 aminokwasów). Głównym „tłum aczem ” w tym procesie są syntetazy aminoacylo-tRNA, które rozpoznają tRNA i katalizują jego reakcję aminoacylacji. W pierwszym etapie następuje aktywacja aminokwasu w obecności adenozynotrifosforanu oraz utworzenie aminoacyloadenylanu z jednoczesnym uwolnieniem pirofosforanu. Reakcja ta przebiega zasadniczo bez udziału tRNA, choć w przypadku syntetaz: arginylo-tRNA, glutaminylo-tRNA, glutamylo-tRNA jego obecność jes t niezbędna. W drugim etapie następuje przeniesienie zaktywowanego aminokwasu z aminoacylo-AM P na grupę 2 ’- lub 3 ’-hydroksylową adenozyny przy końcu 3 ’ tRNA i utworzenie am inoacylo-tRNA.
Olbrzymie zróżnicowanie strukturalne aaRS tłumaczy szerokie spektrum ich działania. Enzymy te obok podstawowej funkcji acylacji tRNA, uczestniczą w procesach dojrzewania RN A, regulacji ekspresji genów na poziomie transkrypcji i translacji, syntezie chlorofilu, alarmonów Ap4A oraz biosyntezie aminokwasów (histydyny). Widoczny jes t udział
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 189http://rcin.org.pl
aaRS w apoptozie i embriogenezie. W ydaje się, że wielofunkcyjność aaRS wraz z dostępnością nowych informacji strukturalnych stwarzają możliwości ich wykorzystania w medycynie molekularnej.
Celem niniejszego artykułu jes t przedstawienie udziału syntetaz am inoacylo-tRNA w różnych procesach komórkowych oraz powstawaniu niektórych chorób autoimmunologicznych. W skażem y również na możliwości wykorzystania syntetaz aminoacy- lo-tRNA w poszukiwaniu nowych antybiotyków.
II. Właściwości syntetaz aminoacylo-tRNA
Główną funkcją syntetaz am inoacylo-tRNA jest swoiste rozpoznanie a następnie dwuetapow a reakcja estryfikacji tRNA. Enzymy te w ykazują o lbrzymie zróżnicowanie strukturalne. Dotyczy to zarówno wielkości polipeptydów, sekwencji aminokwaso- w ych jak i budowy czwartorzędowej [1]. aaRS mogą występować jako: m onomery (a ) , hom odim ery i ho- motetramery ( a 2, a 4) lub heterotetramery (CI2P2), je d nak analiza struktury kryształów PheRS Thermus therm ophilus wskazuje, że ten enzym jes t dimerem zbudowanym z dwóch podjednostek ( a P )2 [2, 3], aaRS dzieli się na dwie klasy (Tabela 1). Każda z
Tabela 1
Reakcja aminoacylacji tRNA i klasyfikacja syntetaz aminoacylo-tRNA
nich charakteryzuje się odmiennym m otywem strukturalnym [4], W klasie pierwszej aaRS miejsce katalityczne enzymu tworzy struktura Rossmanna pięciu na przemian ułożonych helis a (ang. Rossm ann fo ld ). W jej obszarze znajdują się dwie znacznikowe sekwencje peptydowe: His-Leu-Gly-His (HIGH) i Lys-Met- Ser-Lys-Ser (KMSKS). Am inokwasy te są zaangażowane w syntezę aminoacylo-adenylanu [5], Dwie reszty lizynowe w sekwencji KM SKS wiążą i aktywują aminokwas. Ten pentapeptyd, oprócz wiązania ATP rozpoznaje koniec 3 ’ cząsteczki tRNA. Dwie reszty histydynowe tetrapeptydu HIGH wiążą reszty fosforanowe ATP. Należy podkreślić, że podobne motywy sekwencyjne w ystępują również w wielu innych białkach wiążących mono- i dinukle- otydy np. w dehydrogenazach [6]. aaRS klasy I specyficznie rozpoznają określone fragmenty tRNA wiążąc się z mniejszą bruzdą helisy RN A i katalizują estryfikację grupy 2 ’OH końcowej 3 ’ rybozy specyficznym aminokwasem [7]. Centrum aktywne syntetaz klasy II tworzy głównie siedem antyrównolegle ułożonych struktur [J-daszkowych oraz trzy helisy ot [8, 9]. W ystępują w nim trzy zdegenerowane m otywy sekwencyjne [10, 11], Syntetazy klasy II (z wyjątkiem PheRS) w iążą się z tRNA w jego większej
A. aa + ATP < aaR-— > aa-AMP + PP|
aa-AMP + tRNA < aaRS -» aa-tRNA + AMP
B.I II
K lasa aaRS
(1) ®Goxx0xxP00
Charakterystyczna
sekwencja aminokwasowaHIGH, KMSKS
(2) ®00X0xxx(F/Y/H)RxE
(R/H)xxxFxxx(D/E)
(3) x0G0G0G0ERo0000
Centrum
katalitycznestruktura Rossmanna
antyrównoległa
struktura [3
Miejsce wiązania
syntetazy do tRNAmniejsza bruzda tRNA
większa bruzda tRNA
Miejsce aminoacylacji
przy końcowej rybozie tRNA2 ’OH 3 ’OH (z wyjątkiem PheRS)
Podklasy aaRS:
a
b
c
d
Arg, Cys, Ile, Leu, Met, Val
Tyr, Trp
Gin, Glu
His, Thr, Pro, Ser
Asp, Asn, Lys
Ala, Gly
Phe
(A) W pierw szym etapie am inoacylacji tRNA, aaRS aktyw uje specyficzny aminokwas z w ytw orzeniem am inoacylo-adenylanu (aa-AM P) i jednoczesnym uwolnieniem pirofosforanu (PPi). W drugim etapie następuje przeniesienie grupy am inoacylow ej am inoacylo-AM P na cząsteczkę tRNA z utworzeniem am inoacylo-tR N A [1], (B) C harakterystyczne sekwencje am inokwasow e aaRS przedstaw iono w kodzie je d noliterowym (© — am inokwasy obdarzone ładunkiem dodatnim , 0 — aminokwas hydrofobowy, x — am inokw as dowolny), podklasy w kodzie trójliterowym . W szystkie AARS z w yjątkiem LysRS (niektórych Archea, Bacteria ) i ProCysRS podlegają powyższej klasyfikacji i są przydzielone do jednej z dwóch klas [2-11].
190 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
bruździe i katalizują przyłączanie aminokwasu do grupy 3 ’OH końcowej 3 ’ rybozy [11].
aaRS Prokaryota w porównaniu z syntetazami Eu- karyota zbudowane są z mniejszych podjednostek. Łańcuchy polipeptydowe syntetazy tryptofany- lo-tRNA i walino-tRNA E. coli zawierają od 344 do 951 aminokwasów. U Eukaryota ich długość wynosi odpowiednio 481 i 1265 aminoakwasów [12, 13]. Jest to konsekwencją występowania dodatkowych peptydów przy końcu aminowym lub karboksylowym [14]. W syntetazie gluprolilo-tRNA o podwójnej specyficzności dodatkowa sekwencja aminokwa- sowa znajduje się pom iędzy sekwencjami swoistymi dla syntetaz glutamylo-tRNA i prolilo-tRNA [15]. Struktura i funkcja dodatkowych peptydów jest mało poznana. Dotychczas wykazano, że biorą one udział w tworzeniu wielocząsteczkowych kompleksów enzymatycznych [16, 17]. Syntetaza metionylo-tRNA Saccharom yces cerevisiae występuje w kompleksie z białkiem A rc łp (ang. am inoacyl-tRNA synthetase cofactor), w tworzeniu którego uczestniczy dodatkowy polipeptyd 185 aminokwasowy przy końcu am inowym. Taki kompleks nie występuje u Prokaryota. Białko A rc lp przy końcu aminowym wiąże GluRS i MetRS, a przy końcu karboksylowym tRNA Glu lub tR N A Met [18]. Obecność A rc lp w kompleksie z M etRS i GluRS zwiększa wydajność aminoacylacji katalizowanej przez obie syntetazy. Domena karboksylowa białka A rc lp oddziałuje niespecyficznie z tRN A phe, tR N A Lys i tR N A Arg [19]. Przyłączenie tej domeny do centrum katalitycznego GlnRS E. coli umożliwia aminoacylację tR N A Gln drożdży [20].
Syntetazy aminoacylo-tRNA występują w kom órkach ssaków na ogół w postaci wielocząsteczkowego kompleksu o m. cz. 1,4 MDa. Składa się on z 11 białek, z których dziewięć to aaRS a pozostałe to białka nieenzymatyczne: p 18, p38 i p43 [21]. Białko p38 wiąże się z ArgRS, GlnRS, AspRS, LysRS i Glu- ProRS stabilizując strukturę kompleksu [21]. Białko p43 uważane jes t za prekursor cytokiny EMAPII (ang. Endothelia l M onocite A ctiva ting Polipeptyde) (proEMAPII), która uczestniczy w ostrej odpowiedzi zapalnej i zaangażowana jes t w proces apoptozy. Domena przy końcu karboksylowym p43 wykazuje właściwości chemotaktyczne wobec leukocytów (monocytów, granulocytów), powodując ich grom adzenie się w ogniskach apoptycznych [22-25]. P43 wiąże ponadto niespecyficznie tRNA, a jego proteo- liza powoduje utratę tych właściwości, co prowadzi do zaburzeń biosyntezy białka i jest przyczyną w ejścia komórki w apoptozę. Udział białka p43 jednocześnie w dwóch procesach komórkowych — translacji i apoptozie, wskazuje na wzajemne powiązanie tych
procesów. Z analizy sekwencji aminokwasowej białka p 18 wynika, że jes t to homolog przedłużenia syntetazy walilo-tRNA przy końcu aminowym, która to sekwencja bierze udział w wiązaniu podjednostek czynnika elongacyjnego EF-1H [26]. Pomimo tych obserwacji, funkcja multisyntetazowego kompleksu jes t wciąż słabo poznana. Kompleksy te występują nie tylko w cytoplaźmie, ale także w jądrze kom órkowym ssaków, gdzie m ogą tworzyć inne połączenia transportujące tRNA z jądra komórkowego do cyto- plazmy [27]. Obecność dodatkowych domen poza rdzeniem katalitycznym aaRS nie jes t jednak w arunkiem tworzenia wieloskładnikowych kompleksów. Dodatkowe aminokwasy przy końcu karboksylowym SerRS S. cerevisiae, nie wpływają na tworzenie m akrokom pleksów, ale zw iększają powinowactwo seryny i tR N A Ser do syntetazy w reakcji aminoacylacji [28]. Istnieją dane doświadczalne wskazujące, że dodatkowe polipeptydy występujące przy końcu am inowym lub karboksylowym, są zaangażowane w oddziaływania z tRNA [29, 30]. Łańcuch 200 am inokwasów przy końcu karboksylowym roślinnej M etRS tworzy strukturę niespecyficznie w iążącą tRNA [31]. Przykład ten potwierdza wcześniejsze obserwacje według których C-końcowa domena MetRS może brać udział w początkowym procesie rozpoznania i przyłączania tRNA przez syntetazę. Pełniąc funkcję swoistego „m agnesu” specyficznych i niespecyficznych tRNA w komórce, może zapobiegać ich dyfuzji w cytoplaźmie przyczyniając się do zw iększenia efektywności aparatu translacyjnego. Bardziej szczegółowe badania wykazały, że dodatkowa domena wiąże i aminoacyluje ramię akceptorowe tR N A Met [31, 32].
Ponad 40 lat temu, tuż po odkryciu syntetaz am inoacylo-tRNA, F.H.C. C r i c k postulował istnienie dwudziestu aaRS w komórkach wszystkich organizmów żywych, gdzie jedna syntetaza rozpoznaje pojedynczy aminokwas [33]. Szybko jednak stwierdzono przypadki będące odstępstwem od tego dogmatu. Ostatnie zaś wyniki sekwencjonowania genomów bakteryjnych potwierdziły, że nie we wszystkich organizmach występuje pełen zestaw aaRS. Genom M ethanococcus ja n a sh ii zawiera geny kodujące tylko 16 z 20 aaRS [34]. Nie zidentyfikowano w nim genów strukturalnych GlnRS, AsnRS, LysRS oraz CysRS, pom imo obserwowanej aktywności katalitycznej tych enzymów [34, 35]. Nasunęło to przypuszczenie, iż w komórkach znajdują się inne białka o podobnych właściwościach, których obecność umożliwia prawidłowy przebieg translacji.
M ethanococcus ja n a sh ii zalicza się do królestwa A rchaea is tniejącego obok B acteria i Eukarya.
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 191http://rcin.org.pl
W każdym królestwie funkcjonuje praw dopodobnie inny m echanizm syntezy g lu tam iny lo-tR N A Gln (Gin- tR N A Gln). W cytoplaźm ie kom órek E ukaryota oraz w niektórych bakteriach (np. E. co li) synteza Gin- tR N A Gln zachodzi przy udziale syntetazy glu- tam inylo-tRNA [36]. Jednak u większości bakterii gram-dodatnich, n iektórych gram -ujem nych, cyja- nobakterii, w organellach kom órkow ych oraz u wszystkich znanych A rchaea proces ten odbywa się pośrednio poprzez etapy am inoacylacji n iespecyficznej i transamidacji [37,38]. U M. ja n a sh ii, M. therm oautotrophicum i B. sub tilis proces glutami- nylacji przebiega w dw óch etapach.
Glu + tR N A Gin + ATP < GluRS > G \u-tR N A GIn + AM P + PPi
G lu -tRN AGln + Gin + ATP < GluAdT > G ln-tRN AGln + G lu + Adp + PPi
W pierwszym etapie GluRS katalizuje n iespecyficzne przyłączanie glutaminianu (Glu) do tRNA n tworząc Glu-tRNAcln. Tak błędnie zacylowany tRNA jest następnie przekształcany do Gln-tRNA cln przez amidotransferazę glutamylo-tRNA (GluAdt). W liniach współczesnych organizmów Bacteria i A rchaea proces transamidacji przebiega przy udziale dwóch strukturalnie różnych amidotransferaz g lutamylo-tRNA. W bakteriach oraz w chloroplastach ten heterodimeryczny enzym jest kodowany przez geny ga tA , gatB i gatC a w królestwie Archaea enzym o tej samej specyficzności kodowany jes t dodatkowo przez geny gatD i gatE [39]. W podobnym szlaku transamidacyjnym przy udziale syntetazy aspartylo-tRNA i amidotransferazy aspartylo-tRNA powstaje A sn-tRNA Asn [40]. Analiza kryształu GluRS Thermus therm ophilus wskazuje, że arginina w pozycji 358 swoiście rozpoznaje tR N A Glu w ykluczając acylację tRNA Gln [41].
Poznanie sekwencji nowych genom ów uwidacznia kolejne przykłady odstępstw od dotychczasowych reguł podziału aaRS. Syntetazy lizylo-tRNA mają swoich przedstawicieli zarówno w klasie I (A rchaea i niektóre bakterię) jak i drugiej (pozostałe organizmy). Centrum katalityczne LysRS M ethano- coccus m anipaludis zawiera oba motywy sekwencyjne HIGH i KMSKS charakterystyczne tylko dla syn- tetaz klasy I [42]. LysRS klasy I i II pomimo braku podobieństw w budowie przestrzennej, rozpoznają te same fragmenty struktury tR N A Lys : ramię akceptorowe i pętlę antykodonową. Jednak sposób wiązania ramienia akceptorowego przez LysRS obu klas jest odmienny. LysRS klasy I (Borelia burgdorferi) w iążą się z mniejszą bruzdą helisy tRNA, podczas gdy enzymy klasy II (np. E. co li) oddziałują z dużą
bruzdą tRNA. [43, 44], Jest to jedyny przykład syntetazy o tej samej specyficzności należących do dwóch klas.
Brak genu kodującego CysRS w sekwencji geno- mowej M. ja n a sh ii i M. theroautotrophicum jes t kolejnym przykładem odstępstw od reguł kodu genetycznego. Wykazano, że acylacja cysteiną u n iektórych Archaea zachodzi przy udziale dwuspecyficz- nej ProCysRS. Jego sekwencja aminokwasowa odpowiada sekwencji ProRS. ProCysRS może syntetyzować in vitro i in vivo zarówno Pro-tRNAPro jak i Cys-tRNACys [45]. Nie zaobserwowano błędnego tworzenia się kompleksów Pro-tRNACys jak i Cys- tR N A Pr0. Mutageneza ProCysRS wykazała, że m iejsca wiązania proliny i cysteiny są wspólne dla obu aminokwasów [46]. Etapy tworzenia cysteinylo-ade- nylanu i prolilo-adenylanu przez ProCysRS są je d nak odmienne. Aktywacja cysteiny przez ProCysRS jes t możliwa tylko w obecności tRNACys. Z kolei tworzenie prolilo-adenylanu wobec ProCysRS zachodzi bez udziału tR N A Pro. Przypuszcza się, że oddziaływanie tRNACys z ProCysRS indukuje zmiany konformacyjne miejsca aktywnego syntetazy, um ożliwiając wiązanie tylko specyficznego aminokwasu [47],
III. Procesy komórkowe kierowane przez syntetazy aminoacylo-tRNA
aaRS obok swej zasadniczej funkcji katalizy am inoacylacji tRNA biorą udział w wielu procesach nie związanych bezpośrednio z rozpoznawaniem tRNA i wiązaniem aminokwasu (Ryc. 1). Enzymy te regu-
dojrzewanieRNA
aminoacylacja tRNA
rozwójembrionalny
biosyntezachlorofilu
aktywnośćcytokin
aminoacylacja wirusowych RNA
podobnych do tRNA
regulacjatranskrypcji
biosynteza alarm onów
regulacjatranslacji
Ryc. 1. Funkcje syntetaz aminoacylo-tRNA. aaRS katalizują reakcję aminoacylacji tRNA a także wykazują inne funkcje nie związane bezpośrednio z biosyntezą białka. Nie uwzględniono tutaj udziału aaRS w mechaniźmie naprawczym [67-69],
lują ekspresję własnych genów, zarówno na poziomie transkrypcji jak i translacji [48]. Syntetaza tre- onylo-tRNA (ThrRS) E. coli wiąże się z dwoma do
192 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
menami odcinka liderowego mRNA przypom inającymi strukturę spinki do włosów. Każda z nich imituje kształtem ramię antykodonu tRN AThr. ThrRS tworząc kompleks z własnym mRNA uniemożliwia jego wiązanie do rybosomu [49, 50]. W podobny sposób ekspresję własnego genu autoreguluje AlaRS. Enzym ten hamuje syntezę AlaRS poprzez wiązanie się z sekwencją palindromową, otaczającą miejsce startu transkrypcji własnego genu [51]. Mi- tochondrialne aaRS zaangażowane są w proces dojrzewania mitochondrialnego RNA. W wycinaniu in- tronów grupy I (ang. splicing) udział biorą: TyrRS N. crassa [52], P. anserina [53], LeuRS S. cerevisiae , S. douglasii [54], Domena M tTyrRS N. crassa zawiera dodatkową sekwencję przy końcu aminowym istotną dla tego procesu. Syntetaza rozpoznaje introny grupy I dzięki ich strukturalnej homologii do tRNA [55]. Bakteryjne LeuRS i ludzkie MtLeuRS nie uczestniczą w procesie składania własnych genów, gdyż nie zawierają intronów. M ogą natomiast wykazywać tę aktywność w procesie składania sekwencji kodującej MtLeuRS S. cerevisiae [56].
LysRS, PheRS i SerRS odpowiedzialne są za syntezę alarmonów — oligofosforanów dinukleotydo- wych, odgrywających w ażną rolę w odpowiedzi komórek bakteryjnych i eukariotycznych na różne w arunki stresowe. Zalicza się do nich: Ap4A, A p3Gpp, Ap4G, A p3G, A p3A w których jedna z reszt fosforanowych cząsteczki ATP (pppA) jes t zastąpiona przez ADP, AMP, ppGpp, GTP oraz GDP [57,58], Alarmo- ny stanowią swoiste „czujniki” sygnalizujące komórce o zmianie warunków otoczenia.
U roślin wyższych, glonów, Eubacteria i Archeo- bacteria syntetaza glutamylo-tRNA zaangażowana jes t w proces biosyntezy porfiryny. Utworzony przez nią g lutam ylo-tRNAGlu jest substratem wyjściowym szlaku prowadzącego do powstania kwasu 5-aminol- ewulinowego, będącego prekursorem związków te- trapirolowych, do których należą chlorofil i hem [59],
W bakteryjnych genomach Bacillus subtilis, Lac- tococcus lactis, Synechocystic sp. odkryto białko uczestniczące w biosyntezie histydyny i wykazujące podobieństwo do HisRS. Otwarta ramka odczytu sekwencji kodującej to białko zawiera gen hisZ, którego produkt jes t homologiem domeny katalitycznej HisRS. Produkt ekspresji genu hisZ nie jes t jednak zdolny zarówno do hydrolizy ATP jak i katalizy reakcji aminoacylacji tR N A Hls. W komórkach bakteryjnych białko HisZ pełni funkcje podjednostki białka HisG o aktywności ATP fosforybotransferazy, który jes t pierwszym enzymem uczestniczącym w szlaku biosyntezy histydyny. U bakterii w których genomie
brak sekwencji hisZ produkt genu hisG jest o 100 aminokwasów dłuższy i funkcjonuje bez białka HisZ. Przypuszcza się więc, że HisZ jest brakującym elementem niekompletnej ATP fosforybozylotrans- ferazy [60].
aaRS katalizują przyłączanie aminokwasów nie tylko do tRNA ale także do genomowych RNA w irusów. RNA Tymowirusów, Tobamowirusów i Bromo- wirusów sąam inoacylow ane na jego końcu 3 ’ ponieważ ta część kwasu nukleinowego przybiera strukturę podobną odpowiednio do tRNA Tyr, tR N A Val, tR N A Hls. Przebieg tej reakcji uwarunkowany jest obecnością struktury tRNA przypominającej kształtem literę L oraz sekwencji CCA na końcu 3 ’. Utworzenie tej sekwencji przez nukleotydylotransfe- razę tRNA i przyłączenie aminokwasu przez odpowiednią aaRS chroni wirusowy genom przed działaniem nukleaz gospodarza. Aminoacylowane wirusowe RNA mogą też wiązać się z komórkowymi czynnikami elongacyjnymi i uczestniczyć w translacji białek wirusa [61].
Niektóre aaRS oraz białka z nimi oddziałujące wykazują aktywność cytokin. Ludzka TyrRS zbudowana jest z dwóch fragmentów wykazujących aktywność cytokin [62]. Domena przy końcu karboksylowym jest strukturalnie podobna do EMAPII-pepty- du biorącego udział w prostej odpowiedzi zapalnej i zaangażowanego w proces apaptozy [63]. Powoduje ona chemotaksję leukocytów, monocytów i stymuluje syntezę mieloperoksydazy, czynnika nekrozy nowotworów T N F -a (ang. tum or necrosis fa c to r -a ) oraz czynnika tkankowego MP (ang. tissue fa c to r produced by m ononuclear phagocytes-M P s). D om ena katalityczna TyrRS wiąże się natomiast z receptorem interleukiny 8A [62]. Za prekursor EMAPII uważany jes t również peptyd p43 wchodzący w skład kompleksów wielosyntetazowych (rozdz. II). A ktywność TrpRS będącej bliskim homologiem TyrRS ma związek z regulacją procesu angiogenezy [64],
Aktywność aaRS może być szczególnie istotna we wczesnym etapie rozwoju organizmów. U Arabi- dopsis thaliana stwierdzono obecność mutanta e d d l . Jego sekwencja jest homologiczna (70%) do sekwencji GlyRS E. coli. Efektem mutacji jest ograniczony wzrost zarodkowy rzodkiewnika, wywołany niepraw idłowym wykształceniem plastydów. Uważa się, że GlyRS odpowiedzialna jes t za tworzenie i przekazywanie sygnału z jądra komórkowego do plastydów warunkujący prawidłowy ich rozwój [65].
Niedawno zauważono związek między niektórymi aaRS a rozwojem embrionalnym zwierząt. W badaniach nad rozwojem gruczołów ślinowych w ykazano zwiększony poziom ekspresji TrpRS, TyrRS,
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 193http://rcin.org.pl
SerRS i AlaRS. Sekwencja TrpRS D rosophila mela- nogaster jes t wysoce hom ologiczna do sekwencji TyrRS ssaków. W kulturach ludzkich kom órek stwierdzono zdolność czynnika przeciwwirusowego IFN-y do aktywacji TrpRS. Ludzka TrpRS posiada przed miejscem startu transkrypcji własnego genu elementy odpowiedzi na ten czynnik (ang. interferon gam m a-stim ulating response elem ents). Poziom ekspresji TrpRS w komórce może być regulowany przez czynniki transkrypcyjne aktywowane przez IFN-y. Możliwe jes t więc, że podwyższona ekspresja TrpRS muszki owocowej stanowi barierę dla rozwoju w irusów oraz innych wew nątrzkom órkowych pasożytów [66].
IV . U d zia ł syn tetaz a m in o a cy lo -tR N A w p ow staw an iu ch orób a u to im m u n o lo - giczn ych
W ostatnich latach badania nad niektórymi chorobami autoimmunologicznymi udowodniły ich związek z obecnością w osoczu pacjentów przeciw ciał skierowanych przeciw określonym aaRS. Celem prac badawczych jest znalezienie przyczyn po jaw iania się tego rodzaju przeciwciał.
Jak wiadomo, układ immunologiczny dojrzałego organizmu rozpoznaje i eliminuje tylko nieswoiste antygeny, a nie reaguje z własnymi. Jednakże zasada tolerancji nie jest absolutna. W pewnych warunkach może pojawić się tzw. reakcja autoimmunologiczna, w której własne antygeny m ogą być nieprawidłowo rozpoznawane, co prowadzi do powstawania chorobotwórczych autoprzeciwciał. Proces ten nie został dotychczas całkowicie wyjaśniony. Rozważa się kilka możliwości ich tworzenia: 1) utrata zdolności układu immunologicznego do rozpoznawania sw oistych substancji we własnym organizmie, 2) wywoływanie niewłaściwych reakcji im m unologicznych w wyniku zmian w tkankach pod w pływem enzymów bakteryjnych i toksyn, 3) zaburzenia m etaboliczne, genetyczne, mechaniczne podczas produkcji przeciwciał. Zatem powstawanie przeciwciał może mieć podłoże immunologiczne, genetyczne, infekcyjne lub hormonalne. Limfocyty T rozpoznają auto- antygen jako egzogenny, jeśli nie oddziałuje on z ko mórkami układu immunologicznego. Zjawisko to nosi nazwę sekwestracji autoantygenu, w efekcie której nie wytwarza się tolerancja na ten autoanty- gen. Może on zostać rozpoznany również jako obcy, jeśli na skutek różnych przyczyn dojdzie do zmian w jego strukturze, co zachodzi w przypadku uszkodzenia tkanek, procesu zapalnego czy wpływu leków [70], Dostępne są dowody potwierdzające wpływ in
fekcji wirusowych na indukcję i rozwój procesu immunologicznego. M ożna j ą tłumaczyć m akrom olekularną mimikrą, to jes t podobieństwem w strukturze antygenów bakteryjnych i fragmentów struktur komórkowych. Przykładem jest syntetaza tryptofa- nylo-tRNA, której fragment aminokwasowy 130/HFLPR jest homologiczny do sekwencji białek wirusowych np. H FVRD H erpes sim plex, HFVKU Epsteina-Barra. W irusowe peptydy w ywołują mo- nonukleazę zakaźną w zespole Sjögrena [71].
Choroby autoimmunologiczne związane są z w ystępowaniem przeciwciał przeciw wielu składnikom komórkowym, takim jak: polimeraza I [72], topoizo- meraza I [73], dehydrogenaza [74] czy histony [75]. Powstające przeciwciała wywołuje wiele chorób tkanki łącznej jak: toczeń rumieniowaty (SLE, ang. System ie Lupus E rythem atosus), zespół Sjörgena (SS, ang. Sjörgen Syndrom e), reumatoidalne zapalenie stawów (RA, ang. R heum atoid A rthritis), zapalenie mięśni (M, ang. M yositis), zapalenie wielomię- śniowe (PM, ang. P olym yositis), zapalenie skórno- mięśniowe (DM, ang. D erm atom yositis), czy sklero- dermę (SSc, ang. System ie Sclerosis) [76]. U pacjentów z tymi chorobami stwierdzono występowanie przeciwciał wobec aaRS. U osób cierpiących na zapalenie mięśni i zapalenie skórno-mięśniowe wykryto przeciwciała anty-Jo-1 (A-Jo-1) reagujące z Hi- sRS [77]. Chorobom tym towarzyszy także śródmiąższowe zapalenie płuc, a niekiedy reumatoidalne zapalenie stawów [78]. Powstawanie określonego rodzaju przeciwciał jes t charakterystyczne wyłącznie dla danego antygenu, co oznacza, że nie ma to wpływu na powstawanie innych przeciwciał. Przeciwciało anty-Jo-1 rozpoznaje wyłącznie synte- tazę HisRS. Jest ono specyficzne dla danego pacjenta i nie reaguje z innymi aaRS. Z analizy reakcji wiązania AsnRS z anty-HisRS, anty- AsnRS i anty-AlaRS wynika, że tylko anty-AsnRS ham ują aminoacylację w 98%. Pozostałe przeciwciała wpływają na reakcję w nieznacznym stopniu [79]. Antygen Jo-1 w ystępuje prawie wyłącznie we frakcji cytoplazmatycznej, co oznacza, że np. MtHisRS nie ma właściwości im- munogennych. U chorych cierpiących na zapalenie skórno-mięśniowe wykryto przeciwciała reagujące z: ThrRS [80], AlaRS i tR N A Ala [81], IleRS [82] i GlyRS [83], dla których stwierdzono występowanie antygenów, odpowiednio: PL7, PL12, OJ i EJ (Tabela 2). Wymienione wyżej aaRS (oprócz IleRS), przeciw którym może być skierowana odpowiedź immunologiczna, występują w komórce w postaci pojedynczych peptydów [17, 18]. Przeciwciała mogą także powodować inhibicję takich aaRS, które w chodzą w skład wieloenzymatycznych komplek
194 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
sów. IleRS w wyniku reakcji z anty-OJ traci prawie całkowicie aktywność enzymatyczną, a kompleks syntetaz ulega wytrąceniu [82].
Metody biochemiczne i immunologiczne obecnie pozwalają na scharakteryzowanie autoantygenu. Określa się miejsca wiązania przeciwciał lub limfocytów T (epitopy) oraz bada się immunogenność określonego autoantygenu. Z analizy sekwencji aaRS wynika, że w ludzkiej HisRS 60 aminokwaso- wy peptyd przy końcu aminowym jest głównym epi- topem rozpoznawanym przez przeciwciała u chorych
Tabela 2
nak może mieć miejsce i zachodzi dwoma drogami: potranslacyjnie poprzez acylację reszt lizynowych białka lub translacyjnie poprzez włączanie S-ni- tro-Hcy do rosnącego łańcucha polipeptydowego białka. Efektem tego jes t obniżenie aktywności biologicznej komórki oraz indukcja patogenezy i arte- riosklerozy [89, 90].
W 1997 roku wykazano, że LysRS może mieć związek z chorobami ośrodkowego układu nerw owego np. w stwardnieniu rozsianym (ALS ang. A m yotrophic Lateral Sclerosis). Rozwój tej choroby na-
Przeciwciała wzglądem aaRS uczestniczące w powstawaniu chorób autoimmunologicznych
Przeciwciało Antygen C horoby autoim m unologiczne Piśm iennictwo
Anty-Jo-1 HisRS PM rzadziej DM 76, 77
Anty-PL-7 ThrRS PM, DM 76, 80
Anty-PL-12 AlaRS+ tRNA Ala PM, DM, ILD 76, 81
Anty-OJ IleRS PM, DM, ILD 76, 82
Anty-EJ GlyRS DM, rzadziej PM 76, 83
Anty-Jo-1 (anty-H isRS); anty-PL-7 (anty-ThrRS); anty-PL-12 ( anty-A laRS i tRNA Ala); anty-OJ (anty-IlcR S); anty-EJ (anty-G ly), DM — zapalenie skórno-m iąśniow e, PM — zapalenie w ielom ięśniow e, ILD — śródm iąższow e zapalenie pluc.
na zapalenie mięśniowe i skórno-mięśniowe. Region ten tworzą głównie helikalne struktury białkowe [84, 85]. Homologiczny region został zidentyfikowany w dwuspecyficznej GluProRS H. sapiens. Obie syntetazy połączone są 3-krotnie powtarzającymi się b lokami aminokwasowymi (ang. tandem repeat motif). Każdy segment o długości 57 aminokwasów jest odpowiednikiem końca aminowego HisRS. Podobny motyw występuje również przy końcu aminowym TrpRS i GlyRS, które podobnie jak HisRS mogą pełnić rolę autoantygenów w procesie autoimmuni- zacji [86],
Okazało się, że aaRS wyjaśnić może etiologię ar- teriosklerozy (tworzenie płytek miażdżycowych), która charakteryzuje się udziałem homocysteiny (Hcy) i syntetazy m etionylo-tRNA w uszkodzeniach naczyń krwionośnych. Homocysteina jest produktem pośrednim w biosyntezie metioniny. Różni się od metioniny brakiem tylko jednej grupy metylowej, w wyniku czego może być niespecyficznie rozpoznawana przez MetRS. Aktywność korekcyjna MetRS zapobiega jednak przeniesieniu zaktywowanej Hcy na tRN A Met, prowadząc w obecności ATP do powstania tiolaktonu homocysteiny. Proces ten odbywa się w komórkach wszystkich organizmów i zapobiega błędnemu wbudowaniu niebiałkowego aminokwasu w łańcuch polipeptydowy [87, 88]. Sytuacja ta jed-
stępuje w wyniku mutacji genu kodującego dysmuta- zę nadtlenkową. Zmutowane białko SOD1 tworzy kompleks z dwoma białkami, w tym z LysRS, podczas gdy natywna forma SOD1 nie wykazuje takiej właściwości. Ma to szczególne znaczenie w kom órkach mózgowych, gdzie poziom ekspresji LysRS i białka SOD1 jest bardzo wysoki [91].
V. Poszukiwanie antybiotyków skierowanych przeciwko bakteryjnym syntetazom aminoacylo-tRNA
Antybiotyki s tanow ią grupę m etabolitów w tórnych w ytw arzanych przez bakterie (E ubacteria les) , prom ieniow ce (A ctin o m yceta les ), grzyby (F ungi), rzadziej przez podstaw czaki (B asid iom ycetes), po rosty (L ich en es ) a także rośliny zielone i zwierzęta w yższe [92]. W spólną cechą w szystkich an tybio tyków je s t ich w ybiórcza zdolność ham ow ania aktyw ności określonych układów enzym atycznych drobnoustro jów a przez to w pływ ania na ich podstaw owe procesy życiowe. aaRS katalizujące podstaw ow ą reakcję am inoacylacji tRNA stanowią doskonałe narzędzie do syntezy tych inhibitorów. Duże zróżnicowanie strukturalne aaRS Prokaryota i Eu- karyota świadczy o wysokiej selektywności tych enzymów, dzięki której m ogą ograniczać aktyw
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 195http://rcin.org.pl
ność patogena nie zaburzając funkcji enzymu ludzkiego. Leki będące substratami (np. am inokwasy) lub produktami pośrednim i (np. am inoacyloadeny- lan) w reakcji am inoacylacji tRNA z udziałem aaRS m ogąprow adzić do silnych zaburzeń syntezy białka [93]. Jednym z lepiej poznanych antybiotyków, k tó ry specyficznie oddziałuje z syntetazą am inoacylo-tRNA jes t m upirocyna (kwas pseudom onowy), wytwarzana przez bakterie P seudom onic flu o re - scens [94]. M upirocyna została po raz p ierwszy w yizolowana w 1971 roku, a w krótce potem określono
Tabela 3
tworzenia izoleucylo-adenylanu. Posiada on szkielet węglowy L-izoleucyny zawierający grupę epoksydową. W ydaje się, że antybiotyk ten będący analogiem L-izoleucyny w spółzaw odniczy o miejsce wiązania przez IleRS. Ponadto antybiotyk ten przyłącza się do m iejsca aktywnego IleRS poprzez zachow aw czą sekw encję 602K M SK S606, blokując miejsce wiązania ATP [ 102], Zastosowanie mupiro- cyny w leczeniu chorób zakaźnych ma jednak pew ne ograniczenia. Jest to związek mało stabilny i we krwi ulega hydrolizie do kwasu monowego. Obec-
Struktury chemiczne inhibitorów (antybiotyków) niektórych bakteryjnych syntetaz aminoacylo-tRNA
L.p.Nazwa
antybiotykuWzór
strukturalny AARS Piśmiennictwo
I. mupirocyna
onw, Y i T r 0' 1
en , o IleRS 97
II- indolmycynaCHj
--- ¡T— C H -C H -C = 0
C X 7 vH 1
NHCHj
TrpRS 103
III. borelidyna
OH
h3CV N / V >HjC J CH, CHj C=0
JL X COOHho y ^ --- rCN
ThrRS 104
IV. furanomycynaNHj
HaC O ¿-COOHW H
IleRS 105
V. granatycynaO
LeuRS 106
Antybiotyki te były projektow ane w oparciu o strukturę substratów lub produktów pośrednich reakcji am inoacylacji.
jej strukturę (Tabela 3) [95-97]. Jest to inhibitor IleRS patogenów g ram -doda tn ich jak: S taphylo coccus epiderm i, S taphylococcus aureus, S taphylo coccus saphrophyticus oraz gram-ujem nych: H aem ophilus influenzae, N eisseria gonorrhoeae i N eisseria m eningitid is [98-100]. Infekcje w yw oływ ane przez S. aureus p row adzą do zaburzeń układu oddechowego [100]. S. aureus charakteryzuje się w ysoką opornością na w iększość stosowanych antybiotyków (np. ß-laktamy). M upirocyna charak teryzuje się znaczną selektywnością . Inhibuje ona aktywność bakteryjnej IleRS z w yda jnośc ią 10000- -krotnie w iększą niż IleRS ssaków [101]. Kwas pseudom onow y blokuje aktyw ność IleRS na etapie
nie projektuje się antybiotyki syntetyczne, będące analogami m upirocyny o korzystniejszych w łaściwościach terapeutycznych jak: wyższa stabilność i selektywność. Jednym z nich jes t inhibitor CB432, który hamuje aktywność bakteryjnej IleRS z w yda jnością 60-11000 krotnie w iększą aniżeli IleRS człowieka. Stężenie 0,1; 0,5 i 10 pg/ml jes t w ystarczające aby zaham ować wzrost bakterii odpow iednio: S. aureus, S. pyogenes i E. coli [93].
Innym antybiotykiem, inhibitorem syntetaz am inoacylo-tRNA jest indolmycyna, opisywana początkowo jako antybiotyk PA -155A. Jest to po chodna tryptofanu (Tabela 3). Hamuje ona wzrost bakterii gram-dodatnich i gram-ujemnych. Indolmy-
196 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
cyna blokuje aktywację tryptofanu na etapie tworzenia tryptofanylo-adenylanu [103].
Odmienny mechanizm działania antybiotyków na aaRS wykazuje borelidyna, która jes t inhibitorem ThrRS, produkowanym przez Streptom yces species (Tabela 3) [104], Przypuszcza się, że w tym przypadku blokowany jest etap aminoacylacji tRNA. Innymi naturalnymi inhibitorami bakteryjnymi aaRS są: fu- ranomycyna (ang . fu ranom ic in ) [105], granatycyna (ang. granaticin ) [106], ochratoksyna (ang. ochra- toxin) i cyspentacyna (ang. cispentacin ), które hamują działanie odpowiednio: IleRS [107], LeuRS [108] PheRS [108,109] i ProRS [110] (Tabela 3). Znane są także inhibitory GlnRS [111], GluRS [112] oraz MetRS [113, 114]. Są to analogi odpowiednio glutaminyloadenylanu, glutaminianu, metionyloade- nylanu i metioniny.
Podstawowym problemem, który nie tylko ogranicza skuteczność antybiotyków, ale także zmusza do poszukiwania nowych, jes t antybiotykooporność, polegająca na uodparnianiu się drobnoustrojów na ich działanie. Jak dotąd nie wydaje się, aby antybiotyki hamujące działanie aaRS mogły całkowicie rozwiązać ten problem. Składa się na to kilka czynników. Częstość spontanicznych mutacji w komórkach bakteryjnych waha się w granicach 10'5-10 '9. Punktowe mutacje bakteryjnych IleRS wywołują natychmiastowe obniżenie wrażliwości patogena na mupi- rocynę. W ostatnich latach wzrosła oporność szczepu S. aureus na ten antybiotyk. Przyczyną tego jest pojawienie się drugiego genu IleRS, który występuje w plazmidzie bakterii. Produkt tego genu wykazuje tylko 34% identyczności aminokwasowej z IleRS kodowanej przez chromosomalny DNA [115]. Jak wiadomo plazmidowy rodzaj oporności charakteryzuje się ogrom ną łatwością przenoszenia, nie tylko wśród szczepów tego samego gatunku, ale także rozprzestrzeniania się na inne gatunki. Zadaniem współczesnej m edycyny jes t poszukiwanie antybiotyków o zmienionych strukturach chemicznych, w odpowiedzi na nowo pojawiające się drobnoustroje. Wydaje się, że w najbliższej przyszłości poszukiwanie antybiotyków realizowane będzie w oparciu o ge- nomikę. W genomach H elicobacterpyro li, M ethano- coccus ja n a sh i czy Borelia burgdorferi nie znaleziono genów syntetazy Gln-tRNAGln oraz A sn-tRNAAsn. Pośrednia glutaminylacja zachodzi przy udziale syntetazy glutamylo-tRNA i amido- transferazy glutamylo-tRNA. Amidotransferaza, której obecność jes t konieczna dla prawidłowego funkcjonowana aparatu translacyjnego Archea może stanowić interesujące narzędzie w projektowaniu antybiotyków [116]. Szczególnym przykładem wśród
syntetaz aminoacylo-tRNA jest LysRS, która według kanonicznego podziału syntetaz przynależy do klasy II, a wśród niektórych patogennych bakterii zidentyfikowano LysRS o strukturze typowej dla klasy I-ej syntetaz. Ta cecha LysRS może być wykorzystana w projektowaniu antybiotyków, które specyficznie blokowałby aktywność tylko LysRS patogena.
VI. Perspektywy
Z przedstawionej charakterystyki wynika, że aaRS należą do jednej z najstarszych i najlepiej poznanych rodziny białek. Również z tego powodu stanow ią one dobre narzędzie badawcze do poszukiwania odpowiedzi na pytania dotyczące ewolucji. Wiadomo, że enzymy te zawierają klasyczne motywy wiążące dinukleotydy występujące także w wielu innych białkach jak oksydazy czy dehydrogenazy. N asuwa się natychmiast pytanie o relacje między tymi enzymami a także o wspólnego przodka.
Podstawowa rola kom órkowa aaRS związana z acylacją tRNA specyficznym aminokwasem daje szanse wykorzystania tych enzymów do celów diagnostycznych. Na przykład inhibitory projektowane w oparciu o substraty lub produkty pośrednie tej reakcji s tanowią now ą alternatywę dla farmakologii. Podejmowane są również próby rozszerzenia kodu genetycznego w celu włączenia nienaturalnych am inokwasów do dowolnego białka. Ich celem jes t skonstruowanie nowych par syntetaza-tRNA, które byłyby specyficzne wobec nowych aminokwasów i włączanie ich do powstającego peptydu. Rozwiązanie tego i podobnych zagadnień z udziałem nowych aa-tRNA umożliwi syntezę dowolnych białek o właściwościach i zastosowaniach terapeutycznych.
A rtyku ł o trzym ano 23 kw ietn ia 2002 Z aakceptow ano do druku 7 m aja 2002
Piśmiennictwo:
1. A r n e z J G , M o r a s D ( 1 9 9 7 ) Trends Biochem Sci 22:211-2162. G o l d g u r Y, M o s y a k L, R e s h e t n i k o v a L, A n k i -
l o v a V, L a v r i k K , K h o d y r e v a S, S a f r o M (1997) Structure 15: 59-68
3. S i a t e c k a M, B a r c i s z e w s k i J (1995) Post Biochem 41: 266-275
4. I b b a M, C u r n o w A W , S o l i D (1997) Trends Biochem Sci 22: 39-42
5. J G A r n e z a n d D M o r a s (1994) Oxford University Press, New York, wyd. przez: K Nagai I IW Mattaj
6. B u r b a u m J , S c h i m m e l P (1991) J Biol Chem 266: 16965-16968
7. D e l a r u e M, M o r a s D (1993) Bioessays 15: 675-6868. M o r a s D (1990) Nature 344: 195-1979. Moras D (1992) Trends Biochem Sci 17: 159-16410. C u s a c k S (1997) Curr Opin Struct Biol 7:881-88911. C u s a k S (1999) Curr Opin Struct Biol 9: 66-73
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 197http://rcin.org.pl
12. C u s a c k S (1995) Nat Struct Biol 2: 824-83113. M i r a n d ę M, L a z a r d M, K e r j a n P, B e e G, A g o u F,
Q u e v i l l o n S , W a l l e r J - P (1993): w: K. H. NicrhausThe Translational Apparatus, wyd. Plenu Press, New York str. 657-668
14. I b b a M , S ö l l D (2000) Annu Rev Biochem 69: 617-65015. R h o S B , L e e J S , J e o n g E J , K i m Y G , K i m S (1998)7
Biol Chem 273: 11267-1127316. Y a n g D C H (1996) Curr Top Cell Regul 34: 101-13617. Berbeć H (1990) Post Biochem 3-4: 41-5018. D e i n e r t K, F a s i o l o F, H u r t E C , S i m o s G (2001)7
Biol Chem 276: 6000-600819. S i m o s G, S a u e r A, F a s i o l o F, H u r t E C (1998) Mol
Cell 1: 235-24220. W a n g C C , S h i m m e l P ( 1 9 9 9 ) 7 B i o l C h e m 2 7 4 :
1 65 08 - 1 6 5 1 22 1 . Q u e v i l l o n S, R o b i n s o n J C , B e r t h o n n e a u E, S i a -
t e c k a M, M i r a n d ę M (1999) 7 Mol Biol 285: 183-19522. M u r r a y J C , T a s J (1996) Int 7 Biochem Cell Biol 28: 837-84123. Q u e v i l l o n S, A g o u F, R o b i n s o n J C , M i r a n d ę M
(1997) 7 Biol Chem 272:32573-3257924. Shalak V, Kamińska M, Mitnacht-Kraus R, Vandenabeele P, Clauss
M, Mirandę (2001) 7 Biol Chem 276: 23769-2377625. K im Y , S h i n J , Li R, C h e o n g C, K i m K, K i m S
(2000)7 Biol Chem 275: 27062-2706826. Q u e v i l l o n S, M i r a n d ę M (1996) FEBS Lett 395: 63-67.27. N a t h a n s o n L, D e u t s c h e r M P (2000) 7 Biol Chem
275:31559-3156228. W e y g a n d - D u r a s e v i ć I , L e n h a r d B, F i l i p i e S,
S ö l l D (1 9 9 6 )7 Biol Chem 271:2455-246129. F r u g i e r M, M o u l i n i e r L, G i e g e R (2000) EMBO J 19:
2371-238030. S c h i m m e l P, R i b a s d e P o p u p l a n a L (2000) Trends
Biochem Sei 25: 207-2093 1 . K a m i ń s k a M, D e n i z i a k M, K e r j a n P, B a r c i s z e w -
s k i J , M i r a n d ę M A (2000) EMBO 7 19: 6908-691732. S t a p u l i o n i s R, D e u t s c h e r M P (1995) Proc Natl Acad Sei
USA 92: 7158-716133. W i l c o x M, N i r e n b e r g M (1968) Proc Natl Acad Sei USA
61:229-23634. B u l t C J , W h i t e O, O l s e n G J , Z h o u L, F l e -
i s c h m a n n R D , S u t t o n G G , B l a k e J A , F i t z G e r a l d L M , C l a y t o n R A , G o c a y n e J D , K e r l a v a g e A R , D o u g h e r t y B A , T o m b J F , A d a m s M D , R e i c h C l , O v e r b e e k R, K i r k n e s s E F , W e i n s t o c k K G , M e r r i c k J M , G l o d e k A, S c o t t J L , G e o g h a g e n N S , W e - i d m a n J F , F u h r m a n n J L , N g u y e n D, U t t e r b a c k T R , K e l l e y J M , P e t e r s o n J D , S a d o w P W , H a n n a M C , C o t t o n M D , R o b e r t s K M , H u r s t M A , K a i n e B P , B o r o d o v s k y M, K l e n k H - P , F r a s e r C M , S m i t h H O , W o e s e C R , V e n t e r J C (1996) Science 273: 1058-1073
35. I b b a M, S ö l l D (2001) EM BO reports 2: 382-38736. A r n e z J G , M o r a s D (1998) Cold Spring Harbor Laboratory
Press3 7 . I b b a M, C u r n o w A W , S ö l l D (1997) Trends Biochem Sei
22: 39-4238. K o o n i n E V , A r a v i n d L (1998) Curr Biol 8: R266-R26939. I b b a M, B e c k e r H D , S t a t h o p o u l o s C , T u m b u l a
D L , S ö l l D (2000) Trends Biochem Sei 25:311-31640. C u r n o w A W , I b b a M, S ö l l D (1996) Afo/nre 382: 589-59041. S e k i n e S, N u r e k i O, S h i m a d a A, V a s s y l y e v D G ,
Y o k o y a m a S (2001) Nat Struct Biol 8: 203-20642. I b b a M, M o r g a n S, C u r n o w A W , P r i d m o r e D R ,
V o t h k n e c h t U C , G a r d e n W, L i n W, W o e s e C R , S ö l l D (1997) Science 278: 1119-1122
43. S ö l l D, B e c k e r H D , P l a t e a u P, B l a n q u a t S, I b b a M (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97: 14224-14228
44. I b b a M, L o s e y H C , K a w a r a b a y a s i Y, K i k u c h i H, B o n j u n S, S ö l l D (1999) Proc Natl Acad Sei USA 96:418-423
45. S t a t h o p o u l o s C, Li T , L o n g m a n R, V o t h k n e c h t U C , B e c k e r H D , I b b a M, S ö l l M (2000) Science 287: 479-482
46. S t a t h o p o u l u s C, J a c q u i n - B e c k e r C , B e c k e r D H , Li T , A m b r o g e l l y A, L o n g m a n R, S ö l l D (2001)Biochemistry 40: 46-52
47. Y a r u s M (2000) Science 287: 440-44148. Putzer H, Grunbcrg-Manago M, Springer M (1995) w: tRNA Struc
ture, Biosynthesis and Function, ASM Press, Washington DC, 293-333.
49. Sacerdot C, Caillet J, Graffe M, Eyermann F, Ehresmann B, Ehres- mann C, Springer M, Romby P (1998) Mol Microbiol 29: 1077-1090
50. Sankaranarayanan R, Dock-Bregeon AC, Romby P, Caillet J, Springer M, Rees B, Ehresmann C, Ehresmann B, Moras D (1999) Cell 97: 371-381
5 1 . P u t n e y S D , S c h i m m e l P (1981) Nature 291: 632-6355 2 . C a p r a r a M G , L e h n e r t V, L a m b o w i t z A M , W e -
s t h o f E (1996) Cell 87: 1 135-1145.5 3 . K a m p e r U, K u c k U, C h e r n i a c k A D , L a m b o w i t z
A M (1992) M ol Cell Biol 12: 499-5115 4 . H e r b e r t C J , L a b o u e s s e M, D u j a r d i n G, S ł o n i m
s k i P P (1988) EMBO 7 7: 473-483.55 . L a m b o w i t z A M , P e r l m a n P S (1990) Trends Biochem Sei
15; 440-444.56. H o u m a n F, R h o S B , Z h a n g J , S h e n X, W a n g C C ,
S c h i m m e l P, M a r t i n i s S A (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97: 13743-13748
57. N i s h i m u r a A (1998) Trends Biochem Sei 23: 157-1595 8 . K i s s e l e v L L , J u s t e s e n J, W o l f s o n A D , F r o l o v a
L Y (1998) FEBS Lett. A ll'. 157-16359. K u m a r A M , S c h a u b U, S ö l l D, U j w a l M L (1996)
7755 1: 371-37560. S i s s l e r M, D e l o r m e C, B o n d J, E h r l i c h S D , R e
n a u l t P, F r a n c k l y n C ( 1 9 9 9 ) Proc Natl Acad SciUSA 96: 8985-8990
ó l . H a e n n i A - L , C h a p e v i l l e F (1997) Acta Biochim Pol 44: 827-837
62. W a k a s u g i K, S c h i m m e l P (1999) Science 284: 147-1516 3 . T a s s M P R . i M u r r a y J C (1996) Int. 7. Biochem. Cell Biol.
28: 837-84164. W a k a s u g i K, S l i k e B M , H o o d J , O t a n i A, E w a l t
K L, F r i e d l a n d e r M, C h e r e s h D A, S c h i m m e l P(2002) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8: 173-177
65. U w e r U, W i l l m i t z e r L, A l t m a n n T (1998) Plant Cell 10: 1277-1294
66. S e s h a i a h P, A n d r e w D J : (1999) Mol Biol Cell 10:1595-1608
67. F e r s h t A R (1997) Enzyme Structure and Mechanism , 263pp., Freeman, San Francisco
68. N u r e k i O, V a s s y l y e v D G , T e t e n o M, S h i m a d a A, N a k a m a T , F u k a i S, K o n n o M, H e n d r i c k s o n T L , S c h i m m e l P, Y o k o y a m a S (1998) Science 280: 578-582
69. J a k u b o w s k i H (1999) Biochemistry 38: 8088-809370. J a k ó b i s i a k M (1995) Immunologia, wyd. PWN, Warszawa71. P a 1 e y E L , A l e x a n d r o v a N, S m e l a n s k y L (1995) Im
munol Lett 48: 201-20772. R e i m e r G , R o s e K M , S c h e e r U , T a n E M (1987) 7 Clin
Invest 79: 65-727 3 . S a m u e l s D S , T o j o T , H o m m a M, S h i m i z u N (1986)
FEBS Lett 209: 231-23474. U i b o R, M a c k a y I R , R o w l e y M, H u m p h r i e s P,
A m s t r o n g J M , M c N e i l a g e J (1990) Clin Exp Immunol 80: 19-24
75. T h o r e n - T o l l i n g K, R y d e n L (1991) Acta Vet Scand 32: 15-26
76. T a r g o f f I N (1992) Rheum Dis Clin North Am 18: 445-48277. B i s w a s T , M i l l e r F W , T a k a g a k i Y, P l o t z P H
(1987) J Immunol Methods 98: 243-24878. T a r g o f f I N , T r i e u E P , P l o t z P H , M i l l e r F W (1992)
Arthritis Rheum 35: 821-8307 9 . B e a u l a n d e M, T a r b o u r i e c h N, H a r t l e i n M (1998)
Nucleic Acid Res 26: 521-52480. T a r g o f f I N , A r n e t t F C , R e i c h l i n M (1988) Arthr
Rheum 31: 515-52481 . T a r g o f f I N , A r n e t t F C (1990) Am J Med 88: 241-251
198 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
82. T a r g o f f I N , T r i e u E P , M i l l e r F W (1993) J Clin Invest 91: 2556-64
83. G e Q, T r i e u E P , T a r g o f f I N (1994) J Biol Chem 269: 28790-28797
84. R a b e n N, N i c h o l a s R, D o h l m a n J , M c P h i e P, S r i d h a r V , H y d e C, L e f f R , P l o t z P (1994) J Biol Chem 269: 24277-24283
85. B 1 e c h y n d e n L M , L a w s o n C M , G a r l e p p M J (1996)Gene 178: 151-156
86. B c r t h o n n e a u E, M i r a n d ę M (2000) FEBS Lett 470:300-304
87. J a k u b o w s k i H (1995) J Biol Chem 270: 17672-1767388. J a k u b o w s k i H (1991) EMBO J 10: 593-59889. J a k u b o w s k i H, Z h a n g L, B a r d e g u e z A, A v i v A (
2000) Circ Res 87: 45-5190. J a k u b o w s k i H (2001) J Nutr 131: 2983S-7S91 . K u n s t C B , M e z e y E, B r o w n s t e i n M J , P a t t e r s o n
D (1997) Nat Genet 15: 91-949 2 . Z e j c A, G o r c z y c a M (1998) Chemia leków, wyd. PZWL,
Warszawa93. S c h i m m e l P, T a o J , H i l l J ( \9 9 8 )F A S E B J 12: 1599-160994. B r o o m N J P , C a s s e l s R, C h e n g H Y , E l d e r J S ,
H a n n a n P C , M a s s o n N , O ’ H a n l o n P J , P o p e A, W i l s o n J M (1996) J M e d Chem 39: 3596-3600
95. B a i n e s P J , J a c k s o n D, M e l l o w s G, S w a i s l a n dA J , T a s k e r T C G (1984) W i 1 k i n s o n D S , P r i c e J D (eds), Royal Society o f Medicine, London, UK: 13-22
96. S i l v i a n L, W a n g J , S t e i t z T A (1999) Science 285:1074-1077
97. Z e j c a A, G o r c z y c a M (1998) Chemia leków wyd.: PZWLWarszawa
98. P o p e A J , L a p o i n t e J , M e n s a h L, B e n s o n N,B r o w n M J , M o o r e K J (1998) J Biol Chem 273: 31680-31690
99. P o p e A J , M o o r e K J , M c V e y M, M e n s a h L, B e n s o n N, O s b o u r n e N , B r o o m N , B r o w n M J , O ’ H a n l o n P (1998) J Biol Chem 273: 31691-31701
100. P o p e A J , M c V e y M, F a n t o m K, M o o r e K J (1998)7 Biol Chem 273: 31702-31706
101. H u g h e s J , M e l l o w s G (1980) Biochem J 191: 209-219102. Y a n a g i s a w a T , L e e J L , W u H C , K a w a k a m i M
(1994) J Biol Chem 269: 24304-24309103.W e r n e r R G , T h o r p e L F , R e u t e r W, N i e r h a u s K H
(1976) Eur J Biochem 68: 1-3104. F r e i s t W , G a u s s D H (1995) Biol Cchem Hoppe Syler 376:
213-224105. N e g w e r M (1978) Organic-chemical drugs and their synonyms
vol 1, Akademie Verlang, Berlin106. K o r z y b o w s k i T , K o w s z y k - G i n d i f e r Z,
K u r y ł o w i c z W (1997) Antybiotyki: pochodne, rodzaje i właściwości PZWL Warszawa
107. Tanara K, Tamaki M, Watanabe S (1996) Biochem Biophys Acta 195: 244-245
108. Konrad I, Röschenthaler R (1977) FEBS Lett 83: 341-348109. R o t h A, E r i a n i G, D i r h e i m e r G, G a n g l o f f J
(1993) FEBS Lett 326: 87-91110. H e a c o c k D H , F o r s y t h C J , S h i b a K, M u s i e r - F o r -
s y t h K (1996) Bioorg Chem 24: 273-289111. B e r n i e r S, D u b o i s D Y , T h e r r i e n M, L a p o i n t e J,
C h q n e v e r t R (2000) Bioorg M ed Chem Lett 10: 2441-2444112. D e s j a r d i n s M, D e s g a g n e s J , L a c o s t e L, Y a n g F,
M o r i n M P , L a p o i n t e J (1997) Bioorg Med Chem Lett 1 : 2363-2366
113. L e e J, K a n g S U , K a n g M K , C h u n M M , J o Y J , K w a k J H , K i m S (1999) Bioorg M ed Chem Lett 9: 1365-1370
114. L e e J , K a n g M K , C h u n M M , J o Y J , K w a k J H , K i m S (1998) Bioorg M ed Chem Lett 8: 3511-3514,
115 B r o w n J R , Z h a n g J , H o d g s o n J E (1998) Curr Biol 8: R365-R367
116. D e c i c c o C P , N e l s o n D J , L u o Y, S h e n L, H o r i u - c h i K Y , A m s l e r K M , F o s t e r L A , S p i t z S M , M e r r l i l l J J , S i z c m o n e C h , G o g e r s K C , C o p e l a n d R A , H a r p e l M R (2001) Bioorg M ed Chem Lett 11: 2561-2564
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 199http://rcin.org.pl
Niedobór cholesterolu sygnałem dla transdukcji informacji z endoplazmatycznego retikulum do jądra komórkowego — procesy proteolitycznego odszczepienia czynników transkrypcyjnych z błon ER
Depletion of cholesterol in signal transduction from endoplasmic reticulum to the cell nucleus — the proteolytic cleavage of transcription factors from the ER membranes
BOŻENA WIECZOREK1, JADWIGA GNIOT-SZULŻYCKA2
Spis treści:
I. W stępII. Sterolowe elem enty regulatorowe SRE i białka SREBPIII. Budowa białek SREBPIV. M echanizm dw uetapowego procesu proteolizy białka
SREBPIV -1.SC A P — białko aktyw ujące proteolityczne rozsz
czepienie SREBP z udziałem proteaz S1P i S2PIV-2. Proces proteolizy białka SR EBP błon ER i uwol
nienie czynnika transkrypcyjnego SREBP-68
Contents:
I. IntroductionII. SRE-steroł regulatory elem ents and SREBP-steroł regu
latory elem ent binding proteinsIII. Structure of the SREBP proteinsIV. M echanism of the proteolytic cleavage and release of
SREBPIV-1. SCAP, the SREBP cleavage activating proteinIV-2. The proteolytic cleavage process and release of the
transcription factor SREBP-68
Wykaz stosowanych skrótów: ACAT — acylotransferaza acy-lo-CoA:cholesterol; AG — aparat Golgiego; bHLH-Zip — motyw suwaka leucynowego (ang. b a sic -h e lix -lo o p -h e lix -leu c i- ne-zipper)\ HDL — lipoproteiny o dużej gęstości; LDL — lipo- proteiny o małej gęstości; SCAP — białko aktywujące proteolityczne rozszczepienie SREBP (ang. SREBP c lea va g e a c tiva tin g protein)', SIP — proteaza miejsca 1 (ang. s ite - \ p ro te a se ); S2P— proteaza miejsca 2 (ang. s ite -2 p ro tea se )\ SRE — sterolowy element regulatorowy (ang. ste ro l reg u la to ry e lem en t); SREBP— białka błon o m.cz. 125 kDa podlegające proteolizie z uwolnieniem SREBP-68; SREBP-68 — białka wiążące się ze sterolowym elementem regulatorowym (ang. s te ro l reg u la to ry e le m ent b in d in g protein)', VLDL — lipoproteiny o bardzo małej gęstości.
'Mgr, 2prof. dr hab., Zakład Biochemii, Instytut Biologii (Ogólnej i Molekularnej), Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, ul. Gagarina 7/9, 87-100 Toruń; e-mail: [email protected]
I. Wstęp
Cholesterol jest związkiem nieodzownym dla prawidłowego przebiegu wielu procesów m etabolicznych zachodzących w komórkach i tkankach organizmów wyższych. Jako składnik błon biologicznych uczestniczy w regulacji ich struktury i funkcji. Cholesterol jest także wyjściowym substratem do biosyntezy wszystkich hormonów steroidowych, w itaminy D3, kwasów żółciowych i oksysteroli [1-8].
W komórkach eukariotycznych cholesterol pochodzi z wewnątrzkomórkowej syntezy de novo oraz cholesterolu dostarczanego z zewnątrz. Rozprowadzanie cholesterolu zachodzi z udziałem jego szybko wymienialnej puli, którą stanowią lipoproteiny osocza (VLDL, LDL, HDL), a wychwytywany jest przez tkanki głównie poprzez receptorozależną endocyto- zę. U ssaków głównym miejscem biosyntezy chole
200 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
sterolu są wątroba, jelito cienkie, mięśnie szkieletowe i skóra [1, 5, 8-10].
Synteza de novo w komórce zachodząca w błonach retikulum endoplazmatycznego (ER) podlega precyzyjnej regulacji na poziomie transkrypcji, translacji i bezpośredniej regulacji aktywności k luczowych enzymów szlaku biosyntezy cholesterolu. Nieprawidłowości metaboliczne wynikające z nadmiernej podaży cholesterolu ukierunkowały badania ostatnich trzydziestu lat głównie na poznanie m echanizmów ograniczających biosyntezę i zaangażowanych w utrzymaniu jego prawidłowego stężenia [ 1 , 11-21],
Modulacja aktywności kluczowych enzymów szlaku biosyntezy cholesterolu jes t procesem stosunkowo dobrze poznanym i polega na modyfikacji kowalencyjnej przez fosforylację i defosforylację, zmianie konformacji niektórych enzymów przez cholesterol i metabolity pośrednie oraz inhibitory kompetycyjne. Stwierdzono ponadto, iż enzymy szlaku biosyntezy cholesterolu pozostają pod kontrolą statusu oksydacyjno-redukcyjnego komórki i aktywności enzymów proteolitycznych [ 1 , 11-15].
Konstytutywna regulacja procesów transkrypcji enzymów biosyntezy cholesterolu, przemian mewa- lonianu i metabolizmu kwasów tłuszczowych polega na oddziaływaniu szeregu sygnałowych związków z czynnikami transkrypcyjnymi uczestniczącymi w regulacji odczytu promotorów z ramką E (CANNTG- 3 ') .Takimi związkami sygnałowymi są np. cholesterol, oksysterole, malonylo-CoA, kwasy tłuszczowe i kwasy żółciowe [16-19]. Transkrypcyjna regulacja syntezy enzymów szlaku biosyntezy przemian me- walonianu przez końcowy produkt cholesterol, była przedmiotem szczególnie intensywnych badań. W ymogiem strukturalnym, koniecznym dla wywarcia hamującego efektu przez cholesterol jes t obecność niezestryfikowanej grupy hydroksylowej w pozycji 3 pierścienia steroidowego, a obecność grupy ketonowej lub hydroksylowej w pozycji 6 , 7 lub 25 znacznie zwiększa efekt inhibitorowy. Wykazano również, że naturalne oksysterole, występujące w śladowych ilościach są skuteczniejszymi od cholesterolu inhibitorami transkrypcji [10, 17, 20, 21].
Oprócz m echanizm ów regulujących homeostazę cholesterolu przy prawidłowej i nadmiernej jego podaży, istnieją również m echanizm y odbioru sygnału o jego niedoborze i konieczności uaktywnienia procesów biosyntezy. M echanizm y te polegają na aktywacji genów z promotorami ze sterolowym elementem regulatorowym (SRE).
Przedmiotem niniejszego artykułu będzie om ówienie poznanych w ostatnich latach mechanizmów
proteolitycznego odszczepienia czynników tran- skrypcyjnych z integralnych białek SREBP. Białka te zlokalizowane są głównie w błonach ER.
II. Sterolowe elementy regulatorowe SRE i białka SREBP
Za zależną od obniżonego poziomu steroli regulację transkrypcji odpowiedzialne są regiony prom otorów ekspresji genów dla enzymów szlaku biosyntezy cholesterolu, receptora LDL i lipogenezy. Zawierają one jed n ą lub wiele kopii jednego z wariantów10-nukleotydowej sekwencji: 3 ’-CATGAGATCA- C C C C A C T G C A A -5’. Regiony te określane są m ianem sterolowy element regulatorowy (SRE). Ich aktywacja jest niezbędna dla inicjacji transkrypcji w kom órkach sygnalizujących zapotrzebowanie na cholesterol (Tabela 1) [17, 21, 22]. Aktywacja SRE nie zachodzi w warunkach konstytutywnej (podstawowej) ekspresji, gdy komórka nie sygnalizuje zapotrzebowania na cholesterol.
Obniżenie się stężenia cholesterolu w komórce inicjuje proteolityczne procesy prowadzące do uwolnienia z integralnych białek błonowych, SREBP, ret ikulum endoplazmatycznego, rozpuszczalnych fragmentów SERB P-68 . Uwolnione białka SRE- B P -68 transportowane są do jądra komórkowego, gdzie uczestniczą w aktywacji genów z promotorami SRE.
Białka SREBP zostały wykryte w 1993 roku [25, 26] przez dwie odrębne grupy badaczy: H u a , Y o k o y a m a , W u , B r i g g s , B r o w n , G o l d s t e i n i W a n g z University o f Texas (Dallas), zajmujących się metabolizmem cholesterolu oraz T o n - t o n o z , K i m , G r a v e s i S p i e g e l m a n z Harvard Medical School (Boston), prowadzących badania nad metabolizmem cholesterolu i jego w pływ em na procesy różnicowania [16-18, 21-23, 27, 28].
Białka SREBP są składnikiem błony retikulum endoplazmatycznego (ER). Ich obecność stwierdzono również w błonie jądrowej i błonach Aparatu Gol- giego (AG).
Aktualnie znane są trzy izoformy białka SREBP: S R E B P -la , S R E B P -lc i SREBP-2. Białka te kodowane są przez dwa geny. Gen SR E B P-1 z dwoma promotorami koduje białka S R E B P -la i lc , różniące się tylko d ługośc iąN - końcowej domeny, S R E B P -la zawiera dodatkowo w tej domenie 29 kwaśnych am inokwasów. Gen SREBP-2 koduje pojedyncze białko (Ryc. 1) [17,18, 28-30].
N adekspresja S R E B P -la wywołuje intensywną biosyntezę cholesterolu i kwasów tłuszczowych, na-
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 201http://rcin.org.pl
dekspresja S R E B P-lc um iarkowany wzrost b iosyntezy cholesterolu i kwasów tłuszczowych. Według najnowszych badań S R E B P -lc , najpraw dopodobniej reguluje głównie syntezę kwasów tłuszczowych i w mniejszym stopniu cholesterolu.
SRE B P-lc uczestniczy również w regulacji metabolizmu węglowodanów. Białko SREBP-2 wpływa głównie na biosyntezę cholesterolu i w pewnym stopniu również na biosyntezę kwasów tłuszczowych. Ekspresja białek SREBP jes t kontrolowana na wielu poziomach i zachodzi w odpowiedzi na zmiany stężenia cholesterolu, oksysteroli, wielonienasyco- nych kwasów tłuszczowych, glukagonu, cAMP oraz stosunku insulina/glukoza (Tabela 2) [17, 28, 31].
mRNA pozostaje w korelacji z ilością odpowiednich białek SREBP [28],
III. Budowa białek SREBP
SREBP to trójdomenowe białka (~ 1150 am inokwasów) o masie 125 kDa, o orientacji szpilki do włosów, związane z błonami ER (Ryc. 2); ich N-ter- minalne domeny (~ 480 aminokwasów) i C-terminal- ne domeny (~ 590 aminokwasów) znajdują się w cy- tosolu. Białka SREBP zakotwiczone są w błonie dom eną centralną (~ 80 aminokwasów). Ta unikalna domena odróżniająca SREBP od innych białek błonowych, zawiera dwa hydrofobowe 2 2 -amino-
Tabela 1
Nukleotydowe sekwencje dla sterolowych elementów regulatorowych SRE [na podstawie 17]
Geny odpowiedzialne za syntezę Sekwencja SRE
OU Receptora LDL ATCACCCCACt/5 Syntazy HMG-CoA CTCACCCCACO-Co GCCACCCTACoNO Reduktazy HMG-CoA ACCGCACCATa CTCTCACCACtS)CJ Syntazy farnezylo-PP CTCACACGAG
'c Syntazy skwalenu ATCACGCCAG.a CGATGCTGAGoQh SREBP-2 ATCACCCCAC
Karboksylazy acetylo-CoA
Syntazy kwasów tłuszczowych
Desaturazy 1 stearylo-CoA
Desaturazy 2 stearylo-CoA
Acylotransferazy glicerylo-3-fosforanu
GGAGGACCAT
CTCACGTCGC
ATCACCCCAC
AGCAGATTGC
AGCAGATTGT
CTCAGCCTAG
InneLiaza ATP-cytrynian
TCAGGCTAG
Stężenie poszczególnych form SREBP jes t odm ienne w różnych tkankach. Dla przykładu w wątrobie i adopocytach ilość mRNA dla S R E B P -1 c przewyższa odpowiednio 9- i 3-krotnie zawartość m RNA dla SREBP-la. Natomiast śledziona zawiera 10-krotnie więcej SREB P-la , aniżeli lc. W większości tkanek przeważa ekspresja białka SR E B P-la . Zawartość
kwasowe segmenty transmembranowe połączone krótką 31 -am inokwasową pętlą zwróconą do światła błon ER. N-końcowe partie białek SREBP zawierają sekwencje bogate w aminokwasy kwaśne. Sekwencje te są stosunkowo długie w S R E B P-1 a (42 am inokwasy) i SREBP-2 (48 aminokwasów), natomiast w SR E B P -lc ten odcinek jes t krótszy i zawiera 24 am i
202 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
Ryc. 1. Domeny i homologia struktury białek SREBP-la I SREBP-2 wg [18]).
nokwasy. Po odcinkach bogatych w aminokwasy kwaśne występują sekwencje bogate w prolinę, sery- nę, glicynę i glutaminę, z następującą po nich klasyczną sekwencją bHLH-Zip. Kolejne odcinki białek SREBP to dwa hydrofobowe segmenty transbłonowe przedzielone krótką sekwencją łącznikową oraz regulatorowa domena C-końca (Ryc. 1). Stopień ho- mologii między S R E B P -la i SREBP-2 jest następujący, procent identyczności dla sekwencji zawierających kwaśne aminokwasy wynosi — 33 %, dla sekwencji bHLH-Zip — 71 % i dla C-końcowej domeny regulatorowej wynosi — 49 % ( Ryc. 1) [ 18].
Domena N-końcowa SREBP po proteolitycznym odszczepieniu jes t transkrypcyjnym czynnikiem rodziny suwaka leucynowego — basic-helix-loop-he- lix-leucine-zipper (bHLH-Zip) [17-19, 21-23, 27-29, 32-36],
Motyw bHLH-Zip pośredniczy w dimeryzacji i translokacji dimeru do jąd ra komórkowego oraz wiązaniu go z regionami SRE.
IV. Mechanizm dwuetapowego procesu proteolizy białka SREBP
IV-1. SCAP — białko aktywujące proteolityczne rozszczepienie SREBP z udziałem proteaz SIP i S2P
Proces proteolizy białek SREBP zachodzi z udziałem dwóch proteaz S IP i S2P (dane o specyficzności w dalszej części artykułu) oraz przy współudziale białka SCAP(ang. cleavage activating protein). Białko SCAP uczestniczy również w trans
porcie białka SREBP o masie cząsteczkowej 125 kDa z błon ER do aparatu błon aparatu Golgiego.
SCAP jest integralnym N-glikozylowanym białkiem błonowym, zbudowanym z około 1276 aminokwasów, recyklizującym między ER i AG (Ryc. 2) [18, 21]. Po N-terminalnej, zlokalizowanej w cytosolu domenie SCAP, w ystępują na przemian hydrofobowe i hydrofilne odcinki, które tworzą osiem transmembranowych fragmentów rozdzielonych krótkimi hydrofilnymi pętlami. Hydrofilna C-końcowa domena SCAP, zlokalizowana również w cytosolu (546 aminokwasów), zawiera pięć powtarzających się sekwencji WD, które pośredniczą w interakcjach białko-białko. Odcinek obejmujący pięć z ośmiu transmembranowych sekwencji białka SCAP (domeny transbłonowe 2 -6 , pomiędzy aminokwasami 280-446) jest dom eną sensorow ą dla steroli. D omeny o podobnej strukturze w ystępują również w takich białkach jak reduktaza HM G-CoA (pomiędzy aminokwasami 57-224 białka zbudowanego z 887 aminokwasów), białka NPC-1 (Nieman-PicK typ 1, pomiędzy aminokwasami 617-691 białka zbudow anego z 1278 aminokwasów) oraz receptorze morfo- genezy Patched (pomiędzy aminokwasami 420-589 białka zawierającego 1434 aminokwasy). Wymienione odcinki sensorowe pozostają pod kontrolą steroidów, choć w reduktazie HM G-CoA nie wykazuje wrażliwości na sterole [17, 18,21 -23,27-29, 32, 37].
Zamiana jednego aminokwasu asparaginy na argi- ninę w obrębie domeny sensorowej SCAP unieczyn- nia jej rolę jako sensora steroli w komórce [2 2 ],
W spomniana już zmiana asparaginy na argininę w SCAP znosi jego aktywujący wpływ na proteazę
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 203http://rcin.org.pl
Ryc. 2. Topologia struktury białka SREBP i SCAP w obrębie błon retikulum edoplazmatycznego (wg [21], zmodyfikowane).
S1P, a w konsekwencji tej zmiany aktywność S1P utrzymuje się na stałym poziomie.
Lipidy niesterolowe jak sfingomielina [38] oraz androgeny [39], oksysterole i nienasycone kwasy tłuszczowe [40] w pływ ają zarówno na proces transkrypcji białek SREBP jak i na aktywność proteazy S1P.
Szczególnie ciekawe choć nie w pełni wyjaśnione są efekty wywołane przez sfingomielinazę w wyniku działania której następuje translokacja cholesterolu z błon plazmatycznych do ER. W odpowiedzi na potraktowanie komórek sfingom ielinazą(w warunkach hodowli tkankowych) zaobserwowano podw yższenie stężenia estrów cholesterolu z powodu aktywacji ACAT oraz zahamowanie syntezy cholesterolu w wyniku zmniejszenia aktywności reduktazy HMG-CoA; oprócz tego stwierdzono obniżenie się ilości dojrzałych form SREB P -68 w jądrach kom órkowych, co jest rezultatem ham owania proteazy S1P(38). Oksysterole w szczególności w obecności nienasyconych kwasów tłuszczowych są również silnymi inhibitorami procesu konwersji SREBP w czynniki transkrypcyjne SREB P -68 [40], Z badań nad wpływem stopnia nienasycenia kwasów tłuszczowych na proces uwalniania białek SREB P -68 w ynika, iż bardzo skutecznym inhibitorem jest kwas oleinowy C l 8:1 (A9) [40]. Według innych autorów [4 3 ] najefektywniejsze w hamowaniu uwalniania białek SREBP-68- l c są wielonienasycone kwasu
tłuszczowe, jak np. kwas arachidonowy C20:4 (A5,8’n ’i4) [4 1 ]. Efekty nienasyconych kwasówtłuszczowych dotyczą również regulacji tkankowo specyficznej ekspresji białek SREBP. W hepatocy- tach wywierają wpływ na ekspresję, natomiast w adi- pocytach pozostają bez wpływu.
Przypuszcza się również, iż proces proteolizy białek S R E B C -lc pozostaje wyłącznie pod kontrolą nienasyconych kwasów tłuszowych i jest niezależny od steroli. Proces aktywacji białek S E R B P-lc regulowany jes t także poprzez proces modyfikacji kow alencyjnej z udziałem kinazy MAP [41].
S R E B P -1 i SREBP-2 w komórkach apoptotycz- nych m ogą również ulegać proteolizie nieregulowa- nej przez sterole z udziałem proteaz cysteinowych CPP-32 i Mch-3 [16]. Znaczenie tych procesów nie zostało jeszcze wyjaśnione.
IV-2. Proces proteolizy białka SREBP błon ER I uwolnienie czynnika transkrypcyjnego SREBP-68
W warunkach niedoboru steroli w komórce białko SREBP błon ER wchodzi w interakcję z SCAP. Interakcja zachodzi pomiędzy C-końcową dom eną regulatorową SREBP i dom eną WD białka SCAP (Ryc. 3). Wytworzony kompleks SREBP-SCAP, według najnowszych doniesień [17] zostaje przetransportowany do błon AG, gdzie w dwuetapowym
204 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
1 SREBP 3 S1P 5 SREBP-68 7 DNA
2 SCAP 4 S2P 6 SRE-1 8 mRNA
Ryc. 3. Model mechanizmu proteolizy membranowego białka SREBP. Proteaza S 1P rozpoznająca kompleks SREBP-SCAP rozcina pętlę SREBP w lu- minamej części ER na dwa fragmenty. Druga proteaza S2P odcina N-terminalną partię SREBP z domeną bHLH (SREBP-68). Kolejnym etapem jest transport uwolnionego czynnika transkrypcyjnego SREBP-68 do jądra komórkowego. Dimer białka SREBP-68 aktywuje promotory SRE.
procesie proteolizy następuje uwolnienie transkryp- cyjnie aktywnego N-końcowego fragmentu o masie 68 kDa (SREBP-68). Pierwsze rozszczepienie następuje w środku pętli białka SREBP w obrębie sekwencji: Arg-Ser-Yal-L eu -S e r (RSYLS) (Ryc. 3) pom iędzy leucyną522 i seryną523, katalizowane jest przez proteazę S 1P, aktyw ow aną przez SCAP. Na tym etapie SREBP rozdzielone zostaje na dwie części, pozostaje jednak nadal związane z błoną Aparatu Golgie- go (Ryc. 3). Według niektórych autorów proces ten zachodzi również w ER [17, 18, 21, 28, 42], W kolejnym etapie, w błonach AG, druga proteaza - S2P uwalnia z połączenia z błoną N-końcowy fragment białka SREBP, tzn. właściwy, transkrypcyjnie czynny czynnik — SREBP -68 (Ryc. 3). Cięcie następuje w segmencie trans-membranowym, w obrębie sekwencji: A sp-A rg-Ser-Arg-Ile-Leu-L eu-C vs (DR- SRILLC) pomiędzy leucyną i cysteiną.
S2P jes t hydrofobową, cynkow ą metaloproteazą, natomiast S IP jes t proteazą typu subtylizyn o strukturze i właściwościach podobnych do subtylizyn bakteryjnych. Obecność S1P stwierdzono również w regionie pre-Golgi i jest ona proteazą odmienną od konwertaz prehormonów, które występują w obrębie AG i post-AG. Stąd możliwe jest, że pierwszy i drugi etap proteolizy zachodzi w regionie pre-Golgi. W/g B r o w n a i G o l d s t e i n a [21] proteaza S1P występuje w formie nieaktywnej w ER i ulega aktywacji w regionie pre-Golgi (mechanizm aktywacji nieznany).
Uwolniona, transkrypcyjnie aktywna N-końcowa domena o masie 68 kDa (SREBP-68) zostaje przeniesiona do cytosolu, skąd migruje do jądra, gdzie jako dimer wiąże się z regionami SRE (Ryc. 3) i aktywuje szereg genów enzymów szlaku biosyntezy cholesterolu, lipogenezy, receptora LDL i metabolizmu węglowodanów, geny syntazy HM G-CoA (pierwszy
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 205http://rcin.org.pl
Tabela 2
Zmiany ekspresji i uczynniania białek SREBP pod wpływem metabolitów i hormonów [na podstawie 17, 28, 31].
SREBP Czynnik mRNA Uczynnienie
SREBP-la, lc, 2 cholesterol 4 4
SREBP-la, lc, 2 oksystcrole bz 4
SREBP-2 insulina/glukoza bz bz
SREBP-lc insulina/glukoza T T
SREBP-lc glukagon, cAMP 4 4
SREBP-2 hipolipidemiczne leki T T
SREBP-1 hipolipidemiczne leki bz 4
SREBP-1wielonienasycone kwasy
tłuszczowebz 4
SREBP-2wielonienasycone kwasy
tłuszczowebz bz
T — wzrost, -i — obniżenie, bz — bez zmian
wykryty), receptora LDL, reduktazy HM G-CoA, syntazy skwalenu, syntazy farnezylodifosforanu, syntazy kwasów tłuszczowych, karboksylazy-CoA, glicerylo-3-fosfoacylotransferazy, lipazy lipoprote- inowej, kaweolin i leptyny [17, 24].
Aktywacja w/w genów wym aga jednak dodatkowo współdziałania SREBP -68 z innymi czynnikami transkrypcyjnymi [17, 21-23, 28], takimi jak N F-Y (ang. nuclear fa c to r Y), Spl lub CREB (ang. cAMP response elem ent binding protein). Dodatkowymi białkowymi koaktywatorami w ym aganymi do aktywacji transkrypcji są CBP (ang. CREB binding p ro tein), P-300 oraz ARC (ang. activa ted recruited f a c tor) lub DRIP (ang. vitam in D receptor in teracting protein) przy czym izoformy S R E B P -la i lc oraz SREBP-2 wchodzą w interakcję z odrębnymi czynnikami transkrypcyjnymi [28], co daje możliwość specyficznych tkankowo modulacji ekspesji genów i precyzyjnej kontroli ich ekspresji przez czynniki wewnątrzkomórkowe.
Transkrypcyjne czynniki z sekwencją suwaka le- ucynowego (bHLH-Zip), takie jak: Myc, Max i USP (ang. upstream stim ula tory fa c to r) zawierają argini- nę w konserwatywnym regionie i w iążą się z ram ką E D N A (5 ’-CANNTG -3 ’) [43]. SREBP -68 są szczególnymi białkami typu bHLH-Zip, ponieważ w m iejscu argininy występuje tyrozyna [43] i w związku z tym w iążą się efektywnie tylko z SRE-1. In teresującym jest fakt, że choć SREB P -68 w warunkach in vivo w iążą się również z ram ką E i w ykazują wysokie powinowactwo do niej, jednak wszystkie promotory do tej pory opisane, wrażliwe na poziom steroli regulowane są tylko poprzez promotory zawierające
SRE. Wynika to prawdopodobnie z faktu, iż interakcja z promotorami z ram ką E, nie wywołuje dostatecznej zmiany konformacji wytworzonego kom pleksu białko-DNA, dla uczynnienia transkrypcji [23, 24]. Najnowsze poglądy o oddziaływaniu czynników transkrypcyjnych SREBP- 68 z promotorami z sekwencją typu SRE i ramką E przedstawione zostały w pracach szeregu pracach [22-24].
Wydaje się, iż ramka E-box jes t rozpoznawana przez białka zawierające motyw suwaka leucynowe- go i uczynnia promotory odpowiedzialne za konstytutywną ekspresję genów szlaków biosyntezy niezależną od omawianych procesów regulowanych przez sterole z udziałem SREBP, SCAP, S1P i S2P.
Czynniki transkrypcyjne — SREBP -68 praw dopodobnie koewoluowały dla optymalizacji i uprecy- zyjnienia regulacji metabolizmu przemian cholesterolu, kwasów tłuszczowych i węglowodanów.
W artykule przedstawiono niedawno poznane podstawowe mechanizmy odbioru sygnałów o n iedoborze cholesterolu oraz konwersji integralnych białek błon retikulum endoplazmatycznego SREBP w czynniki transkrypcyje SREBP -68 uczestniczące w aktywacji genów z promotorami SRE.
Artykuł otrzymano 12 grudnia 2001 Zaakceptowano do druku 20 maja 2002
Piśmiennictwo:
1. R u s s e l l D (1992) Cardiovasc Drugs Ther 6: 103-1102. H i n s o n D D, C h a m b l i s K L, T o t h M J , T a n a k a R
D, G i b s o n K M (1997) J Lipid Res 38: 2216-22233. L a u f s U, L a F a t a V, L i a o J K (1997) J Biol Chem 272:
31725-31729
206 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
4. B e l l o s t a S, B e r n i n i F , F e r r i N, Q u a r a n t o P, C a - n a v a e s i M, A r n a b o l d i L, F u m a g a l l i R, P o a l e t t i R, C o r s i n i A (1998) Artherosclerosis 137: S I01- S I09
5. F a r c s e R V, H e r z J (1998) Trends in Genetics 14: 115-1206. F u Q , G o o d r u m J F, H a y e s C, H o s t e t t l e r J D, T o -
e w s A D, M o r e l i P (1998) J Neurochem 71: 549-5557. M a n n R K, B c a c h y P A (2000) Biochim Biophys Acta 1529:
188-2028. Y o k o y a m a S (2000) Biochim Biophys Acta 1529: 231 -2449. L o i r d i g h i N, M e n a r d D, D e l v i n E, L e v y E (1997)
Am J Physiol 273: G62-G6710. A c c a d M, F a r e s e R V (1998) Current Biology 8: R 601-R60411. B r o w n M S, G o l d s t e i n J L (1986) Science 232: 43-4712. F i e l d i n g C h J , F i e l d i n g P E (1997) J Lipid Res 38:
1503-152113. L o p e z D, C h a m b e r s C h M, N e s s G C (1997) Arch Bio-
chem Biophys 343: 118-12214. G r i f f i n M, F r a z e r A, J o h n s o n A, C o l l i n s P,
O w e n s D, T o m k i n G H (1998) Artherosclerosis 138: 313-318
15. W i e c z o r e k B, G n i o t - S z u l ż y c k a J (2000) Kosmos 49: 191-206
16. S c h o o n j a n s K , B r e n d e l C, M a n g e l s d o r f D, A u w e r x J (2000) Biochim Biophys Acta 1529: 114-125
17. E d w a r d s P A , T a b o r D, K a s t H R, V e n k a t e s w a r a n A (2000) Biochim Biophys Acta 1529: 103-113
18. B r o w n M S, G o l d s t e i n J L (1997) Cell 89: 331-34019. N o g a l s k a A, Ś w i e r c z y ń s k i J (2001) Postępy Biochemii
47: 160-16820. C h r i s t e n s o n L K, M c A l l i s t e r J M, M a r t i n K O
J a v i t N B, O s b o r n e T F, S t r a u s s I I I J F (1998)J B io l Chem 273, 30727-30735
21. B r o w n M S , G o l d s t e i n J L (1999) Proc Natl Acad Sci 96: 11041-11048
22. E d w a r d s P A, E r i c s s o n J (1999) Annu Rev Biochem 68: 157-185
2 3 . A t h a n i k a r J N , O s b o r n e T F (1998) Proc Natl Acad Sci 95:4935-4940
24. P a h 1 H L (1999) Physiological Reviews 79: 683-701
2 5 . H u a X, Y o k o y a m a C, W u J, B r i g g s M R, B r o w n M S, G o l d s t e i n J L, W a n g X (1993) Proc Natl Acad Sci 90: 11603-11607
26. T o n t o n o z P, K i m J B, G r a v e s R A, S p i e g e l m a n B M (1993) M ol Cell Biol 13: 4753-4759
27. R a w s o n R B, D e B o s e - B o y d R, G o l d s t e i n J L, B r o w n M S (1999) J Biol Chem 274: 28549-28556
28. O s b o r n e T F (2000) J Biol Chem 275: 32379-3238229. P a i J , G u r y e v O, B r o w n M S, G o l d s t e i n J L (1998)J
Biol Chem 273: 26138-2614830. M a g a n a M M, K o o S - H , T o w l e H C, O s b o r n e T F
(2000) J Biol Chem 275: 4726-47333 1 . H a n n a h V C, O u J , L u o n g A , G o l d s t e i n J L,
B r o w n M S (2001) J Biol Chem 276: 4365-437232. Hua X, Sakai J, Brown M S, Goldstein J L (1996)J B io l Chem 271:
10379-1038433. H u a X , S a k a i J , H o Y K, G o l d s t e i n J L, B r o w n M
S (1995) J Biol Chem 270: 29422-2942734. C h e n g D, E s p e n s h a d e P J , S l a u g h t e r C A, J a e n J
C, B r o w n M S, G o l d s t e i n J L (1999) J Biol Chem 274: 22805-22812
35. Y a n g T , G o l d s t e i n J L, B r o w n M S (2000) J Biol Chem 275: 29881-29886
36. S t u r l e y S L (2000) Biochim Biophys Acta 1529: 155-16337. N o h t u r f f t A, D e B o s e - B o y d R A, S c h e e k S, G o l d
s t e i n J L , B r o w n M S (1999) Proc Natl Acad Sci 96: 11235-11240
38. S c h e e k S, B r o w n M S, G o l d s t e i n J L (1997) Proc Natl Acad Sci 94: 11179-11183
3 9 . S w i n n e n J V, U l r i x W, H e y n s W, V e r h o e v e n G (1997) Proc Natl Acad Sci 94: 12975-12980
40. T h e w k e D P, P a n i n i S R, S i n e n s k y M (1998) J Biol Chem 273: 21402-21407
4 1 . M a t e r M K . , T h e l e n A P, P a n D A, J u m p D B (1999) J.Bio.Chem 274: 32725-32732
42. D u n c a n E A, B r o w n M S, G o l d s t e i n J L, S a k a i J (1997) J Biol Chem 272: 12778-12785
4 3 . P a r r a g a A, B e l l s o l e l l L, F e r r e - D ’ A m a r e A R, B u r l e y S K (1998) Structure 4 6: 661-672
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 207http://rcin.org.pl
Rola lipidów błony komórkowej w zjawisku oporności wielolekowej i jego modulacji
The role of cell membrane lipids in multidrug resistance and its modulation
KRYSTYNA MICHALAK1, ANDRZEJ B. HENDRICH2
Spis treści:
I. Oporność w ielolekowa pow stająca w w yniku działania transporterów usuwających leki z kom órki
II. Cechy budowy transporterów zw iązanych z opornością wielolekową i ich lokalizacja w błonie kom órkowej
III. Hipoteza „odkurzacza m olekularnego”IV. Rola fizycznego stanu błony w m odulacji aktyw ności
transportowej glikoproteiny PIV-1. Błona jako środowisko dla dyfuzji lekówIV-2. W pływ stanu fazow ego lipidów błonowych na pro
ces transportu lekówIV-3. Fenotiazyny jako przykład m odulatorów oporno
ści wielolekowejV. Zmiany w m etabolizm ie lipidów w kom órkach opor
nych i wpływ m odulatorów na ten m etabolizmV -l. Skład lipidowy błon kom órek nowotworowych
w ykazujących oporność w ielolekowąV-2. W pływ m odulatorów oporności w ielolekowej na
transport i m etabolizm lipidów w kom órkachVI. Proces chem ouczulania a m odyfikacja w łaściw ości fazy
lipidowej błony kom órkowejV II.Uwagi końcowe
W ykaz stosowanych skrótów: CDR1, CDR2 — transportery wielolekowe grzybów C andida albicans', CPZ — chlorproma- zyna; DPPC — dipalmitylofosfatydylocholina; DPPE — dipal- mitylofosfatydyloetanoloamina; DMPC — dimirystylofosfaty- dylocholina; DMPE — dimirystylofosfatydyloetanoloamina; LmrA — transporter wielolekowy bakterii L a c to co cu s lactis, bakteryjny homolog ludzkiej glikoproteiny P; MDR — oporność wielolekowa (ang. m u ltid ru g r e s is ta n c e ); MRP- białko związane z opornością wielolekową (ang. m u ltid ru g resis ta n ce-a sso c ia ted p ro te in ), PA — kwas fosfatydowy; P-gp — gliko- proteina P; Pdr5 — transporter z drożdży S a cch a ro m yces cerevi- sia e związany z plejotropową lekoopomością tych komórek; PS — fosfatydyloseryna; SDS — siarczan dodecylu sodu.
’Prof. dr hab., 2dr, Katedra i Zakład Biofizyki, Akademia Medyczna we Wrocławiu, ul. Chałubińskiego 10, 50-368 Wrocław, e-mail: [email protected]
Contents:
I. M ultidrug resistance generated as a result o f activity o f transporters that extrude drugs out o f cell
II. Features o f structure o f m ultidrug resistance related transporters and their localization in cell m em brane
III. “Vacuum cleaner” hypothesisIV. Role of m em brane physical state in m odulation o f P gly
coprotein transport activityIV-1. M em brane as a drug diffusion mediumIV-2. Influence o f phase state o f m em brane lipids on
process o f drug transportIV-3. Phenotiazines as an exam ple o f m ultidrug resi
stance m odulatorsV. Alterations in lipid m etabolism in resistant cells and in
fluence of m odulators on that m etabolismV -l. M em brane lipid com position o f cell m em branes o f
m ultidrug resistant cancer cellsV-2. Influence o f drug resistance m odulators on cellu
lar lipid transport and lipid m etabolismVI. Relation between chem osensitization and modification
o f properties o f cell m em brane lipid phaseV II.F inal remarks
I. Oporność wielolekowa powstająca w wyniku działania transporterów usuwających leki z komórki
Istnieje wiele różnorodnych m olekularnych m echanizmów powstawania oporności na leki w kom órkach bakterii, pasożytów, grzybów i nowotworów. Cechą charakterystyczną komórek przejawiających tzw. oporność wielo lekow ą (ang. m ultidrug resistan- ce, w skrócie — MDR) jes t brak wrażliwości na bardzo wiele leków, różniących się znacznie strukturą chemiczną. Jedną z głównych przyczyn oporności wielolekowej w przypadku nowotworów, a także p a togennych grzybów, bakterii i pasożytów, jes t aktywny transport chemoterapeutyków z wnętrza komórki przez błonę kom órkow ą do środowiska zewnątrzko- mórkowego. Za ten proces odpowiadają białka nazywane wielolekowymi transporterami (ang. m ultidrug transporters). Ekspresja transporterów, zaliczanych
208 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
do nadrodziny białek ABC (ang. A TP -binding cassette), w błonie komórek opornych jest znacznie zwiększona. Głównymi tego typu transporterami zidentyfikowanymi w komórkach nowotworowych człowieka są glikoproteina P oraz białka typu MRP (białko związane z opornością wielolekową, ang. m ultidrug resistance-associa ted pro tein ). Z kolei transportery CDR1 i CDR2 obecne w błonach patogennych drożdży Candida albicans przyczyniają się do ich oporności na leki przeciwgrzybicze. Transporter Pdr5p z drożdży piekarskich Saccharom yces cerevisiae wykazuje w swojej budowie 56% identyczności sekwencji z białkiem CDR1 z Candida a lbicans. Oba białka (Pdr5p i CDR1) posiadają wiele substratów wspólnych z glikoproteiną P, co świadczy o ich funkcjonalnym podobieństwie. Transportery usuwające leki z różnych komórek, pomimo różnic w sekwencji aminokwasowej a także w topologii, często nie tylko transportują te same substraty, ale również są podatne na działanie tych samych inhibitorów. Może to wskazywać na zbliżony mechanizm transportu i identyfikacji substratów przez różne transportery.
Transportery usuwające leki z komórek, ich substraty i inhibitory (modulatory oporności) oraz lipidy błonowe powiązane są wieloma wzajemnymi zależnościami funkcjonalnymi. Najwięcej prac na ten temat pochodzi z badań nad glikoproteiną P [ 1 ], odpowiadającą za najlepiej poznany typ oporności kom órek nowotworowych (MDR1). W wielu z nich pokazano, że transportowane leki i modulatory oporności (chemouczulacze) m ogą oddziaływać bezpośrednio z glikoproteiną P [2], wpływając na jej aktywność ATPazową. Przypuszcza się, że niektóre modulatory, takie jak werapamil lub cyklosporyna A są transportowane przez glikoproteinę P [3]. Z innych badań wynika jednak, że lipidowa faza błony ma kluczowe znaczenie zarówno dla oporności M DR wynikającej z działania glikoproteiny P, jak i dla modulacji tej oporności przez odpowiednie inhibitory [4]. Działanie chemouczulaczy może być związane zarówno z ich specyficznym wiązaniem z transporterami b łonowymi, jak i z n iespecyficzną adsorpcją do lipidowej części błony. Jednak rola lipidów w regulacji funkcji transporterów i procesie chemouczulania jes t z łożona i słabo poznana. Ponieważ substraty transporterów oraz modulatory oporności są na ogół hydrofobowe, a leki prawdopodobnie są przenoszone przez białko transportujące z dwuwarstwy lipidowej, a nie z fazy wodnej [5, 6], lipidowe otoczenie musi mieć ważny wpływ na oddziaływanie leków z glikoproteiną P. Określenie roli fazy lipidowej jes t ważne dla zrozumienia mechanizmu działania i funkcji trans
porterów związanych z MDR. Należy rozpatrzyć oddziaływania glikoproteina P-lipidy błonowe oraz li- pidy-leki (substraty i modulatory). Dotychczas najwięcej prac na temat możliwej roli fazy lipidowej błony komórkowej oraz poszczególnych rodzajów lipidów w zjawisku oporności wielolekowej przeprowadzono w układach modelowych: liposomach i proteoliposomach, w których rekonstytuowano glikoproteinę P [7-9]. Chociaż układy takie są uproszczonym modelem błony biologicznej, to jednak badania nad dobrze zdefiniowanymi strukturami lipidowymi zawierającymi oczyszczoną glikoproteinę P, w noszą ważne informacje na temat oddziaływań tego białka z lipidami. Lipidy o różnej strukturze i właściwościach m ogą modulować działanie glikoproteiny P, a także mogą wpływać na wiązanie transportowanego leku z białkiem. Zróżnicowany skład lipidowy błon komórkowych w różnych typach komórek może powodować zależność aktywności glikoproteiny P od rodzaju tkanki. Odrębnym ciekawym zagadnieniem jest przypuszczalna rola glikoproteiny P w transporcie lipidów w komórce [10]. Taka funkcja glikoproteiny P wiązałaby to białko z wieloma procesami komórkowymi, z uwagi na udział lipidów i ich metabolitów w przekazywaniu sygnałów w komórce (np. szlak poprzez pochodne fosfatydyloinozytolu lub sfingolipidów).
II. Cechy budowy transporterów związanych z opornością wielolekową i ich lokalizacja w błonie komórkowej
Pewne fragmenty sekwencji aminokwasowej różnych białek błonowych korzystających z energii ATP przy usuwaniu leków z komórek wykazują znaczne podobieństwo strukturalne i najprawdopodobniej funkcjonalne. Ze względu na te podobieństwa om awiane tranportery zaliczane są (razem z kilkuset innymi białkami) do jednej wspólnej nadrodziny białek ABC [11]. Cechami wspólnymi białek z tej nadrodziny jes t występowanie w ich strukturze domen wiążących nukleotydy (ang. nucleotide binding domain — NBD) oraz obecność domen transbłono- wych. Domeny takie posiada także w swojej strukturze glikoproteina P. Jak pokazano na rycinie 1, glikoproteina P zawiera dwie domeny wiążące ATP ulokowane w pętlach znajdujących się po cytoplazmatycz- nej stronie błony oraz dwie domeny transbłonowe, z których każda składa się z sześciu segmentów [ 1 2 , 13]. Obecność domen transbłonowych wskazuje, że glikoproteina P (podobnie jak inne transportery) jest integralnym białkiem błonowym, a co za tym idzie
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 209http://rcin.org.pl
Miejsca glikozylacji Domeny transbłonowe
Cytoplazma Domenawiążącanukleotydy
Miejscafosforylacji
Ryc. 1. Schemat struktury glikoproteiny P jako przykład budowy wielolekowego transportera.
stan fizyczny otoczenia lipidowego może wpływać na jego zdolność do transportowania leków.
W transporterach usuwających leki z komórki, d o meny zaangażowane w wiązanie leków są przypuszczalnie zlokalizowane w segmentach transbłono- wych tych białek integralnych, jak to wykazano w przypadku glikoproteiny P [14]. W związku z tym jest bardzo prawdopodobne, że oddziaływanie leku z fazą lipidową będzie wpływać na oddziaływanie gli- koproteina P-lek, co z kolei będzie mieć istotne znaczenie dla transportu leku przez to białko.
Prosta rola lipidów błonowych, jak ą jes t tworzenie amfipatycznej dwuwarstwy otaczającej komórki i organelle oraz blokującej przepływ hydrofitowych związków, nie wym agałaby tak dużej różnorodności lipidów, jaka występuje w błonach biologicznych. Badania prowadzone w ostatnich latach zaczynają wyjaśniać niektóre konsekwencje funkcjonalne hete- rogenności lipidów. Jedną z nich jes t możliwość n ieprzypadkowego mieszania się lipidów w dwuwar- stwie i tworzenie lipidowych m ikrodom en [15], w y raźnie różniących się składem od swojego otoczenia i odpornych na rozpuszczanie detergentami. Istnienie takich mikrodomen, zawierających dużą ilość cholesterolu i glikosfingolipidów [16] wykazano w błonach komórek wielu typów — np. erytrocytów [17], komórek nabłonka [18], kom órek mięśniowych [19] czy neuronów [20]. M ikrodom eny m ogą tw orzyć w błonie tzw. „tratwy lipidowe” (ang. lip id ra- f t s ) oraz silnie zakrzywione wgłębienia zwane kawe- olami [21]. Trwałość tych wgłębień jes t stabilizow ana m.in. przez integralne białko błonowe zwane ka- weoliną, które wiąże cholesterol i oddziałuje z innymi białkami obecnymi w kaweolach [22]. Schemat błony zawierającej zarówno „tratwy lipidow e” , jak i kaweole przedstawiony jes t na rycinie 2. Przypuszcza się, że struktury tego typu m ogą uczestniczyć zarówno w procesach przekazywania sygnałów, jak i w
gospodarce lipidowej [23, 24]. M ikrodomeny mogą być miejscem skupiania się białek zaangażowanych w określony proces [25, 26]. Istnieją też przesłanki by sądzić, iż glikoproteina P jes t tego typu białkiem i znaczna jej część jes t ulokowana w błonie właśnie w strukturach typu caveolae [27, 28].
III. Hipoteza „odkurzacza molekularnego”
Wiadomo, że glikoproteina P jest białkiem o szerokiej substratowej specyficzności [29]. Wydaje się, że jedyną wspólną cechą transportowanych substancji, jak też chemouczulaczy, jest ich stosunkowo duża hydrofobowość. Leki przeciwnowotworowe oraz leki stosowane do zwalczania chorób infekcyjnych, a także inhibitory transporterów związanych z MDR, należą najczęściej do związków o znacznej hydrofobowości i przem ieszczają się przez błonę z zewnątrzkomórkowego do wewnątrzkomórkowego środowiska w wyniku biernej dyfuzji (na skutek istnienia gradientu ich potencjału chemicznego lub elektrochemicznego przez błonę) [30, 31].
Wiele dowodów eksperymentalnych wskazuje na to, że glikoproteina P rozpoznaje swoje substraty, gdy znajdują się one w błonie komórkowej. D ow odzi tego między innymi eksperyment, w którym p o kazano przeniesienie energii z daunorubicyny (fluoryzujący substrat glikoproteiny P), na światłoczułą pochodną azydkow ą (azydek jodonaftalenu), którym znakowane było to białko transportujące [6], O od działywaniu substratów z transporterem we wnętrzu błony świadczą również wyniki badań nad transportem znaczników fluorescencyjnych przez błony, w których występowały takie transportery jak glikoproteina P lub transporter LmrA bakterii Lactococ- cus lactis. Wykazano, że estry acetoksymetylowe niektórych znaczników fluorescencyjnych będące substratami badanych transporterów są usuwane z
210 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
Tratwa lipidowa
Kaweolina
Tratwa lipidowa
g Sfingolipid o Cholesterol
KaweolaRyc. 2. Domeny lipidowe typu tratwa lipidowa oraz kaweola.
błon zanim osiągną cytoplazmę, w której byłyby hy- drolizowane przez wewnątrzkomórkowe esterazy [32, 33]. Ostatnio wykryto ciekawe cechy struktury białka oporności wielolekowej w komórkach Bacil- lus subtillis, w trakcie badań nad czynnikiem tran- skrypcyjnym BmrR, który po związaniu leku indukuje ekspresję transportera Bmr. Stwierdzono, że cechą charakterystyczną struktury Bmr jest obecność dużej hydrofobowej kieszeni [34], co prawdopodobnie jest bardzo istotne dla możliwości rozpoznawania wielu strukturalnie różnych związków przez jedno białko.
Hydrofobowa natura substratów i eksperymentalne dowody, że rozpoznawanie substratu ma miejsce na poziomie transbłonowych segmentów glikoprote- iny P prowadzi do hipotezy działania tego białka jako hydrofobowego „odkurzacza m olekularnego” . Zgodnie z tą koncepcją, glikoproteina P (oraz najprawdopodobniej również inne transportery odpowiedzialne za MDR) „w yciąga” leki bezpośrednio z błony i transportuje je aktywnie na zewnątrz komórki [6]. Pomimo, że istnieje jeszcze kilka innych hipotez dotyczących sposobu działania glikoproteiny P, hipotezę odkurzacza molekularnego potwierdzają w yniki licznych najnowszych prac eksperymentalnych [35].
Na rycinie 3 przedstawiony jes t schemat działania wielolekowego transportera oraz przypuszczalna rola, jaką mogą pełnić związki przyczyniające się do modulacji jego zdolności transportowej. Zgodnie z tym modelem cząsteczki leku, biernie przenikające przez błonę w kierunku cytoplazmy, są wiązane przez białko w obrębie hydrofobowej części dwu- warstwy lipidowej i następnie dzięki energii pochodzącej z hydrolizy ATP są transportowane z p o wrotem na zewnątrz komórki. Zdolność transportowa białka może zostać zmniejszona hipotetycznie na kilka sposobów:
— wszelkie zmiany właściwości fazy lipidowej błony, traktowanej jako środowisko, w którym zachodzi dyfuzja leku, m ogą zmieniać praw dopodobieństwo kontaktu lek-białko,
— zmiany właściwości środowiska lipidowego, w którym zanurzone jes t białko mogą wpływać na jego zdolności transportowe,
— miejsca wiążące leki m ogą zostać bezpośrednio zablokowane cząsteczkami związków działających jako chemouczulacze,
— cząsteczki chemouczulaczy mogą oddziaływać z białkiem transportującym i indukować zmiany konformacji białka, zmieniając jednocześnie jego zdolność do wiązania leków.Hipoteza „molekularnego odkurzacza” pozwala
na wyjaśnienie roli, jak ą w modulacji oporności w ielolekowej oraz w regulacji różnych funkcji wielole- kowych transporterów pełni faza lipidowa błon. Jak pokazano poniżej, istnieje wiele faktów doświadczalnych bezpośrednio lub pośrednio potwierdzających słuszność tego modelu.
IV. Rola fizycznego stanu błony wmodulacji aktywności transportowej glikoproteiny P
IV-1. Błona jako środowisko dla dyfuzji leków
Zarówno substraty glikoproteiny P jak i chem ouczulacze mają bardzo często charakter lipofilowych słabych zasad. Przenikanie tego typu hydrofobowych cząsteczek przez błonę zależy od błonowego współczynnika podziału pom iędzy fazą w odną i lipidową. Dyfuzja i lokalizacja w błonie zależą od wielu parametrów, takich jak właściwości struktury lipidowej (typ główki polarnej, struktura łańcuchów kw asów tłuszczowych, stan fizyczny dwuwarstwy) i
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 211http://rcin.org.pl
Chemouczulacz©
Cząsteczka leku związana z miejscem wiążącym
Chemouczulacz blokujący miejsce wiążące
CytoplazmaMiejsce wiążące zmodyfikowane przez chemouczulacz
Ryc. 3. Schemat działania „odkurzacza molekularnego”.
skład wodnego roztworu otaczającego dwuwarstwę. Zasadowe leki m ogą ponadto występować w dwóch różnych formach — neutralnej i dodatnio naładow anej (protonowanej). Te dwie postacie cząsteczek prawdopodobnie m ają różne współczynniki podziału i różną lokalizację w lipidowej dwuwarstwie. S tężenie każdej z form przy powierzchni błony zależy nie tylko od pH i jonow ego składu fazy wodnej, ale rów nież od właściwości biofizycznych granicy faz (interfazy), takich jak lokalna stała dielektryczna czy potencjał błonowy. W formie nienaładowanej związki te łatwo przenikają przez błonę lipidową, forma protonowana w niewielkim stopniu wnika do błony. Natomiast trwale naładowane leki kationowe mają często taką strukturę, że ładunek jes t zdelokali- zowany lub osłonięty lipofilowymi resztami, co ułatwia ich dyfuzję przez błony.
Obserwowana w ypadkowa szybkość transportu przez błonę zawierającą glikoproteinę P jes t w ynikiem dwóch procesów: aktywnego transportu do środowiska zewnętrznego oraz biernej dyfuzji zgodnie z gradientem stężenia. Rolę biernej dyfuzji leków w błonach komórek z opornością M DR potwierdza zależność pomiędzy lipofilnością cząsteczek a ich efektywnością w charakterze chemouczulaczy, co wykazano na przykładzie homologicznej serii p ro stych, aromatycznych związków [36]. W cytowanej pracy pokazano, że istnieje granica lipofilności, po niżej której komórki nie reagują na cząsteczki che- mouczulacza.
Oddziaływanie chemouczulaczy z dwuwarstwami lipidowymi badano między innymi w przypadku fe- notiazyn, leków należących do środków psychotropowych, będących równocześnie efektywnymi m o
dulatorami MDR. Pokazano, że chloropromazyna (CPZ), amfipatyczny kationowy lek z tej grupy związków wbudowuje się w lipidową dwuwarstwę liposomów ze współczynnikiem podziału zależnym od długości acylowego łańcucha lipidu i zab u rza ją w sposób zależny od fosfolipidowej grupy polarnej [37]. Wykazano również, że powierzchnia przypadająca w błonie na cząsteczkę fosfatydyloseryny (PS) ulega podwojeniu, gdy chloropromazyna w budowuje się do liposomów. Wpływ chloropromazyny na błony utworzone z mieszaniny lipidów DPPC/DM PC, które nie niosą ładunku elektrycznego netto jes t niewielki i wskazuje na słabe oddziaływanie chloropromazyny z nienaładowanymi cząsteczkami fosfolipidów [37],
Rola protonowania w oddziaływaniach modulatorów M DR z błonami badana była w przypadku innego reprezentanta fenotiazyn — trifluoperazyny. W ykazano, że postać neutralna tego leku, jako bardziej hydrofobowa, lepiej wbudowuje się w błony erytrocytów [38].
Chemouczulacze mogą wpływać na wiązanie substratów glikoproteiny P z błoną oraz na ich dyfuzję przez błonę. Wykazano to na przykładzie werapamilu (inhibitor glikoproteiny P), który zwiększa szybkość dyfuzji doksorubicyny (substrat glikoproteiny P) przez błony liposomów [30]. Chemouczulacze mogą zatem zwiększać szybkość wpływu substratów glikoproteiny P do komórki na drodze biernej dyfuzji, co dzięki skróceniu czasu pobytu leku w błonie pozwala tym ostatnim na „ucieczkę” przed wypompowaniem przez ten transporter. Dzięki temu stężenie leku wewnątrz komórki staje się większe. Stwierdzono, że niektóre modulatory — kationowe leki lipofilne —
212 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
mają zdolność do indukowania przepływu barwnika (,Sulphan blue) poprzez błony jednowarstwowych pęcherzyków formowanych z ujemnie naładowanych lipidów [39]. Indukowanie tego przepływu pod wpływem poszczególnych związków zwiększało się znacznie ze wzrostem współczynnika podziału okta- nol/bufor. Zmianę przepuszczalności liposomów pod wpływem kilku chemouczulaczy (rezerpiny, werapa- milu, chininy i kolchicyny) wykazano również badając wpływ tych substancji na bierny transport znacznika fluorescencyjnego — karboksyfluoresce- iny [40]. Modulatory mogą indukować w błonach modelowych powstawanie lipidowej nie dwuwarstwowej fazy heksagonalnej Hn [41]. Wśród znanych wcześniej czynników, które wpływają na przejścia dwuwarstwa — struktury nie dwuwarstwowe są: temperatura, skład lipidowy, lokalne anestetyki i kationy dwuwartościowe. Wykazano, że chloropromazyna, chemouczulacz z grupy fenotiazyn, może indukować powstawanie fazy Hu w błonach modelowych zawierających kwas fosfatydowy (PA) [41].
Rozpatrując związek pomiędzy strukturą leków a ich zdolnością do wiązania się z białkami błonowymi, trzeba wziąć pod uwagę lokalne otoczenie lipidowe, w którym wiązanie takie zachodzi. Przy wyznaczaniu stałej dysocjacji K d lek-białko transportujące należy rozważyć stężenie leku w dwuwarstwie lipidowej błony [42], Obserwując wiązanie leków z oczyszczoną glikoproteiną P w obecności różnych fosfolipidów, stwierdzono, że w przypadku winbla- styny stała dysocjacji Kd lek-białko transportujące zmienia się znacznie w zależności od otoczenia lipidowego [43]. Zmiany stałej K d m ogą odzwierciedlać różnice w zdolności leków do wbudowyw ania się do fazy lipidowej. Powinowactwo wiązania winblasty- ny z glikoproteiną P jes t odwrotnie proporcjonalne do współczynnika podziału tego leku pomiędzy fazą wodną a lipidową. Glikoproteiną P w rzeczywistości „widzi” swoje substraty umieszczone w lipidowej dwuwarstwie. Białko to może mieć stosunkowo niskie powinowactwo do swoich substratów, ale jes t to kompensowane przez lipidową dwuwarstwę, która koncentruje leki, „prezentując” je białku.
W przypadku oddziaływań lek-błona małe m odyfikacje w strukturze związków (substratów P gliko- proteiny) należących do tej samej rodziny chemicznej mogą prowadzić do istotnej zmiany oddziaływań z lipidową dwuwarstwą, co zaobserwowano na przykład w przypadku antracyklin [44], Różna lokalizacja i współczynnik podziału w błonie mogą z kolei zmieniać dostęp leku do miejsca wiązania z białkiem lub spowodować związanie się leku z innym fragmentem białka.
IV-2. W pływ stanu fazowego lipidów błonowych na proces transportu leków
Z uwagi na zanurzenie wielolekowych transporterów w środowisku lipidowym błony, oraz ze względu na hydrofobowość ich substratów, wydaje się oczywiste, że fosfolipidy m uszą odgrywać ważną rolę w modulowaniu zarówno ATPazowej aktywności, jak i transportowych właściwości glikoproteiny P.
Integralne białka błonowe w ym agają zwykle dla swojej funkcjonalnej aktywności minimalnej liczby zasocjowanych z nimi fosfolipidów. ATPazowa aktywność glikoproteiny P zostaje zniesiona przy całkowitym usunięciu jej lipidowego otoczenia za pom ocą Tritonu X-100 lub deoksycholanu [45]. Ponowne umieszczenie uprzednio wyizolowanej glikoproteiny P w otoczeniu różnych fosfolipidów przywraca aktywność tego białka w różnym stopniu, np. azolektyna — mieszanina fosfolipidów z ziaren soi przywraca 84% pierwotnej aktywności, fosfatydylo- cholina z żółtek ja ja kurzego — 95%, a stosunkowo płynny w pokojowej temperaturze, syntetyczny lipid — dimirystylofosfatydylocholina (DMPC) — 62%. W przeciwieństwie do tego lipidy o wysokiej tem peraturze topnienia takie jak: dipalmitylofosfatydylo- cholina (DPPC), dimirystylofosfatydyloetanoloami- na (DMPE) czy dipalmitylofosfatydyloetanoloamina (DPPE) nie przywracają glikoproteinie P jej aktywności. W temperaturze pokojowej, a więc takiej w j a kiej prowadzono powyższe eksperymenty, lipidy te znajdują się w stanie żelu i cechują się stosunkowo małą płynnością. Dane te wskazują, że glikoproteiną P dla swojej aktywności ATPazowej potrzebuje w najbliższym otoczeniu obecności fosfolipidów charakteryzujących się dużą płynnością.
Wiadomo, że na płynność dwuwarstwy lipidowej duży wpływ m ogą wywierać nawet sublityczne ilości działających na nią detergentów. Już w latach siedemdziesiątych stwierdzono, że Tween 80 może uczulać na leki komórki oporne [46]. Kilka niejonowych detergentów, w szczególności z grupy poliok- syetylenów moduluje cytotoksyczność i/lub akum ulację związków przeciwnowotworowych w opornych komórkach nowotworowych. Przyjmuje się, że w odwracaniu oporności M DR przez detergenty ma znaczenie ich wpływ na fazę lipidową błony, chociaż możliwe jes t również specyficzne oddziaływanie z glikoproteiną P.
W innych badaniach [47] wykazano, że lipidy są zdolne nie tylko do przywracania katalitycznej aktywności po uprzedniej delipidacji detergentem, ale również do ochrony glikoproteiny P przed termiczną inaktywacją. Pokazano, że przed inaktywacją najle
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 213http://rcin.org.pl
piej chronią fosfatydyloetanoloaminy (PE) z nasyconymi łańcuchami — dimirystylofosfatydyloetanolo- amina (DMPE) i dipalmitylofosfatydyloetanoloami- na (DPPE).
Aktywność glikoproteiny P wydaje się szczególnie wrażliwa na rodzaj i stan fizyczny dwuwarstwy lipidowej w całej objętości błony (nie tylko w najbliższym otoczeniu białka). Egzogenne fosfolipidy m odulują ATPazową aktywność glikoproteiny P. O bserwowano inhibicję jej ATPazowej aktywności przy wzroście płynności lipidowej dwuwarstwy. Zależność ATPazowej aktywności glikoproteiny P od składu lipidowego w całej objętości błony może odzwierciedlać zmiany konformacyjne indukowane w transbłonowej części glikoproteiny P w danym środowisku lipidowym, przenoszone następnie do miejsc wiązania ATP. Wrażliwość ATPazowych domen glikoproteiny P na stan fazowy dwuwarstwy, w którą białko jes t wbudowane [45] pozwala sądzić, że domeny te m ogą być ściśle zasocjowane z dwu- warstwą lipidową. Zależność aktywności glikoproteiny P od płynności otaczającej j ą dwuwarstwy lipidowej odbiega od zwykle obserwowanej dla innych transporterów. W przypadku wielu pomp i enzymów energia aktywacji jes t mniejsza, gdy dwuwarstwa lipidowa, w której są zanurzone, znajduje się w fazie ciekłokrystalicznej. Glikoproteina P natomiast efektywniej hydrolizuje ATP, gdy jes t wbudowana w dwuwarstwę będącą w stanie żelu. Stan fazowy wpływa również na szybkość pom powania leków i jest ona większa w stanie żelu [45]. Wykazano, że dodanie związku upłynniającego dwuwarstwę (alkohol benzylowy) powoduje 2-4 krotne zmniejszenie zdolności glikoproteiny P do transportu daunorubi- cyny i winblastyny [48]. Wzrost zdolności transportowych glikoproteiny P w obecności mniej płynnych lipidów jest cechą zadziwiającą. Większość b łonowych białek transportujących efektywniej działa w otoczeniu lipidów w fazie płynnej, a kilka z nich traci zdolność transportową, gdy lipidowa matryca jes t w stanie żelu. Glikoproteina P jes t zatem niezwykłym transporterem, którego funkcja jes t m odulowana przez lipidy w nieznany dotąd sposób. M odulujący wpływ na aktywność glikoproteiny P może wywierać cholesterol. Lipid ten może wpływać na funkcję białka błonowego przez zmianę fizycznych właściwości lipidowej dwuwarstwy (w całej jej objętości) lub przez działanie przy interfazie li- pid-białko. Inne transportery ABC zaangażowane w M DR np. w Candida albicans i Saccharom yces ce- rivisiae są również wrażliwe na skład lipidowego otoczenia, a w szczególności na zawartość cholesterolu [49,50].
IV-3. Fenotiazyny jako przykład modulatorów oporności wielolekowej
Fenotiazyny oddzia łu ją z receptorami komórek układu nerwowego, m.in. z receptorami dopamino- wymi i receptorami serotoniny. Ostatnio wykazano również, że chloroprom azyna silnie hamuje prądy postsynaptyczne w yw ołane w iązaniem kwasu y-aminom asłowego (GA BA ) z jego receptorem [51]. Fenotiazyny oddziału ją również z białkami tworzącymi kanały jonow e w błonach, na przykład z kanałami potasowym i i sodowymi. Oprócz tego jednak fenotiazyny, tioksanteny i związki podobne do nich strukturalnie są szczególnie silnymi m odulatorami MDR, co w ykazano w kilku opornych liniach kom órek now otw orow ych [52-54], Istotny wpływ na zdolność ham ow ania przez nie transportowej aktywności g likoproteiny P m ają następujące właściwości strukturalne: hydrofobowy trójcy- kliczny pierścień, dodatnio naładow ana trzeciorzędowa amina oraz wprow adzenie reszty aminowej do formy cyklicznej [55, 56]. Analiza zdolności do re dukcji oporności w ielolekowej przez 232 fenotiazyny w opornych mysich kom órkach białaczkowych P388/DOX potw ierdziła istotność wymienionych cech strukturalnych [57]. Wykazano, że jedna z fe- notiazyn — trifluoperazyna — oprócz tego, że hamuje aktywność pom pow ania leków przez gliko- proteinę P w kom órkach nowotworow ych, jes t rów nież inhibitorem transportu rodaminy 6G (substrat glikoproteiny P) przez białko Pdr5p — funkcjonalny hom olog glikoproteiny P z drożdży piekarskich Saccharom yces cerevisiae [58], Okazało się, że wiele zw iązków mających zdolność odwracania oporności w ielolekowej w kom órkach now otw orowych, a także wiele leków przeciwnowotworo- wych, jes t silnymi inhibitorami transportu rodam iny 6G przez Pdr5p. W skazuje to na funkcjonalne podobieństw o pom iędzy glikoproteiną P a Pdr5p [58].
W przypadku modulowania oporności wielolekowej przez fenotiazyny i ich pochodne, a także inne chemouczulacze, ich wpływ na właściwości lipidowej fazy błony może mieć istotny wkład do molekularnych m echanizmów redukcji oporności wielolekowej. Fenotiazyny wywierają istotny wpływ na dwuwarstwę lipidową, jak wykazano to między innymi w badaniach własnych autorów pracy. W pływają one na płynność lipidów błonowych w błonach m odelowych i naturalnych [59], obniżają temperaturę i entalpię przejścia fazowego żel-ciekły kryształ oraz m ogą indukować separację faz w układach lipidowych [60].
214 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
V. Zmiany w metabolizmie lipidów w komórkach opornych i wpływ modulatorów na ten metabolizm
V -l. Skład lipidowy błon komórek nowotworowych wykazujących oporność wielolekową
W komórkach linii wyselekcjonowanych poprzez ekspozycję na leki cytotoksyczne obserwuje się zmiany w składzie lipidowym błon plazmatycznych. M ogą to być zmiany w zawartości neutralnych lipidów, fosfolipidów lub kwasów tłuszczowych [61-63]. Trudno jednoznacznie określić, czy obserwowane modyfikacje struktury lipidów błonowych są związane z nadekspresją glikoproteiny P, czy też są niezależną konsekw encją procedury selekcyjnej poprzez ekspozycję komórek na leki [64], M etabolizm lipidów w komórkach nowotworów różnych typów jest na ogół zaburzony, a rozwój oporności może pogłębiać te zaburzenia [65].
Zmiany w składzie lipidowym błon towarzyszące pojawieniu się oporności na leki są różne w różnych komórkach. Na przykład w komórkach P388 mysiej białaczki, wyselekcjonowanych za pom ocą adriamy- cyny, stwierdzono zwiększone ilości fosfatydylo- choliny oraz sfingomieliny [66], Użycie dipiridamo- lu zamiast adriamycyny prowadziło do zwiększenia ilości fosfatydyloseryny i zmniejszenia ilości fosfa- tydyloetanoloaminy w komórkach P388. W tym samym rodzaju komórek selekcjonowanych za pom ocą daunomycyny stwierdzono natomiast zmniejszoną ilość fosfatydyloseryny [67].
Przy zastosowaniu jądrow ego rezonansu m agnetycznego 'H N M R zaobserwow ano różnice pom iędzy fragmentami widma pochodzącymi od lipidów w przypadku komórek K562 wrażliwych i opornych na działanie adriamycyny [64]. Natężenie sygnału p o chodzącego od kwasów tłuszczowych było znacznie wyższe w komórkach wrażliwych niż w opornych. W komórkach opornych stwierdzono wzrost natężenia sygnałów pochodzących od fosfatydyloinozytolu i cholesterolu. Wzrost zawartości zarówno cholesterolu, jak i fosfolipidów wykryto także w lekoopor- nych białaczkowych limfoblastach T, wyselekcjonowanych za pom ocą winblastyny [68].
W nowotworow ych komórkach opornych na leki obserwuje się również znacznie zmieniony m etabolizm ceramidów i glikolipidów (przede wszystkim glikosfingolipidów) w porównaniu z komórkami nie wykazującymi oporności [21,77], co również wpływa na występowanie różnic w składzie lipidowym błon komórek wrażliwych i opornych.
V-2. W pływ modulatorów lekooporności natransport i metabolizm lipidów w komórkach
Chemouczulanie komórek opornych może prow adzić do zmian w ilości niektórych fosfolipidów w komórkach, jak to stwierdzono w komórkach P388 [66]. W reakcji na działanie leków odwracających oporność komórek, takich jak: werapamil, tamoksy- fen i dipirydamol stwierdzono wzrost syntezy fosfa- tydylocholiny w komórkach opornych i brak takich zmian w komórkach wrażliwych na leki.
Niektóre modulatory oporności wielolekowej wpływają na szlaki metaboliczne lipidów; przykładem takim m ogą być tamoksyfen, werapamil i cyklosporyna A, które ham ują glikozylację cerami- du. Zmiany w biosyntezie lipidów pod wpływem m odulatorów dotyczą na ogół właśnie glikolipidów i sfingolipidów. PCS833, silny chemouczulacz będący pochodną cyklosporyny, aktywuje syntezę ceramidu i zwiększa jednocześnie wrażliwość kom órek nowotworowych (KBV1) na winblastynę [69]. Chloropromazyna działając na komórki wywiera wpływ na enzymatyczne przemiany kwaśnych fosfolipidów. Jednak nie da się wytłumaczyć wszystkich obserwowanych zmian jedynie poprzez bezpośrednie oddziaływanie modulatora z enzymami katalizującymi poszczególne etapy przemian. Jest bardziej prawdopodobne, że chloropromazyna wpływa na fizyczne rozmieszczenie substratów w stosunku do enzymów w błonie, przy czym zjawisko to określane jes t jako prezentacja substratu [37].
Na kolejne istotne powiązania pomiędzy w ystępowaniem oporności z nadekspresją w błonie kom órkowej glikoproteiny P a lipidami wskazuje zdolność glikoproteiny P do transportu lipidów [70], Nie w iadomo, czy lipidy z długimi łańcuchami reszt kwasów tłuszczowych są transportowane przez glikoproteinę P, wykazano natomiast, że glikoproteina P transportuje krótkołańcuchowe analogi fosfolipidów, akumu- lując je w zewnętrznej warstewce dwuwarstwy lipidowej [71]. Glikoproteina P transportuje również krótkołańcuchowe analogi sfingomieliny i glukozy- loceramidu [77]. Podobne obserwacje poczyniono również w przypadku innych transporterów odpowiadających za oporność w ielolekową np. w kom órkach drożdży — w transport lipidów są praw dopodobnie zaangażowane transportery Pdr5, Yorlp, CDR1 [72],
Niektóre badania wskazują, że glikoproteina P może brać także udział w transporcie steroli z błony plazmatycznej do retikulum endoplazmatycznego, kontrolując estryfikację cholesterolu i jego biosynte
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 215http://rcin.org.pl
zę [73, 74]. Sterole często są substratami glikoproteiny P bądź modulatorami MDR. W ykazano, że określone mutacje w strukturze glikoproteiny P prow adzą do utraty jej zdolności do rozpoznaw ania steroli i ich transportu [75, 76],
VI. Proces chemouczulania a modyfikacja właściwości fazy lipidowej błony komórkowej
M odulatory M D R dzia ła ją często poprzez specy ficzne ham ow anie g likoproteiny P [3, 56]. L ip id o wa faza błony nie może jednakże być pom inię ta w badaniach nad m echanizm em dzia łan ia m odu la to rów. Chinidyna i ira^s-f lupen tik so l są bardziej ak tywne jako modulatory M D R niż ich odpowiednie stereoizomery. Taką stereospecyficzność związków chiralnych przypisuje się zw ykle specyficzności wiązania s tereoizom erów z określonym i miejscam i w łańcuchach peptydow ych białek. Jednakże ob y dwa stereoizomery f lupentiksolu ( tra n s - i cis-) w równym stopniu ham ują przy łączanie azydopiny do glikoproteiny P, co przem aw ia p rzeciw ko różnym m iejscom wiązania tych izom erów w cząsteczce transportera. Za pom ocą jąd row ego rezonansu m agnetycznego i skaningowej kalorym etrii różn icowej w ykazano natomiast, że trans- i c /s-f lupenti- ksol m ogą oddziaływać z lipidami, fosfa tydylocho- liną i fosfa tydyloseryną w sposób zależny od ich stereoizomerii [78]. Fakt ten p rzem aw ia za ko n iecznością uwzględnienia roli oddzia ływ ania m odu la to rów M DR z lipidami w procesie chem ouczulan ia komórek.
Modulatory oporności wielolekowej ze względu na swoją hydrofobowość w nikają do lipidowej dwu- warstwy błony i oddziałują z jej składnikami. N ie zbędne jest dokładne poznanie lokalizacji m odulatorów w błonie oraz dyfuzyjnych charakterystyk w badanym układzie. Łatwość wnikania do błony jest istotnym warunkiem rozpoznania substratów, czy też przypominających je inhibitorów, przez transportery związane z opornością w ielo lekow ą MDR. W ykazano na przykład korelację pom iędzy hydrofobow ością modulatorów transportera Pdr5p a ich stężeniem hamującym do połowy aktywność tej pompy [58]. Wiele danych doświadczalnych wskazuje na związek pomiędzy hydrofobow ością m odulatorów z ich zdolnością do odwracania oporności w ielo lekowej komórek nowotworow ych [79].
Nadekspresja glikoproteiny P wraz ze wszystkimi jej skutkami, jak na przykład zaburzenia w strukturze i funkcji błony, jes t jedynie jednym z elementów ple- jotropowych zmian obserwowanych w opornych ko
mórkach nowotworowych. Opracowanie strategii postępowania mającej na celu zwiększenie skuteczności chemioterapii w ym aga zrozumienia m olekularnych podstaw tych plejotropowych zmian w błonach komórek opornych. N ależą tu m.in. zmiany przepuszczalności, składu lipidowego lub stanu fazowego lipidów błon komórkowych.
Rekonstytucja oczyszczonej glikoproteiny P w pęcherzykach lipidowych o określonym składzie wpływa na przejścia fazowe w znacznej liczbie otaczających j ą lipidów, co pokazano m etodą skaningowej kalorymetrii różnicowej [43]. Ze wzrostem zawartości glikoproteiny P w błonie, następuje przesunięcie temperatury przejścia fazowego lipidów w stronę niższych temperatur oraz znaczne obniżenie kooperatywności topnienia lipidu, czyli zm niejszenie tej frakcji cząsteczek lipidowych, które jednocześnie podlegają przejściu fazowemu. Pokazano, że wbudowaniu P-gp do liposomów towarzyszy wzrost płynności błony i zwiększenie jej przepuszczalności Efekty te są częściowo zmniejszane przez obecność w błonie cholesterolu — zwiększanie jego zawartości w błonie do 30% wagowych wywołuje zm niejszenie płynności dwuwarstwy lipidowej oraz jej p rzepuszczalności [80],
W przypadku silnie opornych komórek, w których glikoproteina P stanowi ponad 20% białka b łonow ego, zaburzenie fazy lipidowej wywołane jej obecnością wpływa silnie na biofizyczne właściwości lipidowej dwuwarstwy, co z kolei może zmieniać transportowe funkcje glikoproteiny P [43],
Stosując znaczniki fluorescencyjne, wykazano [82], że gęstość upakowania zewnętrznej monowar- stwy lipidowej błony plazmatycznej jes t znacznie większa w komórkach opornych niż w komórkach wrażliwych. Obecność glikoproteiny P prowadzi wprawdzie do zmiany upakowania lipidów błonowych, lecz nie zaobserwowano zmian całkowitej mi- krolepkości błony.
Niektóre chemouczulacze zwiększają cytotok- syczność i akumulację czynników przeciwnowotwo- rowych w określonych liniach komórkowych nie w ykazujących oporności lub w komórkach z M D R nie wykazujących ekspresji glikoproteiny P. Takie działanie m odulatorów można, przynajmniej częściowo, wiązać ze zmianami metabolizmu lipidowego lub/i niezależnymi zmianami właściwości błon np: płynności czy przepuszczalności. Wykazano, że zdolność niektórych związków do modulowania M DR jest skorelowana z ich zdolnością do indukowania wypływu rodaminy 6G z liposomów oraz hamowania wiązania tego znacznika z błoną, a także z ich zdolnością do oddziaływania z anionowym deter
216 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
gentem SDS [83], W wielu badaniach wykazano, że chemouczulacz mogą albo zwiększać albo zm niejszać uporządkowanie lipidów w błonach komórek z opornością M DR łub w izolowanych frakcjach błonowych.
Modyfikacja składu lipidowego błony może uczulać komórki oporne bez specyficznej inhibicji gliko- proteiny P. Udowodniono, że związki lub warunki hodowli komórek, które modyfikują właściwości lipidowej dwuwarstwy, uczulają komórki oporne, przywracając akumulację przez nie leków [84], W ykazano, że liposomy m ogą przywracać akumulację winblastyny w kom órkach opornych i przyjmuje się, że efekt ten pochodzi z modyfikacji lipidowego składu błony komórkowej w wyniku fuzji z liposo- mami.
Rolę stanu fizycznego lipidów błonowych w redukcji oporności wielolekowej w liniach komórek nowotworowych wykazano przy wykorzystaniu w ażnej klinicznie klasy nietoksycznych surfaktantów, takich jak: Solutol HS-15, Tween 40 lub Cremophor EL. Surfaktanty te obniżają płynność lipidów błonowych i może to być ważny mechanizm niwelowania oporności przez te polioksyetylenowe związki [85].
Zaobserwowano, że zdolność do zmiany biofi- zycznych właściwości błony przez niektóre substancje wiąże się często z inhibicją wzrostu komórek opornych w ich obecności [86], Określone warunki hodowli i niektóre substancje są bardziej toksyczne dla komórek z opornością w ielo lekow ą niż dla w rażliwych linii rodzimych. Zjawisko to, nazwane hy- per- lub kolateralną wrażliwością, wykryto w kom órkach opornych w obecności werapamilu, lokalnych anestetyków, detergentów i długołańcuchowych n ienasyconych kwasów tłuszczowych [81]. Ponieważ stwierdzono, że wśród tych związków są też takie, które nie oddziałują bezpośrednio z glikoproteiną P, można sądzić, że kolateralna wrażliwość może być spowodowana przez ich wpływ na przykład na przepuszczalność błony.
VI. Uwagi końcowe
Podsumowując, można stwierdzić, że istotna rola lipidowej fazy błony plazmatycznej w zjawisku oporności wielolekowej i jego modulacji wynika z kilku przyczyn:— związki transportowane przez glikoproteinę P
oraz modulatory oporności są substancjami o znacznej hydrofobowości, a ich transport do komórki zachodzi drogą biernej dyfuzji poprzez dwuwarstwę lipidową, zgodnie z gradientem p o
tencjału chemicznego lub elektrochemicznego [3 0 ,3 1 ] ,
— zgodnie z h ipotezą „molekularnego odkurzacza” leki usuwane są z komórki bezpośrednio z dw uwarstwy lipidowej błony plazmatycznej [5, 6],
— otoczenie lipidowe glikoproteiny P (i innych transporterów usuwających leki z komórki) jest czynnikiem regulującym aktywność ATPazową i transportow ą tego białka [87],
— oporność wielolekową komórek nowotworowych wiąże się często ze zmienionym metabolizmem lipidów w komórce, co w pływa na zmianę składu lipidowego błon komórek opornych w porów naniu z komórkami wrażliwymi [64, 68].
— glikoproteiną P bierze prawdopodobnie udział w transporcie lipidów, w tym cholesterolu, w komórce [75, 76].
— nadekspresja transporterów błonowych pow odujących lekooporność może zmieniać biofizycz- ne właściwości błony, takie jak przepuszczalność lub płynność lipidów błonowych [88],
— istnieje związek pomiędzy rozmieszczeniem glikoproteiny P w błonie, a niedawno odkrytą strukturą dom enow ą błon komórkowych, w której w ażną rolę odgryw ają m.in. glikosfingolipidy [21].
— modulatory oporności wielolekowej modyfikują biofizyczne właściwości błony komórkowej, takie jak przepuszczalność błon, płynność lipidów błonowych, właściwości przejść fazowych lipidów błonowych, co może być jednym z m echanizmów m odulowania oporności wielolekowej [41].
— niektóre modulatory, takie jak werapamil czy chloropromazyna, wyw ierają wpływ na m etabolizm lipidów komórkowych, co znajduje odzwierciedlenie w składzie błon plazmatycznych kom órek opornych [89].Badania dyfuzji w błonach m odelowych oraz od
działywania substratów glikoproteiny P i chemo- uczulaczy z lipidami, a także badania zależności p o m iędzy funkcjonowaniem transportera leków a jego oddziaływaniem z fazą lipidow ą błony komórkowej, powinny przyczynić się do odkrycia sposobów redukcji oporności wielolekowej w różnych typach komórek, umożliwiając w przyszłości skuteczniejszą chemioterapię. Zagadnienia te są również istotne w przypadku oporności wielolekowej wywołanej nad- ekspresją w błonach komórek nowotworowych innych transporterów, na przykład typu MRP.
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 217http://rcin.org.pl
Podziękowanie
Niniejsza praca została sfinansowana z funduszy grantu KBN No. 6 P05A 01221.
Artykuł otrzymano 12 lutego 2001 Zaakceptowano do druku 20 maja 2002
Piśmiennictwo
1. G o t t e s m a n M M , A m b u d k a r S V, C o r n w e l l M M , P a s t a n I, G e r m a n U A (1996) W : S c h u l t z S G (red) M olecular Biology o f Membrane Transport Disorders, Plenum Press, New York, 243-257
2. S t e i n W (1997) Physiol Rev 77: 545-5903. S p o e l s t r a E C , W e s t e r h o f f H V , P i n e d o H M , D e k -
k e r H, L a n k e l m a J (1994) Eur J Biochem 221: 363-3734. F e r t e J (2000) Eur J Biochem 267: 277-2945. A l t e n b e r g G A , V a n o y e C G , H o r t o n J K , R e u s s L
(1994) Proc Nat Acad Sci USA 91: 4564-46576. Raviv Y, Pollard HB, Bruggemann EP, Pastan I, Gottesman MM
(1990) J Biol Chem 265: 3975-39807. A w a s t h i S, S h a r m a R, A w a s t h i Y C , B e l l i J A ,
F r e n k e l P (1992) Cancer Lett 63: 109-1168. U r b a t s c h I L , S e n i o r A E (1995) Arch Bioch Biophys 316:
135-1409. R o m s i c k i Y, S h a r o m F J (1998) Eur J Biochem 256:
170-1781 0 . B e v e r s E M , C o m f u r i s P, D e k k e r s D W C , Z w a a l
R F A (1999) Biochim Biophys Acta 1439: 317-33011. B a r t o s z G (1998) Post Bioch 44: 136-14912. B o s c h I, C r o o p J (1996) Biochim Biophys Acta 1288:
F37-F5413. L o o T W , C l a r k e D M (1999) Biochim Biophys Acta 1461:
315-32514. L o o T W , C l a r k e D M (1999) J Biol Chem 274:35388-3539215. F i e l d i n g C h J , F i e l d i n g P E (2000) Biochim Biophys Acta
1529: 210-22216. B r o w n D A , L o n d o n E (1997) Biochem Biophys Res Com-
mun 240: 1-717. Y u J, F i s c h m a n D A , S t e c k T L (1973)7 Supramol Struct
3: 233-24818. F i e d l e r K, K o b a y a s h i T , K u r z c h a l i a T V , S i m o n s
K (1993) Biochemistry 32: 6365-637319. C h a n g W - J , Y i n g Y - S , R o t h b e r g K G , H o o p e r
N M , T u r n e r A J , G a m b l i e l H A , D e G r u n z b u r g J, M u m b y S M , G i l m a n A G , A n d e r s o n R G W (1 9 9 4 )7 Cell Biol 126: 127-138
20. M o s s D J , W h i t e C A (1992) Eur J Cell Biol 57: 59-6521. L a v i e Y , F i u c c i G, L i s c o v i t c h M (1998) 7 Biol Chem
273: 32380-3238322. L i s c o v i t c h M , L a v i e Y (2000) Trends Biochem Sci 25:
530-53423. H a r d e r T, S i m o n s K (1997) Curr Opinion Cell Biol 9:
534-54224. W a n g T Y , S i l v i u s J R (2000) Biophys J 79: 1478-148925. B r o w n D A , L o n d o n E (1998) J Membrane Biol 164:
103-1142 6 . K u r z c h a l i a T V , P a r t o n R G (1999) Curr Opinion Cell Biol
11: 424-43127. L a v i e Y, F i u c c i G, C z a r n y M, L i s c o v i t c h M (1999)
Lipids 34: S57-S6328. D e m e u l e M, J o d o i n J, G i n g r a s D, B e l i v e a u R
(2000) FEBS Lett 466: 219-22429. P a w a g i A B , W a n g J , S i l v e r m a n M, R e i t h m e i e r
R A F , D e b e r C M (1994) 7 Molec Biol 235: 554-56430. S p e e l m a n s G, S t a f f h o r s t R W H M , d e W o l f F A , d e
K r u i j f f B (1995) Biochim Biophys Acta 1238: 137-146
3 1 . E y t a n G D , R e g e v R, O r e n G, A s s a r a f Y G (1996)7 Biol Chem 271: 12897-12902
32. H o m o l y a L, H o l l o Z, G e r m a n n U A , P a s t a n I, G o t t e s m a n M M , S a r k a d i B (1993) 7 Biol Chem 268: 21493-21496
3 3 . B o l h u i s H, v a n V e e n H W , M o l e n a a r D, P o o l m a n B, D r i e s s e n A J M , K o n i n g s W N (1996) EMBO 7 15: 4239-4245
34. Z h e l e z n o v a E E , M a r k h a m P N , N e y f a k h A A , B r e n n a n R G (1999) Cell 96: 353-362
35. L u P , L iu R , S h a r o m F J (2001) Eur J Biochem 268: 1687-1697
36. D e l l i n g e r M, P r e s s m a n B C , C a l d e r o n - H i g g i n - s o n C, S a v a r a j N , T a p i e r o H, K o l o n i a s D, L a m - p i d i s T J (1992) Cancer Res 52: 6385-6389
37. N e r d a l S A , G u n d e r s e n V, T h o r s e n H, H o i l a n d H, H o 1 m s e n H (2000) Biochim Biophys Acta 1464: 165-175.
3 8 . M a l h e i r o s S V, d e P a u l a E , M e i r e l l e s N C (1998) Biochim Biophys Acta 1373: 332-340
39. C a s t a i n g M, B r o u a n t P, L o i s e a u A, S a n t e l - l i - R o u v i e r C h , S a n t e l l i M, A 1 b e r t - F r a n c o S, M a h a m o u d A, B a r b e J (2000) 7 Pharm Pharmacol 52: 289-296
40. D r o r i S, E y t a n G D , A s s a r a f Y G (1995) Eur 7 Biochem 228: 1020-1029
4 1 . V e r k l e i j A J , d e M a a g d R, L e u n i s s e n - B i j v e 11 J, d e K r u i j f f B (1982) Biochim Biophys Acta 684: 255-262
42. M a s o n R P , R h o d e s D G , H e r b e t t e L G (1991) 7 Med C h e m 3 4 : 8 6 9 - 8 7 7
4 3 . S h a r o m F J , L i u R, R o m s i c k i Y (1998) Biochem Cell Biol 76: 695-708
44. L a m p i d i s T J , K o l o n i a s D, P o d o n a T, I s r a e l M, S a f a A R , L o t h s t e i n L, S a v a r a j N N , T a p i e r o H, P r i e b e W (1997) Biochemistry 36: 2679-2685
45. S h a r o m FJ (1997) Biochem Soc Trans 25: 1088-109646. R i e h m J , B i e d l e r L (1972) Cancer Res 32: 1195-120047. D o i g e C A , Y u X, S h a r o m FJ (1993) Biochim Biophys
Acta 1146: 65-724 8 . S i n i c r o p e F A , D u d e j a P K , B i s s o n n e t t e B M ,
S a f a A R , B r a s i t u s T A (1992) 7 Biol Chem 267: 24995- 25002
49. K r i s h n a m u r t h y S S , P r a s a d R (1999) FEMS Microbiol Lett 173: 475-481
50. K a u r R, B a c k h a w a t A K (1999) Microbiol 145: 809-81851. M o z r z y m a s J W , B a r b e r i s A, M i c h a l a k K, C h e r u
bi n i E (1999) J Neuroscience 19: 2474-24885 2 . M o l n a r J , H e v e r A, F a k l a I , F i s c h e r J, O c s o v s k i
I , A s z a l o s A (1997) Anticancer Res 17: 481-48653. M o l n a r J , S z a b o D, M a n d i Y, M u c s i I, F i s c h e r J,
V a r g a A, K ö n i g S, M o t o h a s h i N (1998) Anticancer Res 18: 3033-3038
54. M o t o h a s h i N , K u r i h a r a T, K a w a s e M, H e v e r A, T a n a k a M, S z a b o D, N a c s a J, Y a m a n a k a W, K e r i m A, M o l n a r J (1997) Anticancer Res 17: 3537-3543.
55 . F o r d J M , P r o z i a l e c k W C , H a i t W N (1988) Molec Pharmacol 35: 105-115
56. F o r d J M , H a i t W N (1990) Pharmacol Rev 42: 155-19957. R a m u N, R a m u A (1992) Cancer Chemother Pharmacol 30:
165-17358. K o 1 a c z k o w s k i M, C y b u 1 a r z - K o ł a c z k o w s k a A,
Ł u c z y ń s k i J , W i t e k S, G o f f e a u A (1998) Microbiol Drug Resistance 4: 143-158
59. M i c h a l a k K, B o b r o w s k a - H a g e r s t r a n d M, H a g e r s t r a n d H, P o ł a A, M o l n a r J (1999) W \ 6th International Conference on Methods and Applications o f Fluorescence Spectroscopy, 12-15 September 1999, Paris
60. H e n d r i c h A B , W e s o ł o w s k a O, M i c h a l a k K (2001) Biochim Biophys Acta 1510: 414-425
61. A 1 o n N , B u s c h e R, T u m m l e r B, R i o r d a n J R (1991) W: R o n i n s o n , I B (red), Molecular and Cellular Biology’ o f Multidrug Resistance in Tumor Cells. Plenum Press, New York, str.
62. W r i g h t L C , D y n e M, H o l m e s K T , M o u n t f o r d C E (1985) Biochim Biophys Res Commun 133: 539-545
218 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
63. R a m u A, G l ä u b i g e r D, W e i n t r a u b H (1984) Cancer Treat Rep 68: 637-641
64. Le M o y e c L, T a t o u d R, D e g e o r g e s A, C a l a b r e s - s e C, B a u z a G, E u g e n e M, C a l v o F (1996) Cancer Res 56: 3461-3467
65. K u 1 i s z k i e w i c z - J a n u s M, B a c z y ń s k i S, M i c h a l a k K (1996) W: P o d o F (red) Eurospin Annual 1995-1996, Roma, str. 224-226
66. R a m u A, R a m u N , R o s a r i o L M (1991) Biochem Pharmacol 41: 1455-1461
6 7 . E s c r i b a P V , F e r r e r - M o n t e i 1 A V , F e r r a g u t J A , G o n z a l e z - R o s J M (1990) Biochemistry 29: 2775-2782
68. M a y G L , W r i g h t L C , D y n e M, M a c k i n n o n W B , F o x R M , M o u n t f o r d C E (1988)/«/ JC ancerA l: 728-733.
6 9 . C a b o t M C , G i u l i a n o A E , H a n T, L i u Y (1999) Cancer Res 59: 880-885
70 . H i g g i n s C F , G o t t e s m a n M M (1992) Trends Biochem Sci 17: 18-21
7 1 . R a g g e r s R J , v a n H e l v o o r t A, E v e r s R, v a n M e e r G (1999) J Cell Science 112: 415-422
72 . D o g r a S, K r i s h n a m u r t h y S, G u p t a V, D i x i t B L , G u p t a C M , S a n g l a r d D, P r a s a d R (1999) Yeast 15: 111-121
7 3 . D e b r y P, N a s h E A , N e k l a s o n D W , M e t h e r a l l J E(1997) J Biol Chem 272: 1026-1031
74. M e t h e r a l J E , Li H, W a u g h K (1996) J Biol Chem 271: 2634-2640
7 5 . B o s c h I, D a n u s s i - J o a n n o p o u 1 o s K, W u R L , F u r l o n g S T , C r o o p J (1997) Biochemistry, 36: 5685-5694
76. V o Q D , G r u o l D J (1999) J B io l Chem 274:20318-2032777. L a v i e Y, C a o H, B ü r s t e n S I , G i u l i a n o A E , C a b o t
M C (1996) J Biol Chem 271: 19530-1953678. P a j e v a I K , W i e s e M, C o r d e s H - P , S e y d e l J K
(1996) J Cancer Res Clin Oncol 122: 27-40.79 . B a r n e s K M , D i c k s t e i n B, C u t l e r G B J r , F o j o T ,
B a t e s S E (1996) Biochemistry 35: 4820-482780. R o t h i e A, T h e r o n D, S o c e n e a n t u L, M a r t i n C,
T r a i k i a M , B e r r i d g e G, H i g g i n s C F , D e v a u x P F , C a l l a g h a n R (2001) Eur Biophys J 30: 430-442
81. C a l l a g h a n R, R i o r d a n J R (1995) Biochim Biophys Acta 1236: 155-162
82. L o e D W , S h a r o m F J (1993) Br J Cancer 68: 342-3518 3 . W a d k i n s R M , H o u g h t o n P J (1993) Biochim Biophys Acta
1153: 225-23684. W a r r e n L, J a r d i l l i e r J C , M a l a r s k a A, A k e l i M G
(1992) Cancer Res 52: 3241-32458 5 . D u d e j a P K , A n d e r s o n K M , H a r r i s J S , B u c k i n
g h a m L, C o o n J S (\995) Arch Biochem Biophys 319: 309-31586. C a l l a g h a n R, S t a f f o r d A, E p a n d R M (1993) Biochim
Biophys Acta 1175: 277-28287. R e g e v R, A s s a r a f Y G , E y t a n D G (1999) Eur J Biochem
259: 18-248 8 . R i n t o u l D A , C e n t e r M S (1984) Cancer Res 44:4978-498089. L a v i e Y, C a o H T , V o l n e r A, L u c c i A, H a n T Y ,
G e f f e n V, G i u l i a n o A E , C a b o t M C (1997) J Biol Chem 272: 1682-1687
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 219http://rcin.org.pl
Receptory nukleotydowe
Nucleotide receptors
EDYTA GENDASZEWSKA-DARMACH
Spis treści:
I. Klasyfikacja receptorów nukleotydowychII. Źródła zew nątrzkom órkow ych nukleotydówIII. Agonisty i antagonisty receptorów nukleotydowychIV. Przekazywanie sygnałów za pośrednictw em receptorów
nukleotydowychV. Rozm ieszczenie receptorów nukleotydowych — znacze
nie fizjologiczneV -l. Układ sercow o-naczyniowyV-2. Układ oddechowyV-3. Układ nerwowy
VI. Podsum owanie
Contents:
I. C lassification of nucleotide receptorsII. Sources of extracellular nucleotidesIII. Agonists and antagonists o f nucleotide receptorsIV. Signal transduction mediated by nucleotide receptorsV. Distribution of nucleotide receptors — physiological si
gnificanceV -l. Cardiovascular systemV-2. Pulm onary systemV-3. Nervous system
VI. Sum m ary
W ykaz stosowanych skrótów: AMPS — adenozyno-5’-tiofo- sforan; Bz-ATP — 2 ’ lub 3’-0-(4-benzoilobenzoil)ATP; CFTR — transbłonowy regulator mukowiscydozy; GPCR — receptor błonowy sprzężony z białkami G; IL — interleukina; IP3 — ino- zytolo-l,4,5-trifosforan; IUPHAR — Międzynarodowa Unia Farmakologiczna; KN-62 — l-[N,0-bis(5-izochinolinosulfo- nylo)-N-metylo-L-tyrozylo]-4-fenylopiperazyna; LG1C — kanały jonowe regulowane przez ligandy; LPS — lipopolisacha- ryd; MAPK — kinaza białkowa aktywowana przez czynniki mi- togenne; a,p-MeATP — a,P-metylenoATP; 2-MeSATP — 2-metylotioATP; MRS 2179 — N6-metylo-2’-deoksyadeno- zyno-3’,5’-bisfosforan; NECA — 5’-N-etylokarboksyamido- adenozyna; NOS — syntaza tlenku azotu; PLA2 — fosfolipaza A2; PLC — fosfolipaza C; PPADS — fosforan 2 ’,4’-disulfo- no-6-azofenylopirydoksalu; TNF — czynnik martwicy nowotworu; TNP-ATP — 2 ’,3’-0-(2,4,6-trinitrofenylo)ATP.
I. Klasyfikacja receptorów nukleotydowych
Nukleotydy obecne wewnątrz komórek odgrywają kluczową rolę w procesach metabolicznych, syntezie kwasów nukleinowych oraz regulacji aktywności wielu enzymów. Nukleotydy i nukleozydy uczestniczą również w przekazywaniu sygnałów ze środowiska zewnętrznego do wnętrza komórki za pośrednictwem specyficznych receptorów. Najwięcej danych dotyczy aktywności trifosforanu adenozyny,
Mgr, Polska Akademia Nauk, Centrum Badań Molekularnych i Makromolekularnych, Zakład Chemii Bioorganicznej, ul. Sienkiewicza 112, 90-363 Łódź, e-mail: [email protected]
który jes t uwalniany do środowiska zewnątrzko- mórkowego m. in. przez neurony, płytki krwi oraz komórki śródbłonka i reguluje takie procesy biologiczne, jak agregacja płytek krwi, przekaźnictwo nerwowe, czynności serca czy skurcze mięśni. ATP występujący w środowisku zewnątrzkomórkowym może być ligandem receptorów P2, lub może podlegać szybkiej degradacji przez ekto-ATPazy i ektonu- kleotydazy. Ostatecznym produktem tych przemian jest adenozyna — ligand receptorów klasy PI [ 1 ]. W 1999 roku wykazano, że ATP może być również w y korzystywany jako dawca grup fosforanowych w procesie katalizowanym przez ektokinazy [2], W końcu lat osiemdziesiątych okazało się, że uwalniane nukleotydy urydylowe mogą także aktywow ać receptory P2 [3], Co więcej, zidentyfikowano również receptory, które mogą być aktywowane przez wszystkie naturalnie występujące trifosforany nu- kleozydów [4, 5]. Od kilku lat zaczęły pojawiać się prace o podobnym działaniu modyfikowanych mo- nonukleotydów. Zaobserwowano, że 2-heksylotio- AMP może pełnić funkcję agonisty receptora klasy P2Y szczurzych komórek glejaka i erytrocytów indyka [6]. Receptory pewnego typu ( P 2 Y n ) obecne m. in. na powierzchni komórek linii HL 60 [7], ludzkich komórek gwiaździaka 1321N1 i kom órek chomika CHO-K1 [8] mogą natomiast podlegać aktywacji przez adenozyno-5’-tiofosforan (AMPS). Przeprowadzone badania sugerują, że także deoksyadenozy- no-5 ’-tiofosforan, deoksyguanozyno-5 ’-tiofosforan i tym idyno-5 ’-tiofosforan mogą wpływać na prolife
220 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
rację komórek poprzez interakcje z receptorami nu- kleotydowymi [9],
W 1978 roku B u r n s t o c k zaproponował klasyfikację receptorów purynergicznych, wyróżniając dwie główne klasy: receptory PI aktywowane przez adenozynę i receptory P2, wykazujące powinowactwo do ATP lub ADP [10]. Obecna klasyfikacja receptorów nukleotydowych P2 opiera się przede wszystkim na kryterium struktury pierwszorzędowej. Wyparła ona stosowany do niedawana podział uwzględniający jedynie charakterystykę farmakologiczną (powinowactwo do określonych ligandów nukleotydowych). Zgodnie z zaleceniami Komitetu do spraw Nazewnictwa Receptorów i Klasyfikacji Leków Międzynarodowej Unii Farmakologicznej (ang. In ternational Union o f Pharm acology — IUPHAR) wyróżnia się dwie grupy receptorów P2: sprzężone z białkami G receptory P2Y oraz jonotropow e receptory P2X. Dotychczas sklonowano cDNA sześciu ludzkich receptorów P2Y (P2Y,, P2Y 2, P2Y4, P2Y6, P 2Y tl i P 2 Y !2) oraz siedmiu receptorów P2X (P 2 X i.7) pochodzących z komórek innych ssaków (Tabela 1). Liczby (1-n) oznaczają kolejność k lonowania cDNA poszczególnych receptorów. Do grupy receptorów P2Y zalicza się receptory aktywowane przez trifosforany nukleozydów (P 2Y [ — P2Yj i), receptory obecne na płytkach krwi aktywowane selektywnie przez ADP (P 2Y )2) oraz receptory aktywowane przez diadenozynotetrafosforan (P2YAP4A) (nazwy pisane kursywą oznaczają, że dotychczas nie sklonowano cDNA tych receptorów). W literaturze można jeszcze spotkać poprzednie nazwy receptorów, kiedy nie znano sekwencji DNA kodujących receptory poszczególnych typów tzn. P2U (obecnie P2Y2), P2Z (obecnie P2X7), P 2 Y adp, P2YAC, P 2 Y c y c , P 2 T ac (obecnie P 2 Y 12) oraz P2 D (obecnie P2YAP4A). Poza tym, zgodnie z zaleceniami IUPHAR mała litera umieszczona przed nazwą receptora wskazuje pochodzenie receptora: h — ludzki, m — mysi, r — szczurzy, b — bydlęcy, t — wyizolowany z indyka, c — z kurczęcia, x — z X enopus laevis.
II. Źródła zewnątrzkomórkowych nukleotydów
Stężenie ATP w środowisku zewnątrzkomórko- wym utrzymuje się na bardzo niskim poziomie, mimo wysokiego stężenia tego nukleotydu w cyto- plazmie (3-5 mM). Wynika to z faktu, że dwuwar- stwa lipidowa błony komórkowej jes t nieprzepuszczalna dla ATP i MgATP (podstawowa forma w cyto- plazmie). Nukleotydy mogą być uwalniane do środowiska zewnątrzkomórkowego w wyniku uszkodze
nia i nagłej śmierci komórki, co zdarza się przy pęknięciu naczyń krwionośnych lub innych urazach tkanek. Poza tym są one uwalniane w procesach nie związanych z lizą komórki: w wyniku egzocytozy nukleotydów nagromadzonych w ziarnistościach i pęcherzykach wydzielniczych lub w wyniku transportu przez kanały i pory błony komórkowej. U w olnione na zewnątrz komórki nukleotydy są szybko hy- drolizowane przez ekto-ATPazy, a następnie ektonu- kleotydazy. Dlatego podwyższone stężenie zew nątrzkomórkowych nukleotydów jest zjawiskiem przejściowym i ma miejsce po zadziałaniu określonych czynników stymulujących. Większość agoni- stów aktywujących płytki krwi (m.in. trombina, epi- nefryna, kolagen, ADP) powoduje również degranu- lację ich ziarnistości i w konsekwencji wzrost stężenia ATP w surowicy do około 50 pM [1]. Stwierdzono, że ATP może być również uwalniany do środowiska zewnętrznego bezpośrednio z cytoplazmy. W przypadku komórek śródbłonka naczyń krwionośnych ma to miejsce pod wpływem m.in. stresu fizjologicznego (np. niedotlenienie) i związków chemicznych (trypsyna, trombina, epinefryna), a nawet stresu mechanicznego [ 1 1 ].
III. Agonisty i antagonisty receptorów nukleotydowych
Głównym problemem w badaniach nad charakterystyką farm akologiczną receptorów nukleotydowych jes t brak wysoce specyficznych agonistów i antagonistów oraz jednoczesne występowanie receptorów różnych podklas na tych samych komórkach.
Biorąc pod uw agę właściwości farmakologiczne, można wyróżnić trzy duże klasy receptorów P2X. Są to po pierwsze receptory P2X] i P2X3, które charakteryzuje wysokie powinowactwo do ATP (EC50 ~ 1//M), po drugie receptory P2X 2, P2X4, P2X 5 i P2X 6
o mniejszym powinowactwie do ATP (EC5o ~ 10 //M), po trzecie receptory o bardzo niskim pow inowactwie do ATP (EC 50 ~ 300-400 //M ), jak np. receptor P2X 7 [12], Z kolei receptory P2Y wykazują zróżnicowane powinowactwo do nukleotydów pury- nowych i pirymidynowych. PŻY^ podobnie jak P2 Y 11 i P2Y i2, je s t określany jako purynospecyficz- ny receptor adeninowy. Receptor P2Y 2 posiada podobną selektywność w stosunku do ATP i UTP. R eceptorami pirymidynospecyficznymi są p2y3 i P2Y 6
wykazujące wysokie powinowactwo do UDP, a także receptor P2Y 4 aktywowany preferencyjnie przez UTP [13, 14], Z kolei receptor p2y8, wyizolowany z Xenopus laevis [5], a także ptasi receptor tp2y [4] mogą być aktywowane z podobną selektywnością
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 221http://rcin.org.pl
Tabela 1
Wykaz receptorów P2 i właściwości farmakologiczne [20]
Poprzednianazwa
Pochodzenie wyizolowanegoTyp receptora receptora /liczba aminokwasów
w białkuGłówne Ugandy
P2X, człowiek (hP2X,)/h399 szczur (rP2X|)/r399
mysz (mP2X|)/m399
BzATP>2-MeSATP>ATP>a,[3-MeATP
P2Xj szczur (rP2X2)/r472 2-MeSATP>ATP
P2Xj człowiek (hP2X3)/h397
szczur (rP2X3)/r397
BzATP>2-MeSATP>ATP>a,p-MeATP
P2X4 człowiek (hP2X4)/h388
szczur (rP2X4)/r388
mysz (mP2X4)/m388
ATP>2-MeSATP>a,P-MeATP
P2XS człowiek (hP2X5)/h422
szczur (rP2X5)/r455
ATP>2-MeSATP>ADP
P2X6 człowiek (hP2X6)/h431
szczur (rP2X5)/r379
mysz (mP2X6)/m379
ATP>2-MeSATP>ADP
P2X7 P2Z człowiek (hP2X7)/h595 szczur (rP2X7)/r595
BzATP>ATP
P2Y, człowiek (hP2Y|)/h373
szczur (rP2Y ,)/r373
mysz (mP2Y|)/m373
kurczak (cP2Y 1)
krowa (bP2Y 1)
indyk (tP2Y,)
2-MeSATP>ATP=ADP
P2Y2 P2U człowiek (hP2Y2)/li377 szczur (rP2Y2)/r374
mysz (mP2Y2)/m373
ATP=UTP>2-McSATP
p2y3* kurczak (cp2y3/c328) ADP>UTP>ATP?
P2Y4 człowiek (hP2Y4)/h365
szczur (rP2Y4)/r361 UTP=UDP>ATP=ADP
P2Y6 człowiek (hP2Y6)/h328
szczur (rP2Y6)/r328 UTP>ADP=2-MeSATP>ATP
p2y«* Xenopus laevis (xp2y8/x532) ATP=ITP=UTP=CTP
P2Y„ człowiek (hP2Yn)/h371 ATP>2-MeSATP>ADP
P2Y12 P2YADp,P2Y Ac,P2T ac,P2Y cyc człowiek (hP2Y |2)/h342 ADP
P2YAp4A** P2D człowiek (hP2YAp4A) AP4A
*Zgodnie z zaleceniam i IUPHAR, m ałymi literam i oznaczono receptory, których charakterystykę ustalono na podstawie klonowania cDNA nie pochodzącego z kom órek ssaków (brak danych na temat występow ania w kom órkach ludzkich i pełnionej funkcji).**Receptory pisane kursyw ą oznaczają, że ustalono ich w łaściw ości farm akologiczne, ale do tej pory nie sklonowano cDNA
przez wszystkie trifosforany nukleozydów. Receptor p 2 y7 został niedawno zidentyfikowany jako receptor leukotrienu B4 i de fa c to nie należy go zaliczać do grupy receptorów nukleotydowych, podobnie jak receptorów p2y5, P2Y 9 i P2Yio [15, 16].
W badaniach nad funkcjonowaniem receptorów nukleotydowych zazwyczaj wyko-rzystywane są analogi ATP i U T P Są to m. in. 2 ’- lub 3 ’-0 -(4 -ben- zoilobenzoil)-ATP (Bz-ATP), a,p-m etylenoA TP (a,P-MeATP) lub 2-metylotioATP (MeSATP). Nadal jednak brak jes t związków, które działałyby w spo
sób selektywny na receptory podklas P2X lub P2Y. Bz-ATP, który do niedawna stosowany był jako selektywny agonista receptora P2X 7 (EC50 ~ 18 pM), okazał się także skuteczny w aktywowaniu receptorów P 2 X[ (EC50 « 1,9 nM) i P2X 3 (E C 50 * 98 nM) [12].
Wśród antagonistów receptorów nukleotydowych najbardziej rozpowszechnionymi są suramina (lek stosowany w leczeniu trypanosomii), PPADS (sól sodowa fosforanu 2 ’,4’-disulfono-6-azofenylopiryd- oksalu) oraz barwniki takie jak reaktywny błękit 2 ,
222 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
błękit trypanu, reaktywna czerwień. Jednakże związki te nie wykazują na tyle wysokiej selektywności, aby mogły być wykorzystywane do selekcji poszczególnych podklas receptorów nukleotydo- wych. Suramina jest antagonistą zarówno receptorów P2X, jak i P2Y, a poza tym hamuje aktywność innych receptorów (nikotynowego, glutaminianowe- go, GABA i 5-hydroksytryptaminy) [17]. Z kolei PPADS — niekompetycyjny inhibitor receptorów
O O oo - i- o - i —O -i'—o
O' o' o" ■ y źHO OH
O O O*J o -ILo - i -o - i 1-
I - • - I -0 0 0
o o o # 11 J °-l-°-l|-o-pl-o 0 ,
o" o" o ' x y
MKS2179V
<U.J
iQ°> n- C X O - n°<
NO,
T N P A T P
VICHO
H° s A p o / ' 0' ll,>Ht c
H J O . S ^ ^ ^ S O, Na
NC H,
0 , 0 ^ > c H [ H — CO —N ^ ) ^ )
R yc.l. Wzory strukturalne niektórych agonistów (I i II) oraz antagonistów receptorów nukleotydowych (III-VII)
P2X może również znosić odpowiedź kom órkową wywołaną za pośrednictwem niektórych receptorów P2Y [12]. W i 1 e y i w s p. wprowadzili nowy, selektywny bloker receptora P2X 7 oznaczony jako KN-62 ( l - [N ,0 -b is (5 - iz o c h in o l in o s u lfo n y lo ) -N -m e ty lo - L-tyrozylo]-4-fenylopiperazyna), znany wcześniej jako inhibitor kinazy zależnej od kalmoduliny, działający w stężeniach nanomolarnych (IC50 « 9 -1 3 nM) [12, 17]. Selektywnym antagonistą receptora P2X 7 jest również błękit Coomassie [17]. Z kolei TNP-ATP (2 ’,3 ’-0-(2,4,6-trinitrofenylo)A TP) jest przykładem antagonisty receptorów P2X], P2X 2 i
P2 X 2/3. TNP-GTP wykazuje podobne właściwości, co sugeruje, że w oddziaływaniach z białkiem receptorowym adenina nie odgrywa kluczowej roli, w przeciwieństwie do grup fosforanowych (TNP- ATP>TNP-A DP>TNP-AM P) [12], Badając różne pochodne 3 ’,5 ’ oraz 2 ’,5 ’ bisfosforanów adenozyny stwierdzono, że modyfikacje w pozycji 2 ’ i 3 ’ deok- syrybozy nie zmieniają znacząco właściwości tych związków [6]. 3 ’,5 ’-bisfosforan 2 ’-deoksyadenozy- ny z grupą m etylową w pozycji N 6 wykazywał natomiast około 17-krotnie silniejsze właściwości anta- gonistyczne. Związek ten, oznaczony jako MRS 2179 ma stałą AT; « 100 nM [18]. Wprowadzenie w pozycji N 6 większych grup alkilowych (etylowej lub propylowej) lub grupy benzoilowej osłabia działanie MRS 2179 [6].
Ze względu na brak wystarczająco selektywnych agonistów i antagonistów receptorów nukleotydowych, w badaniach nad ich funkcjonowaniem i właściwościami farmakologicznymi bardzo pom ocne mogą być specyficzne przeciwciała. Jednak dostępność takich przeciwciał również jest ograniczona. Tylko nieliczne laboratoria dysponująpoliklonal- nymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko receptorom P2Xi, P2X4 oraz P2X 7 [17]. Dotychczas wyizolowano i scharakteryzowano tylko jedno przeciwciało m onoklonalne skierowane przeciwko zewnątrzkomórkowej domenie ludzkiego receptora P2X 7 [19],
IV. Przekazywanie sygnałów za pośrednictwem receptorów nukleotydowych
Receptory P2X, których liczba aminokwasów waha się od 379 do 595, zawierają dwie transmem- branowe hydrofobowe domeny oddzielone przez obszerny region znajdujący się na zewnątrz komórki. W części zewnątrzkomórkowej znajduje się 10 reszt cysteinowych i od 2 do 6 miejsc glikozylacji. Zarów no N-, jak i C-końce receptorów P2X znajdują się po stronie cytoplazmatycznej błony komórkowej [17]. Wszystkie receptory P2X w ystępują w formie struktur składających się z wielu podjednostek (7 podstawowych zostało już sklonowanych), przy czym pod- jednostki te m ogą być identyczne (np. P2Xj w m ięśniach gładkich) lub różne (np. P2X2/3 w zwoju dolnym nerwu błędnego). Podjednostki receptora P2X 7
w wyniku agregacji tworzą pory przepuszczalne dla cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej [20]. Pory są na tyle duże, że m ogą przez nie przenikać nawet barwniki takie jak bromek etydyny (394 Da), LY (550 Da) czy YO-PRO-1 (629 Da) [17, 19],
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 223http://rcin.org.pl
Receptory P2X wiążąc specyficzne Ugandy stają się jednocześnie kanałami jonow ym i (ang. Li- gand-G ated Ion Channels — LGIC). Aktywacja receptorów P2X przez ATP i UTP jest związana z szybkim wzrostem stężenia C a2+ w cytoplazmie. Wzrost ten może być wynikiem napływu jonów C a2+ bezpośrednio ze środowiska zewnątrzkomórkowego przez kanały receptorowe [1]. Inną przyczyną wzrostu stężenia jonów Ca2+ jest wtórna aktywacja kanałów wapniowych zależnych od napięcia. Związanie przez receptor P2X agonisty powoduje bowiem depolaryzację błony komórkowej [1]. Pod wpływem sygnałów zewnątrzkomórkowych wzrost stężenia wap-
Tabela 2
Odpowiedź komórki na stymulację receptora nukleotydowego
nia w cytoplazmie (od około 100 nM do około 1 piM) uruchamia wiele procesów regulujących funkcje k o mórki. Odbiorcami sygnału wapniowego sąm . in. k i nazy białkowe typu C, kinazy zależne od kalmoduli- ny, fosfolipazy C, D i Zmiany w ew nątrzkom órkowego stężenia wapnia m ają również wpływ na ak tywację lub inhibicję kanałów jonow ych (np. kanału dla jonów K+) i w konsekwencji na zmianę po tencjału błonowego i pobudliwości komórki.
Receptory P2Y są przykładem najliczniejszej ro dziny receptorów błonowych sprzężonych z białkami G (ang. G Protein Coupled Receptors — GPCR). R eceptory P2Y są integralnymi białkami błonowymi zawierającymi jeden łańcuch polipeptydowy tworzący siedem helikalnych domen transmembranowych
(TM1 — TM7). Liczba aminokwasów receptorów P2Y człowieka waha się od 328 do 377, a masa cząsteczkowa po glikozylacji od 41 do 53 kDa. N-ko- niec białka znajduje się na zewnątrz komórki, natomiast C-koniec występuje po stronie cytoplazmatycz- nej [17]. Aktywacja receptorów P2Y moduluje aktywność zarówno białek G q, jak również G s i Gj. Białka G podrodziny G q aktywują fosfolipazę C typu p, która katalizuje powstawanie 1,4,5-trifosforanu inozytolu z fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforanu. Trifosforan inozytolu (IP3) otwiera IP3-zależny kanał wapniowy siateczki śródplazmatycznej. Następuje wypływ jo nów Ca2+ do cytoplazmyi i wzrost stężenia jonów
wapnia [1]. Konsekwencją aktywacji receptorów P2Y związanych z białkami Gj jest obniżenie poziomu cAMP w cytoplazmie [21, 22], natomiast w wyniku aktywacji receptorów P2Y związanych z białkami Gs poziom cAMP zostaje podwyższony [7, 23].
Ogromna różnorodność efektów wywoływanych przez nukleotydy i nukleozydy może świadczyć o występowaniu większej liczby receptorów PI (receptorów adenozyny) i P2 (receptorów nukleotydo- wych) niż wynikałoby z ilości sklonowanych cDNA. Wiadomo, że cząsteczki receptorów P2X składają się z wielu podjednostek, przy czym podjednostki receptorów różnych podklas mogą być identyczne (homo- mery) lub różne (heteromery). Do tej pory sklonowa- no siedem podjednostek receptorów P2X (P2X i_7)
Nazwa receptora B ezpośrednia odpowiedź kom órki W tórna odpowiedź kom órki
P2X, Kanał dla Na+/K+/Ca2+ Napływ Ca2+, depolaryzacja błonyP2X2 Kanał dla Na+/K+ Depolaryzacja błonyP2X3 Kanał dla Na+/K+/Ca2+ Napływ Ca2+, depolaryzacja błonyP2X4 Kanał dla Na+/K+ Depolaryzacja błonyP2X5 Kanał dla Na+/K+/Ca2+ Napływ Ca2+, depolaryzacja błonyP2X6 Kanał dla Na+/K+/Ca2+ Napływ Ca2+, depolaryzacja błonyP2X7 Kanał dla Na+/K+ Depolaryzacja błony
P2Y, Aktywacja białek Gq/n Aktywacja PLCp—>IP3—>Ca2+P2Y2 Aktywacja białek Gq/n, Gi3 Aktywacja PLCp—>IP3—>Ca2+
i inhibicja cyklazy adenylanowej
p2y3 Aktywacja białek Gq/n Aktywacja PLCp—»IP3-»C a2+P2Y4 Aktywacja białek Gq/n Aktywacja PLCp—>IP3—>Ca2+P2Y6 Aktywacja białek Gq/n Aktywacja PLCP—>IP3—>Ca2+
p2y8 Brak danych Ca2+P2Y„ Aktywacja białek Gs, Gq/n Aktywacja PLCP->IP3—>Ca2+
i aktywacja cyklazy adenylanowejP2Y12 Aktywacja białek Gi/o Inhibicja cyklazy adenylanowejP2Yapu Brak danych Brak danych
224 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
mogących asocjować ze sobą, tworząc heterome- ryczne receptory P2X. Obecnie wiadomo o w ystępowaniu czterech heteromerów P2X: P2 X 2/3, P2X4/6, P 2 X 1/5, P2X 2/6 [24].
Y o s h i o k a , S a i t o h i N a k a t a wykazali m ożliwość tworzenia na drodze asocjacji dimerów składających się z receptora adenozyny A] i receptorów nukleotydowych P2Yi lub P2Y 2 (mniej niż 5% homologii w sekwencji aminokwasowej) [25]. K om pleks A]/P2Yi wykazuje odmienne właściwości farmakologiczne w stosunku do receptorów Aj i P2Y], Związki, będące agonistami lub antagonistami receptora adenozyny w ykazują znikome powinow actwo do powstałego heteromeru, podczas gdy agoni- sta receptora P2Y] (A D PpS) — zwiększone około 400 razy. W wyniku asocjacji receptorów A! i P2Y] zmienia się nie tylko powinowactwo ligandów, ale również uruchamiane mechanizmy przetwarzania sygnału błonowego. Przyłączenie agonisty do receptora Ai powoduje zmianę jego konformacji, co pozwala na oddziaływanie z białkiem Gj/o hamującym aktywność cyklazy adenylanowej. Z kolei receptor P2Yi jest związany z białkiem Gq, aktywującym fos- folipazę C. W komórkach wykazujących ekspresję receptora A)/P2Yi, A DPpS powoduje obniżenie stężenia cAMP (aktywacja białek GO, nie mając wpływu na aktywność fosfolipazy C. Rezultaty te wskazują, że tworzenie heteromeru z receptora A] i P 2Y ] zmienia funkcjonalne właściwości na korzyść aktywacji cyklazy adenylanowej. Możliwość asocjacji różnych receptorów GPCR może wyjaśniać nietypowe właściwości przypisywane przez wielu autorów receptorom nukleotydowym np. stwierdzony przez O k a d ę i w s p . wzrost stężenia jonów wapnia w cytoplazmie neuronów pod wpływem adenozyny [26], Podobnie F e r n a n d e z i w s p . wykazali, że ATP, ATPyS i AM P aktywują receptor P2Y w sposób zależny od 8-cyklopentyloteofiliny, lecz niezależny od suraminy i PPADS [27].
Wielu autorów sugeruje również występowanie niesklonowanych do tej pory receptorów nukleotydowych. Stwierdzono, że uwalnianie noradrenaliny z tętnicy ogonowej szczura zachodzi zarówno pod wpływem 2-chloroadenozyny, jak i ATP [28]. R ów nież działanie ATP i adenozyny wywołujące zwiotczenie mięśni tętnicy piersiowej królika należy przypisać receptorom innym niż PI i P2 [29], podobnie jak stymulowane przez ATP i 2-chloroadenozynę uwalnianie norepinefryny z nerwów adrenergicz- nych tętnicy usznej królika [28]. S a i t o h i N a k a t a wyizolowali białko pochodzące z mózgu szczura, wykazujące powinowactwo do 5 ’-N-etylokarboksy- amidoadenozyny (ang. 5 ’-N -ethylcarboxam idoade-
nosine — NECA) [30]. Specyficzność wiązania ligandów zapisano następująco: 5 ’-N-etylokarboksy- amidoadenozyna = A D PpS > cAMP = (3,y-MeATP > A P4A > a ,P -M eA T P > 5 ’-deoksy-5’-metylotioade- nozyna. Kolejność wiązania ligandów przez białko wyizolowane z mózgu szczura odpowiada aktywacji białka receptorowego opisanego przez C h i n e 1- 1 a t o i w s p. i aktywowanego w następującej kolejności przez ligandy: 5 ’-N-etylokarboksyamidoade- nozyna > adenozyna > ATP [29]. Uwalnianie noradrenaliny z nerwów adrenergicznych tętnicy ogonowej szczura jes t stymulowane przez 2 -chloroadenozynę > ATP > adenozynę [28], a indukcja prądu K+ w pęcherzykowych oocytach X enopus laevis w równym stopniu zależy od adenozyny, ATP i p,y-M- eATP [31]. Receptory aktywowane zarówno przez ATP i adenozynę zaliczane są obecnie do nowej klasy receptorów P3 lub tzw. białek P3LP (ang. P 3 p u ri- noreceptor-like p ro te ins — P3LP). Aktywacja receptorów P3 moduluje aktywność białek G s, czego konsekwencją jest wzrost stężenia cAMP w cytoplazmie [31, 32], Takiej aktywacji nie wywołują związki będące antagonistami receptorów PI (1,3- dipropylo-8-(2-amino-4-chlorofenylo)ksantyna i P2 (suramina), a także 2-M eSATP i UTP (agonisty receptorów P2Y) [29]. Antagonistyczne działanie w obec receptora P3 wykazuje 8-(p-sulfofenylo)teofili- na. Dopóki nie zostanie sklonowany cDNA hipotetycznego receptora P3, nie można jednak wykluczyć, że efekty przypisywane temu białku są wywołane asocjacją receptorów P2Y i PI.
V. Rozmieszczenie receptorów nukleotydowych — znaczenie fizjologiczne
Nukleotydy obecne w środowisku zewnątrzko- m órkowym w pływ ają na funkcjonowanie komórek wielu typów za pośrednictwem receptorów P2. W ykazano, że nukleotydy działają jako m iędzykom órkowe przekaźniki informacji w procesach zw iązanych ze skurczem mięśni gładkich, przekazywaniem sygnałów nerwowych i regulowaniem funkcji układu krwionośnego. W ciągu ostatnich 10 lat okazało się, że trifosforany i difosforany nukleozydów stanowią jedne z najbardziej rozpowszechnionych cząsteczek sygnałowych.
V -l. Układ sercowo-naczyniowy
Od 1961 roku wiadomo, że ADP powoduje agregację płytek krwi [33]. Na poziomie komórkowym objawia się to wzrostem wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca2+, aktywacją fosfolipazy C i inhibi
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 225http://rcin.org.pl
cją cyklazy adenylanowej. Poza tym ADP wywołuje zmianę kształtu płytek krwi i aktywację receptorów fibrynogenu [15, 33]. Do niedawna sądzono, że wszystkie przedstawione efekty są w ywoływane za pośrednictwem jednego receptora nukleotydowego P2j. Okazało się jednak, że na powierzchni tych komórek występują trzy rodzaje receptorów nukleotydowych (Tabela 3). Receptor P2Y) odpowiedzialny jest za uwalnianie C a2+ ze struktur komórkowych poprzez aktywację fosfolipazy C. Jonotropowy receptor P2 X! pośredniczy w napływie jonów w apniowych ze środowiska zewnętrznego, natomiast receptor P 2 Y 12, sklonowany niedawno przez H o 11 o p e - t e r a i w s p. [34], wpływa na zahamowanie aktyw ności cyklazy adenylanowej. Receptor P2Y ]2, związany z białkiem Gj najprawdopodobniej nie b ierze udziału w indukowanej przez ADP zmianie kształtu płytek krwi, natomiast wraz z receptorem
Tabela 3
lują powstawanie pęcherzyków pinocytowych [17]. Mimo obecności na tych komórkach zarówno receptorów P2Y, jak i P 2X 7, różnice w wartościach EC 50
dla ATP (odpowiednio 50-70 pM i 250-400 pM) wskazują, że łatwiej i częściej aktywowane są receptory P2Y [17]. ATP i inne nukleotydy aktywują ma- krofagi w odpowiedzi na uszkodzenia tkanek lub inwazję bakteryjną: s tym ulują wytwarzanie nadtlenków i czynników o charakterze humoralnym, takich jak T N F -a i interleukina 1(3 ( IL -ip ) , chociaż m olekularny mechanizm tego zjawiska nie jest poznany. Wiadomo, że pod wpływem bakteryjnego lipopolisa- charydu makrofagi, w przeciwieństwie do monocy- tów krwi obwodowej, w ytwarzają wysokocząstecz- kową (31-34 kDa), nieaktywną biologicznie formę pro-IL -ip . W 1992 roku P e r r e g a u x i w s p . stwierdzili, że ATP (poprzez wiązanie się z receptorem P2X7), podobnie jak nigerycyna, powoduje ob-
Znaczenie fizjologiczne receptorów nukleotydowych obecnych na płytkach krwi [17, 34]
C harak terystyka receptora/odpow iedź kom órki R eceptor P2Yi2 R eceptor P2Yi R eceptor P2Xi
Napływ jonów Ca2+ ze środowiska zewnętrznego (aktywacja kanałów jonowych) - - +
Uwalnianie jonów Ca2+ z siateczki śródplazmatycz- nej (aktywacja fosfolipazy C)
- + ?
Inhibicja cyklazy adenylanowej + - -
Synteza IP3 - + -
Powinowactwo do ATP + + -
Powinowactwo do ADP + + +
Udział w zmianie kształtu płytek krwi - + -
Udział w agregacji płytek krwi + + -
P2Yi ma wpływ na ich agregację. Związki będące antagonistami tego receptora (tiklopidyna, klopido- grel) znoszą efekt inhibicji cyklazy adenylanowej i częściowo przeciwdziałają agregacji płytek krwi [15, 17]. Mimo wyizolowania m RNA receptora P 2 X t z płytek krwi nie stwierdzono jego znaczącego udziału ani w agregacji tych komórek, ani w zmianie ich kształtu [33].
Zew nątrzkomórkowe nukleotydy uwalniane np. w wyniku uszkodzenia naczyń krwionośnych w yw ierają wpływ nie tylko na płytki krwi, ale również na inne komórki krwi (monocyty /makrofagi, limfocyty, erytrocyty, komórki dendrytyczne) oraz na komórki śródbłonka. Już pod koniec lat sześćdziesiątych C o h n i P a r k s stwierdzili, że nukleotydy adenino- we dodane do hodowli mysich makrofagów stymu-
niżenie stężenia jonów K + w cytoplazmie, co z kolei uaktywnia enzym przekształcający nieaktywną formę interkeukiny p ro - IL - ip do formy dojrzałej IL - ip (17 kDa) [35]. ATP może również stymulować w ydzielanie interleukiny 1 p poprzez aktywację egzocy- tozy pęcherzyków (późnych endosomów i lizoso- mów) zawierających tę cytokinę [17].
Innym enzymem pośredniczącym w lizie m akrofagów, który podlega regulacji przez zewnątrzkomórkowe trifosforany nukleozydów jest indukowal- na syntaza tlenku azotu (ang. inducible nitric oxide synthase — iNOS). ATP i UTP podane wraz z lipopo- lisacharydem w ywołują silniejszą stymulację aktyw ności indukowalnej syntazy tlenku azotu niż sam LPS [17]. Nukleotydy uczestniczą nie tylko w procesie fagocytozy czynników chorobotwórczych. O ka
226 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
zało się, że nukleotydy są toksyczne dla zainfekowanych makrofagów, a w procesie tym bierze udział receptor P2X 7 (cytotoksyczny wpływ ATP zostaje zniesiony po zablokowaniu tego receptora). Stwierdzono, że ATP indukuje lizę makrofagów zainfekowanych przez prątki M ycobacterium za pośrednictwem receptora P2X 7 [36]. Aktywność antybakteryj- na trifosforanu adenozyny może więc mieć istotne znaczenie nie tylko w leczeniu gruźlicy, ale również innych infekcji bakteryjnych.
Na powierzchni ludzkich limfocytów B występują receptory P2X i P2Y. Te ostatnie ulegają aktywacji nie tylko przez ATP i UTP, lecz również przez pozostałe trifosforany nukleozydów (GTP, CTP i ITP) [17]. Nadekspresję receptora P2X 7 stwierdzono w komórkach przewlekłej białaczki leukocytarnej [17]. Ludzkie limfocyty T, pochodzące z krwi obwodowej wykazują ekspresję receptorów P2Xi, P2X4 i P2X 7, ale do tej pory nie zidentyfikowano na ich p o wierzchni receptorów P2Y [17]. Obecność receptorów P2 Y( i P2Y2 udokumentowano natomiast w przypadku mysich tymocytów, które ulegają apopto- zie pod wpływem ATP.
Nukleotydy uwalniane z płytek krwi, neuronów i uszkodzonych komórek regulują również aktywność komórek śródbłonka naczyń krwionośnych. Na powierzchni ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej stwierdzono obecność receptorów czterech podklas P2Y: P2Y,, P2Y2, P2Y 4 i P2Y 6 [37], ATP i ADP, za pośrednictwem receptorów P2Y! i P2Y2, stymulują wydzielanie tlenku azotowego oraz pro- stacykliny (PGI2) poprzez aktywację odpowiednio syntazy tlenku azotowego (NOS) i fosfolipazy A 2
[38, 39]. Związki te rozszerzają naczynia krwionośne i hamują agregację płytek krwi. Zewnątrzkomór- kowe nukleotydy zwiększają także adhezję neutrofili do komórek śródbłonka.
Stymulacja receptorów P2Y występujących na powierzchni komórek śródbłonka prowadzi również do fosforylacji reszty tyrozyny dwóch izoform (p42 i p44) kinazy białkowej aktywowanej przez czynniki mitogenne (ang. m itogen-activa ted protein kinase — MAPK) [40]. Chociaż rola białek G w procesach aktywujących kinazy MAP jest słabo poznana, aktywacja ta jest niezbędna dla indukowanej przez zewnątrzkomórkowe nukleotydy produkcji prosta- glandyny I2 [40],
W warunkach fizjologicznych ATP wydzielany z neuronów współczulnych reguluje napięcie naczyń krwionośnych poprzez oddziaływanie na komórki mięśni gładkich. Kiedy śródbłonek naczyń zostanie uszkodzony ATP, ADP i UTP uwalniane z płytek
krwi mogą bezpośrednio wpływać na komórki m ięśni gładkich powodując ich skurcz i w efekcie hamując krwotok. W procesie tym uczestniczą zarówno receptory jonotropow e (głównie P2Xi), jak i me- tabotropowe (P2Y2, P2Y 4 i P2Y 6) [15]. Ich aktywacja powoduje wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia jonów C a2+, które odgrywają kluczową rolę w zależnym od nukleotydów skurczu mięśni. W przypadku komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych ATP (za pośrednictwem receptora P2Y2) jest rów nież czynnikiem stymulującym syntezę DNA i białek, ekspresję genów wczesnej odpowiedzi komórkowej (m. in. protoonkogenu c-fos) [41]. W proliferacji kom órek mięśni gładkich może również uczestniczyć receptor P2Y4, którego stymulacja przez ATP powoduje z kolei aktywację kaskady kinaz MAP [15].
V-2. Układ oddechowy
Zewnątrzkomórkowe nukleotydy mogą wpływać na funkcjonowanie komórek wielu typów górnych dróg oddechowych oraz płuc. ATP i UTP stymulują transport jonów Cl' w komórkach nabłonkowych zarówno u osób zdrowych, jak i chorych z torbielowatym zwłóknieniem tych komórek (mukowiscydoza). Wynikiem aktywacji receptora P2Y2, występującego na powierzchni komórek nabłonkowych, jes t wzrost stężenia jonów Ca2+ w cytoplazmie. Wzrost ten jest niezbędny do aktywacji kanału transportującego jony chlorkowe. Transbłonowy regulator mukowi- scydozy (ang. cystic fib ro sis transm em brane regulator — CFTR) jes t aktywowany przy niskim stężeniu jonów Ca2+. U chorych pacjentów białko CFTR jest zmutowane i ulega aktywacji przy znacznie w yższym stężeniu jonów wapnia. Wymagany wzrost stężenia wapnia w cytoplazmie ma miejsce po podaniu chorym UTP. Zewnątrzkomórkow e nukleotydy pow odują również wzrost wydzielania mucyny przez komórki kubkowe, a następnie jej transport oraz w ydzielanie surfaktantu (substancji lipidowej pokrywającej c ienką w arstw ą powierzchnię nabłonka od dechowego) przez komórki pęcherzyków płucnych drugiego rzędu. Z tych względów ATP, a zwłaszcza UTP (uracyl — produkt rozpadu UTP — w przeciwieństwie do adenozyny nie wywołuje efektów ubocznych) znalazły zastosowanie w terapii chorób układu oddechowego [12, 39]. Obecnie UTP jest podawany w postaci aerozolu chorym na mukowiscy- dozę, jak również pacjentom cierpiącym na przewlekłe zapalenie oskrzeli.
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 227http://rcin.org.pl
V-3. Układ nerwowy
Wpływ ATP obserwowano zarówno w przypadku komórek nerwowych, jak i glejowych. Stwierdzono, że może on odgrywać rolę neuroprzekaźnika w połączeniach synaptycznych ośrodkowego i obw odowego układu nerwowego. W zależności od typu komórek wywołuje stymulację (neurony przedzwo- jowe) lub inhibicję (synapsy nerwowo-mięśniowe) wydzielania acetylocholiny. N eurony hipokampa z kolei pod wpływem ATP wydzie la ją glutaminian [1], ATP bierze udział w przekazywaniu informacji od receptorów bodźców bólowych (nocyceptywnych) w przypadku zespołów zaburzeń neurotroficznych, m igreny czy bólów nowotworowych. Podanie ATP p o woduje powstanie bólu w miejscu iniekcji, a także ułatwia nocyceptywną odpowiedź na inne szkodliwe czynniki. Efekt ten jest znoszony przez związki będące antagonistami receptorów P2 (suramina, PPADS). Stwierdzono, że receptor P2X 3, którego podwyższoną ekspresję wykryto w nocycepty wnych neuronach czuciowych może w znaczący sposób przyczyniać się do indukcji odczuć bólowych. Z tego względu związki będące antagonistami receptora P2X3 mogą być rozważane jako potencjalne leki przeciwbólowe [ 1 2 ].
VI. Podsumowanie
Zewnątrzkomórkowe nukleotydy odgrywają istotną rolę w modulowaniu aktywności poszczególnych komórek, tkanek, a nawet całego organizmu. Mimo że od dawna wiedziano o działaniu tych związków za pośrednictwem specyficznych receptorów obecnych na powierzchni prawie wszystkich k o mórek organizmu, dopiero analiza struktury cDNA i możliwość klonowania w liniach komórkowych nie wykazujących ekspresji żadnego receptora P2, p o zwoliła na ustalenie charakterystyki farm akologicznej receptorów poszczególnych podklas. Obecnie prowadzone badania m ają na celu zidentyfikowanie poszczególnych elementów i mechanizm ów zw iązanych z przekazywaniem sygnałów za pośrednictwem receptorów nukleotydowych. Coraz bardziej realne wydaje się zastosowanie agonistów i antagonistów receptorów P2 w leczeniu procesów zapalnych, zakrzepów naczyń krwionośnych, schorzeń układu oddechowego i nerwowego, a nawet w terapii now otworów. Wykazano, że trifosforany nukleotydów m ogą powodować inhibicję wzrostu kom órek now otworowych pewnych typów (np. kom órek raka p ro staty), a nawet ich lizę. Prowadząc drugą fazę badań klinicznych stwierdzono, że podawanie ATP pacjen
tom z zaawansowanym rakiem płuc prowadzi do zahamowania wzrostu guza i utraty wagi ciała, a także zmniejsza stopień ogólnego wyniszczenia organizmu [42]. Badaniom nad Ugandami receptorów nukleotydowych wykazującymi działanie terapeutyczne powinny jednak towarzyszyć badania nad białkami innymi niż receptory P2, lecz zależnymi od obecności ATP. Aktywność takich enzymów jak ekto-ATPazy, ektonukleotydazy, kinazy białkowe oraz kanały potasowe regulowane przez ATP może się bowiem zmieniać pod wpływem antagonistów receptorów nukleotydowych.
Podziękowania
Dziękuję doc. dr hab. Marii Koziołkiewicz za pomoc w opracowaniu niniejszego przeglądu.
Artykuł otrzymano 18 lutego 2002 Zaakceptowano do druku 21 marca 2002
Piśmiennictwo
1. D u b y a k G R , El — M o a t a s s i m C (1993) Am J Physiol 265: C577-C606
2. R e d e g e l d F A, C a l d w e l l CC, S i t k o v s k y M V (1999) Trends Pharmacol Sci 20: 453-459
3. C o m m u n i D, B o c y n a c m s JM (1997) Trends Pharmacol Sci 18: 83-863
4. B o y e r JL, D e l a n e y SM, V i l l a n u e v a D, H a r d e n T K(2000) Mol Pharmacol 57: 805-810
5. B o g d a n o v YD, D a l e L, K i n g BF, W h i t t o c k N, B u r n s t- o c k G (1 9 9 7 )7 5 /o / Chem 272: 12583-12590
6. C a m a i o n i E, B o y e r JL, M o h a n r a m A, H a r d e n TK, J a c o b s o n K A (1998) 7A/e7 Chem 41: 183-190
7. C o n i g r a v e AD, L e e J Y, v a n d e r W e y d e n L, J i a n g L, W a r d P, T a s e v s k i V, L u t t r e l l BM, M o r r i s M B (1998)Rr 7 Pharmacol 124: 1580-1585
8. C o m m u n i D, R o b a y e B, B o e y n a e m s J M (1999) B rJ Pharmacol 128: 1199-1206
9. K o z i o ł k i e w i c z M, G e n d a s z e w s k a E, M a s z c w s k a M, S t e i n C A , S t e c W J (2001) Blood 98: 995-1002
10. F r e d h o l m BB, A b b r a c c h i o MP , B u r n s t o c k G, D u b y a k GR, H a r d e n TK, J a c o b s o n KA, S c h w a b e U, W i l l i a m s M (1997) Trends Pharmacol Sci 18: 79-82
1 1 . Y e g u t k i n G , B o d i n P, B u r n s t o c k G (2000) B rJ Pharmacol 129: 921-926
12. W i l l i a m s M, J a r v i s M F (2000) Biochem Pharmacol 59: 1173-1185
13. C o m m u n i D , G o v a c r t s C , P a r m e n t i e r M , B o e y n a e m s J M (1997) 7 Biol Chem 272: 31969-31973
14. M u r t h y K S , M a k h l o u f G M (1998) 7 Biol Chem 273: 4695-4704
15. K u n a p u l i SP, D a n i e l J L (1998) Biochem 7 336: 513-52316. R a l e v i c V, B u r n s t o c k G (1998) Pharmacol Rev 50:413-492 17 D i V i r g i l i o F, C h i o z z i P, F e r r a r i D, F a l z o n i S, S a n z J
M , M o r e l l i A , T o r b o l i M , B o l o g n e s i G , B a r i c o r d i OR(2001) Blood 97: 587-600
18. M o r o S, G u o D, C a m a i o n i E, B o y e r JL, H a r d e n K, J a c o b s o n K A (1998) J M ed Chem 41: 1456-1466
19. B u e l l G , C h e s s c l l IP, M i c h e l AD, C o l l o G, S a l a z z o M , H e r r e n S , G r e t e n e r D , G r a h a m e s C , K a u r R , K o s c o - V i l b o i s M H , H u m p h r e y P P A (1998) R/oo792: 3521-3528
20. Receptor & Ion Channel Nomenclature Supplement. Trends Pharmacol Sci (1999)
228 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
2 1 . M u r a y a m a T, Y a k u s h i Y, W a t a n a b e A, N o m u r a Y(1998) Eur J Pharmacol 348: 71-76
22. M u r t h y KS , M a k h l o u f G M (1998) M ol Pharmacol 54: 122-128
23. P u c e a t M, B o n y C . J a c o n i M , V a s s o r t G (1998)F EB SLett 431: 189-194
24. K i n g B F, T o vv n s e n d-N i c h o l s o n A, W i l d m a n SS, T h o m a s T, S p y e r K M , B u r n s t o c k G (2000) JN eurosci 20: 4871-4877
2 5 . Y o s h i o k a K, S a i t o h O, N a k a t a H (2001) Proc Natl Acad Sei USA 98: 7617-7622
26. I k c u c h i Y, N i s h i z a k i T, M o r i M, O k a d a Y (1996) E u rJ P harm acology 191-199
27. M e n d o z a-F e r n a n d e z V, A n d r e w RD, B a r a j a s - L o p e z C (2000) J Pharmacol Exp Ther 293: 172-179
28. U m i n o T , Y o s h i o k a K, S a i t o h Y, M i n a k a w a N, N a k a t a H, M a t s u d a A (2001) J M ed Chem 44: 208-214
29. C h i n e l l a t o A , R a g a z z i E, P a n d o l f o L, F r o l d i G , C a p a r r o t t a L, F a s s i n a G (1994) Pharm Pharmacol 46: 337-341
30. Y o s h i o k a K, M a t s u d a A, N a k a t a H (2001) Clin Exp Pharmacol Physiol 28: 278-284
31 . K i n g BF, W i l d m a n SS, T o w n s e n d-N i c h o l s o n A, B u r n s t o c k G (1 998) J Pharmacol Exp Ther 285: 1005-1011
3 2 . M a t s u o k a I, Z h o u Q, I s h i m o t o H . N a k a n i s h i H (1995) Mol Pharmacol 47: 855-62
33. K u n a p u l i S P (1998) Trends Pharmacol Sei 19: 391-39434. H o l l o p e t e r G , J a n t z e n HM, V i n c e n t D, Li G , E n g l a n d
L, R a m a k r i s h n a n V, Y a n g R B , N u r d e n P, N u r d e n A, J u l i u s D, C o n l e y P B (2001) Nature 409: 202-207
35. P e r r e g a u x D, B a r b e r i a J, L a n z e t t i AJ , G e o g h c g a n K F, C a r t y T J, G a b e l C A (1992) J Immunol 149: 1294-1303
36. L a m m a s D A, S t o b c r C, H a r v e y C J, K e n d r i c k N, P a n c h a l i n g a m S, K u m a r a r a t n e D S. (1997) Immunity 7: 433-444
37. J i n J, D a s a r i VR, S i s t a r e FD, K u n a p u l i S P (1998) B rJ Pharmacol 123: 789-794
3 8 . B o e y n a e m s J M, P e a r s o n J D ( 1 990) Trends Pharmacol Sei 11: 34-37
39. B o a r d e r MR, W e i s m a n G A, T u r n e r JT, W i l k i n s o n G F (1995) Trends Pharmacol Sei 16: 133-139
40. P a t e l V, B r o w n C, G o o d w i n A, W i l k i e N, B o a r d e r M R(1996) B iochem J 320: 221-226
41 .M a 1 a m — S o u l e y R, C a m p a n M, G a d e a u A P , D e s g r a n g e s C (1993) Am J Physiol 264: C783-C788
42. B u r n s t o c k G, W i l l i a m s M (2000) J Pharmacol Exp Ther 295: 862-869
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 229http://rcin.org.pl
Adenozyna — neuroprzekaźnik i neuromodulator w centralnym układzie nerwowym
Adenosine — neurotransmitter and neuromodulator in central nervous system
MAŁGORZATA ROMANOWSKA1, MICHAŁ KOMOSZYŃSKI2
Spis treści:
I. WstępII. Stężenie adenozyny w komórce i przestrzeniach między
komórkowychII-l. Metabolizm adenozyny w komórce II-2. Źródła ektoadenozyny
III. Receptory adenozynowe w centralnym układzie nerwowym
IV. Regulacja stężenia ektoadenozynyIV-1. Transport adenozyny przez błonę komórkową
IV-1.1. Transport bierny nośnikowy IV-1.2. Transport aktywny
IV-2. Lokalizacja i funkcja deaminazy ektoadenozyny w centralnym układzie nerwowymIV-2.1. Lokalizacja deaminazy adenozyny w strukturach mózguIV-2.2. Udział deaminazy adenozyny w regulacji stężenia ektoadenozyny
V. Funkcje adenozyny w centralnym układzie nerwowymV -l. Regulacja wydzielania neuroprzekaźników z
udziałem receptorów adenozynowych AiV-2. Regulacja wydzielania neuroprzekaźników za po
średnictwem receptorów A2a, A2B i A3.VI. Podsumowanie
Wykaz stosowanych skrótów: CGS 21680 — 2-[p-(2-karbo- nylo-etylo)-fenyloetyloamino]-5’-N-etylokarboksyamidoadeno- zyna; CSC-8-8-(3-chlorostyrylo)kofeina; DMPX — 1,3-dime- tylo-7-propyloksantyna; IB-MECA-N6-(3-jodobenzylo)-adenozy- no-5’-N-metylokarboksyamid; N B M PR — nitrobenzylotioino- zyna; PI — receptory adenozynowe; P2 — receptory nukleoty- dowe; ADA — deaminaza adenozyny; ADA-BP — białko wiążące deaminazę adenozyny (ang. Adenosine Deaminase Binding Protein)', Ado — adenozyna, Ino — inozyna.
'Mgr, 2prof. dr hab., Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Zakład Biochemii, 87-100 Toruń, ul. Gagarina 9, tel. (0-56) 6114520, e-mail: [email protected], [email protected]
Contents:
I. IntroductionII. Intra- and extracellular concetration of adenosine
II-1. Intracellular metabolism of adenosineII-2. Sources of ecto-adenosine
III. Adenosine receptors in central nervous systemIV. Regulation of extracellular adenosine concetration
IV-1. Adenosine transport across the cell membraneIV-1.1. Equilibrative nucleoside transport IV-1.2. Active transport of nucleoside
IV-2. Localization and function of ectoadenosine deaminase (ADA) in central nervous systemIV-2.1. Distribution of adenosine deaminase in the brain regionsIV-2.2. Participation of adenosine deaminase in the control of ectoadenosine concetration
V. Functions of adenosine in the central nervous systemV -l. Regulation of neurotransmitters secreting by A]
adenosine receptorsV-2. Regulation of neurotransmitters secreting by ade
nosine receptors A2a, A2B i A3.VI. Concluding remarks.
I. Wstęp
Nukleozydy i nukleotydy purynowe (adenozyna, ADP, ATP, polifosforany adenozyny) oraz p irym idynowe (UDP, UTP) obecne w przestrzeniach m iędzykomórkowych i płynach ustrojowych m ogą funkcjonować jako cząsteczki sygnałowe. Związki te, wiążąc się ze zlokalizowanymi na powierzchni błon komórkowych specyficznymi receptorami adenozy- nowymi — P 1 i nukleotydowymi — P2, określanymi dawniej jako purynergiczne, aktywują w komórkach wiele reakcji fizjologicznych [1 ,2]. Ich wynikiem są zmiany powstające natychmiast po aktywacji receptorów (egzocytoza, zmiana stężenia wtórnych przekaźników) lub pojawiające się i trwające przez dłuższy okres czasu (zmiana ekspresji genów i szybkości proliferacji komórek). W komórkach są wszystkie elementy niezbędne do przekazywania sygnału z
230 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
udziałem adenozyny: 1 ) adenozyna (cząsteczka sygnałowa), 2 ) białkowe transportery tego nukleozydu przez błonę komórkową, 3) substraty i enzymy n iezbędne do produkcji adenozyny w przestrzeniach międzykomórkowych, 4) receptory adenozynowe (purynoreceptory P ł ) oraz 5) enzymy — deaminaza adenozyny i/lub białka (transportery adenozyny) n iezbędne do inaktywacji sygnału. Udział adenozyny w regulacji aktywności metabolicznej komórek m ięśnia sercowego wykazano po raz pierwszy już w 1929 roku [3], Jednym z najwcześniejszych doniesień o wpływie nukleozydu na układ nerwowy było stwierdzenie, że adenozyna stymuluje syntezę cAMP w komórkach kory mózgowej świnki morskiej, a powstawanie wtórnego przekaźnika sygnału jest b lokowane w obecności metyloksantyn [4], Wyniki dotychczasowych badań wykazały, że adenozyna uczestniczy w regulacji metabolizmu układu nerw owego, krwionośnego, immunologicznego, oddechowego i wydalniczego [ 1 , 2 ].
Celem artykułu jes t omówienie wyników badań mechanizmów przekazywania informacji z udziałem adenozyny w centralnym układzie nerwowym. W artykule dużo miejsca poświęcono również udziałowi tego nukleozydu w ochronie tkanek w okresie niedotlenienia i niedokrwienia, a także deaminazie ekto- adenozyny (ADA), która jak wskazują rezultaty badań, może być odpowiedzialna za inaktywację sygnału adenozynowego.
II. Stężenie adenozyny w komórce i przestrzeniach międzykomórkowych
Stężenie wewnątrzkomórkowej i pozakomórko- wej adenozyny jes t wynikiem procesów syntezy, transportu przez błonę kom órkow ą oraz degradacji. W warunkach fizjologicznych stężenie pozakomór- kowej adenozyny w mózgu jes t nanomolowe, a w warunkach stresowych takich jak niedotlenienie i niedokrwienie, jak również po depolaryzacji błony komórkowej pod w pływem bodźców elektrycznych czy chemicznych wzrasta do poziomu mikromolo- wego [5-9].
II—1. Metabolizm adenozyny w komórce
Istnieją dwa główne źródła wewnątrzkomórkowej adenozyny (Ryc. 1). Podstawowym jej źródłem w komórce jest hydroliza nukleotydów adeninowych. Wiele badań wskazuje, że wywołane niedotlenieniem zmiany w metabolizmie komórki powodują spadek stężenia w ewnątrzkom órkowego ATP. Ich efektem jest wzrost ilości ADP, AMP i Ado [10].
S-adenozylohomocysteina
AMP
->• Homocysteina
Adenozyna Inozyna
Ryc. 1. Przemiany adenozyny w komórce. 1 — 5’-nukleotydaza, 2 — kinaza adenozyny, 3 — deaminaza adenozyny, 4 — hydrolaza S-adenozylohomocysteiny.
W ewnątrzkomórkowa Ado może ulegać deaminacji do inozyny (Ino) i jonów amonowych w reakcji katalizowanej przez deaminazę adenozyny, lub z udziałem kinazy adenozyny może być fosforylowana do AMP. Rezultaty badań wskazują, że Km kinazy adenozyny względem Ado jako substratu jest o 1-2 rzędy wielkości mniejsze niż Km deaminazy. Z tego względu uważa się, że w warunkach fizjologicznych w iększą rolę w degradacji komórkowej Ado gra kinaza, podczas gdy rola deaminazy może wzrastać w warunkach zwiększonego stężenia nukleozydu [ 1 1 ].
W komórce adenozyna może powstawać również w wyniku przemiany S-adenozylohomocysteiny (SAH) z udziałem hydrolazy S-adenozylohomocy- steiny (SAHH). Reakcja katalizowana przez tę hy- drolazę jes t reakcją odwracalną syntezy S-adenozylohomocysteiny [10]. W mózgu hydrolaza S-adenozylohomocysteiny jes t obecna zarówno w neuronach, jak i w komórkach glejowych [12]. Wydaje się, że znaczenie SAHH w przemianach adenozyny jest nieduże, ponieważ stężenie SAH wewnątrz komórki jes t niskie.
II-2. Źródła ektoadenozyny
Wysunięto kilka hipotez mówiących o pochodzeniu zewnątrzkomórkowej adenozyny [ 10 ]. Źródłem tego nukleozydu w przestrzeniach pozakomórko- wych może być:— egzocytoza,— transport z udziałem przenośników białkowych
obecnych w błonach komórkowych— hydroliza zewnątrzkomórkowych nukleotydów
adeninowych (ATP, cAMP, polifosforanów adenozyny) przez ektoenzymy,
— liza komórek.Precyzyjne określenie udziału białkowych prze
nośników nukleozydów w transporcie adenozyny na zewnątrz komórki jes t trudne, ponieważ transport
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 231http://rcin.org.pl
adenozyny zarówno do, jak i z komórki odbywa się zgodnie z gradientem stężeń tego związku po obu stronach błony komórkowej. Najlepiej poznanym źródłem ektoadenozyny jest hydroliza ektonukleoty- dów. ATP, podobnie jak inne neuroprzekaźniki, pojaw ia się w szczelinie synaptycznej w wyniku egzo- cytozy zależnej od jonów C a2+ [13-15], Obecność ektoenzym ów hydrolizujących zewnątrzkomórkowy ATP do ADP, AMP i adenozyny stwierdzono we wszystkich dotychczas badanych strukturach układu nerwowego. W procesie tym uczestniczą następujące ektohydrolazy: ATPaza [EC 3.6.3], ATP difosfohy- drolaza [EC 3.6 .1.5] oraz 5 ’-nukleotydaza [EC 3.1.3.5] [16]. Hydrolizę zewnątrzkomórkowego ATP prowadzącą do powstawania adenozyny obserw owano między innymi w płytce nerwowo-mięśnio- wej [15], cholinergicznych synapsach prążkowia [17] i h ipokampu [18] oraz skrawkach hipokampu i kory mózgowej [15]. W ydaje się, iż degradacja ATP przez ektoenzymy jes t podstawowym źródłem tego nukleozydu poza komórką.
Innym źródłem zewnątrzkomórkowej adenozyny może być degradacja pozakomórkowego cAMP [19] i polifosforanów adenozyny [16]. Hydrolizę pozakomórkowego cAMP do adenozyny przez ektofosfo- diesterazę obserwowano w hipokampie, korze m ózgowej i synaptosomach rdzenia k ręgow ego[10 ].
III. Receptory adenozynowe w centralnym układzie nerwowym
W centralnym układzie nerwowym obecne są wszystkie podtypy receptorów PI — A], A 2a , A 2B, i A 3 [2 ].
Receptory A \ charakteryzujące się w ysokim powinow actw em do adenozyny m ogą być aktywowane przez nanomolowe stężenie tego związku poza kom órką [2]. Obecność tych receptorów wykryto w pre- i postsynaptycznych błonach neuronów takich struktur jak kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, móżdżek, prążkowie i rdzeń kręgowy [2 , 2 0 ].
Receptory A 2a sklonowano przy użyciu biblioteki cDNA hipokampu człowieka [21], m ózgu szczura [22] i mózgu świnki morskiej [23]. Receptory te podobnie jak Ai m ają duże powinowactwo do adenozyny. Do niedawna, stosując techniki o niskiej czułości sądzono, że w centralnym układzie nerwow ym receptory A 2a występują tylko w rejonach bogatych w unerwienie dopaminergiczne. W neuronach prążkowia receptory A 2a występują razem z receptorami D 2
[24], N owe badania stosujące metodę RT-PCR, która charakteryzuje się w iększą czułością, wykazały niew ielką ilość mRNA receptora A 2a w hipokampie, ko
rze mózgowej, móżdżku, wzgórzu i podwzgórzu [20].
Receptory A 2B sklonowano przy wykorzystaniu biblioteki cDNA hipokampu człowieka [25] i mózgu szczura [26]. Stosując RT-PCR stwierdzono we wszystkich badanych strukturach mózgu szczura niski poziom m RNA tego receptora [20]. Receptory A 2B wym agają do swojej aktywacji wysokich, mikro- molowych stężeń adenozyny. Uważa się więc, że odgrywają większą rolę w warunkach patologicznych, podczas których stężenie pozakomórkowej adenozyny wzrasta. Rezultaty badań innych autorów sugerują, że receptory te mogą być również aktywowane przez fizjologiczne stężenie zewnątrzkomórkowej adenozyny [27]. Funkcje receptora A2B w układzie nerwowym nie zostały poznane. W przeciwieństwie do receptorów Ai i A 2a trudności w badaniu tego podtypu receptora wynikają przede wszystkim z braku selektywnych ligandów.
Receptor A 3 jes t najpóźniej zidentyfikowanym receptorem P 1. Został sklonowany przy wykorzystaniu biblioteki cDNA prążkowia szczura [28] i człowieka [29]. Podobnie jak receptor A 2B wymaga do aktywacji wysokich, mikromolowych stężeń Ado. Z udziałem RT-PCR stwierdzono obecność niewielkiej ilości m RNA tego receptora w wielu rejonach mózgu szczura, m. in. w korze mózgowej, hipokampie, prążkowiu, wzgórzu, podwzgórzu i móżdżku [2 0 ],
IV. Regulacja stężenia ektoadenozyny
Adenozyna może być usuwana z przestrzeni poza- komórkowych w wyniku transportu do komórki poprzez przenośniki białkowe transportujące nukleozy- dy i dopiero wewnątrz komórki metabolizowana z udziałem wewnątrzkomórkowej kinazy adenozyny i deaminazy adenozyny lub może ulegać deaminacji poza kom órką w wyniku reakcji katalizowanej przez deaminazę ektoadenozyny [10]. Adenozyna byłaby więc cząsteczką sygnałową, której stężenie w przestrzeni pozakomórkowej regulowałyby dwa różne mechanizmy: 1 ) degradacja przez ektoenzym i 2 ) transport do komórki i przemiany nukleozydu dopiero w jej wnętrzu (Ryc. 2).
IV-1. Transport adenozyny przez błonę komórkową
Nukleozydy są cząsteczkami, które, między innymi ze względu na rozmiar i hydrofilność, nie mogą swobodnie przenikać przez błony plazmatyczne. Rezultaty badań wskazują, że pojedyncze neurony piramidalne regionu CA1 hipokampu szczura są zdolne do uwalniania adenozyny na zewnątrz, jeśli wzrasta
232 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
cytosol
1 2 3 4
ATP ADP AMP Ado Ino
jej stężenie w komórce [30]. Wyniki tych badań sugerują, że w błonach komórkowych neuronów muszą funkcjonować przenośniki białkowe, które transportują adenozynę.
W komórkach ssaków transport nukleozydów odbywa się zgodnie z gradientem stężeń drogą transportu biernego nośnikowego (ang. equlibrative nucleoside transport) lub aktywnego symportu z jonami sodu (ang. sodium -dependent concentrative nucleoside transport), gdzie nukleozydy transportowane są wbrew gradientowi stężeń [31]. Oba rodzaje transportu nukleozydów występują również w komórkach mózgu [31].
IV-1.1. Transport bierny nośnikowy
Transport nukleozydów przez błonę kom órkową może odbywać się zgodnie z gradientem stężenia przenoszonej cząsteczki. Jest to sposób przenikania substancji przez błony określany jako bierny transport nośnikowy lub dawniej jako dyfuzja ułatwiona [31-33]. Przenośniki nukleozydów działające według zasad transportu biernego nośnikowego są obecne w komórkach wielu typów i w ykazują małą selektywność wobec przenoszonych cząsteczek. Transportują zarówno nukleozydy purynowe, jak i pirymidynowe [3 1 ]. W transporcie biernym nośnikowym nukleozydów uczestn iczą dwa typy nośników białkowych: 1 ) es (ang. equlibrative sensitive) — wrażliwy na działanie inhibitora transportu nukleozydów — nitrobenzylotioinozynę (NBMPR) oraz2 ) ei (ang. equlibrative insensitive) — niewrażliwy na NBM PR [32]. W centralnym układzie nerwowym obecność białek transportujących nukleozydy na zasadzie transportu biernego stwierdzono między innymi w synaptosomach kory m ózgu szczura [34] i świnki morskiej [35] oraz w błonach komórkowych
Ryc. 2. Źródła ektoadcnozyny. 1 — ekto- ATPaza, 2 — ektoATPdifosfohy- drolaza, 3 — ekto-5-nukleotyda- za, 4 — kompleks deaminazy ektoadenozyny i białka wiążącego (ADA-BP), 5 i 6 — przenośniki białkowe nukleozydów, Ado — adenozyna, Ino — inozyna
komórek glejowych [36]. Komórki m ogą zawierać jednocześnie obydwa typy białek przenośnikowych, czego przykładem m ogą być synaptosomy z m ózgu świnki morskiej [31].
IV-1.2. Transport aktywny
Przenośniki białkowe uczestniczące w symporcie nukleozydów (kotransporcie) z jonam i Na+ transportują nukleozydy tylko do wnętrza komórki [31, 37-39]. Dotychczas opisano i scharakteryzowano w komórkach ssaków 5 typów przenośników nukleozydów wykorzystujących gradient jonów N a+ [38]. Są to przenośniki: N I (selektywny dla puryn, ale transportuje również urydynę), N2 (selektywny dla piry- midyn, ale transportuje także adenozynę), oraz p rzenośniki N3, N4 i N5, które charakteryzują się n iską specyficznością w stosunku do przenoszonych cząsteczek [38]. Dotychczas niewiele wiadomo o aktywnym symporcie adenozyny w układzie nerw owym i znaczeniu tego procesu dla przekazywania informacji z udziałem receptorów PI. Obecność mRNA kodującego przenośnik typu N2 wykazano we wszystkich przebadanych strukturach mózgu szczura, m.in. w splocie naczyniówkowym, tylnym podwzgórzu, korze mózgowej, hipokampie, m óżdżku oraz pniu mózgu. W mózgu szczura stwierdzono również obecność m RNA kodującego przenośnik białkowy typu N I [40]. Do tej pory brak jes t inform acji na temat występowania tego rodzaju przenośników w rejonie szczeliny synaptycznej.
IV-2. Lokalizacja i funkcje deaminazy ektoadenozyny w centralnym układzie nerwowym
Jednym z enzymów, który reguluje stężenie adenozyny w komórce i przestrzeniach pozakomórko-
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 233http://rcin.org.pl
wych jes t deaminaza adenozyny (ADA) [EC.3.5.4.4]. Deaminaza adenozyny uczestniczy w regulacji stężenia wewnątrzkomórkowej i zewnątrz- komórkowej adenozyny i deoksyadenozyny. W iększość badań poświęconych lokalizacji komórkowej i subkomórkowej tego enzymu w układzie nerwowym dotyczy form rozpuszczalnych [41,42], Do dnia dzisiejszego nie udało się wyizolować i oczyścić do ho- mogenności enzymu z błon komórkowych komórek nerwowych lub glejowych.
IV-2.1. Lokalizacja deam inazy adenozyny w strukturach mózgu
Aktywność deaminazy adenozyny w obrębie układu nerwowego jest niższa niż w komórkach innych tkanek. Regionami mózgu o największej ak tywności deaminazy adenozyny u szczura, myszy oraz świnki morskiej są przednie i tylne podwzgórze, opuszka węchowa i wzgórek górny blaszki czwora- czej. Najniższą aktywność enzymu stwierdzono w prążkowiu, korze mózgowej i hipokampie [43]. B adano również subkom órkową lokalizację ak tyw ności enzymu między innymi w korze mózgowej, m óżdżku, hipokampie i podwzgórzu szczura [43,44]. W badaniach tych stwierdzono, że większość ak tyw ności deaminazy adenozyny związana jest z frakcją cy- tosolową i tylko około 25% aktywności tego enzymu znajduje się w frakcji błon komórkowych [43, 45].
IV-2.2. Udział deam inazy adenozyny w regulacji stężenia ektoadenozyny
Deaminaza ektoadenozyny uwalnia receptory PI od naturalnego liganda — adenozyny przynajmniej w niektórych obszarach mózgu [17]. Udział deam inazy ektoadenozyny w metabolizmie pozakomórko- wego ATP i adenozyny został stwierdzony między innymi w immunologicznie oczyszczonych synapsach cholinergicznych prążkowia [ 17]. Po stymulacji neuronu obserwowano w tej strukturze uwalnianie acetylocholiny i ATP. ATP był następnie hydrolizo- wany przez szereg ektoenzymów do ADP, AMP oraz adenozyny. Produkt hydrolizy — adenozyna uczestniczyła w presynaptycznej inhibicji wydzielania acetylocholiny. W obszarze synaps obserwowano rów nież deaminację adenozyny do inozyny. Powyższe obserwacje sugerują udział deaminazy adenozyny w uwalnianiu purynoreceptorów PI od naturalnego agona [17]. Ci sami autorzy stwierdzili również niską aktywność deaminazy adenozyny w cholinergicznych synapsach kory mózgowej i hipokampu [17 ,18].
Interesującą jest obserwacja, że występująca na powierzchni błony komórkowej deaminaza adeno
zyny nie jest glikoproteiną i nie zawiera peptydu sygnalnego kierującego j ą do błony komórkowej [46], Nie wiadomo więc, w jaki sposób enzym może pojawiać się na zewnątrz komórki, czy odbywa się to w wyniku sekrecji czy lizy [16, 46, 47], Znany jes t natomiast sposób umocowania enzymu w błonie komórkowej. Deaminaza adenozyny może ulec asocjacji z białkami wiążącymi deaminazę adenozyny — ADA-BP (ang. A D A -B inding P rotein) i utworzyć kompleksy o dużej masie cząsteczkowej. Część białek należących do ADA-BP to integralne białka błonowe, z udziałem których enzym może zostać związany z strukturą błony komórkowej. Są znane dwa takie białka: białko CD26 identyczne z dipepty- dylopeptydazą IV oraz receptor A 2B limfocytów T [46], Stosując przeciwciała dowiedziono, że deam inaza adenozyny i receptory A, mają identyczną lokalizację (kolokalizację) w strukturze błon komórek mięśni gładkich D DTiM F-2 oraz membran neuronów kory mózgowej szczura [48-53]. W 1996 roku S a u r a i in. wykazali, że deaminaza adenozyny w ystępuje w kolokalizacji z receptorami A) błon pla- zmatycznych kory mózgu wieprzowego [49]. Było to pierwsze doniesienie o kolokalizacji w błonach pla- zmatycznych mózgu ektoenzymu i receptora, k tórego naturalny agon jest jednocześnie substratem enzymu. W późniejszym doniesieniu ci sami autorzy stwierdzają wspólną internalizację w komórkach deaminazy adenozyny i receptorów Ai [52, 53]. A utorzy sądzą, że receptory A) w ystępują w dwu stanach charakteryzujących się różnym powinowactwem do adenozyny. Receptor o wysokim powinowactwie do adenozyny (K d = 0 .1-0.2 nM) to receptor związany z białkiem G, natomiast receptor niezwiązany z białkiem G ma niższe powinowactwo (K d= l-2 nM). Wykazano, że w nieobecności deaminazy adenozyny receptory te posiadają niskie powinowactwo do adenozyny. Badania te sugerują więc, że w komórce oprócz funkcji katalitycznej, jak ą jes t deaminacja zewnątrzkomórkowej adenozyny, deaminaza adenozyny, zwiększając powinowactwo receptora do białka G pełni funkcję pozaenzym atyczną [52, 53]. Limfocyty z udziałem białka CD26 i deaminazy adenozyny m ogą wiązać się z komórkami zrębu tkanki limfatycznej [46]. Ta obserwacja oraz interakcja i kolokalizacja deaminazy adenozyny zarówno z receptorami Ai i białkiem CD26 stała się podstaw ą hipotezy, że ADA podczas tworzenia się struktur nerwowych może pełnić również funkcję cząsteczki ułatwiającej adhezję komórek neuron/neuron, neuron/komórka glejowa, komórka glejowa/komórka glejowa podczas tworzenia się struktur nerwowych [46, 47],
234 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
V. Funkcje adenozyny w centralnym układzie nerwowym
Badania roli adenozyny w układzie nerwowym dotyczą jej funkcji jako:
1 ) neuromodulatora biorącego udział w przekazywaniu sygnału nerwowego
2 ) cząsteczki odgrywającej istotną rolę w ochronie neuronów w sytuacjach stresowych
3) związku o charakterze parakrynowym uczestniczącym w procesach proliferacji i apoptozy komórek wielu typów [2, 54].
Jedną z głównych funkcji adenozyny w centralnym układzie nerwowym jest regulacja wydzielania neuroprzekaźników [55, 56]. Neuromodulator może wpływać na wydzielanie i efekty fizjologiczne m ediatorów synaptycznych za pośrednictwem receptorów pre-, post- i pozasynaptycznych [57], W m odulację wydzielania neuroprzekaźników w szczelinie synaptycznej są zaangażowane przede wszystkim receptory A! i A 2a- Niewiele zaś na razie wiadomo o udziale w tym procesie receptorów A 2B i A 3 [2].
V -l. Regulacja wydzielania neuroprzekaźników z udziałem receptorów adenozynowych A,
W obrębie centralnego układu nerwowego za pośrednictwem receptorów A \ adenozyna hamuje w ydzielanie przez neurony: acetylocholiny [15,58], noradrenaliny [59, 60] dopaminy [61], glutaminianu [62], serotoniny [63] i G ABA [64, 65].
W warunkach fizjologicznych stężenie pozako- mórkowej Ado wynosi 0,3-300 nM. W sytuacjach stresowych typu niedotlenienie, niedokrwienie, hi- poglikemia lub nadmiar dwutlenku węgla we krwi (hiperkapnia) może wzrosnąć nawet stukrotnie, do poziomu mikromolowego [66]. Podczas niedokrwienia mózgu następuje uwalnianie nadmiernych ilości neuroprzekaźników pobudzających (głównie aminokwasów- glutaminianu i asparaginianu) oraz osłabienie wychwytu glutaminianu przez astrocyty. Jakkolwiek brak jest dowodów to fakt, że ATP jest m agazynowane w pęcherzykach synaptycznych wraz z innymi pobudzającymi neurotransmiterami, może sugerować, że aktywacja presynaptycznych receptorów Ai ogranicza również wydzielanie ATP — prekursora adenozyny. Efektem tych procesów jes t nadmierna aktywacja receptorów glutaminianergicznych zarówno metabotropowych jak i jonotropowych (w tym również receptorów NM DA). Prowadzi to do niekontrolowanej depolaryzacji neuronów i przedłużającej się ich aktywności. Nadmierna i przedłużająca się aktywacja receptorów glutaminianergicz-
nych powoduje degenerację komórek nerwowych. Jest to zjawisko określane jako ekscytotoksyczność. G łów ną i destrukcyjną rolę przypisuje się w tym procesie jonom Ca2+. Wysokie stężenie jonów wapnia w cytoplazmie uruchamia procesy prowadzące do degeneracji neuronów, w wyniku tworzenia wolnych rodników i nadtlenków oraz aktywacji niszczących strukturę komórki proteaz, nukleaz i fosfolipaz [66-69]. W tych warunkach podstawową funkcją adenozyny jes t hamowanie aktywności neuronów przez zmniejszanie ilości neuroprzekaźników pobudzających. Zapobiega to degradacji neuronów. W tym procesie uczestniczą głównie receptory Ai związane z błoną presynaptyczną. Autorzy rozw ażają następujące mechanizmy hamowania presynap- tycznego:— otwieranie presynaptycznych kanałów K + pro
wadzące do hiperpolaryzacji neuronów i zaham owania wpływu jonów Ca2+ przez kanały bram kowane napięciem [ 10 ],
— zamykanie kanałów wapniowych w błonach p resynaptycznych prowadzące do bezpośredniego hamowania egzocytozy uwarunkowanej jonam i Ca2+ [70, 71],
— oddziaływanie na egzocytozę pęcherzyków synaptycznych, ale bez wpływu na przemieszczanie się jonów Ca2+ [72].Dodatkowo aktywacja postsynaptycznych recep
torów A] może powodować zmniejszanie pobudliwości błony postsynaptycznej oraz hiperpolaryzację poprzez zwiększanie przewodności błony kom órkowej dla jonów K+ i zmniejszanie przewodności dla jonów Ca2+ [73,74]. Adenozyna za pośrednictwem receptorów A 2 stymuluje na poziomie pozasynap- tycznym powstawanie glukozy w astrocytach w procesie glikogenolizy oraz zwiększa dopływ krwi do rejonów mózgu objętych niedotlenieniem/niedokrwieniem poprzez rozszerzanie naczyń krw ionośnych i hamowanie agregacji płytek krwi [66 , 75, 76].
V-2. Regulacja wydzielania neuroprzekaźników za pośrednictwem receptorów A2a, A 2B i A3
Przypuszcza się, że jed n ą z głównych funkcji receptorów A 3 w mózgu jes t regulacja aktywności receptorów Ai [10]. Stwierdzono, że aktywacja receptorów A 3 w hipokampie szczura powoduje odczulenie receptorów Ai, których aktywność hamuje w y dzielanie neuroprzekaźników pobudzających [77]. Stwierdzono również, że poprzedzający niedokrwienie mózgu zróżnicowany czas stymulacji in vivo re ceptorów A 3 h ipokampu przez selektywny agon —
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 235http://rcin.org.pl
IB-M ECA (N 6-(3-jodobenzylo)-adenozyno-5 ’-N- m etylokarboksyamid) wywiera istotny wpływ na przeżywalność neuronów i przepływ krwi w naczyniach. Krótkotrwała stymulacja tego podtypu receptorów wywołuje zwiększenie uszkodzeń neuronów i zmniejszenie przepływu krwi, natomiast d ługotrwała stymulacja powoduje prawdopodobnie ich odczulenie. Prowadzi to do zwiększenia krążenia krwi i zmniejszenia zmian neuropatologicznych [78]. W ydaje się więc, że w przeciwieństwie do receptorów Aj, które w warunkach stresowych pełnią funkcje ochronne wobec neuronów, receptory A 3 m ogą indukować śmierć komórek [69, 78].
A denozyna i inne agony receptorów A 2a zwiększają uwalnianie neurotransmitterów w obrębie centralnego i obwodowego układu nerwowego [2]. W hipokampie stwierdzono obecność receptorów pre- synaptycznych A \ hamujących, jak i presynaptycz- nych receptorów A 2a zwiększających uwalnianie acetylocholiny [58]. C u n h a i inni stwierdzili również, że uwalnianie acetylocholiny w różnych regionach hipokampu może być regulowane przez odmienne podtypy receptorów Pj. Selektywny agon receptora A 2a — CGS-21680 powoduje zwiększanie wydzielania [H3]-acetylocholiny podczas stymulacji elektrycznej w regionie CA3 i w obszarze “dentate g yru s” hipokampu. W obszarze CA1 były obecne tylko receptory Aj związane z ham owaniem w ydzielania acetylocholiny [58]. Podobnie CGS21680 zw iększał wydzielanie [H3]-acetylocholiny z synaptoso- mów hipokampu i prążkowia [79, 80]. Ten efekt w synaptosomach hipokampu znosił nieselektywny an- tagon receptorów A 2 — DM PX (1 ,3-dimetylo-7-pro- pyloksantyna) oraz antagon receptorów A 2a — CSC (8-8-(3-chlorostyrylo)kofeina) [79]. Bardzo interesującym wydaje się fakt, że adenozyna, która stymuluje receptory A) oraz A 2a w szczelinie synaptycznej hipokam pu może pochodzić z różnych puli nukleozydu. Wydaje się, że podczas stymulacji prądem o dużej częstotliwości (100 Hz) adenozyna w szczelinie synaptycznej pochodzi głównie z hydrolizy poza- kom órkowego ATP. Ta pula pozakomórkowej adenozyny stymuluje głównie receptory A 2A, podczas gdy adenozyna aktywująca receptory A \ jest uwalniana bezpośrednio przez kom órkę [15, 81].
Receptory A 2a, podobnie jak receptory A), m odulują tak uwalnianie acetylocholiny jak i wydzielanie innych neuroprzekaźników. Selektywny agon receptorów A 2a z GABAergicznych neuronów łączących prążkowie z kompleksem gałki bladej — CGS-21680 zwiększa uwalnianie G ABA spowodowane stym ulacją elektryczną [82]. Nie jes t do końca poznany mechanizm, dzięki któremu agony presy-
naptycznego receptora A 2a mogą zwiększać wydzielanie neuroprzekaźników. Sądzi się, że w przeciwieństwie do presynaptycznych receptorów A ^które hamują wydzielanie neuroprzekaźników zamykając kanały wapniowe, .receptory A 2a otwierają kanały wapniowe w błonach komórkowych neuronów oraz promują egzocytozę zależną od jonów wapnia [83, 84]. Receptory A 2a aktywują cyklazę adenylanową. Brak jednak dowodów czy związana z receptorami A 2a aktywacja kanałów wapniowych w błonach presynaptycznych regionu CA3 hipokampu szczura wymaga udziału cAMP i kinazy białkowej A, kinazy białkowej C lub tylko białka G [84]. Na powierzchni różnych typów komórek ekspresji może ulegać więcej niż jeden podtyp receptora P I. Taka sytuacja zachodzi między innymi w przypadku receptorów A\ i A 2a błon presynaptycznych regionu CA3 hipokampu szczura oraz zakończeń nerwowych prążkowia [58,85]. Wiadomo, że receptory A 2A z zakończeń nerwowych prążkowia regulują powinowactwo receptorów D 2 do agona [86]. Okazuje się, że selektywny agon receptorów A 2a — CGS21680 może pow odować również odczulenie i zmniejszenie pow inowactwa receptorów A) do agona. W proces ten jest zaangażowana kinaza białkowa C [85].
Udział receptorów A 2B w regulacji egzocytozy neuroprzekaźników nie jes t do końca wyjaśniony. Niektóre badania wskazują na udział tego podtypu receptora w modulacji wydzielania neuroprzekaźników w pniu m ózgu i hipokampie [27, 87].
VI. Podsumowanie
Ektopuryny i ich receptory występują w przestrzeniach międzykomórkowych każdej tkanki i narządu ssaków. Regulują wiele procesów fizjologicznych, a zmiany w ich metabolizmie lub stężeniu mogą być przyczyną procesów patofizjologicznych [88]. Trudno przecenić rolę ektoadenozyny w regulacji m etabolizmu centralnego układu nerwowego, układu krwionośnego czy nerek. Puryny są stosowane w hamowaniu rozwoju chorób Parkinsona i Alzheimera a także w terapii przeciwbólowej [89,90]. Nukleozyd ten używany jest w leczeniu schorzeń serca i naczyń krwionośnych. Adenozyna jes t lekiem stosowanym w terapii zawałów, a jego analogi używane jako czynnik antyagregacyjny [76]. Adenozyna i agony receptorów PI są lekami stosowanymi w leczeniu chorób nerek i układu oddechowego, leczeniu astmy [88]. Z tych też powodów poznanie mechanizmu przekazywania sygnałów z udziałem adenozyny i pu- rynoreceptorów PI ma ogromne znaczenie praktyczne. Jednak mimo intensywnych i wieloletnich badań
236 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
nie wyjaśniono szeregu istotnych spraw związanych z przenoszeniem sygnałów z udziałem receptorów PI. Brakuje bezpośrednich dowodów wskazujących na źródła tego nukleozydu i nie poznany jest m echanizm eksportu adenozyny poza komórkę, a rola deaminazy ektoadenozyny również w tych procesach budzi kontrowersje. W ykazano bowiem, że w wielu rejonach m ózgu aktywność deaminazy jes t bardzo niska, a inne są jej pozbawione [17, 18]. Z naszych badań nad enzymami metabolizującymi ektopuryny w naczyniach krwionośnych człowieka wynika, iż aktywność deaminazy ektoadenozyny stanowi n iewielki procent aktywności innych ektohydrolaz nu- kleotydów purynowych [91]. Skutkiem tego we krwi utrzymuje się stały wysoki poziom tego nukleozydu. Podobne obserwacje dotyczą synaptosomów kory mózgu świni {personal com unication — Kukulski). Być może nieproporcjonalnie niska aktywność deaminazy ektoadenozyny (w porównaniu z innymi ektohydrolazami nukleotydów) w korze m ózgu i w endotelium naczyń krwionośnych związana jest z ochronną funkcją tego nukleozydu. Ten problem oraz mechanizm eksportu adenozyny do przestrzeni pozakomórkowej wymaga dalszych badań.
Artykuł otrzymano 5 lipca 2001 Zaakceptowano do druku 29 kwietnia 2002
Piśmiennictwo.
1. B u r n s t o c k G (1979) W: B a e r H P , D r u m m o n d G I (red) Physiological and regulatory function s o f adenosine and adenine nucleotides. Raven Press, New York, str. 3-32
2. R a l e v i c V , B u r s t o c k G (\99S) Pharmacol Rev 3: 413-4923. D r u r y A N, S że n t - G y o r g y i A (1 9 2 9 )J Physiol (London) 68:
213-2374. S a t t i n A, R a i l T W (1970) Mol Pharmacol 6: 13-235. L l o y d H G E , L i n d s t r o m K, F r e d h o l m B B (1993) Neuro-
chem ln t 23:173-1856. L a t i n i S , B o r d o n i F . P c d a t a F , C o r r a d e t t i R(1999 )B rit
J Pharmacol 127: 729-7397. B e r m a n R F , F r e d h o l m B B , A d e n U, O ’C o n n o r W T
(2000) Brain Res 872:44-538. K o b a y a s h i S, Z i m m e r m a n n H, M i l l h o r n D E (2000) J
Neurochem 74: 621-6329. D u n w i d d i e T V, D i a o L (2000) Neurosci 95: 81-8210. B r u n d e g e J M, D u n w i d d i e T V ( l 997) Advances in Pharma
cology 39: 353-3911 1 . A r c h J R , N e w s h o l m E A (1978) Biochem J 174: 965-97712. C e b a l l o s G, T u t t l e J B, R u b i o R (1994) J Neurochem 62:
1144-115313. Z i m m e r m a n n H (1994) Trends Neurosci 17: 420-42614. C u n h a R A, V i z i E S , R i b e i r o J A, S e b a s t i a o A M (1996)
J Neurochem 67: 2180-218715. R i b e i r o J A, C u n h a RA, C o r r e i a - d e - S a P, S e b a s t i a o
A M (1996) Prog Brain Res 109: 231-2411 6 .Zi m m e r m a n n H (1996) Drug Dev Res 39: 337-35217. R i c h a r d s o n P J, B r o w n SJ , B a i l y e s E M, L u z i o J P
(1987) Nature 327: 232-23418. C u n h a R A, S e b a s t i a o A M, R i b e i r o J A (1992) J Neuro
chem 59: 657-66619. G e r e a u x R W, C o n n P J (1994) Neuron 12: 1121-1129
20. D i x o n K A , G u b i t z A K , S i r i n a t h s i n g h j i D J S , R i c h a r d s o n PJ, F r e e m a n T C (1996) Brit J Pharmacol 118: 1461-1468
21. F u r l o n g T J, P i e r e e K D , S e l b i e LA, S h i n e i( \9 9 2 )M o l Brain Res 15: 62-66
22. C h e r n Y, K i n g K, L a i H L , L a i H T (1992) Biochem Biophys Res Commun 185: 304-309
2 3 . M e n g F, X i e GX, C h a l m e r s D, M o r g a n C, W a t s o n SJ, A k i 1 H (1994) Neurochem Res 19: 613-621
24. S v e n n i n g s s o n P, L e M o i n e C, F i s o n e G, F r e d h o l m B B (1999) Prog Neurobiol 59: 355-396
25. P i e r c e KD, F u r l o n g T J, S e l b i e LA, S h i n e J (1992) Biochem Biophys Res Commun 187: 86-93
26. S t e h l e J H , R i v k e e s S A, L e e J J, W e a v e r DR, D e e d s J D, R e p p e r t S M (1992) Mol Endocrinol 6: 384-393
27. K e s s e y K, M o g u 1 D J (1998) Neurosci 84: 59-6928. Z h o u QY, L i C, O l a h ME , J o h n s o n R A, S t i l e s GL ,
C i v e 1 1 i O (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 7432-743629. S a l w a t o r e C A, J a c o b s o n M A, T a y l o r HE, L i n d e n J,
J o h n s o n R G (1993) Pro Natl Acad Sci USA 90: 10365-1036930. B r u n d e g e J M, D u n w i d d i e T M (1998) Neuro Report 9:
3007-30113 1 . G r i f f i t h DA, J a r v i s S M (1996) Bioch Biophys Acta 1286:
153-18132. D e c k e r t J, M o r g a m FF, M a r a n g o s PJ (1988) Life Sci 42:
1331-134533. G u J G, F o g a IO , P a r k i n s o n FE, G e i g e r J D (1995) J Neu
rochem 64: 2105-211034. B e n d e r AS , W u P H, P h i l l i s J W (1980) J Neurochem 33:
629-64035. B a r b e r i s C, M i n n A, G a y e t J (1981) J Neurochem 36:
347-35436. T h a m p y K G , B a r n e s E M (1983) JNeurochem 40: 874-87937. W u X, Y u a n G, B r e t t C M, H u i AC, G i a c o m i n i K M
(1992) J Biol Chem 267: 8813-881838. W a n g J . S c h a n e r M E , T h o m a s s e n S , Su S F , P i q u e t t e -
M i l l e r M , G i a c o m i n i K M (1997) Pharmac Res 14: 1524-1532
39. C a s s E C , Y o u n g J D, B a l d w i n S A (1998) Biochem Cell Biol 76: 761-770
40. A n d e r s o n C M , X i o n g W, Y o u n g J D , C a s s C E , P a r k i n s o n ¥ E (\996) Brain Res Mol Brain Res 42:358-361
4 1 . C c n t e l l e s J J, F r a n c o R, B o z a l J (1988) J Neurosci Res 19: 258-267
42. S z a r o j a n SG, A n t o n y a n A A, M a r d a n y a n S S (1994) Biokchimija 59: 239-245
43. Y a m a m o t o T, G e i g e r J D , D a d d o n a PE, N a g y J I (1987) Brain Res Bull 19: 473-484
44. P u 1 1 I, M c I 1 w a n H (1974) Biochem J 144: 37-41.45. T r a m s E G, L a u t e r C J (1975) Biochem J 152: 681-68746. F r a n c o R, V a l e n z u e l a A, L l u i s C, B l a n c o J (1998) Im
munol Rev 161: 27-4247. F r a n c o R , C a s a d o V , C i r u e l a F , S a u r a C , M a l l o l J , C a n
e 1 a El , L l u i s C (1997) Prog Neurobiol 52: 283-29448. N a g y J I, Y a m a m o t o T, U e m u r a H , S c h r a d e r P (1996)
Neurosci 73: 459-47149. S a u r a C, C i r u e l a F, C a s a d o V, C a n e l a El , M a l l o l J,
L l u i s C, F r a n c o R (1996) J Neurochem 66: 1675-168250. R u i z MA, E s c r i c h e M, L l u i s C, F r a n c o R, M a r t i n M,
A n d r e s A, R o s M (2000) J Neurochem 75: 656-66451. Herrera C, Casado V, Ciruela P, Schofield P, Mallol J, Lluis C,
Franco R (2001) M ol Pharmacol 59: 127-13452. C i r u e l a F, S a u r a C, C a n e l a El , M a l l o l J, L l u i s C,
F r a n c o R (1996) FEBS Letters 380: 219-22353. S a u r a C A, M a l l o l J, C a n e l a El , L l u i s C, F r a n c o R
(1998) J Biol Chem 273: 17610-1761754. J a c o b s o n K A, H o f f m a n n C, C a t t a b e n i F,
A b b r a c c h i o M P (1999) Apoptosis 4: 197-21155. D u n w i d d i e T V , H o f f e r B J (1980)B rJP harm aco l69: 59-6856. P h y 11 i s J W, W u P H (1981) Prog Neurobiol 16: 187-19357. B u r n s t o c k G (1998) W: T u r n e r J T, W e i s m a n G A ,
F e d a n J S (red) The P2 nucleotide receptors. Humana Press, Toto- wa, New Jersey, str. 3-40
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 237http://rcin.org.pl
58. C u n h a R A , M i l u s h e v a E, V i z i ES , R i b c i r o J A, S e b a s t i a o A M (1994) J Neurochem 63: 207-214
59. v o n K u g e l g e n I, S p a t h L, S t a r k e K (1992) Na- unyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol 346: 187-196
60. J a c k i s c h R , F e h r R , H e r t t i n g G (1985)Neuropharmacology 24: 499-507
61 . M i c h a e l i s ML, M i c h a e l i s EK, M y e r s S L (1979 ) Life Sci 24: 2083-2092
62. D o l p h i n AC, F o r d a S R , S c o t t R H (1983) J Physiol (London) 313: 41-61
63. F e u e r s t e i n T J, H e r t t i n g G, J a c k i s c h R (1985) 2s«r7 Pharmacol 107: 233-242
6 4 . W u Y, M e r c u r i NB, J o h n s o n S W (1 995) J Pharmacol Exp Ther 273: 576-581
65. U l r i c h D, H u g u e n a r d J R (1995) Neuron 15: 909-91866. D r a g u n o w M, F a u l l R L M (1 9 8 8 ) Trends Pharmacol Sci 9:
193-19467. R u d o l p h i KA, S c h u b e r t P , P a r k i n s o n FE, F r e d h o l m
B B (1992) Trends Pharmacol Sci 13: 439-44568. R u d o l p h i KA, S c h u b e r t P, P a r k i n s o n FE, F r e d h o l m
(1992) Cerebrovascular and brain metabolism reviews 4: 346-36969. A b b r a c c h i o M P , C e r u t i S , B r a m b i l l a R , F r a n c e s c h i
C, M a l l o r n i W, J a c o b s o n K, v o n L u b i t z D K J E , C a t a b e n i F (1 997) Annals o f the New York Academy o f Science 825: 11-22
70. S c h u b e r t P, O g a t a T, M a r c h i n i C, F e r r o n i S, R u d o l p h i K (1991) Annals o f the New York Academy o f Science 825: 1-10
7 1 . A m b r o s i o A F, M a 1 v a J O, C a r v a l h o A P, C a r v a l h o C M (1997) Eur J Pharmacol 340: 301-310
72. W u L G , S a g g a u P (1994) Neuron 12: 1139-114873. S c h o 1 z K P, M i 1 1 e r R J (1992) Neuron 8: 1139-1150
74. T h o m p s o n SM, H a a s HL, G a h w i l e r B H (1992) J Physiol (London) 451: 347-363
75. G e r b e r U, G r e e n e RW, H a a s RW, S t e v e n s D R (1989)7 Physiol (London) 417: 567-578
76. P i c a n o E, A b b r a c c h i o M P (2000) Brain Res Bull 52: 75-8277. D u n w i d d i e TV, D i a o L , K i m H , J i a n g J L , J a c o b s o n K
A (1997) 7 Neurosci 17: 607-61478. v o n L u b i t z D K J E , P o p i k P , C a r t e r M F , J a c o b s o n K A
(1994) Eur J Pharmacol 163: 59-6779. C u n h a R A, J o h a n s s o n B, F r e d h o l m BB, R i b c i r o JA,
S e b a s t i a o A M (1995) Neurosci Lett 196: 41-4480. K i r k p a t r i c k K A, R i c h a r d s o n P J (1993) Br 7 Pharmacol
110: 949-95481 .R i b e i r o JA , d e M e n d o n c a A, C o r r e i a - d e - S a P,
C u n h a RA, S e b a s t i a o A M (1996)D rugD evR es39: 353-36082. M a y f i e l d RD, S u z u k i F, Z a h n i s e r N R (1993) 7 Neuro
chem 60: 2334-23378 3 . G u b i t z AK, W i d d o w s o n L, K u r o k a w a M, K i r k p a t
r i c k KA, R i c h a r d s o n PJ (1996) J Neurochem 67: 374-3818 4 .G o n c a lv e s M L , C u n h a R A, R i b c i r o J A (1997) Neurosci
Lett 238:73-7785 . D i x o n A K, W i d d o w s o n L, R i c h a r d s o n PJ (\991) J Neu
rochem 69: 315-32186. F e r r e S , F r e d h o l m B B , M o r e l l i M , P o p o l i P , F u x e K
(1997) Trends Neurosci 20: 482-48787 .U m e m i y a M, B e r g e r A J (1994) Neuron 13: 1439-144688. W i n d s c h e i f U (1996) 7 Pharm Pharmacol 48: 993-101189. K a i s e r S M, Q u i n n R J (1999) DD T 4: 542-55190. M ü 1 1 e r C H (2000) Drugs o f the Future 25:1043-10529 1 . Ł ę c k a J, M o l s k i S, K o m o s z y ń s k i M (2000) W: V a n d u-
f f e l L, [ 2 ] L e m m e n s R (red) Ecto-A TP-ases and Related Nucleotidases. Shaker Publishing, Maastricht, The Netherlands, str. 167-174
238 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
Recenzja książki „Wybrane zagadnienia z biochemii ogólnej z ćwiczeniami”
Autorzy: Maria Gałka-Walczak, Teresa Kędryna i Barbara Ostrowska Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 2001
Przedstawiona do recenzji książka jest zbiorem ćwiczeń studenckich zgrupowanych w 29 rozdziałach. Każdy z tych rozdziałów, nazywanych w książce: Ćwiczeniem, zawiera obszerny wstęp teoretyczny. Całość mieści się na 450 stronach. Ostatni, 30 rozdział poświęcony jes t statystycznemu opracowaniu wyników doświadczalnych. Książka ta, zgodnie z zamiarem Autorek, jes t przeznaczona głównie dla studentów Oddziału Analityki Medycznej W ydziału Farmaceutycznego Collegium Medicum U niwersytetu Jagiellońskiego oraz dla studentów innych wydziałów medycznych; Lekarskiego, Stomatologicznego i Farmaceutycznego. To w sposób oczywisty zdecydowało o doborze' proponowanych ćw iczeń; duża ich część to ćwiczenia analityczne jak o ściowe (np. reakcje charakterystyczne am inokwasów, próby redukcyjne dla monosacharydów i disa- charydów, reakcje charakterystyczne dla bilirubiny) oraz ilościowe (np. oznaczanie glukozy, cholesterolu, HDL, kreatyniny, mocznika, triacylogliceroli, poziomu elektrolitów w surowicy krwi; oznaczanie glukozy, kwasu m oczow ego w moczu). Ćwiczenia te są stosunkowo proste i tw orzą klasyczny zestaw, odpowiedni dla wstępnego kursu biochemii, a właściwie analityki biochemicznej. W przyszłości warto może zastanowić się nad wzbogacaniem podobnych opracowań w coraz nowocześniejsze techniki stosowane w laboratorium biochemicznym, nawet kosztem opisu niektórych tradycyjnych ćwiczeń analitycznych. Nie znaczy to, że w omawianym skrypcie nie ma ćwiczeń nowoczesnych, dotyczących metod współcześnie stosowanych w analityce medycznej.
Teoretyczne wprow adzenia do każdego ćwiczenia zdecydowanie u łatwiają zrozumienie części praktycznej. Są one bardzo obszerne, często bardzo szczegółowe i p rzypom inają raczej opracowania podręcznikowe, niż krótkie wstępy do ćwiczeń zazwyczaj spotykane w zestawach ćwiczeń dla studentów. To duży walor recenzowanej książki. Nie udało się jednak A utorkom uniknąć błędów i niejasności. I tak na przykład: na stronach 143 i 156 (tutaj tłustym drukiem) napisano, że „przy stężeniach substratu,
przekraczających stężenia enzymu, reakcja enzym atyczna przebiega jako reakcja pierwszego rzędu w stosunku do enzymu oraz jako reakcja zerowego rzędu w stosunku do substratu” . Tymczasem, jednym z założeń przy wyprowadzaniu równania Michaeli- sa-Menten jes t to, że stężenie substratu jest znacznie wyższe niż stężenie enzymu. Stopień wysycenia enzymu substratem zależy nie tylko od stężenia tego ostatniego, ale od powinowactwa enzymu do substratu. Reakcja staje się zerowego rzędu w stosunku do substratu, wtedy gdy jego stężenie znacznie (wielokrotnie) przekracza wartość K m a szybkość początkowa reakcji zbliży się do szybkości m aksymalnej. Dalsza część wywodu dotyczącego kinetyki enzymatycznej jest poprawna, a zatem niezrozumiałe jes t umieszczenie tego niefortunnego stwierdzenia. Na stronie 230 umieszczono informację, że „fruktozo-2,6-difosforan (nawiasem mówiąc jest to bisfosforan, podobnie jak fruktozo- 1,6-difosforan i 1,3-difosfoglicerynian ze str. 305, 306 są bisfosfora- nami) .... jes t wytwarzany tylko w wątrobie, ...” co nie jes t prawdą, ponieważ tworzy się on także w m ięśniu sercowym. Jego powstawanie katalizuje rów nież fosfofruktokinaza II, różniąca się od enzymu wątrobowego pod względem regulacji aktywności. W Ćwiczeniu 18 poświęconym cukrom napisano, że „większość m onosacharydów ma właściwości redukujące” . Sądzę, że należało by podać przykład takiego cukru prostego, który nie wykazuje właściwości redukujących. W tym samym rozdziale opis budowy cząsteczki glikogenu jes t niejasny. Nie wynika z niego, które wiązania tworzą rozgałęzienia, a które łańcuch główny. Ponadto występowanie w glikoge- nie wiązania 1-3 nie jes t powszechnie opisywane w podręcznikach, a zatem warto może podać źródło tej informacji. Termin „dehydrogenaza pirydynowa” (str. 304) nie wydaje się poprawny. Skrótem acetylo- koenzymu A jes t acetyloCoA, a nie acetyloKoA. Uważam, że w opracowaniach przeznaczonych dla studentów, należy szczególnie zawracać uwagę na stosowanie nazewnictwa zgodnego z ogólnymi zaleceniami.
POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002 239http://rcin.org.pl
Ponadto: na stronie 53, przy okazji omawiania metod oznaczania białka podano nazwę błękit kuma- zyny. Oczywiście chodzi tu o błękit Coomassie, niekiedy w żargonie laboratoryjnym zwany „kuma- syną” . Błękit kumazyny wydaje mi się określeniem dość niefortunnym. Opis mechanizmu działania enzymów allosterycznych umieszczony na stronie 167 jes t niejasny i dla osoby nie znającej tego zagadnienia - zupełnie niezrozumiały. Podobnie, mało precyzyjny wydaje się opis syntezy ATP na str. 304. Na stronie 189 napisano, że: „... peroksydaza występuje w komórkach różnych tkanek, na przykład tarczycy, błony śluzowej jelita, w płucach oraz w trzustce” . Sadzę, że zręczniej jes t zastąpić słowo „tkanka” terminem „narząd”.
Mimo tych uwag, om aw iana książka stanowi niewątpliwie bogate źródło ogólnej w iedzy b iochemicznej przydatnej s tudentom kierunków m edycznych oraz obszerny zbiór opisów doświadczeń jakie wykonuje się w pracow niach studenckich, nie tylko w uczelniach o profilu farm aceutycznym czy lekarskim. Dlatego przedstawione mi opracowanie powinno wzbudzić zain teresow anie studentów i nauczycieli akademickich prowadzących zajęcia z biochemii ogólnej na uniwersyteckich wydziałach biologicznych oraz w wyższych szkołach rolniczych.
K rzysztof Zabłocki
Dr, Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN 02-093 Warszawa, ul. Pasteura 3
240 POSTĘPY BIOCHEMII 48(3), 2002http://rcin.org.pl
http://rcin.org.pl
Wskazówki dla Autorów
W yd a w a n y p rzez Polskie Tow arzystw o Biochem iczne kw artalnik „Postępy B iochem ii" publiku je prace p rzeg lądow e om aw ia jące nowe osiągn ięcia, koncepcje i kierunki badaw cze w dz iedzin ie biochem ii i nauk pokrew nych; publiku je też noty z historii biochemii, zasady po lsk iego słow nictw a b iochem icznego, recenzje nadesłanych książek o raz sp raw ozdan ia ze z jazdów , konferencji i szkół, w których b io rą udz ia ł członkow ie Towarzystwa.
Prace p rzeznaczone do pub likac ji w „Postępach Biochem ii" m ogą mieć charakter a rtyku łów m onograficznych (do 2 0 stron tekstu licząc piśm iennictwo i tabele), m inireviews (do 10 stron tekstu), o raz krótkich not o najnowszych os iągn ięciach i pog lądach (do 5 stron tekstu).
Au to rzy artykułu o d p o w ia d a ją za p raw id łow ość i ścisłość podaw anych in form acji o raz popraw ność cy tow anego piśmiennictwa. U jęcie prac w inno być syntetyczne, a p rzedstaw ione za gadnien ia zilustrowane za pom ocą tabel, rycin: wykresy, schematy, reakcje, w zo ry i fo togra fie .
W skazany jest p o d z ia ł a rtyku łów m onograficznych na rozdz ia ły i podrozdz ia ły , których rzeczow e tytu ły tw orzą spis treści. Zgodn ie z przyjętą konwencją rozd z ia ły noszą cy fry rzymskie, pod ro zd z ia ły o d p ow ie dn io rzymskie i arabskie, np. 1-1, 1-2. Poprawność log iczna i stylistyczna tekstu warunku je jego jednoznaczność i czytelność. A u to rzy prze to w inn i unikać składni ob cojęzycznej, g w a ry labo ra to ry jne j, a także og ran iczać stosowanie doraźn ie tworzonych skrótów, naw et jeśli b yw a ją używ ane w pracach specjalistycznych. Każda z nadesłanych do Redakcji prac pod lega ocenie specja listów i op racow an iu redakcyjnemu. Redakcja zastrzega sobie m ożliw ość skrócenia tekstu i w p row a dzenia zm ian nie w p ływ a ją cych na treść pracy, deklaru je też go towość konsultowania tekstu z Autoram i.
Przekazanie artykułu do redakcji jest rów noznaczne z oświadczeniem , że nadesłana praca nie by ła i nie będzie publikow ana w innym czasopiśm ie, jeżeli zostanie og łoszona w „Postępach B iochem ii". W przypadku , g d y Autor(zy) zam ierza(ją) w łączyć do swego artykułu ilustracje pub likow ane przez autorów prac cytowanych, na leży uzyskać i p rzekazać nam o d p o w iedn ią zgodę na przedruk.
Redakcja prosi A u to rów o przestrzegan ie następujących wskazówek szczegółowych:
TEKST: prosim y o nadsyłanie dw óch egzem p la rzy wydruku o raz dyskietki z tekstem zapisanym jako * .d o c w form acie IBM PC. W yd ruk pow in ien być jednostronny z lewym marginesem około 4 cm, z zachow aniem p o d w ó jn eg o odstępu m iędzy w ie rszami, z użyciem czcionki A ria l CE 11 lub 12. W p rzypadku stosowania w tekście liter a lfabetu greckiego prosim y o w pisanie ołówkiem na marginesie ich fonetycznego brzm ienia.
Strona informacyjna jest n ienum erowana, zaw ie ra im iona i nazw isko (a) Autora (ów), nazw y, adresy, telefony, adresy e-maii
zak ładów , w których p racu ją Autorzy, adres do korespondencji, tytuł artykułu w języku polskim i angielskim o raz - w p raw ym do lnym rogu: liczbę tabel, rycin, w z o ró w i fo togra fii o raz skrócony tytuł pracy, zam ieszczany na ok ładce czasopisma (do 25 znaków).
Strona 1 (tytu łowa) zaw ie ra im iona i nazwiska Autorów , tytu ł p racy w języku polskim i angielskim, rzeczow y spis treści też w obu językach, tytu ł naukow y każdego z A u to rów i ich miejsce p racy z adresem pocztow ym i adresem e-mail o raz w ykaz stosowanych skrótów w porządku a lfabetycznym .
Kolejno num erowane dalsze strony obejm ują tekst pracy, piśm iennictwo, tabele, podp isy i ob jaśnienia rycin, w zo rów i fo togra fii.
PIŚMIENNICTWO: W yk a z piśm iennictwa obejm uje prace w kolejności ich cytow an ia w tekście, zaznacza się je liczbam i porządkow ym i ujętymi w naw iasy kw adratow e, np. [3 , 7, 9 -26 ], O dnośnik i b ib liog ra ficzne pow inny mieć nową, uproszczoną formę. Sposób cytow an ia czasopism (1), m onografii (2), rozd z ia łó w z książek jednotom ow ych (3), rozd z ia łó w z tom ów serii op racow anych p rzez różnych redakto rów (5) wskazują poniżej podane przykłady.
1. H i l d e b r a n d t G R , A r o n s o n N N ( 1980) Bio- chim Biophys A cta 631 : 4 9 9 -5 0 2
2. B o s t o c k CJ , S u m m e r A T (1978) The Eucary- otic Chromosome, Elsevier, N orth -H o lland , Amsterdam
3. N o r b e r t h T, P i s c a t o r M (1979) W : F r i- b e r g L, N o r d b e r g G F V o n V B (red) Handbook on the Toxicology o f Metals. Elsevier, N orth -H o lland , Amsterdam, str. 541 -5 5 3
4. D e l e j J , K e s t e r s K (1975) W : F I o r k i n M , S t o t z E H (red) Cmprehensive Biochemistry 129B. Elsevier, N orth-H olland, Amsterdam, str. 1-7
5. F r a n k s N P, L i e b W R (1981) W : K n i g h t C G (red) Research Monographs in Celi and Tissue Physiology, t. 7. Elsevier, N orth-H olland, Amsterdam, str. 2 4 3 -2 7 2
ILUSTRACJE: ryciny pow inny być zapisane na dyskietce jako: *.tif, lub *.cdr, lub *.psd, lub *.eps. Fotografie czarno-b ia łe (kontrastowe) pow inny być w ykonane na pap ie rze m atowym . Istnieje m ożliwość w ykonan ia reprodukcji barw nych, a le ich koszty ponoszą Autorzy. N a rycinach nie na leży umieszczać op isów słownych, lecz posług iw ać się skrótami. Osie w ykresów pow inny być opa trzone napisem ła tw o zrozum iałym . Decyzję o stopniu zm niejszenia ryciny podejm uje w yd a w ca . Ilustracji nie należy w łą cza ć w tekst maszynopisu, lecz odp ow ie dn io ponum erow ać: ryciny noszą cy fry arabskiej, w z o ry zaś rzymskie. N a marginesie tekstu na leży zaznaczyć o łów kiem preferow ane miejsce umieszczenia ryciny czy w zoru. S łowne objaśnienia znaków gra ficznych m ożna umieścić w podpis ie pod ryciną, rysunkowe zaś jedynie na p lanszy ryciny. Tytuły i ob jaśnienia rycin sporządza się w postaci oddz ie lnego w ykazu. W yd ruk i ilustracji na leży na od w rocie podp isać im ieniem i nazwiskiem p ierw szego z A u to rów i pierwszym słowem tytułu p racy o ra z oznaczyć „gó ra -d ó ł" (o łów kiem, na odw rocie ). Ze w zg lędu na w ew nętrzną spoistość a rty kułu wskazane jest konstruowanie o ryg ina lnych rycin i zb iorczych tabel na podstaw ie danych z piśm iennictwa.
W yd ru k i za łączn ik i (w dw u egzem plarzach) o raz dyskietkę, w łaściw ie zabezp ieczone przed uszkodzeniem w czasie transportu, prosimy przesłać na adres:
Redakcja kw arta ln ika „Postępy B iochem ii"Polskie Towarzystwo Biochem iczneul. Pasteura 30 2 -0 9 3 W arszaw a
http://rcin.org.pl
KOMUNIKAT ZARZĄDU GŁÓWNEGO
POLSKIEGO TOW ARZYSTW A BIOCHEMICZNEGO
Prosimy o w noszenie opłat za składki członkowskie na nasze konto w PBK XIII Oddz. Warszawa nr 11101053-411050000371.
Jednocześnie uprzejmie informujemy, że decyzją Zarządu Głównego PTBioch. została zmieniona wysokość składki członkowskiej. W roku 2002 wynosi ona:
dla Członków rzeczywistych 70.- zł.dla Członków studentów 35.- zł
Członkow ie, którzy opłacą składkę członkow ską za rok 2002, otrzym ają bezpłatną prenum eratę kwartalnika Polskiego T ow arzystw a B iochem icznego „Postępy B iochem ii” . M ałżeństw a m ogą opłacać: 70.- + 45.- = 115.-zł, otrzym ają w ów czas jeden egzem plarz „Postępów B iochem ii” .
Powyższe zm iany nie dotyczą Członków Honorowych Towarzystwa. N atom iast Członkowie-Emery- ci - nadal zwolnieni z opłacania składki członkowskiej - p łacą za prenumeratę „Postępów Biochem ii” 25.- zł.
Biblioteki p łacą za prenum eratę „Postępów Biochemii” w roku 2002 100.- zł.
POLSKIE TOW ARZYSTW O BIOCHEMICZNE
ZAPROSZENIE
Jeżeli chciałabyś/chciałbyś zapisać się na listę e-mailową Polskiego Towarzystwa Biochemicznego wyślij e-mail na adres: infoptbioch@ nencki.gov.pl. W polu „subject „ umieść swoje nazwisko i imię (w takiej kolejności i bez polskich znaków diakrytycznych) oraz adres e-mailu. Wysyłając taki mail zgadzasz się na to, aby na Twój adres e-mailowy przychodziły informacje ZG, listy pojedynczych lub grup członków do ogółu członków, informacje z FEBS o zjazdach i kursach oraz materiały reklamowe. Lista będzie rozsyłać materiały kontrolowane przez moderatora, k tórym będzie Adam Szewczyk, sekretarz Zarządu Głównego Polskiego Towarzystwa Biochemicznego, tak więc nie będzie Ci grozić zalew śmieciowej poczty i zawirusowanych „attachmentów” . M am nadziej ę, że tą drogą poprawi się stan poinformowania naszych członków o różnych wydarzeniach naukowych, stypendiach, kursach i wreszcie o aktywności poszczególnych oddziałów naszego Towarzystwa. Być może również „Listy do b iochem ików ” redagowane przez p. Teresę W esołowską będą obok wersji drukowanej kolportowane przez naszą listę. Zapraszam także do odwiedzenia strony ww w naszego Towarzystwa
Adam Szewczyk
Sekretarz Zarządu GłównegoPolskiego Towarzystwa Biochemicznego
http://rcin.org.pl