adherence of streptococcus sanguis to conformationally specific determinants in fibronectin

7/29/2019 Adherence of Streptococcus sanguis to Conformationally Specific Determinants in Fibronectin

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I N F E C T I O N AND I M M U N I T Y , S e p t . 1 9 8 8 , p . 2 2 7 9 - 2 2 8 50 0 1 9 - 9 5 6 7 / 8 8 / 0 9 2 2 7 9 - 0 7 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 8 8 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

A d h e r e n c e o f S t r e p t o c o c c u s s a n g u i s t o C o n f o r m a t i o n a l l y S p e c i f i cD e t e r m i n a n t s i n F i b r o n e c t i nJON H . LOWRANCE,1'2 DAVID L . H A S T Y , 1 ' 3 AND W. ANDREW SIMPSON' 2 t *

V e t e r a n s A d m i n i s t r a t i o n M e d i c a l C e n t e r , M e m p h i s , T e n n e s s e e 3 8 1 0 4 , 1 and Departments of M i c r o b i o l o g y andI m m u n o l o g y 2 and Anatomy and N e u r o b i o l o g y , 3 U n i v e r s i t y o f T e n n e s s e e , Memphis, Ten nessee 381 63R e c e i v e d 2 3 F e b r u a r y 1 9 8 8 / A c c e p t e d 1 0 J u n e 1 9 8 8

T h e a d h e r e n c e o f S t r e p t o c o c c u s s a n g u i s t o s p e c i f i c r e c e p t o r s e x p o s e d or d e p o s i t e d a t t h e s i t e o f e n d o t h e l i a ld a m a g e may p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e d e v e l o p m e n t o f i n f e c t i v e e n d o c a r d i t i s . A d h e r e n c e o f t h e C h a l l i ss t r a i n o f S . s a n g u i s t o g e l a t i n ( o r c o l l a g e n ) a n d g e l a t i n - b i n d i n g components o f p l a s m a was examined w i t h ane n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t assay. S . s a n g u i s a d h e r e d p o o r l y t o i m m o b i l i z e d g e l a t i n and t o m o l e c u l a r orf i b r i l l a r c o l l a g e n . H o w e v e r , i n t h e p r e s e nce o f f r e s h human p l a s m a , t h e a d h e r e n c e o f S . s a n g u i s t o a l l t h r e es u b s t r a t e s i n c r e a s e d as much as e i g h t f o l d . Removal o f g e l a t i n - b i n d i n g p r o t e i n s e l i m i n a te s t h e a b i l i t y o f plasmat o e n h a n c e a d h e r e n c e o f S . s a n g u i s t o t h e s u b s t r a t e s . A d d i t i o n o f p u r i f i e d hum an p l a s m a f i b r o n e c t i n ( F n ) t o t h ea b s o r b e d p l a s m a r e s to r e d t he a d h e r e n c e - p r o m o t i n g a b i l i t y i n a d o s e - d e p e n d e n t manner. A s i m i l a r d o s e -d e p e n d e n t i n c r e a s e i n S . s a n g u i s a d h e r e n c e was o b s e r v e d when i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f Fn a l o n e werea d d e d t o t h e g e l a t i n - c o a t e d assay w e l l s . S . s a n g u i s a d h e r e n c e t o i m m o b i l i z e d f i b r o n e c t i n c o u l d n o t b e i n h i b i t e db y p r e i n c u b a t i n g e i t h e r t h e b a c t e r i a o r t h e g e l a t i n - c o a t e d as s ay w e l l s w i t h Fn o r b y i n c l u d i n g e x c e s s s o l u b l e Fni n t h e assay m i x t u r e . S t u d i e s w i t h p e p t i d e s p u r i f i e d f r o m t r y p s i n d i g e s t s o f Fn i n d i c a t e d t h a t t he 1 6 0 - t o1 8 0 - k i l o d a l t o n ( k D a ) f r a gm e n ts w h i c h r e t a i n b o t h t h e g e l a t i n - b i n d i n g a n d t h e c e l l - b i n d i n g r e g i o n s o f t h e i n t a c tm o l e c u l e s u p p o r t a d h e r e n c e o f S . s a n g u i s t o g e l a t i n . T h e 1 6 0 - t o 1 8 0 - k D a f r a g m e n t s i n h i b i t e d t h e i n t e r a c t i o no f S . s a n g u i s w i t h i m m o b i l i z e d F n . I n c o n t r a s t , i n t a c t Fn a n d t h e 3 1 - k D a a m i n o - t e r m i n a l f r a g m e n t were u n a b l et o i n h i b i t t h e a d h e r e n c e when u s e d i n e q u i v a l e n t o r g r e a t e r m o l a r a m o u n t s . T h e s e i n v i t r o r e s u l t s s u g g e s t t h a ti n t h e presence o f w h o l e p l a s m a , S . s a n g u i s b i n d s t o i m m o b i l i z e d g e l a t i n o r c o l l a g e n v i a Fn b o u n d t o t h ei m m o b i l i z e d s u b s t r a t e s . Our f i n d i n g t h a t a d h e r e n c e o f S . s a n g u i s t o i m m o b i l i z e d Fn c a n oc cur i n t h e p r e s e nceo f l a r g e c o n c e n t r a ti o n s o f F n , w h e t h e r i n p l a s m a o r p u r i f i e d , i n d i c a t e s t h a t a S . s a n g u i s - b i n d i n g d o m a i n i sc r y p t i c i n t h e Fn m o l e c u l e w hi l e i n s o l u t i o n a n d i s e x p o s e d b y a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e w h e n t h e Fn b e c o m e sb o u n d t o g e l a t i n - c o a t e d p l a s t i c . T h e a b i l i t y o f p e p t i d e f r a g m e n t s o f Fn t o i n h i b i t S . s a n g u i s a d h e r e n c e i sc o n s i s t e n t w i t h t h i s h y p o t h e s i s .

S t r e p t o c o c c u s s a n g u i s i s a v i r i d a n s s t r e p t o c o c c a l s p e c i e st h a t c o m m o n l y c o l o n i z e s t he o r a l c a v i t y a n d i s u s u a l l yc o n s i d e r e d a v i r u l e n t . N e v e r t h e l e s s , t h i s m i c r o o r g a n i s m c a ncause i n f e c t i v e e n d o c a r d i t i s ( I E ) . I n t e r m i t t e n t b a c t e r e m i af r e q u e n t l y occurs w i t h t h i s a n d o t h e r v i r i d a n s s t r e p t o c o c c i ,p a r t i c u l a r l y a f t e r c e r t a i n d e n t a l a n d m e d i c a l m a n i p u l a t i o n s ,b u t b a c t e r e m i a alone i s n o t s u f f i c i e n t t o i n i t i a t e I E i nn o r m a l l y h e a l t h y i n d i v i d u a l s ( 7 , 1 0 , 2 6 ) . C e r t a i n i n d i v i d u a l sw i t h u n d e r l y i n g v a lv u l a r h e a r t d i se a s e a r e , h o w e v e r , a t r i s ko f d e v e l o p i n g I E f r o m t r a n s i e n t S . s a n g u i s b a c t e r e m i a ( 2 9 ) .C u r r e n t e v i de n c e s u g g e s t s t h a t a c r u c i a l s t e p i n t he d e v e l -opment o f I E i s t h e i n i t i a l a d h e r e n c e o f b a c t e r i a t o o n e o rmore o f t h e m o l e c u l e s p r e s e n t o n d a m a g e d c a r d i a c v a lv u l a rs u r f a c e s ( 2 5 ) . T h e s e s u r f a c e c o m p o n e n t s , w h i c h w o u l d n o tn o r m a l l y b e e x p o s e d o r d e p o s i t e d on h e a l t h y v a s c u l a r t i s -s u e s , c o u l d t h e n a c t as r e c e p t o r s f o r c i r c u l a t i n g b a c t e r i a ,s u c h as S . s a n g u i s . S i n c e b a c t e r i a l a d h e r e n c e t o t h e s er e c e p t o r s may l e a d t o e n d o c a r d i t i s , i t w o u l d b e o f c o n s i d e r -a b l e i m p o r t a n c e t o u n d e r s t a n d t h e m o l e c u l a r e v e n t s t h a ta l l o w S . s a n g u i s t o c o l o n i z e d a m a g e d c a r d i a c v a l v u l a rt i s s u e s .Some t i s s u e c o m p o n e n t s t h a t are l i k e l y t o b e p r e s e n t a ts i t e s o f e n d o c a r d i a l d a m a g e ar e t h e s u b e p i t h e l i a l c o l l a g e n o u sm a t r i x a n d c e r t a i n p l a s m a c o m p o n e n t s t h a t would becomeb o u n d t o t h e m a t r i x o n c e i t i s e x p o s e d ( e . g . , f i b r i n , p l a t e l e t s ,

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .t P r e s e n t a d d r e s s : Research S e r v i c e , H a r r y S . T r u m a n VeteransA d m i n i s t r a t i o n H o s p i t a l , 8 0 0 H o s p i t a l D r i v e , C o l u m b i a , MO 6 5 2 0 1 .

f i b r o n e c t i n , e t c . ) . On e f a c t o r t h a t must b e c o n s i d e r e d whend e s i g n i n g i n v i t r o assays t o s t u d y m e c h a n i s m s o f S . s a n g u i sa d h e r e n c e t o t h e s e t i s s u e components i s t h a t t h e a d h e s i n -r e c e p t o r i n t e r a c t i o n t a k e s p l a c e i n t h e presence o f b l o o d .H a m i l l h a s s u g g e s t e d t h a t Fn may p l a y a r o l e i n I E b yi n t e r a c t i n g w i t h c i r c u l a t i n g b a c t e r i a ( 1 3 ) . S . s a n g u i s h a s b e e ns h o w n t o b i n d F n , b u t t h e r o l e o f t h i s b i n d i n g i n t h ea d h e r e n c e o f S . s a n g u i s t o t i s s u e s h a s n o t b e e n s t u d i e d ( 2 ,3 4 ) . F u r t h e r m o r e , t h e r e ar e l a r g e c o n c e n t r a t i o n s o f s o l u b l eFn i n p l a s m a , w h i c h s h o u l d make i t a n u n l i k e l y a d h e r e n c ef a c t o r i n t h i s p a r t i c u l a r s i t u a t i o n , s i n c e t h e s o l u b l e F n s h o u l di n h i b i t b i n d i n g o f S . s a n g u i s t o i m m o b i l i z e d F n .W e h a v e b e g u n t o s t u d y t h e m e c h a n i s m s o f S . s a n g u i sa d h e r e n c e b y a r e l a t i v e l y s i m p l e a p p r o a c h . G e l a t i n o r c o l l a -ge n was d e p o s i t e d on assay w e l l s , b a c t e r i a w e r e c o m b i n e dw i t h f r e s h p l a s m a i n t h e s e assay w e l l s , a n d a d h e r e n c e wasq u a n t i t a t e d w i t h a n a n t i s e r u m s p e c i f i c f o r S . s a n g u i s . I n t h i spaper, we p r e s e n t d a t a i n d i c a t i n g t h a t Fn may p l a y a r o l e i nt h e a d h e r e n c e o f S . s a n g u i s t o d a m a g e d e n d o t h e l i a l t i s s u e s ,s i n c e t h e s e b a c t e r i a b i n d t o s u b s t r a t e - a b s o r b e d Fn e v e n i nt h e presence o f h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f s o l u b l e F n . T h i ss u g g e s t s t h a t S . s a n g u i s a d h e r e n c e may b e r e l a t e d t o c o n -f o r m a t i o n a l c h a n g e s t h a t t a k e p l a c e w h e n Fn i s i m m o b i l i z e d .

MATERIALS AND METHODSB a c t e r i a . A l l s t r e p t o c o c c a l s t r a i n s were gro wn i n Todd-H e w i t t b r o t h f o r 1 8 h a t 3 7 C . B a c t e r i a were h a r v e s t e d b yc e n t r i f u g a t i o n , washed t w i c e , an d s u s p e n d e d i n p h o s p h a t e -b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ; 0 . 0 2 M P 0 4 , 0 . 1 5 M N a C l , pH 7 . 4 ) .

2 2 7 9

V o l . 5 6 , N o . 9


2/7

2 2 8 0 LO WRANCE ET A L .B a c t e r i a l s u s p e n s i o n s w e r e a d j u s t e d t o i n d i c a t e d o p t i c a ld e n s i t y v a l u e s a t 5 3 0 nm w i t h a C o l e m a n J u n i o r I I s p e c t r o -p h o t o m e t e r .

P r e p a r a t i o n o f p r o t e i n s . Human p l a s m a f i b r o n e c t i n ( F n )w a s p u r i f i e d b y a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y b y t h e m e t h o d o fE n g v a l l a n d R u o s l a h t i ( 9 ) . P u r i f i e d t y p e I c o l l a g e n f r o mb o v i n e s k i n w a s a g i f t f r o m K . H a s t y ( D e p a r t m e n t o fA n a t o m y a n d N e u r o b i o lo g y , U n i v e r s i t y o f T e n n e s s e e ,M e m p h i s ) . G e l a t i n w a s o b t a i n e d c o m m e r c i a l l y ( F i s h e r S c i -e n t i f i c C o . , F a i r L a w n , N . J . ) .P r e p a r a t i o n o f p l a s m a f r e e o f g e l a t i n - b i n d i n g c o m p o n e n t s .G e l a t i n - b i n d i n g p r o t e i n s w e r e r e m o v e d f r o m f r e s h h u m a np l a s m a b y p a s s a g e o v e r a S e p h a r o s e c o l u m n f o l l o w e d b yt h r e e s u c c e s s i v e p a s s a g e s o v e r a g e l a t i n - S e p h a r o s e c o l u m n .T h e a b s o r b e d p l a s m a w a s d i a l y z e d a g a i n s t PBS ( p H 7 . 4 ) , a sw a s a c o n t r o l s a m p l e o f u n a b s o r b e d p l a s m a f r o m t h e s a m eb a t c h . E a c h s a m p l e w a s t h e n a d j u s t e d t o t h e s a m e o p t i c a ld e n s i t y a t 2 8 0 n m a n d u s e d i n a d h e r e n c e a s s a y s . No d e t e c t -a b l e l e v e l s o f F n w e r e o b s e r v e d i n t h e a b s o r b e d s a m p l e s ,w h i l e t h e u n a b s o r b e d s a m p l e s w e r e p o s i t i v e , a s d e m o n -s t r a t e d b y d o u b l e - d i f f u s i o n a g a r g e l a s s a y s p e r f o r m e d b y t h em e t h o d o f Munoz ( 2 2 ) .

P r e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f p e p t i d e f r a g m e n t s . P e p t i d e so f F n w e r e p r e p a r e d a n d p u r i f i e d e s s e n t i a l l y b y t h e m e t h o do f M o s h e r a n d P r o c t o r ( 2 1 ) . B r i e f l y , p u r i f i e d F n ( 8 0 m g ) w a sd i a l y z e d a g a i n s t 0 . 0 5 M N a C l - 0 . 0 1 M T r i s ( p H 7 . 4 ) a n dd i g e s t e d f o r 1 3 m i n a t 3 7 C w i t h t r y p s i n ( t o l y l s u l f o n y lp h e n y l a l a n y l c h l o l o r o m e t h y l k e t o n e t r e a t e d ; S i g m a C h e m i -c a l C o . , S t . L o u i s , M o . ) a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 5 4 n g / m g o fF n . T h e d i g e s t i o n w a s t e r m i n a t e d b y t h e a d d i t i o n o f s o y b e a nt r y p s i n i n h i b i t o r ( 7 7 0 n g / m g o f F n ) . T r y p t i c d i g e s t s w e r ea p p l i e d t o a DEAE c o l u m n e q u i l i b r a t e d w i t h 0 . 0 5 M N a C l -0 . 0 1 M T r i s ( p H 7 . 4 ) a n d t h e n w e r e e l u t e d f i r s t w i t h 0 . 0 1 MT r i s ( p H 7 . 4 ) - 0 . 0 5 M N a C l a n d t h e n w i t h 0 . 4 M N a C l .F r a c t i o n s f r o m m a j o r p e a k s w e r e p o o l e d , d i a l y z e d e x h a u s -t i v e l y a g a i n s t d o u b l e - d i s t i l l e d w a t e r , a n d a n a l y z e d b y s o -d i u m d o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s .T h e p r o t e i n c o n t e n t o f t h e m a j o r p e a k s w a s m e a s u r e d b y t h em e t h o d o f Lowry e t a l . ( 2 0 ) , a n d t h e f r a c t i o n s w e r e s n a pf r o z e n a n d s t o r e d a t - 7 0 C u n t i l n e e d e d .P r e p a r a t i o n o f a n t i s e r a a n d m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . A n t i -s e r a d i r e c t e d a g a i n s t S . s a n g u i s w e r e p r e p a r e d b y i n t r a c u -t a n e o u s i n j e c t i o n o f Ne w Z e a l a n d W h i t e r a b b i t s i n t h e b a c ko f t h e n e c k w i t h a n i n o c u l u m o f 0 . 5 m l o f 1 0 8 C FU o f S .s a n g u i s p e r m l i n PBS e m u l s i f i e d i n F r e u n d c o m p l e t e a d j u -v a n t . T w o s u b s e q u e n t b o o s t e r i n j e c t i o n s w e r e g i v e n i n t r a -v e n o u s l y a t 2 - w e e k i n t e r v a l s w i t h t h e s a m e n u m b e r o fb a c t e r i a i n s t e r i l e P BS ( p H 7 . 4 ) . A n t i s e r a w e r e c o l l e c t e d ,a s s a y e d f o r a n t i b o d y t i t e r , a n d s t o r e d a t 4 C u n t i l n e e d e d .A n t i s e r u m a g a i n s t g r o u p A s t r e p t o c o c c i ( S t r e p t o c o c c u s p y o -g e n e s t y p e M 5 ) w a s a g i f t f r o m H . C o u r t n e y ( V e t e r a n sA d m i n i s t r a t i o n M e d i c a l C e n t e r , M e m p h i s , T e n n . ) a n d w a sp r e p a r e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 5 ) . P r e p a r a t i o n a n d c h a r -a c t e r i z a t i o n o f t h e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s u s e d h e r e h a v eb e e n d e s c r i b e d i n d e t a i l p r e v i o u s l y ( 1 4 ) .ELISA f o r a d h e r e n c e o f S . s a n g u i s t o i m m o b i l i z e d s u b -s t r a t e s . G e l a t i n o r Fn w a s i m m o b i l i z e d o n t o m i c r o d i l u t i o np l a t e s ( F 1 6 , h i g h b i n d i n g , m i c r o w e l l m o d u l e ; N u n c , R o s -k i l d e , D e n m a r k ) b y a d d i n g 2 0 0 , u 1 o f t h e p r o t e i n s o l u t i o n ( 5 0, u g / m l i n 0 . 0 5 M s o d i u m c a r b o n a t e b u f f e r , pH 9 . 6 ) t o e a c hw e l l a n d i n c u b a t i n g t h e p l a t e s f o r 1 6 h a t 4 C . T h e m o l e c u l a rc o l l a g e n o r c o l l a g e n f i b r i l s w e r e i m m o b i l i z e d i n t h e s a m em a n n e r a n d w i t h t h e s a m e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n , e x c e p t t h ep r o t e i n w a s i n 0 . 2 M N a C l - 0 . 0 1 M T r i s h y d r o c h l o r i d e ( p H7 . 4 ) . C o l l a g e n f i b r i l s w e r e f o r m e d f r o m m o l e c u l a r c o l l a g e nw h i c h w a s w a r m e d t o 3 7 C b e f o r e u s e . P l a t e s w e r e w a s h e d

b e f o r e u s e t h r e e t i m e s w i t h P BS ( a l l s u b s e q u e n t w a s h e s w e r et h e s a m e ) . B a c t e r i a w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n f o r 1 0m i n a t 8 , 0 0 0 rpm i n a B e c k m a n J A 2 0 r o t o r a n d s u s p e n d e d i nPBS t o a n o p t i c a l d e n s i t y o f 0 . 9 a t 5 3 0 n m . B a c t e r i a ls u s p e n s i o n s w e r e t h e n m i x e d w i t h e q u a l v o l u m e s o f p l a s m a ,PBS a l o n e , o r P BS c o n t a i n i n g Fn o r Fn f r a g m e n t s a n da p p l i e d t o t h e a s s a y p l a t e s ( 1 0 0 p . l p e r w e l l ) . M i c r o d i l u t i o np l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t room t e m p e r a t u r e f o r 3 0 m i n w i t hg e n t l e c i r c u l a r s h a k i n g . N o n a d h e r e n t b a c t e r i a w e r e r e m o v e dw i t h s e v e r a l w a s h e s o f P B S . A d h e r e n t b a c t e r i a w e r e f i x e d t ot h e p l a t e s w i t h a 1 5 - m i n i n c u b a t i o n a t 6 0 C . A 1 : 2 0 0 d i l u t i o no f a n t i s e r a a g a i n s t S . s a n g u i s o r S . p y o g e n e s ( i n PBS w i t h5% b o v i n e s e r u m a l b u m i n ) was a d d e d t o e a c h w e l l a n di n c u b a t e d f o r 1 h a t 3 7 C . P l a t e s w e r e w a s h e d w i t h P B S , a n da 1 : 1 , 0 0 0 d i l u t i o n ( i n PBS w i t h 5% b o v i n e s e r u m a l b u m i n ) o fp e r o x i d a s e - l a b e l e d g o a t a n t i - r a b b i t i m m u n o g l o b u l i n G( C o o p e r B i o m e d i c a l , I n c . , M a l v e r n , P a . ) was a p p l i e d a n di n c u b a t e d f o r 1 h a t 3 7 C . o - P h e n y l e n e d i a m i n e was u s e d a st h e c h r o m o p h o r e , a n d t h e c o l o r was a l l o w e d t o d e v e l o p f o r3 0 m i n , a f t e r w h i c h t h e A 4 5 0 was m e a s u r e d w i t h a M i c r o E l i s aR e a d e r ( D y n a t e c h L a b o r a t o r i e s , A l e x a n d r i a , V a . ) .I n e a c h e x p e r i m e n t , s i x r e p l i c a t e s a m p l e w e l l s w e r e a s -s a y e d a n d e a c h e x p e r i m e n t was p e r f o r m e d a t l e a s t t w i c e .I n i t i a l s t u d i e s s h o w e d t h a t t h e a b s o r b a n c e v a l u e s m e a s u r e dw e r e d i r e c t l y r e l a t e d t o t h e n u m b e r o f a d d e d b a c t e r i a . T h ea b s o r b a n c e i n c r e a s e d p r o p o r t i o n a t e l y w h e n t h e c o n c e n t r a -t i o n o f b a c t e r i a l s u s p e n s i o n s i n c r e a s e d f r o m a n o p t i c a ld e n s i t y o f 0 . 1 t o 0 . 4 ( 5 3 0 n m ) a n d t h e n b e c a m e s a t u r a t e d a th i g h e r b a c t e r i a l c o n c e n t r a t i o n s . B a c t e r i a f r o m c u l t u r e sg r o w n f o r 7 , 1 3 , 1 6 , a n d 2 0 h b o u n d e q u a l l y w e l l t oi m m o b i l i z e d F n . A d h e r e n c e o f t h e b a c t e r i a was o p t i m a lb e t w e e n p H s 6 a n d 7 a n d d r o p p e d o f f r a p i d l y a b o v e o r b e l o wt h i s pH r a n g e . A d h e r e n c e o f t h e b a c t e r i a was n o t a f f e c t e d b yM g 2 + o r C a 2 + c o n c e n t r a t i o n s r a n g i n g f r o m 1 t o 5 0 m M .U n d e r t h e a s s a y c o n d i t i o n s , b a c t e r i a l a d h e r e n c e was m a x i -m a l w i t h i n 1 0 m i n . M o s t o f t h e a d h e r e n c e a s s a y s r e p o r t e d i nt h i s s t u d y u s e d g e l a t i n i n s t e a d o f c o l l a g e n d u e t o t h e a v a i l -a b i l i t y a n d c o s t o f g e l a t i n .S t a t i s t i c a l e v a l u a t i o n . D a t a w e r e e v a l u a t e d b y t h e u s e o fS t u d e n t ' s t t e s t f o r u n p a i r e d d a t a t o d e t e r m i n e s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s .

RESULTSP l a s m a - e n h a n c e d a d h e r e n c e o f S . s a n g u i s t o g e l a t i n . G e l a -t i n , m o l e c u l a r c o l l a g e n , a n d c o l l a g e n f i b r i l s w e r e i m m o b i -l i z e d o n m i c r o d i l u t i o n w e l l s , a n d S . s a n g u i s b i n d i n g wasa s s a y e d b y a m o d i f i c a t i o n o f t h e t y p i c a l e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ( 8 ) . T h e C h a l l i s s t r a i n o f S . s a n g u i sa d h e r e d p o o r l y t o t h e s e t h r e e i m m o b i l i z e d e x t r a c e l l u l a rp r o t e i n s i n t h e a b s e n c e o f p l a s m a ( F i g . 1 ) . H o w e v e r , i n t h ep r e s e n c e o f p l a s m a , t h e a d h e r e n c e o f t h i s s t r a i n i n c r e a s e d a sm u c h a s e i g h t f o l d o v e r t h e b u f f e r c o n t r o l . T h e s e d a t a s u g g e s t

t h a t c o m p o n e n t s o f p l a s m a e n h a n c e t h e a d h e r e n c e o f s o m es t r a i n s o f S . s a n g u i s t o i m m o b i l i z e d g e l a t i n , m o l e c u l a rc o l l a g e n , a n d c o l l a g e n f i b r i l s .When g e l a t i n - b i n d i n g c o m p o n e n t s w e r e r e m o v e d f r o mhuman p l a s m a b y s e v e r a l p a s s a g e s o v e r g e l a t i n - S e p h a r o s ea f f i n i t y c o l u m n s , t h e a b s o r b e d p l a s m a n o l o n g e r s u p p o r t e da dh e r e n c e o f S . s a n g u i s t o g e l a t i n - c o a t e d m i c r o d i l u t i o np l a t e s ( F i g . 2 ) . P l a s m a e n h a n c e d a d h e r e n c e o f S . s a n g u i s t og e l a t i n . A p r i n c i p a l g e l a t i n - b i n d i n g p r o t e i n o f p l a s m a i s F n .T h e r e f o r e , p u r i f i e d Fn was a d d e d b a c k t o p l a s m a p r e v i o u s l yd e p l e t e d o f g e l a t i n - b i n d i n g p r o t e i n s . A d d i t i o n o f i n c r e a s i n ga m o u n t s o f p u r i f i e d F n r e s t o r e d t h e a b i l i t y o f a b s o r b e dp l a s m a t o e n h a n c e a d h e r e n c e o f S . s a n g u i s t o i m m o b i l i z e d

I N F E C T . I M M U N .


3/7

S . SANGUIS ADHERENCE T O FIBRONECTIN 2 2 8 1

E

z-J-CI-a -0

1 . 21 . 00 . 80 . 60 . 40 . 2

0

- 1 -

I

G E L A T I N C O L L A G E N F I B R I L SF I G . 1 . E f f e c t o f p l a s m a o n S . s a n g u i s a d h e r e n c e t o i m m o b i l i z e ds u b s t r a t e s . G e l a t i n , c o l l a g e n , a n d c o l l a g e n f i b r i l s w e r e i m m o b i l i z e do n m i c r o d i l u t i o n w e l l s a t 5 0 p L g / m l . B a c t e r i a w e r e a l l o w e d t o a d h e r ef o r 3 0 m i n a t room t e m p e r a t u r e i n t h e p r e s e n c e o f PBS ( b l a c k b a r s )o r w h o l e p l a s m a ( w h i t e b a r s ) . T h e v e r t i c a l l i n e s o n e a c h b a r i n d i c a t et h e s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n . E x p e r i m e n t a l v a l u e s w e r e s i g n i f i -c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e PBS c o n t r o l v a l u e s ( n = 3 , P < 0 . 0 5 ) .

g e l a t i n i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r ( F i g . 3 ) . W h i l e i t w a s n o tp o s s i b l e w i t h t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n o f Fn t h a t we w e r ea b l e t o t e s t ( o n e - t h i r d t o o n e - h a l f o f t h e n o r m a l p l a s m ac o n c e n t r a t i o n ) t o c o m p l e t e l y r e s t o r e t h e a d h e r e n c e l e v e l s t ot h a t o b s e r v e d w i t h w h o l e p l a s m a , i t i s c l e a r f r o m t h e s er e s u l t s t h a t F n h a s a m a j o r e f f e c t o n a d h e r e n c e .I f Fn i s t h e m a j o r c o m p o n e n t o f p l a s m a t h a t s u p p o r t s S .s a n g u i s a d h e r e n c e t o g e l a t i n s u b s t r a t e s , p u r i f i e d p l a s m a F ns h o u l d p r o m o t e a d h e r e n c e i n t h e a b s e n c e o f o t h e r p l a s m ac o m p o n e n t s . To i n v e s t i g a t e t h i s h y p o t h e s i s , p u r i f i e d F n i nPBS ( p H 7 . 4 ) w a s a s s a y e d f o r t h e a b i l i t y t o i n c r e a s e S .s a n g u i s a d h e r e n c e t o g e l a t i n , c o l l a g e n , a n d c o l l a g e n f i b r i l s .S i m i l a r i n c r e a s e s t o t h e a d h e r e n c e l e v e l o b s e r v e d w i t h w h o l ep l a s m a w e r e r e c o r d e d ( F i g . 4 ) . I n a d d i t i o n , when i n c r e a s i n ga m o u n t s o f Fn ( 1 t o 1 0 0 , u g / m l ) i n PBS w e r e p r e s e n t d u r i n gt h e a d h e r e n c e a s s a y , a d o s e - d e p e n d e n t r e s p o n s e , s i m i l a r t ot h a t s e e n w i t h t h e a d d i t i o n o f Fn t o a b s o r b e d p l a s m a , w a so b s e r v e d . T o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e m a j o rc o m p o n e n t o f p l a s m a w h i c h b i n d s t o g e l a t i n , m o l e c u l a rc o l l a g e n , a n d c o l l a g e n f i b r i l s a n d e n h a n c e s t h e a d h e r e n c e o fS . s a n g u i s i s F n .

0L -0

0

L US

L I Ai n

1 0 0 08006 0 040020 0

c0- )KL l t

1 0 0 08 0 0

60 0

4 0 02 0 0

.

0 . 1 1 . 0 1 0 1 0 0 W h o l eP l a s m aF I B R O N E C T I N ( u g / m l )

F I G . 3 . E f f e c t o f p u r i f i e d Fn o n S . s a n g u i s a d h e r e n c e t o g e l a t i n -c o a t e d m i c r o d i l u t i o n w e l l s i n t h e p r e s e n c e o f a b so r b e d p l a s m ar e c o n s t i t u t e d w i t h p u r i f i e d F n . A d h e r e n c e c o n d i t i o n s w e r e t h e s a m ea s f o r p r e v i o u s a s s a y s . A d h e r e n c e w a s r e c o r d e d i n t h e p r e s e n c e o fF n - f r e e p l a s m a ( O ) , r e c o n s t i t u t e d p l a s m a ( a ) , a n d w h o l e p l a s m a ( 0 )( n = 4 ) . A d di t i o n o f 1 0 a n d 1 0 0 , u g o f Fn c a u s e d a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e( P < 0 . 0 0 1 ) i n t h e a d h e r e n c e o f S . s a n g u i s .

E f f e c t s o f p r e i n c u b a t i o n o f b a c t e r i a a n d g e l a t i n s u b s t r a t ew i t h f i b r o n e c t i n . I n t h e a d h e r e n c e a s sa y s d e s c r i b e d a b o v e ,t h e b a c t e r i a w e r e a d d e d t o t h e m i c r o d i l u t i o n w e l l s i n t h ep r e s e n c e o f p l a s m a o r F n . To d e t e r m i n e w h e t h e r s o l u b l e Fne n h a n c e d o r i n h i b i t e d t h e i n t e r a c t i o n o f S . s a n g u i s w i t hg e l a t i n , b a c t e r i a w e r e p r e i n c u b a t e d w i t h s o l u b l e Fn o r P BSa l o n e f o r 3 0 m i n . Un bo un d F n w a s r e m o v e d b y w a s h i n gt h r e e t i m e s w i t h P BS p r i o r t o i n c u b a t i o n . P r e i n c u b a t i o n o f S .s a n g u i s w i t h Fn ( a d h e r e n c e , 0 . 0 6 + 0 . 0 0 7 ) d i d n o t i n c r e a s ea d h e r e n c e s i g n i f i c a n t l y o v e r t h e g e l a t i n - c o a t e d c o n t r o l w e l l s( a d h e r e n c e , 0 . 0 3 + 0 . 0 0 2 ) . C o n v e r s e l y , i f t h e g e l a t i n - c o a t e dw e l l s w e r e p r e i n c u b a t e d w i t h 5 0 p L g o f Fn p e r m l f o r 3 0 m i na n d t h e n w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h P BS p r i o r t o t h e a d d i t i o no f t h e b a c t e r i a , a s e v e n f o ld o r b e t t e r i n c r e a s e i n t h e a d h e r -e n c e o f S . s a n g u i s was o b s e r v e d ( a d h e r e n c e , 0 . 0 3 + 0 . 0 0 2v e r s u s 0 . 4 1 + 0 . 0 2 f o r P B S - t r e a t e d b a c t e r i a o n P B S - a n df i b r o n e c t i n - t r e a t e d w e l l s , r e s p e c t i v e l y , a n d 0 . 0 6 0 . 0 0 7v e r s u s 0 . 4 3 0 . 0 3 f o r f i b r o n e c t i n - t r e a t e d c e l l s o n P B S - a n df i b r o n e c t i n - t r e a t e d w e l l s , r e s p e c t i v e l y ) . T h e r e was n o t a

EcC ).d

c001 0

. _0

P B S P L A S M A F N - F R E EP L A S M AF I G . 2 . E f f e c t o f g e l a t i n - b i n d i n g c o m p o n e n t s o f p l a s m a o n S .s a n g u i s a d h e r e n c e t o g e l a t i n . B a c t e r i a were a l l o w e d t o a d h e r e t og e l a t i n - c o a t e d m i c r o d i l u t i o n w e l l s ( 5 0 , u g / m l ) i n t h e p r e s e n c e o f P B S ,w h o l e p l a s m a , o r p l a s m a w h i c h h a d g e l a t i n - b i n d i n g c o m p o n e n t sr e m o v e d b y t h r e e s u c c e s s i v e p a s s e s o v e r a g e l a t i n a f f i n i t y c o l u m n .I n f i v e r e p l i c a t e e x p e r i m e n t s ( n = 5 ) , t h e a s s a y w e l l s c o n t a i n i n gp l a s m a w e r e d i f f e r e n t f r o m t h e w e l l s c o n t a i n i n g PBS a n d t h e F n - f r e ep l a s m a ( P < 0 . 0 0 1 ) , w h i l e t h e w e l l s c o n t a i n i n g P BS a n d F n - f r e ep l a s m a w e r e n o t d i f f e r e n t f r o m e a c h o t h e r .

1 . 21 . 00 . 80 . 60 . 40 . 2

G E L A T I N C O L L A G E N C O L L A G E NF l B R I L SF I G . 4 . E f f e c t o f p u r i f i e d Fn on a d h e r e n c e o f S . s a n g u i s t om i c r o d i l u t i o n w e l l s c o a t e d w i t h g e l a t i n , m o l e c u l a r c o l l a g e n , o rc o l l a g e n f i b r i l s . B a c t e r i a were s u s p e n d e d i n P BS ( b l a c k b a r s ) o r P B Sc o n t a i n i n g Fn ( w h i t e b a r s ) a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 0 , u g / m l a n d werea l l o w e d t o a d h e r e f o r 3 0 m i n a t r oom t e m p e r a t u r e . T h e v e r t i c a l l i n e so n e a c h b a r i n d i c a t e t h e s t a n d a r d e r r o r o f t h e mean. E x p e r i m e n t a lv a l u e s w e r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e PBS c o n t r o l v a l u e s ( n =3 , P < 0 . 0 0 5 ) .

V O L . 5 6 , 1 9 8 8

T


4/7

2 2 8 2 LOWRANCE ET AL.2 4 02 2 0

-W

t Yr

1 6 0

1 4 0

1 2 0

1 0 0 1

1 2

1 8 0 k d _

3 1 kd _ m -8 06 0

1 . 0 1 0 1 0 0S O L U B L E F I BR O NE C TI N C O N C . ( u g / m l )

F I G . 5 . C o m p a r i s o n o f s t r e p t o c o c c a l a d h e r e n c e t o i m m o b i l i z e dFn i n t h e presence o f s o l u b l e F n . S . s a n g u i s ( a ) o r S . p yog ene s ( l )w e r e w a s h e d a n d a d j u s t e d t o an A 5 3 0 o f 0 . 4 0 . T h e b a c t e r i a w e r em i x e d w i t h i n c r e a s i n g amounts o f Fn ( 0 . 1 t o 1 0 0 , u g / m l ) a n d a d d e d t og e l a t i n - c o a t e d m i c r o d i l u t i o n w e l l s . I n two r e p l i c a t e e x p e r i m e n t s ( n= 6 i n e a c h ) , a d d i t i o n o f 1 0 a n d 1 0 0 , u g o f Fn c a u s e d a s i g n i f i c a n ti n c r e a s e i n S . s a n g u i s b i n d i n g ( P < 0 . 0 0 1 ) a n d a s i g n i f i c a n t d e c r e a s ei n S . p y o g e n e s b i n d i n g ( P < 0 . 0 0 1 ) .

s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n a d h e r e n c e t o F n - p r e t r e a t e d g e l a t i nassay w e l l s b e t w e e n b a c t e r i a w h i c h w e r e p r e i n c u b a t e d w i t hF n ( a d h e r e n c e , 0 . 4 3 0 . 0 3 ) a n d b a c t e r i a n o t p r e i n c u b a t e dw i t h Fn ( a d h e r e n c e , 0 . 4 1 0 . 0 3 ) . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a ts o l u b l e Fn i n t e r a c t s p r i m a r i l y w i t h t h e g e l a t i n s u b s t r a t e ,w h i l e S . s a n g u i s a d h e r e s t o Fn i m m o b i l i z e d o n t o g e l a t i n . I fS . s a n g u i s b i n d s s o l u b l e F n , t h i s b i n d i n g d o e s n o t i n t e r f e r ew i t h s u b s e q u e n t a d h e r e n c e o f b a c t e r i a t o i m m o b i l i z e d F n .C o m p a r i s o n o f s t r e p t o c o c c a l a d h e r e n c e t o i m m o b i l i z e d F n .T h e d a t a p r e s e n t e d t h u s f a r i n d i c a t e t h a t S . s a n g u i s i n t e r a c t sd i f f e r e n t l y w i t h s o l u b l e a n d i m m o b i l i z e d F n . I n c o n t r a s t , weh a v e p r e v i o u s l y s h o w n t h a t S . p y o g e n e s r e a c t s i d e n t i c a l l yw i t h b o t h s o l u b l e a n d i m m o b i l i z e d Fn ( 4 ) . To c o n f i r m t h e s eo b s e r v a t i o n s , t h e a d h e r e n c e o f S . s a n g u i s t o i m m o b i l i z e d Fni n t h e presence o f i n c r e a s i n g amounts o f s o l u b l e Fn wasc o m p a r e d t o t h a t o f S . p y o g e n e s . T h e a d h e r e n c e o f S .p y og e n e s was i n h i b i t e d i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t f a s h -i o n , as w o u l d b e p r e d i c t e d on t h e b a s i s o f o ur p r e v i o u s w o r k( 4 ) . On t h e o t h e r h a n d , t h e a d h e r e n c e o f S . s a n g u i s was n o ti n h i b i t e d b y s o l u b l e F n . I n d e e d , S . s a n g u i s a d h e r e n c e t oi m m o b i l i z e d Fn i n c r e a s e d t o 230% o f t h e c o n t r o l ( F i g . 5 ) .T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t S . s a n g u i s a n d S . pyogenes c o u l di n t e r a c t w i t h d i f f e r e n t r e g i o n s o f t h e Fn m o l e c u l e . T h ei n a b i l i t y o f s o l u b l e Fn t o i n h i b i t t h e b i n d i n g o f S . s a n g u i s t oi m m o b i l i z e d Fn i n any o f t h e t e s t s we h a v e p e r f o r m e ds u g g e s t s t h a t a c r y p t i c b i n d i n g s i t e ( s ) may b e c o m e e x p o s e dwhen Fn b e c o m e s i m m o b i l i z e d on p l a s t i c , g e l a t i n , o r c o l l a -gen.E f f e c t o f t r y p t i c p e p t i d e s on a d h e r e n c e o f S . s a n g u i s t og e l a t i n . T o d e t e r m i n e w h i c h r e g i o n o f Fn m i g h t s e r v e a s ab i n d i n g s i t e ( s ) f o r S . s a n g u i s , p e p t i d e f r a c t i o n s p r o d u c e d b yl i m i t e d t r y p s i n d i g e s t i o n o f Fn were u s e d i n t h e a d h e r e n c ea s s a y s . T h e f r a c t i o n s were s e p a r a t e d on a DEAE c o l u m n ,a n d t h e f r a c t i o n s c o n t a i n i n g p r o t e i n were c h a r a c t e r i z e d b ys o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s

F I G . 6 . S o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o -r e s i s o f t h e p e a k s o b t a i n e d f r o m D E A E - S e p h a r o s e a n d h e p a r i n -a g a r o s e c o l u m n s o f a f i b r o n e c t i n t r y p t i c d i g e s t . P e a k I , s h o w n i nl a n e 1 , i s t h e a m i n o - t e r m i n a l f r a g m e n t o f F n , a n d p e a k I I , s h o w n i nl a n e 2 , c o n t a i n s f r a g m e n t s t h a t s p a n t h e g e l a t i n - a n d c e l l - b i n d i n gr e g i o n s o f F n ( s e e t e x t f o r d e t a i l s ) .( F i g . 6 ) a n d i d e n t i f i e d b y t h e i r r e a c t i v i t y w i t h d o m a i n -s p e c i f i c p o l y c l o n a l a n d m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t h a t h a v ep r e v i o u s l y b e e n d e s c r i b e d ( 1 4 ) . P e a k I c o n t a i n s t h e 3 1 -k i l o d a l t o n ( k D a ) a m i n o - t e r m i n a l f r a g m e n t , a s d e t e r m i n e d b yr e a c t i v i t y w i t h a p o l y c l o n a l a n t i b o d y ( s y n I I ) w h i c h i sp r o d u c e d a g a i n s t a s y n t h e t i c p e p t i d e f r o m t h e a m i n o t e r m i -n u s o f t h e Fn m o l e c u l e a n d w h i c h i s s p e c i f i c f o r t h a tf r a g m e n t . P e a k I I c o n t a i n s 1 6 0 - t o 1 8 0 - k D a f r a g m e n t s t h a ts p a n t h e g e l a t i n - b i n d i n g a n d c e l l - b i n d i n g d o m a i n s , o n t h eb a s i s o f t h e i r r e a c t i v i t y w i t h m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s D9b a n dI B 1 0 , r e s p e c t i v e l y , w h i c h a r e s p e c i f i c f o r t h o s e d o m a i n s( 1 4 ) . W e s t e r n b l o t ( i m m u n o b l o t ) a n a l y s i s o f t h e s e t w o m a j o rp e a k s a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t t h e r e was n o d e t e c t a b l e c r o s s -c o n t a m i n a t i o n b e t w e e n t h e t w o p e a k s ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e3 1 - k D a f r a g m e n t , w h i c h d o e s n o t c o n t a i n g e l a t i n - b i n d i n gs i t e s , d o e s n o t p r o m o t e t h e a d h e r e n c e o f S . s a n g u i s t oi m m o b i l i z e d g e l a t i n ( T a b l e 1 ) . I n c o n t r a s t , t h e 1 6 0 - t o 1 8 0 -kDa f r a g m e n t s d o p r o m o t e a d h e r e n c e , a n d t h e a d h e r e n c e i sd o s e d e p e n d e n t . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t p e a k I I c o n t a i n s a nS . s a n g u i s b i n d i n g s i t e . A l t h o u g h i t i s c l e a r t h a t p e a k I w i l ln o t i n h i b i t o r s u p p o r t a d h e r e n c e i n t h e s e a s s a y s , o u r r e s u l t sd o n o t r u l e o u t t h e p o s s i b i l i t y t h a t p e a k I c o u l d b i n d t o S .s a n g u i s .To d e t e r m i n e w h e t h e r c r y p t i c s i t e s i n t h e Fn m o l e c u l ew e r e e x p o s e d b y t r y p s i n d i g e s t i o n , f r a g m e n t s o f Fn w e r eTABLE 1 . E f f e c t o f t r y p t i c p e p t i d e s o n a d h e r e n c e o f S . s a n g u i st o g e l a t i n - o r f i b r o n e c t i n - c o a t e d m i c r o d i l u t i o n w e l l s aA d h e r e n c e

F r a g m e n t C o n c n ( , u g / m l ) ( % o f PBS c o n t r o l )G e l a t i n w e l l s F n w e l l s

3 1 kDa 5 0 8 0 9 01 0 0 1 0 5 9 51 6 0 t o 1 8 0 kDa 5 0 1 0 5 1 0 51 0 0 8 2 0 b 5 0 ba P e p t i d e s w e r e p u r i f i e d a s s t a t e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . I n d i c a t e dc o n c e n t r a t i o n s o f p e p t i d e s w e r e a d d e d t o t h e b a c t e r i a l s u s p e n s i o n , w h i c h w a st h e n a d d e d t o t h e w e l l s f o r 3 0 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e ; n = 5 e x p e r i m e n t s .b p < 0 . 0 0 1 c o m p a r e d t o PBS c o n t r o l ; o t h e r r e s u l t s w e r e n o t s i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t .



5/7

S . SANGUIS ADHERENCE T O FIBRONECTIN 2 2 8 3t e s t e d f o r t h e i r a b i l i t y t o i n h i b i t S . s a n g u i s b i n d i n g t o i n t a c t ,i m m o b i l i z e d F n . When t h e 3 1 - k D a a n d 1 6 0 - t o 1 8 0 - k D af r a g m e n t s w e r e i n c u b a t e d w i t h S . s a n g u i s i n t h e a d h e r e n c ea s s a y , S . s a n g u i s b i n d i n g t o i m m o b i l i z e d F n w a s n o t i n h i b -i t e d b y t h e p r e s e n c e o f t h e 3 1 - k D a f r a g m e n t a t 5 0 o r 1 0 0 , u g /m l ( T a b l e 1 ) . I n c o n t r a s t , t h e 1 6 0 - t o 1 8 0 - k D a f r a g m e n ti n h i b i t e d t h e b i n d i n g o f t h e b a c t e r i a t o i m m o b i l i z e d F n b y5 0 % a t 1 0 0 , u g / m l . T h u s , t h e 1 6 0 - t o 1 8 0 - k D a f r a g m e n t s ,w h i c h r e t a i n b o t h t h e g e l a t i n - a n d c e l l - b i n d i n g r e g i o n s , w i l ls u p p o r t b i n d i n g o f S . s a n g u i s t o i m m o b i l i z e d g e l a t i n a n d w i l li n h i b i t t h e b i n di n g o f S . s a n g u i s t o i n t a c t , i m m o b i l i z e d F n .

DISCUSSIONS i n c e K u u s e l a ( 1 7 ) i n i t i a l l y d e s c r i b e d t h e b i n d i n g o f F n t oS t a p h y l o c o c c u s a u r e u s 1 0 y e a r s a g o , a l a r g e n u m b e r o f o t h e rm i c r o o r g a n i s m s h a v e b e e n s h o w n t o i n t e r a c t w i t h t h i s i m -p o r t a n t g l y c o p r o t e i n ( 3 , 2 3 , 3 0 , 3 2 ) . I t now a p p e a r s t h a t o n eo f t h e p r i m a r y f u n c t i o n a l c o n s e q u e n c e s o f t h e i n t e r a c t i o n o fFn w i t h b a c t e r i a i s i n t h e i n i t i a l a d h e r e n c e o f t h e b a c t e r i a t oh o s t c e l l s a n d t i s s u e s . H a m i l l h a s s pe c ul at e d i n a r e c e n tr e v i e w t h a t Fn may p l a y a r o l e i n i n f e c t i v e e n d o c a r d i t i s b ya c t i n g a s a n a d h e r e n c e r e c e p t o r o n d a m a g e d c a r d i a c v a l v u l a r

s u r f a c e s ( 1 3 ) . A t p o i n t s o f d a m a g e t o t h e v a s c u l a r e n d o t h e -l i u m , s u b c e l l u l a r c o l l a g e n i s e x p o s e d , l e a d i n g t o p l a t e l e tb i n d i n g a n d a c t i v a t i o n a n d t h r o m b u s f o r m a t i o n . I t i s k n o w nt h a t Fn i s o n e o f t h e p r e d o m i n a n t c o m p o n e n t s o f t h e s et h r o m b i a n d i s t h u s i n a p o s i t i o n t o s e r v e a s a s i t e f o r i n i t i a lb a c t e r i a l a d h e r e n c e . I n de e d , S . a u r e u s a p p e a r s t o b i n d muchb e t t e r t o a r t i f i c i a l t h r o m b i f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f F n t h a nt o t h r o m b i m a d e f r o m F n - d e f i c i e n t p l a s m a ( 2 7 ) . T h e q u e s t i o nr e m a i n s , h o w e v e r , w h e t h e r F n c a n i n f a c t s e r v e a s a r e c e p t o rf o r a d h e r e n c e o f c e r t a i n o r g a n i s m s t o d a m a g e d h e a r t v a l v e s ,e s p e c i a l l y i n v i e w o f t h e f a c t t h a t t h e r e i s a h i g h c o n c e n t r a -t i o n o f s o l u b l e F n i n p l a s m a .S . s a n g u i s i s a n o r m a l i n h a b i t a n t o f t h e o r a l c a v i t y , a n d S .s a n g u i s b a c t e r e m i a i s a r e l a t i v e l y common p h e n o m e n o n .T h i s m i c r o o r g a n i s m i s a l s o o n e o f t h e l e a d i n g c a u s e s o fi n f e c t i v e e n d o c a r d i t i s . I n t h e p r e s e n t s t u d y , w e h a v e b e g u nt o i n v e s t i g a t e t h e m e c h a n i s m o f a d h e r e n c e o f S . s a n g u i s t oe x t r a c e l l u l a r m a c r o m o l e c u l e s t h a t may b e e x p o s e d o r d e p o s -i t e d a t p o i n t s o f e n d o t h e l i a l c e l l d a m a g e . O u r i n i t i a l f i n d i n g ss u p p o r t a n d e x t e n d e a r l i e r r e p o r t s o f i n t e r a c t i o n s b e t w e e n S .s a n g u i s a n d Fn b y d e m o n s t r a t i n g t h a t Fn c a n s e r v e a s ar e c e p t o r f o r a d h e r e n c e o f t h e s t r e p t o c o c c i e v e n i n t h ep r e s e n c e o f l a r g e a m o u n t s o f s o l u b l e Fn ( 2 , 3 4 ) .I n t h i s s t u d y , S . s a n g u i s d i d n o t b i n d t o i m m o b i l i z e dg e l a t i n , m o l e c u l a r t y p e I c o l l a g e n , o r t y p e I c o l l a g e n f i b r i l s ,m o l e c u l e s t h a t m i g h t a l s o b e e x p e c t e d t o b e e x p o s e d a tp o i n t s o f d a m a g e t o v a s c u l a r e n d o t h e l i u m . E x p o s u r e o fg e l a t i n - o r c o l l a g e n - c o a t e d p l a t e s t o p l a s m a , h o w e v e r , l e a d st o a d h e r e n c e o f t h e o r g a n i s m s . T h e p l a s m a m o l e c u l e t h a tb i n d s t o t h e g e l a t i n - c o a t e d p l a t e s a n d s u p p o r t s S . s a n g u i sa d h e r e n c e i s m o s t l i k e l y F n , s i n c e r e m o v a l o f Fn b y g e l a t i n -S e p h a r o s e c h r o m a t o g r a p h y e l i m i n a t e s t h e a b i l i t y o f p l a s m at o s t i m u l a t e a d h e r e n c e a n d s i n c e r e c o n s t i t u t i o n o f a d s o r b e dp l a s m a w i t h p u r i f i e d Fn r e s t o r e s t h e a d h e r e n c e - s t i m u l a t i n ge f f e c t . T h e s e w e r e n o t u n e x p e c t e d f i n d i n g s , s i n c e so meb a c t e r i a d o n o t b i n d t o g e l a t i n o r c o l l a g e n a n d s i n c e a l a r g en u m b e r o f b a c t e r i a a r e known t o b i n d t o s u b s t r a t e - a d s o r b e dF n . I t was s o m e w h a t u n e x p e c t e d , h o w e v e r , t o f i n d t h a ta d h e r e n c e o f S . s a n g u i s t o s u b s t r a t e - a d s o r b e d Fn w as n o ti n h i b i t e d b y s o l u b l e F n . T h i s i s , o f c o u r s e , a c r i t i c a l f i n d i n gr e l a t i v e t o t h e p o s s i b i l i t y t h a t Fn may b e a n a d h e r e n c er e c e p t o r o n d a m a g e d c a r d i a c v a l v e s .A l t h o u g h a d d i t i o n a l s t u d i e s w i l l b e n e e d e d t o d e t e r m i n eho w S . s a n g u i s i n t e r a c t s d i f f e r e n t l y w i t h s o l u b l e v e r s u s

s u b s t r a t e - a d s o r b e d F n , w e b e l i e v e t h a t t h e f o l l o w i n g w i l l b eu s e f u l a s a n i n i t i a l h y p o t h e s i s . I t i s t h o u g h t t h a t F n c h a n g e sc o n f o r m a t i o n a n d u n d e r g o e s a s u r f a c e a c t i v a t i o n w h e n i tb e c o m e s b o u n d t o c e r t a i n o t h e r m o l e c u l e s o r s u b s t r a t e s ,s u c h a s g e l a t i n , c o l l a g e n , o r p l a s t i c ( 1 ) . W i l l i a m s e t a l . h a v ed e m o n s t r a t e d t h a t p l a s m a F n e x i s t s i n a f o l d e d g l o b u l a rc o n f i g u r a t i o n u n d e r p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s a n d t h a t i t c a nu n f o l d a s t h e pH o r i o n i c s t r e n g t h i n c r e a s e s o r a s i t i n t e r a c t sw i t h c e r t a i n o t h e r m o l e c u l e s ( 3 5 ) . T h e same t y p e o f u n f o l d -i n g may a l s o o c c u r a s F n i n t e r a c t s w i t h a n d b e c o m e si m m o b i l i z e d o n a c o l l a g e n m a t r i x , a n d t h i s u n f o l d i n g c o u l de x p o s e n ew s i t e s w h i c h t h e n s u p p o r t S . s a n g u i s a d h e r e n c e .V e r c e l l o t t i e t a l . h a v e p r e v i o u s l y s u g g e s t e d t h i s p o s s i b i l i t y i na s t u d y o f t h e i n t e r a c t i o n o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s a n ds e v e r a l o t h e r b a c t e r i a , i n c l u d i n g S . s a n g u i s , w i t h e x t r a c e l -l u l a r m a t r i x m o l e c u l e s ( 3 3 ) . T h e y f o u n d t h a t S . s a n g u i s wasa b l e t o b i n d t o a s u r f a c e c o a t e d w i th F n b u t d i d n o t a g g r e g a t ei n t h e p r e s e n c e o f s o l u b l e F n .S u c h s u r f a c e a c t i v a t i o n o f F n a s i t b e c o m e s i m m o b i l i z e dh a s b e e n s u g g e s t e d b y s e v e r a l a u t h o r s t o e x p l a i n c e r t a i no t h e r s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l d i f f e r e n c e s t h a t h a v e b e e no b s e r v e d b e t w e e n s o l u b l e a n d i n s o l u b l e F n ( 1 ) . F o r i n s t a n c e ,p l a s m i n o g e n b i n d s t o i n s o l u b l e F n t h a t h a s b e e n i m m o b i l i z e don p o l y s t y r e n e s u r f a c e s b u t w i l l n o t b i n d s o l u b l e F n ( 2 4 ) .S i m i l a r r e s u l t s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d w i t h h y a l u r o n a t e ,w h i c h b i n d s o n l y t o i m m o b i l i z e d F n a n d n o t t o s o l u b l e F n( 1 8 ) . A n o t h e r e x a m p l e i s t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e s o l u b l ef o r m o f t h e 1 2 0 - k D a c h y m o t r y p s i n - g e n e r a t e d c e l l - b i n d i n gf r a g m e n t s o f F n d i d n o t c o n t a i n g l y c o s a m i n o g l y c a n - b i n d i n gs i t e s ( 1 9 ) . I n c o n t r a s t , i f t h e same f r a g m e n t s were i m m o b i -l i z e d , g l y c o s a m i n o g l y c a n - b i n d i n g s i t e s were e x p o s e d , a l l o w -i n g t h e b i n d i n g o f d e r m a t a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n s . I n a d d i -t i o n , G r i n n e l l a n d F e l d d e m o n s t r a t e d n o t o n l y t h a t a n t i - F na n t i b o d i e s r e a c t d i f f e r e n t l y t o i m m o b i l i z e d F n b u t a l s o t h a tt h e r e a c t i v i t y may d e p e n d u p o n t h e k i n d o f s u r f a c e u s e d f o ri m m o b i l i z a t i o n ( 1 2 ) .G i b b o n s a n d H a y h a v e d e s c r i b e d a s o m e w h a t s i m i l a rs i t u a t i o n f o r t h e a d h e r e n c e o f A c t i n o m y c e s v i s c o s u s LY3 t op r o l i n e - r i c h p r o t e i n s ( P R P s ) p u r i f i e d f r o m human s a l i v a ( 1 1 ) .T h e s e i n v e s t i g a t o r s o b s e r v e d t h a t A . v i s c o s u s c o u l d b i n d t oP R P - c o a t e d h y d r o x y a p a t i t e i n t h e p r e s e n c e o f s o l u b l e P R P s .T h e y s u g g e s t e d t h a t a s PRPs w ere i m m o b i l i z e d o n h y d r o x -y a p a t i t e , r e g i o n s t h a t were h i d d e n i n t h e s o l u b l e f o r m o f t h ePRPs were e x p o s e d a n d a b l e t o i n t e r a c t w i t h t h e m i c r o o r -g a n i s m s . T h e s e d a t a s u p p o r t t h e p r i n c i p l e t h a t F n a n dp o s s i b l y o t h e r p r o t e i n s c o n t a i n a d d i t i o n a l b i n d i n g s i t e sw h i c h a r e n o t e x p o s e d i n t h e s o l u b l e f o r m b u t w h i c h a r ea c t i v a t e d when t h e m o l e c u l e i s i m m o b i l i z e d .R e s u l t s i n t h e p r e s e n t s t u d y a l s o s u g g e s t t h a t t h e i n t e r a c -t i o n s o f S . s a n g u i s a n d S . p y o g e n e s w i t h F n a r e d i s t i n c t . S .p y o g e n e s i s u n d o u b t e d l y t h e b e s t - c h a r a c t e r i z e d s t r e p t o -c o c c a l s p e c i e s w i t h r e g a r d t o i n t e r a c t i o n s w i t h F n . F a t t y a c i dc ha i n s o f t h e l i p o t e i c h o i c a c i d on t h e s u r f a c e o f t h e o r g a n i s mb i n d F n v i a a f a t t y a c i d - b i n d i n g s i t e i n t h e 2 7 - k D a a m i n o -t e r m i n a l f r a g m e n t o f Fn ( 2 8 ) . S o l u b l e Fn b i n d s t o l i p o t e i -c h o i c a c i d a n d i s a c o m p e t i t i v e i n h i b i t o r o f t h e b i n d i n g o fg r o u p A s t r e p t o c o c c i t o s u b s t r a t e - a d s o r b e d Fn ( 4 ) . I n con-t r a s t , s o l u b l e Fn d o e s n o t i n h i b i t S . s a n g u i s b i n d i n g t os u b s t r a t e - a d s o r b e d F n .I n t h e e x p e r i m e n t a l s y s t e m u s e d i n t h i s p a p e r , p r o t e o l y t i cc l e a v a g e o f F n a p p a r e n t l y m i m i c s s u r f a c e a c t i v a t i o n i n t e r m so f e x p o s i n g a c r y p t i c s i t e i n Fn f o r b i n d i n g t o S . s a n g u i s .B r i e f t r y p s i n i z a t i o n r e s u l t s i n r e l e a s e o f a s m a l l c a r b o x y -t e r m i n a l f r a g m e n t t h a t c o n t a i n s t h e d i s u l f i d e b o n d s t h a t j o i nt h e Fn m o n o m e r s , t h e 2 7 - k D a a m i n o - t e r m i n a l d o m a i n , a n dt h e 1 6 0 - t o 1 8 0 - k D a f r a g m e n t s t h a t c o n t a i n t h e g e l a t i n -

V O L . 5 6 , 1 9 8 8


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2 2 8 4 LOWRANCE ET A L .b i n d i n g a n d c e l l - b i n d i n g d o m a i n s ( 1 1 , 1 9 ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e3 1 - k D a a m i n o - t e r m i n a l f r a g m e n t t h a t c o n t a i n s t h e p r i m a r yb i n d i n g s i t e s f o r S . pyogenes a n d S . au r e u s d o e s n o t a f f e c ta d h e r e n c e o f S . s a n g u i s t o i m m o b i l i z e d F n . I n a d d i t i o n , t h e1 6 0 - t o 1 8 0 - k D a f r a g m e n t s , b u t n o t t h e 3 1 - k D a a m i n o -t e r m i n a l f r a g m e n t , w i l l s u p p o r t t h e b i n d i n g o f S . s a n g u i s t og e l a t i n . T h u s , t h e i n t e r a c t i o n o f S . s a n g u i s a n d S . p y o g e n e sw i t h Fn w o u l d a p p e a r t o occur b y d i f f e r e n t m e c h a n i s m s .O t h e r r e p o r t s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t f u n c t i o n a l d o m a i n scan b e r e m o v e d f r o m t h e i n t a c t m o l e c u l e a n d s t i l l r e t a i n t h e i ra c t i v i t y ( 1 , 1 7 , 2 1 ) . I n a d d i t i o n , some o f t h e s e s t u d i e s w e r ea b l e t o s h o w t h a t w h i l e i n t a c t Fn l a c k e d o r d i d n o t e x h i b i tc e r t a i n a c t i v i t i e s o r f e a t u r e s , p r o t e o l y t i c a l l y d e r i v e d f r a g -ments were a c t i v e . F o r e x a m p l e , a t r a n s f o r m a t i o n - e n -h a n c i n g f a c t o r was n o t d e t e c t e d w i t h t h e i n t a c t Fn m o l e c u l e( 6 ) . H o w e v e r , p l a s m i n - a n d c a t h e p s i n G - g e n e r a t e d F n f r a g -ments were h i g h l y a c t i v e i n p r o m o t i n g v i r u s - i n d u c e d mor-p h o l o g i c a l c e l l t r a n s f o r m a t i o n ( 2 4 ) . I n a n o t h e r e x a m p l e , tw oh e p a r i n - b i n d i n g f r a g m e n t s o f Fn p u r i f i e d f r o m c a t h e p s i n D o ra l p h a - t h r o m b i n d i g e s t s were s p e c i f i c , p o t e n t i n h i b i t o r s o f t h eg r o w t h o f c u lt ur e d b o v i n e a o r t i c e n d o t h e l i a l c e l l s , b u t i n t a c tF n , e v e n a t h i g h c o n c e n t r a t i o n s , was n o t a b l e t o i n h i b i tg r o w t h ( 1 6 ) . O u r o b s e r v a t i o n s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h i s r e p o r ti n t h a t t h e i n t a c t s o l u b l e Fn w i l l n o t i n h i b i t i n t e r a c t i o n s w i t ht h e i m m o b i l i z e d m o l e c u l e , w h e r e a s p r o t e o l y t i c a l l y d e r i v e df r a g m e n t s c o n t a i n t h e b i n d i n g d o m a i n f o r S. s a n g u i s a n d w i l li n h i b i t t h e i n t e r a c t i o n s w i t h t h e i m m o b i l i z e d m o l e c u l e . A l -t h o u g h t h e s e f r a g m e n t s h a v e b e e n i d e n t i f i e d , more w o r k w i l lb e n e e d e d t o d e f i n e t h e b i n d i n g r e g i o n f o r S . s a n g u i s morep r e c i s e l y .I t h a s a l s o b e e n s u g g e s t e d t h a t i n t e r a c t i o n s o f b a c t e r i aw i t h p l a t e l e t s o r l a m i n i n may p l a y a r o l e i n I E by s e r v i n g a ss u b s t r a t e s f o r t h e a d h e r e n c e a n d c o l o n i z a t i o n o f t h e h o s t b yp a t h o g e n i c b a c t e r i a ( 1 5 , 3 1 ) . N e v e r t h e l e s s , a d h e r e n c e s t u d -i e s w i t h t h e s e t i s s u e components i n w h i c h t h e b a c t e r i a a n da d h e r e n c e r e c e p t o r s were i n c u b a t e d i n t h e presence o fp l a s m a h a v e n o t b e e n p e r f o r m e d . I n t h i s s tu dy , t he d a t ad e m o n s t r a t e a p o s s i b l e m e c h a n i s m f o r t h e a d h e r e n c e o f S.s a n g u i s t o i m m o b i l i z e d Fn i n t h e presence o f p l a s m a . I t i sp o s s i b l e , o f course, t h a t a d h e r e n c e o f b a c t e r i a t o damagede n d o t h e l i a l t i s s u e may d e p e n d upon more t h a n one mecha-n i s m , a n d v a r i o u s b a c t e r i a may a l s o u t i l i z e d i f f e r e n t m e c h a -n i s m s t o c o l o n i z e d a m a g e d c a r d i a c t i s s u e s . P r o d u c t i o n o fw e l l - c h a r a c t e r i z e d S . s a n g u i s mutants which l a c k t h e a b i l i t yt o b i n d t o s p e c i f i c m o l e c u l e s may a l l o w one t o d i s s e c t t h er o l e t h a t a d h e r e n c e t o one o r more o f t h e m o l e c u l e s presenta t t h e s u r f a c e o f d a m a g e d h e a r t v a l v e s m i g h t a c t u a l l y p l a y i nt h e p a t h o g e n e s i s o f I E .

ACKNOWLEDGMENTSW e t h a n k S u z i e F e r r a n b a c h a n d S u s a n P r i c e f o r e x c e l l e n t t e c h -n i c a l a s s i s t a n c e a n d C a r o l Lowrance f o r ex pert s e c r e t a r i a l a s s i s -

t a n c e i n p r e p a r i n g t h e m a n u s c r i p t . I n a d d i t i o n , we t h a n k L . M .B a d d o u r a n d G . D . C h r i s t e n s e n f o r t h e i r c r i t i c a l review o f t h i sm a n u s c r i p t a n d f o r t h e i r t h o u g h t f u l d i s c u s s i o n s .T h e s e s t u d i e s were s u p p o r t e d by a U . S . Veterans A d m i n i s t r a t i o nr e s e a r c h g r a n t a n d U . S . P u b l i c H e a l t h S e r v i c e grant DE-07218 fr omt h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h .LITERATURE C I T E D

1 . A k i y a m a , S . K . , an d K . M . Yamada. 1 9 8 7 . F i b r o n e c t i n . Adv.E n z y m o l . R e l a t . A r e a s M o l . B i o l . 5 9 : 1 - 5 7 .2 . B a b u , J . P . , W. A . S i m p s o n , H. S . Courtney, a nd E. H. Beachey.1 9 8 3 . I n t e r a c t i o n o f human p l a s m a f i b r o n e c t i n w i t h c a r i o g e n i ca n d n o n c a r i o g e n i c o r a l s t r e p t o c o c c i . I n f e c t . Immun. 41:162-1 6 8 .

3 . B e a c h e y , E . H . 1 9 8 1 . B a c t e r i a l a d h e r e n c e : a d h e s i n - r e c e p t o ri n t e r a c t i o n s m e d i a t i n g t h e a t t a c h m e n t o f b a c t e r i a t o m u c o s a ls u r f a c e s . J . I n f e c t . D i s . 1 4 3 : 3 2 5 - 3 4 5 .4 . C o u r t n e y , H . S . , I . O f e k , W . A . S i m p s o n , D . L . H a s t y , a n d E . H .B e a c h e y . 1 9 8 6 . B i n d i n g o f S t r e p t o c o c c u s p y o g e n e s t o s o l u b l ea n d i n s o l u b l e f i b r o n e c t i n . I n f e c t . I m m u n . 5 3 : 4 5 4 - 4 5 9 .5 . D a l e , J . B . , a n d E . H . B e a c h e y . 1 9 8 4 . U n i q u e a n d commonp r o t e c t i v e e p i t o p e s a m o n g d i f f e r e n t s e r o t y p e s o f g r o u p A s t r e p -t o c o c c a l M p r o t e i n s d e f i n e d w i t h h y b r i d o m a a n t i b o d i e s . I n f e c t .I m m u n . 4 6 : 2 6 7 - 2 6 9 .6 . D e P e t r o , G . , S . B a r l a t i , T . V a r t i o , a n d A . V a h e r i . 1 9 8 1 .T r a n s f o r m a t i o n - e n h a n c i n g a c t i v i t y o f g e l a t i n - b i n d i n g f r a g m e n t so f f i b r o n e c t i n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 7 8 : 4 9 6 5 - 5 9 6 9 .7 . D u r a c k , D . T . , P . B . B e e s o n , a n d R . G . P e t e r s d o r f . 1 9 7 3 .E x p e r i m e n t a l b a c t e r i a l e n d o c a r d i t i s I I I : p r o d u c t i o n a n d p r o g -r e s s o f t h e d i s e a s e i n r a b b i t s . B r . J . E x p . P a t h o l . 5 4 : 1 4 2 - 1 5 1 .8 . E n g v a l l , E . , a n d P . P e r l m a n n . 1 9 7 1 . E n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r -b e n t a s s a y ( E L I S A ) q u a n t i t a t i v e a s s a y o f i m m u n o g l o b u l i n G .I m m u n o c h e m i s t r y 8 : 8 7 1 - 8 7 4 .9 . E n g v a l l , E . , a n d E . R u o s l a h t i . 1 9 7 7 . B i n d i n g o f s o l u b l e f o r m o ff i b r o b l a s t s u r f a c e p r o t e i n , f i b r o n e c t i n , t o c o l l a g e n . I n t . J . C a n -c e r 2 0 : 1 - 5 .1 0 . E v e r t t , E . D . , a n d J . V . H i r s c h m a n n . 1 9 7 7 . T r a n s i e n t b a c t e r e m i aa n d e n d o c a r d i t i s p r o p h y l a x i s . M e d i c i n e ( B a l t i m o r e ) 5 6 : 6 1 .1 1 . G i b b o n s , R . J . , a n d D . I . H a y . 1 9 8 8 . Human s a l i v a r y a c i d i cp r o l i n e - r i c h p r o t e i n s a n d s t a t h e r i n p r o m o t e t h e a t t a c h m e n t o fA c t i n o m y c e s v i s c o s u s LY7 t o a p a t i t i c s u r f a c e s . I n f e c t . I m m u n .5 6 : 4 3 9 - 4 4 5 .1 2 . G r i n n e l , F . , a n d M . K . F e l d . 1 9 8 1 . F i b r o n e c t i n a b s o r p t i o n o nh y d r o p h i l i c a n d h y d r o p h o b i c s u r f a c e s d e t e c t e d b y a n t i b o d yb i n d i n g a n d a n a l y z e d d u r i n g c e l l a d h e s i o n t o s e r u m c o n t a i n i n gm e d i u m . J . B i o l . C h e m . 2 5 7 : 4 8 8 8 - 4 8 9 3 .1 3 . H a m i l l , R . J . 1 9 8 7 . R o l e o f f i b r o n e c t i n i n i n f e c t i v e e n d o c a r d i t i s .R e v . I n f e c t . D i s . 9 ( S u p p l . 4 ) : 3 6 0 - 3 7 1 .1 4 . H a s t y , D . L . , H . S . C o u r t n e y , W . A . S i m p s o n , J . A . M c d o n a l d ,a n d E . H . B e a c h e y . 1 9 8 6 . I m m u n o c h e m i c a l a n d u l t r a s t r u c t u r a lm a p p i n g o f t h e g e l a t i n - b i n d i n g a n d c e l l - b i n d i n g r e g i o n s o f h u -man p l a s m a f i b r o n e c t i n w i t h m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . J . C e l l S c i .8 1 : 1 2 5 - 1 4 1 .1 5 . H e r z b e r g , M . C . , K . L . B r i n t z e n h o f e , a n d C . C . C l a w s o n . 1 9 8 3 .A g g r e g a t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s a n d a d h e s i o n o f S t r e p t o c o c c u ss a n g u i s . I n f e c t . I m m u n . 3 9 : 1 4 5 7 - 1 4 6 9 .1 6 . H o m a n d b e r g , G . A . , J . E . W a l i a m s , D . G r a n t , B . S c h u m a c h e r ,a n d R . E i s e n s t e i n . 1 9 8 5 . H e p a r i n - b i n d i n g f r a g m e n t s o f f i b r o -n e c t i n a r e p o t e n t i n h i b i t o r s o f e n d o t h e l i a l c e l l g r o w t h . A m . J .P a t h o l . 1 2 0 : 3 2 7 - 3 3 2 .1 7 . K u u s e l a , P . 1 9 7 8 . F i b r o n e c t i n b i n d s t o S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s .N a t u r e ( L o n d o n ) 2 6 7 : 6 8 0 - 6 8 5 .1 8 . L a t e r r a , J . , a n d L . A . C u l p . 1 9 8 2 . D i f f e r e n c e s i n h y a l u r o n a t eb i n d i n g t o p la s m a a n d c e l l s u r f a c e f i b r o n e c t i n . J . B i o l . C h e m .2 5 7 : 7 1 9 - 7 2 6 .1 9 . L e w a n d o w s k a , K . , H . U . C h o i , L . C . R o s e n b e r g , L . Z a r d i , a n dL . A . C u l p . 1 9 8 7 . F i b r o n e c t i n - m e d i a t e d a d h e s i o n o f f i b r o b l a s t :i n h i b i t i o n b y d e r m a t a n s u l f a t e p r o t e o g l y c a n a n d e v i d e n c e f o r ac r y p t i c g l y c o s a m i n o g l y c a n - b i n d i n g d o m a i n . J . C e l l B i o l . 1 0 5 :1 4 4 3 - 1 4 5 4 .2 0 . L o w r y , 0 . H . , N . J . R o s e b r o u g h , A . L . F a r r , a n d R . J . R a n d a l l .1 9 5 1 . P r o t e i n m e a s u r e m e n t w i t h t h e F o l i n p h e n o l r e a g e n t . J .B i o l . C h e m . 1 9 3 : 2 6 5 - 2 7 5 .2 1 . M o s h e r , D . F . , a n d R . A . P r o c t o r . 1 9 8 0 . B i n d i n g a n d f a c t o rV I l l a - m e d i a t e d c r o s s - l i n k i n g o f a 2 7 - k i l o d a l t o n f r a g m e n t o ff i b r o n e c t i n t o S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s . S c i e n c e 2 0 9 : 9 2 7 - 9 2 9 .2 2 . M u n o z , J . 1 9 7 1 . I m m u n o p r e c i p i t i n t e s t . M e t h o d s I m m u n o l .I m m u n o c h e m . 3 : 1 4 6 - 1 6 0 .2 3 . O u a i s s i , M . A . , J . C o r n e t t e , a n d A . C a p r o n . 1 9 8 5 . T r y p a n o s o m ac r u z i i n f e c t i o n i n h i b i t e d b y p e p t i d e s m o d e l e d f r o m a f i b r o n e c t i nc e l l a t t a c h m e n t d o m a i n . E u r . J . I m m u n o l . 1 5 : 1 0 9 6 - 1 1 0 1 .2 4 . S a l o n e n , E . M . , 0 . S a k s e l a , T . V a r t i o , A . V a h e r i , L . S . N i e l s o n ,a n d J . Z e u t h e n . 1 9 8 5 . P l a s m i n o g e n a n d t i s s u e - t y p e p l a s m i n o g e na c t i v a t o r b i n d t o i m m o b i l i z e d f i b r o n e c t i n . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 :1 2 3 0 2 - 1 2 3 0 7 .2 5 . S c h e l d , W. M . 1 9 8 4 . P a t h o g e n e s i s a n d p a t h o p h y s i o l o g y o fi n f e c t i v e e n d o c a r d i t i s , p . 1 - 3 2 . I n M . A . S a n d e , D . K a y e , a n d



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S . SANGUIS ADHERENCE T O FIBRONECTIN 2 2 8 5R . K . R o o t ( e d . ) , E n d o c a r d i t i s . C h u r c h i l l L i v i n g s t o n e , L t d . ,Ne w Y o r k .2 6 . S c h e l d , W. M . , a n d M. A . S a n d e . 1 9 7 9 . E n d o c a r d i t i s a n di n t e r v a s c u l a r i n f e c t i o n s , p . 5 0 4 - 5 2 8 . In G . L . M a n d e l , R . G .D o u g h a s , a n d J . E . B e n n e t t ( e d . ) , P r i n c i p l e s a n d p r a c t i c e o fi n f e c t i o u s d i s e a s e s . J o hn W i le y &S o n s , I n c . , Ne w Y o r k .2 7 . S c h e l d , W. M . , J . A . V a l o n e , a n d M. A . S a n d e . 1 9 7 8 . B a c t e r i a la d h e r e n c e i n t h e p a t ho g e n e si s o f e n d o c a r d i t i s : i n t e r a c t i o n o f t h eb a c t e r i a l d e x t r a n , p l a t e l e t s , a n d f i b r i n . J . C l i n . I n v e s t . 6 1 : 1 3 9 4 -1 4 0 4 .2 8 . S t a n i s l a w s k i , L . , H . S . C o u r t n e y , W. A . S i m p s o n , D . L . H a s t y ,E . H . B e a c h e y , a n d I. O f e k . 1 9 8 7 . H y b r i d o m a a n t i b o d i e s t o t h el i p i d - b i n d i n g s i t e ( s ) i n t h e a m i n o - t e r m i n a l r e g i o n o f f i b r o n e c t i nt h a t i n h i b i t s b i n d i n g o f s t r e p t o c o c c a l l i p o t e i c h o i c a c i d . J . I n f e c t .D i s . 1 5 6 : 3 4 4 - 3 4 9 .2 9 . S u l l a m , P . M . , T . A . D u r a c k , a n d M. A . S a n d e . 1 9 8 5 . P a t h o g e n -e s i s o f e n d o c a r d i t i s . Am . J . M e d . 7 8 : 1 1 0 - 1 1 5 .3 0 . S w i t a l s k i , L . M . , A . L j u n g h , C . R y d e n , K . R u b i n , M. H o o k , a n dT . W a d s t r o n . 1 9 8 2 . B i n d i n g o f f i b r o n e c t i n t o t h e s u r f a c e o fgroups A , C , a n d G s t r e p t o c o c c i . E u r . J . C l i n . M i c r o b i o l . 1 : 3 8 1 -

3 8 7 .3 1 . S w i t a l s k i , L . M . , H . M u r c h i s o n , R . T i m p l , R . C u r t i s s III, a n d M.H o o k . 1 9 8 7 . B i n d i n g o f l a m i n i n t o o r a l a n d e n d o c a r d i t i s s t r a i n so f v i r i d a n s s t r e p t o c o c c i . J . B a c t e r i o l . 1 6 9 : 1 0 9 5 - 1 1 0 1 .3 2 . T h o m a s , D . D . , J . B . B a s e m a n , a n d J . F . A l d e r e t e . 1 9 8 5 .F i b r o n e c t i n m e d i a t e s T r e p o n e m a p a l l i d u m c y t a d h e r e n c et h r o u g h r e c o g n i t i o n o f f i b r o n e c t i n c e l l - b i n d i n g d o m a i n . J . E x p .M e d . 1 6 1 : 5 1 4 - 5 2 5 .3 3 . V e r c e l l o t t i , G . M . , D . L u ss e n h o p , P . K . P e t e r s o n , L . T . F u r c h t ,J . B . M c C a r t h y , H . S . J a c o b , a n d C . F . M o l d o w . 1 9 8 4 . B a c t e r i a la d h e r e n c e t o f i b r o n e c t i n a n d e n d o t h e l i a l c e l l s : a p o s s i b l e m e c h -a n i s m f o r b a c t e r i a l t i s s u e t r o p i s m . J . L a b . C l i n . M e d . 1 0 3 : 3 4 - 4 3 .3 4 . V e r c e l l o t t i , G . M . , J . B . M c C a r t h y , P . L i n d h o l m , P . K . P e t e r s o n ,H . S . J a c o b , a n d L . T . F u r c h t . 1 9 8 5 . E x t r a c e l l u l a r m a t r i x p r o -t e i n s ( f i b r o n e c t i n , l a m i n i n , a n d t y p e I V c o l l a g e n ) b i n d a n da g g r e g a t e b a c t e r i a . Am. J . P a t h o l . 1 2 0 : 1 3 - 2 1 .3 5 . W i ll i am s , E . C . , P . A . J a n m e y , J . D . F e r r y , a n d D . E . M o s h e r .1 9 8 2 . C o n f o r m a t i o n a l s t a t e s o f f i b r o n e c t i n : e f f e c t s o f p H , i o n i cs t r e n g t h , a n d c o l l a g e n b i n d i n g . J . B i o l . C h e m . 2 5 7 : 1 4 9 7 3 - 1 4 9 7 8 .

VOL. 5 6 , 1 9 8 8

adherence of streptococcus sanguis to conformationally specific determinants in fibronectin

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