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8/6/2019 Adducts Paper

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with Aldehydes Alone: Possible Role in Ethanol ToxicityTryptophan Analogues Form Adducts by Cooperative Reaction with Aldehydes and Alcohols or

JE Austin, and H Fraenkel-Conrat

doi:10.1073/pnas.89.18.84391992;89;8439-8442PNAS

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2/5

P r o c . N a t i .A c a d . S c i .USAVo l .8 9 ,p p .8 4 3 9 - 8 4 4 2 ,S e p t e m b e r1 9 9 2B i o c h e m i s t r y

T r y p t o p h a na n a l o g u e sf o r m a d d u c t sb y c o o p e r a t i v er e a c t i o n w i t ha l d e h y d e sa n d a l c o h o l so r w i t h a l d e h y d e sa l o n e : P o s s i b l er o l e i ne t h a n o l t o x i c i t y

[ m i x e da c e t a l s / h y d r o x y e t h y l a t i o n / i n d o l e / b i s ( i n d o l y l ) e t h a n e ]

J A M E SE . A U S T I NAND H E I N ZFRAENKEL-CONRAT*D e p a r t m e n to f M o l e c u l a ra n d C e l lB i o l o g y ,U ni v er s i ty o fC a l i f o r n i a ,B e r k e l e y ,C A 9 4 7 2 0

C o n t r i b u t e db y H e i n zF r a e n k e l - C o n r a t ,J u n e 1 7 ,1 9 9 2

A B S T R A C T P r e v i o u s w o r k s h o w e dt h a t t h e e x o c y c l i ca m i n og r o u p s o f n u c l e i ca c i dc o m p o n e n t sr e a c tq u i c k l ya ta m b i e n tt e m p e r a t u r ew i t h a c et a l de h yd ea n d e t h a n o l t o y i e l dm i x e da c e t a l s[ R - N H - C H ( C H 3 ) - O - C 2 H 5 ] .Wen o wf i n dt h a t t h es a m e t y p eo f r e a c t i o no c c u r s r e a d i l yw i t h t h en i t r o g e no f3 - s u b s t i t u t e di n d o l e s( e . g . ,i n d o l e - 3 - a c e t i ca c i da n d N - a c e t y l -t r y p t o p h a n ) ,a n a l o g u e s o f t h e a m i n o a c i dt r y p t o p h a n . Inc o n t r a s t ,u n s u b s t i t u t e di n d o l e r e a c t sv e r yr a p i d l ya tt h ec a r b o ni n r i n gp o s i t i o n2 o r 3 w i t h a c e t a l d e h y d et o f o r m b i s ( i n -

d o l y l ) e t h a n ew i t h o u te t h a n o l e n t e r i n gi n t ot h er e a c t i o n .P r o d -u c ts t r u c t u r e sh a ve b e enc o n f i r m e db y f a s ta t o mb o m b a r d m e n tMS a n d 1 HN M R . T h e f o r m e r r e a c t i o no c c u r s o p t i m a l l yi n3 0 - 5 0 %a q u e o u ss o l u t i o nb e l o wpH 4 . I t a l s op r o c e e d sm o r es l o w l ya n d w i t h r e d u c e dy i e l d si n a q u e o u sm e d i a a t m o r en e u t r a lp H . T h i s r e a c t i o nmay b e o f b i o l o g i c a lc o n c e r n ,a s i ts u p p l i e sa m e c h a n i s mf o rp r o t e i nm o d i f i c a t i o n sw i t h p o s s i b l et o x i ce f f e c t si n human t i s s u e sw h e r ee t h a n o l i s m e t a b o l i z e d .

A c e t a l d e h y d er e a c t sr e a d i l yu n d e r p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n sw i t h t h ee x o c y c l i c a m i n og r o u p s o f n u c l e o s i d e s ,a n d t h i sl a b i l ea d d u c tb e c o m e ss t a b i l i z e db y c o n d e n s a t i o nw i t h e t h -a n o l ( 1 ) . We h a v e i n i t i a t e da n i n v e s t i g a t i o n t o e s t a b l i s hw h e t h e rt h es a m et e r n a r y r e a c t i o no c c u r sw i t hp r o t e i na m i n og r o u p s .W h i l et h en u c l e o s i d er e a c t i o nw a ss u s p e c te d o f b e i n g

m u t a g e n i c ,t h e r ea r eg r o u n d st o b e l i e v et h a ts u c h p r o t e i nm o d i f i c a t i o n sm i g h tc o n t r i b u t et o t h e t o x i c i t yo f e t h a n o l .P r i m a r ya m i n og r o u p s( - N H 2 ) ,s u c ha s t h eN - t e r m i n a la n d

l y s i n ee - a m i n og r o u p s o fp r o t e i n s , r e a c tr a p i d l yw i t h a c e t a l -d e h y d e t o f o r m S c h i f fb a s e s [ - N = C H ( C H 3 ) ] ,w h i c h a r eu n a b l et o r e a c tf u r t h e rw i t h a l c o h o l s .T h i s w e l l - k n o w nr e a c -t i o nh a s r e c e i v e d c o n s i d e r a b l ea t t e n t i o nf r o m r e s e a r c h e r ss t u d y in g e t h a no l - i n d u c edh e p a t i ci n j u r ya n d t o x ic i t y ( 2 - 5 )b u ti sd i s t i n c tf r o mt h ec o o p e r a t i v er e a c t i o nd i s c u s s e dh e r e .O u rr e s e a r c h f o c u s e d i n s t e a do n t h e s e c o n d a r ya m i n og r o u p s(>NH) t h a ta r e p r e s e n t i np r o t e i n si n t h ei m i d a z o l eg r o u po fh i s t i d i n e ,t h ei n d o l eg r o u p o f t r y p t o p h a n , a n d N - t e r m i n a lp r o l i n e .T o a v o i dt h e f o r m a t i o no f m u l t i p l ep r o d u c t st h r o u g hS c h i f fb a s e f o r m a t i o na t t h e p r i m a r ya m i n og r o u p o f f r e ea m i n oa c i d s ,w e u s e dN - a c e t y l t r y p t o p h a na n d i n d o l e - 3 - a c e t i ca c i d( I A A )a s m o d e l sf o rt r y p t o p h a ni n p r o t e i n s .

3

2 2

HI n d o l e

C H 2 C H ( N H 2 ) C O O H

H C H 2 C O O HT r y p t o p h a n

- - NH

I AA

Ta b l e 1 . F o r m a t i o no f I AA N - a c e t a l

T i m e , A c e t a lf o r m e d ,%h r 8 0 ow a t e r 5 0 o w a t e r 3 3 %w a t e r 1 0 %w a t e r

0 . 5 5 3 31 1 2 1 4 1 12 1 7 2 72 4 2 6 5 9 6 2 1 5R e a c t i o nm i x t u r e sc o n t a i n e da b o u t3 mM I AA a n d e q u a la m o u n t s

o f a c e t a l d e h y d ea n d e t h a n o l .P r o d u c tw a s d e t e c t e da f t e r 3d a y s i nr e a c t i o nm i x t u r e s c o n t a i n i n ga s much a s 9 9 . 9 % ow a t e r b u f f e r e dt on e u t r a lp H .

B o t ho f t h e s ec o m p o u n d sy i e l d e dr e a c t i o np r o d u c t sw h e nt r e a t e ds i m u l t a n e o u s l yw i t h a c e t a l d e h y d ea n d e t h a n o l .N op r o d u c t sw e r e d e t e c t e dw h e ne i t h e ro f t h e s e r e a g e n t s w a su s e d a l o n e .S t r u c t u r a la n a l y s i sb y f a s ta t o mb o m b a r d m e n t( F A B )MS a n d 1 HNMR d e t e r m i n e dt h a ti t w a s o nt h e>NHg r o u p , r a t h e rt h a n t h en e i g h b o r i n g:C H g r o u p ,t h a tc o n d e n -s a t i o nw i t ht h ep r i m a r ya l d e h y d et o o kp l a c e ,f o l l o w e db y t h a tw i t h t he a lc o ho lt o p r o d u c es t a b l e d e r i v a t i v e s :

I AA + C H 3 C H O I A A > N - C H ( C H 3 ) - O H+ C 2 H 5 O H

I A A > N - C H ( C H 3 ) - O - C 2 H 5When a t t e m p t i n gt o u s e u n s u b s t i t u t e di n d o l ef o rt h e s a m e

p u r p o s e ,w e f o u n dr a p i df o rm a ti o n o fa p r o d u c tt h a tp r e c i p -i t a t e di n a q u e o u sr e a c t i o nm i x t u r e s . MS d a t a s u p p o r t ap r o p o s e db i s ( i n d o l e )s t r u c t u r e o f t h i sp r o d u c tf o r m e db yp r i m a r ya d d i t i o no f a l d e h y d e st ot h ei n d o l er i n g ,p r o d u c i n ga n- O Hg r o u pt h a tr e a d i l yr e a c t s w i t ha s e c o n di n d o l et o y i e l dab i s ( i n d o l y l ) a l k a n e( s e eF i g .5 I n s e t ) .

M E T H O D SA N DM AT E R I A L SA l lr e a g e n t s w e r e c o m m e r c i a lp r e p a r a t i o n s .

T L Cw a s d o n eo n s i l i c ap l a t e s( E a s t m a nK o d a k1 3 1 8 1 )w i t h1 - b u t a n o l / e t h a n o l / w a t e r ,8 0 : 1 0 : 2 5( v o l / v o l ) ,a s s o l v e n t .

UV s p e c t r a w e r e o b t a i n e df r o ma Va r i a nC a r y2 1 9 s p e c -t r o p h o t o m e t e r .

H P L C s e p a r a t i o n so f e l u a t e so r t o t a lr e a c t i o nm i x t u r e sw e r ep e r f o r m e do n a B e c k m a nU l t r a s p h e r e5 - , u mO DS s e m i -p r e p a r a t i v ec o l u m n( 2 5 0x 1 0 m m )w i t h a m o b i l ep h a s eo f7 5 % m e t h a n o l / 2 5 %w a t e r a n d a f l o w r a t e o f 2 m l / m i na ta m b i e n tt e m p e r a t u r e .A H e w l e t tP a c k a r dd i o d e - a r r a yd e t e c -t o r a n d C h e m s t a t i o nw e r e u s e d f o r d a t a c o l l e c t i o na n da n a l y s i s .

P o s i t i v e - i o nF AB( F A B + )MS w as c o n d u c t e do n a K r a t o sM S - 5 0m a s s s p e c t r o m e t e r .

A b b r e v i a t i o n s :I A A , i n d o l e - 3 - a c e t i ca c i d ;F A B + ,p o s i t i v e - i o nf a s ta t o mb o m b a r d m e n t .* T ow h o mr e p r i n tr e q u e s t s s h o u l db e a d d r e s s e d .

T h ep u b l i c a t i o nc o s t s o f t h i s a r t ic l ew e r ed e f r a y e di np a r tb y p a g ec h a r g ep a y m e n t .T h i sa r t i c l em u s tt h e r e f o r eb e h e r e b ym a r k e d" a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c ew i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4s o l e l yt o i n d i c a t et h i sf a c t .

8 4 3 9


3/5

8 4 4 0 B i o c h e m i s t r y :A u s t i na n d F r a e n k e l - C o n r a t

2 0 3 0T i m e( h r s )

F I G . 1 . R e a c t i o nr a t ea n d p r o d u c ty i e l df o r3 mM I AA t r e a t e dw i t h a c e t a l d e h y d e / e t h a n o l / w a t e r( 1 :1 : 1 ) a tp H 3 .

1 HNMR s p e c t r a w e r er e c o r d e df o ra 1 - m g / m ls o l u t i o no ft h eI AA a d d u c t i n a c e t o ne - d 6 ( 9 9 . 9 6 %;C a m b r i d g eI s o t o p eL a b o r a t o r i e s ,C a m b r i d g e ,MA ) o n a B r u k e rAM 5 0 0 s p e c -t r o m e t e r .S p e c t r aw e r er e f e r e n c e dt o t h e r e s i d u a la c e t o n e - d 5p e a k s e t t o 2 . 0 4 p p m . F o r t h e T O C S Y( t o t a lc o r r e l a t e ds p e c t r o s c o p y )e x p e r i m e n t ,a s w e e pw i d t h o f 4 5 4 5H z w a su s e d a n d a 2 0 4 8x 1 2 8 d a t a m at r i xw a s c o l l e c t e du s i n g t w os c a n sp e r i n c r e m e n t .F 1 w a sz e r o - f i l l e dt o2 5 6p o i n t s p r i o rt ot r a n s f o r m a t i o n .T h e m i x i n gt i m e w a s 1 3m s ( 6 ) .

R E S U LT SR e a c t i o no f I A Aa n dN - A c e t y l t r y p t o p h a nw i t hA c e t a l d e h y d e

a n d E t h a n o l . R e a c ti o n m i x tu r esc o n s i s t i n go f 0 . 1 %I AA i ne q u a l a m o u n t so f a c e ta l de h y de ,e t h a n o l ,a n d w a t e r w e r ea l l o w e dt o r e a c t f o r1 8 h r a t a m b i e n tt e m p e r a t u r e( 2 2 - 2 5 0 C ) .T L Cc l e a r l ys e p a r a t e ds p o t s o f s i m i l a rUV a b s o r b a n c ea t 5a n d 6 c m f r o mt h eo r i g i n .When d i l u t e[ 1 4 C ] e t h a n o lw a su s e d ,t h er a d i o l a b e lw a s d e t e c t e d o n l y i n t h es p o t a t 6 c m . Whena c e t a l d e h y d ew a s o m i t t e d ,n o s p o t w a s s e e n a t 6 c m . AnH P L Cs y s t e mw a sa l s oa b l et o s e p a r a t et h et w oc o m p o n e n t s

0

, 0r A

E D

2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0

F I G .2 . UV s p e c t r aa t n e u t r a lpH o f I AA (-) a n d i t sN - a c e t a la d d u c t - - - - ) .T h e i rm o l a re x t i n c t i o nc o e f f i c i e n t sa r e a b o u t6 0 0 0 .

o f t h i sr e a c t i o nm i x t u r e .I AA h a d a r e t e n t i o nt i me o f7 m i nc o m p a r e dw i t h 1 0 m i nf o ri t sa c e t a l d e h y d e / e t h a n o lp r o d u c t .

R e a c t i o nr a t e sa n d p r o d u c t y i e l d sw e r e d e t e r m i n e db y 'H P L Ca n a l y s i so f r e a c t i o nm i x t u r e so f v a r y i n g c o m p o s i tD a t as h o w na r e f o rr e a c t i o n sp e r f o r m e da ta p p r o x i m a t e l ypH4 , a pH r e s u l t i n gf r o m t h ea c e t a l d e h y d e( T a b l e1 ; F i g .1 ) .A q u e o u sr e a c t i o nm i x t u r e s w i t h pH f r o m 5 t o 7 . 4 a n dc o n t a i n i n ga s m u c h a s 9 9 . 9 o w a t e r a l s oy i e l d e ds m a l la m o u nt s o fp r o d u c ta f t e ra f e w d a y s .

R e a c t i o nm i x t u r e sw e r e a l s op r e p a r e du s i n g1 - ,3 - ,a n d4 - c a r b o n - c h a i na l d e h y d e sa n d a l c o h o l s .A f t e r2 4 h r o fr e a c -t i o na t a m b i e n tt e m p e r a t u r e ,t h e s ea l t e r n a t i v em i x t u r e sw e r e

1 1 5

2 0 2

1 3 0

1 7 5

1 8 51

I .I.

. i

2 4 7

2 3 7

1 5 0 2 0 0

CH2COOH

27 0C H ( C H 3 ) - O - C 2 H 5

IAA N - A C E TA LMW=247

2 9 2

!.

1111 i ...2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0?n /z

F I G . 3 . FAB+ MS o f t h e I AA N - a c e t a l i n a t h i o g l y c e r o l / g l y c e r o lm a t r i x . T h e p a r e n t i o n ( M + )ha s m /z 2 4 7 . T h e m /z 27 0 a n d 29 2 p e a k sr e p r e s e n t t h e a d d i t i o no f s o d i u mi o n s p r e s e n ti n t h e m a t r i xt o t h e p a r e n t i o n ,( M + N a ) +a n d ( M + 2N a - H ) + , r e s p e c t i v e l y .Three o t h e r p e a k sr e p r e s e n t f r a g m e n t so f t h e p a r e n t :2 0 2 ,( M - C O O H ) + ;1 7 5 ,[ A A + ;1 3 0 ,( I A A- C O O H ) + .T h e r e m a i n i n gm a j o r p e ak sa r e c h a r a c t e r i s t i c o f t h em a t r i x . MW, m o l e c u l a rw e i g h t .

1 0 0

A

j

~ 1

. 4a) - I

00 1

1 0 4II

4 0

2 0

i

O 1. l i g " . j

1 0 0

P r o c . N a t l .A c a d .S c i .USA8 9 ( 1 9 9 2 )

I

i.

a1 1k I .. l , .


4/5

P r o c . N a t l .A c a d .S c i .USA 8 9 ( 1 9 9 2 ) 8 4 4 1

A914 C-C-OH

5

7 C - O - C - C *

'I

1k.7 6 5 4 3 2

ppm

F I G .4 . 1 HNMR s p e c t r a ld a t a c o n f i r m i n gt h e p r o p o s e ds t r u c t u r e o f t h e I AA N - a c e t a la d d u c t . A s s i g n m e n t sf o rt h e o n e - d i m e n s i o n a lspectrums h o w nh e r e a re a s f o l l o w s :f r o ml e f tt o r i g h t ,r i n gp r o t o n s a t p o s i t i o n sC - 7a n d C - 4( d o u b l e t s ) ,C - 2( s i n g l e t ) ,C - 6a n d C - 5( t r i p l e t s )a n d e x o c y c l i cp r o t o n s e ( q u a r t e t ) ,* ( s i n g l e t ) ,* ( p a i ro f q u i n t e t s ) ,water ( 2 . 8 5p p m ) ,r e s i d u a lace tone ( 2 . 0 4p p m ) , v ( d o u b l e t )a n d * ( t r i p l e t ) .A l o n g - r a n g ec o u p l i n gb e t w e e nt h e C - 2 p r o t o n a n d t h e A m e t h y l e n ep r o t o n s ( a v e r a g e4 J H - H= 0 . 4 5 H z ) was d e t e c t e d , s i n c ed e c o u p l i n ga t A r e s u l t e di n as h a r p e n i n go f t h eC - 2p r o t o n s i n g l e tr e s o n a n c e o f a b o ut0 . 9 H z . A dd i t i o n o fexcess 2 H 2 0t o t h e s a m p l er e s u l t e di n no l o s so f i n t e n s i t yo f t h er e s o n a n c e a t 7 . 3 1ppm, c o n f i r m i n gi t t o b e a C - b o u n dproton r a t h e r t h a n an e x c h a n g e a b l eN - b o u n dp r o t o n . O t h e ra s s i g n m e n t swere c o n f i r m e db y a t w o - d i m e n s i o n a lT O C S Y( t o t a lc o r r e l a t e ds p e c t r o s c o p y )e x p e r i m e n tw i t h a s h o r tm i x i n gt i m e .

a n a l y z e don t h e same H P L Cs y s t e m .R e a c t i o np r o d u c t s( d a t an o t s h o w n )were d e t e c t e d i n a l l c a s e s , e x c e p t when t h ea l d e h y d ewas f o r m a l d e h y d e , ta n d p r o d u c t r e t e n t i o nt i m ei nc re as ed a lo ng w i t ht he l en g t h o f t h e r e a g e n t s 'c a r b o nc h a i n s .T h e y i e l d sd e c r e a s e dw i t h i n c r e a s i n ga l c o h o l a n daldehyde chain l e n g t h ( m e t h a n o l / a c e t a l d e h y d e -* b u t a n o l /b u t y r a l d e h y d e ) .

F o r p r e p a r a t i v ep u r p o s e s , a m i x t u r ec o n t a i n i n g2 0 mg o fI AA i n0 . 5m l o f 40% w a t e r / 4 0 % oe t h a n o l / 2 0 %a c e t a l d e h y d ewas a l l o w e d t o r e a c t a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e f o r 1 8 h r .A l i q u o t so f t h i sm i x t u r ewere s e p a r a t e db y T L C i n t ot h e5 -a n d 6 - c mc o m p o n e n t s , w h i c hwere e l u t e df o r f u r t h e rs t u d y .H P L Ca n a l y s i sd e t e r m i n e dt h a tt h e p r o d u c twas p u r e w i t h ay i e l do f > 6 0 % .I t was f o u n d t o b e s t a b l ei n s o d i u mc i t r a t e

b u f f e r ,pH 7 . 4 .C o m p a r i s o no f UV s p e c t r a s h o w e da r e d s h i f to f a b o u t2 nm w i t h a d i m i n i s h e d2 9 0 - n mh u m pr e l a t i v et o I AA( F i g .2 ) .T h e m o le c ul a r w e ig h t o ft h ea d d u c twas d e t e r m i n e db y FA B + MS t o b e 2 4 7 ,e q u a l t o t h a tc a l c u l a t e df o r t h ep r o p o s e di n d o l e - 3 - e t h y l c a r b o x y1 - e t h y l a c e t a l( F i g .3 ) .

O n e i s s u es t i l lr e m a i n e dt o b e r e s o l v e d ,h o w e v e r .P r e v i o u sw o r k h a d i n d i c a t e dt h a tt h e c a r b o n a t p o s i t i o n2 o f t h ef i v e - m e m b e r e dr i n gmay a l s ob e a r e a c t i v ec e n t e r , i n somecases more r e a c t i v et h a n t h e n i t r o g e n a t p o s i t i o n1 ( 8 ) .T od e t e r m i n ew h e t h e rt h e o b s e r v e dr e a c t i o nwas t a k i n gp l a c e onN - 1o r C - 2 ,a s e r i e so f NMR e x p e r i m e n t swas c o n d u c t e d .T h er e s u l t sp r o v i d e ds u f f i c i e n ts t r u c t u r a li n f o r m a t i o nt o c o n c l u d et h a tt h e r e a c t i o n t a k e s p l a c e on N - 1 a n d n o t on C - 2 ( F i g .4 ) .

V e r y s i m i l a rr e s u l t s( d a t an o t s h o w n )w e r e o b t a i n e dw i t hN - a c e t y l t r y p t o p h a n( H P L C r e t e n t i o n t i me o fp r o d u c t , 8 . 5

m i n , c o m p a r e dw i t h 6 m i nf o rt h e s t a r t i n gm a t e r i a l ; y i e l dwas5 0% i n 1 8 h rw i t h t h e same r e a g e n tc o n c e n t r a t i o n ;no p r o d u c twas o b ta i ne d w i tha c e t a l d e h y d ea l o n e ) .

R e a c t i o no f I n d o l e w i t h A c e t a l d e h y d e .A 0 . 2 %s o l u t i o n o fi n d o l e i n e q u a l a m o u n t s o f w a t e r , e t h a n o l ,a n d a c e t a l d e h y d ef o r m e da p r o d u c tw i t h 6 0 % 6y i e l da f t e r1 h r o f r e a c t i o n a ta m b i e n tt e m p e r a t u r e . O m i t t i n gt he e th a n o l( 5 0 %a c e t a l d e -h y d e i n w a t e r m i x t u r e )h a d n o e f f e c t .D e c r e a s i n gt h e c o n -

t I t m i g h tb e n o t e d t h a ti n t h e c o u r s e o f t h e m u c h e a r l i e rs y s t e m a t i cs t u d y o f t h e r e ac t i o nso f f o r m a l d e h y d ew i t h p r o t e i n s ,3 - s u b s t i t u t e di n d o l e sw e r e f o u n d t o y i e l ds t a b l eN - m e t h y l o ld e r i v a t i v e s ;t h i sd i s c r e p a n c yr e q u i r e sf u r t h e r s t u d y .T he d i m e r i z a t i o no f u n s u b s t i -t u t e d i n d o l e s a t p o s i t i o nC - 2o r C - 3b y a n a l d e h y d eb r i d g ewas f i r s tr e p o r t e d i n t h e same paper ( 7 ) .

c e n t r a t i o n o f a c e t a l d e h y d et o 0 . 1 %i n c r e a s e dt h e r ea c t i o nr a t e a n d p e r c e n t y i e l do f p r o d u c t .

H P L C o f o r g a n i c r e a c t i o n m i x t u re s d e t e r m i n edt h a tt h ep r o d u c th a d a r e t e n t i o nt i m e o f 8 m i nc o m p a r e dw i th 6m i nf o ri n d o l e .A q u e o u sr e a c t i o nm i x t u r e s ,r a n g i n gi npH f r o m3t o 5 w i t h d i m i n i s h i n ga c e t a l d e h y d ec o nc e nt r at i on , q u i ck l yt o o k o n a y e l l o wt i n ta n d i n s e v e r a l m i n u t e sb e c a m et u r b i d .T h e r e s u l t i n gp r e c i p i t a t e ,when r e d i s s o l v e di n e t h a n o l ,r e p -r e s e n t e da l m o s tt h e e n t i r ea m o u n t o f U V- a b s o r b i n gm a t e r i a l ,a b o u t 8 0 % oo f w h i c hwas t h e i n d o l e p r o d u c t . Th e p r o d u c t ' sUV s p e c t r u ms h o w e da r e d s h i f to f a f e w n a n o m e t e r sa n dsome c h a r a c t e r c h a n g e s( F i g .5 ) . I t s m o l e c u l a rw e i g h twas

o~~~~~~~~~~~~~Sl

2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0Xm

F I G .5 . UV s p e c t r a a t n e u t r a l pH o f i n d o l e (-) and b i s ( i n -d o l y l ) e t h a n e( - - -) . T h e i r m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s a r e a b o u t6 4 0 0 . T he o v e r a l la b s o r b a n c eo f t h e p r o d u c t i s h i g h e r du e t o t h ey e l l o wt i n to f t h e r e a c t i o n m i x t u r e s .

8

B i o c h e m i s t r y :A u s t i na n d F r a e n k e l - C o n r a t

I

vlk..


5/5

8 4 4 2 B i o c h e m i s t r y :A u s t i n a n d F r a e n k e l - C o n r a t

B I S ( I N D O LY L ) E T H A N EMW = 2 6 0

2 4 52 6 0

2 8 9

,Il1l. ., 1l l

3 0 7

,l -ii l

2 5 0 3 0 0 3 5 0m/z

F I G . 6 . FA B + MS o f b i s ( i n d o l y l ) e t h a n ei n a n i t r o b e n z y la l c o h o lm a t r i x .T h ep a r e n t i o n ( M + )h a s m/z 2 6 0 .T h em/z 2 4 5p e a kr e p r e s e n t s t h e

( M-

C H 3 ) +f r a g m e n t .T h em/z 1 4 4p e a k r e p r e s e n t s t h e( M-

i n d o l e ) +f r a g m e n t .T h er e m a i n i n gm a j o rp e a k si n t h e spect rum a re c h a r a c t e r i s t i co f t h e m at r ix .MW, m o l e c u l a rw e i g h t .

d e t e r m i n e db y FA B + MS t o b e 2 6 0 , c o n s i s t e n t w i t h t h ep r o p o s e db i s ( i n d o l y l ) e t h a n es t r u c t u r e ( F i g .6 ) .

DISCUSSIONA c e t a l d e h y d ei s t h e f i r s tm e t a b o l i cp r o du c t o fe t h a n o l ,a sw e l l a s a n i n t e r m e d i a t ei no t h e rm e t a b o l i cp r o c e s s e s . I t i s wel lk n o w n t h a ta c e t a l d e h y d er e a d i l yr e a c t s w i t h a mi n es ,a n d i nt h e c a s e o f t h e e x o c y c l i c n i t r o g e n s o f n u c l e o s i d e s , t h ep r i ma r y p r o du c t[ R 2 > N - C H ( C H 3 ) - O H ]h a s a v e r y r e a c t i v eh y d r o x y lg rou p , w h i c hr a p i d l yc o n d e n s e sw i t h a l c o h o l s t og i v e s t a b l em i x e da c e t a l s[ R 2 > N - C H ( C H 3 ) - O - C 2 H 5 ]a t am-b i e n tt e m p e r a t u r e( 1 ) .

We a r e now s t u d y i n gt h e r e a c t i v i t yo f p r o t e i na m i n og r o u p sw i th a c e t a l d eh y d ea n d e t h a n o l .T h e s t r o n g l yb a s i cp r i m a r ya m i n og r o u p s o f l y s i n e r e s i d u e s ,N t e r m i n i ,a n d a m i n oa c i d sa r e k n o w n t o r e a c t r a p i d l yw i t h a c e t a l d e h y d et o p r o d u c eS c h i f fb a s e s [ R - N = C H ( C H 3 ) ] ,w h i c hh a v e b e e n i n t e n s e l ys t u d i e d a n d w o u l d n o t b e a b l e t o i n t e r a c tw i t h a l c o h o l s .H o w e v e r ,m u c h l e s si s k n o w n a b o u t t h e r e a c t i o n so f t h es e c o n d a r yr i n gn i t r o g e n s o f t r y p t o p h a na n d h i s t i d i n ew i t ht h e s e r e a g e n t s . T h ep r e s e n t s t u d y d e a l sw i t h t h e r e a c t i o n so fm o d e l sf o rt r y p t o p h a nl a c k i n gi t sp r i m a r ya m i n og r o u p s : I AAa n d i n d o l e .

I t was f o u n d t h a tI AA ( a sw e l la s N - a c e t y l t r y p t o p h a n )r e a c t e di nt h e same manner a s t h e n u c l e o s i d e s .A c e t a l d e h y d ea l o n e d o e s n o t g i v e a s t a b l e d e r i v a t i v e ,b u t t h e presence o fe t h a n o l r e s u l t si n a c o n d e n s a t i o nw i t h t h a t i n t e r m e d i a t e

a d d u c t s t a b i l i z i n gt h e N - C l i n k a g e ,a n d s t a b l em i x e da c e t a l sa re f o r m e dr a p i d l ya t a m b i e n tt e m p e r a t u r ei n r e a c t i o n m i x -t u r e s b e l o wpH 4 .T h eq u e s t i o no f w h e t h e rs u c hs u b s t i t u t i o n so c c u r a t t h e >NH o r t h e n e i g h b o r i n g- C H , a r e c u r r i n go n ei n t h e i n d o l e l i t e r a t u r e ,i s s e t t l e dh e r e i n f a v o r o f t h e >NHg r o u p b y NMR a n a l y s i so f t h e p r o d u c t .

S i n c et h e s e N - a c e t a la d d u c t sa re s t a b l eu n d e rp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s ,t h e r e a c t i o n t h a tp r o d u c e st h e mc o u l dp l a y a r o l e

i n e t h a n o l t o x i c i t yt h r o u g ht h e m o d if i c at i o no f t r y p t o p h a n -c o n t a i n i n gp r o t e i n si n h u m a n t i s s u e sw h e r ee t h a n o l i s m e-t a b o l i z e d .I t w o u l dseem o f i n t e r e s t ,t h e r e f o r e ,t o i n v e s t i g a t et h e r e a c t i o no f a c e t a l d e h y d ea n d e t h a n o lw i t h s u c hp r o t e i n s .

I n d o l e ,w h i c hl a c k s a s u b s t i t u e n ta t t h e 3 p o s i t i o no f t h er i n g ,b e h a v e sq u i t ed i f f e r e n t l yu n d e r t h e same c o n d i t i o n s .I th a s l o n g b e e nk n o w nt h a ti n t h i sh e t e r o c y c l i cc o m p o u n dt h eC - 3 :C H group, a n d t o a l e s s e re x t e n t t h e :C H a t p o s i t i o n2 , i smore r e a c t i v et h a n t h e >NH group . T h u s , a l de h y de sa rek n o w n t o a d d p r e f e r e n t i a l l yt o t h e s e c a r b o n s( I n d o l e. C -C R 2 - O H ) .Y e t t h e h i g h r e a c t i v i t yo f b o t h t h e r e s u l t i n gh y -d r o x y l a n d t h e i nd ol e C - 2 o r C - 3 p o s i t i o nl e a d s r e a d i l yt oc o n d e n s a t i o no f t h e s e groups, f o r m i n gb i s ( i n d o l y l ) a l k aeven i n t h e presence o f a l c o h o l s .T h a t t h e a l c o h o ld o e s n o tcompete w i t h i n d o l e f o r c o n d e n s a t i o nw i t h t h e p r i m a r ya d d i t i o np r o d u c tmay b e a c c o u n t e dfo r b y t h e i n s o l u b i l i t yo ft h e b i s ( i n d o l y l ) a l k a n e s ,w h i c h w i t h i n m i n u t e s p r e c i p i t a t ef r o m t h e s o l u t i o na t a m b i e n tt e m p e r a t u r e .

We t h a n k D r s . J a r o s l a wT . K u s m i e r e ka n d B . S i n g e r f o r h e l p f u la d v i c ea n d D r . G r a h a m E . B a l l fo r NMR a n a l y s e sa n d c o n s u l t a t i o n .T h i s work was s u p p o r t e db y G r a n t sAA08854 a n d CA47723 f r o mt h eN a t i o n a l I n s t i t u t e so f H e al t h .

1 . F r a e n k e l - C o n r a t ,H . & i n g e r ,B . ( 1 9 8 8 )P r o c . N a t l .A c a d .S c i .USA 8 5 ,3 7 5 8 - 3 7 6 1 .

2 . D o n o h u e ,T . M . , J r . ,T u m a ,D . J . & S o r r e l l ,M. F . ( 1 9 8 3 )A r c h .B i o c h e m .B i o p h y s .2 2 0 ,2 3 9 - 2 4 6 .

3 . L i e b e r ,C . S . ( 1 9 9 0 )P h a r m a c o l .T h e r . 4 6 ,1 - 4 1 .4 . N o m u r a ,F . & L i e b e r , C . S . ( 1 9 8 1 )B i o c h e m .B i o p h y s .R e s .

C o m m u n .1 0 0 ,1 3 1 - 1 3 7 .5 . W i c k r a m a s i g h e ,S . N . , G a r d n e r ,B . & a r d e , G . ( 1 9 8 7 )L a n c e t

i i , 1 2 2 - 1 2 6 .6 . B a x , A . & D a v i s , D . G . ( 1 9 8 5 )J . M a g n .R e s o n .6 5 ,3 5 5 - 3 6 0 .7 . F r a e nk e l - C o nr a t , H . ,S i n g e r ,B . & O l c o t t ,H . ( 1 9 4 7 )J . B i o l .

Chem. 1 6 8 ,9 9 - 1 1 8 .8 . S u n d b e r g ,R . J . ( 1 9 7 0 )T h e C h e m i s t r yo f I n d o l e s ( A c a d e m i c ,

N ew Yo r k ) .

1 5 4

1 3 6

1 0 0

8 0

0

4 0

u

' t 6 0 -

C . )

: - 4 0_ 3c )

2 0

i 1 4 4

I i

120

i .

o 11 l l11kdpu11111111p l lgmei1 0 0

1 7 6

1 6 6

. 1

1 ~11lS ,1l .I . 1 ,i .2 0 0

2 1 7

.. i. i i i l l.

I

1 5 0 4 0 0

P r o c . N a t l .A c a d . S c i .USA8 9 ( 1 9 9 2 )

.7

ii1 . , i ,

adducts paper

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