Acute LD50 values for a variety of chemical agents

Agent Species LD50 mg/kg b.w.

Ethanol Mouse 10,000

Sodium chloride Mouse 4,000

Ferrous sulphate Rat 1,500

Morphine sulphate Rat 900

Phenobarbital Sod Rat 150

DDT Rat 100

Picrotoxin Rat 5

Strychnine sulphate Rat 2

Nicotin Rat 1

D-Tubocurarine Rat 0.5

Hemicholinium-3 Rat 0.2

Tetrodoxin Rat 0.1

Dioxin (TCDD) Guinea-pig 0.001

Botulinum toxin Rat 0.00001

Dasar-dasar Uji Laboratorium dalam Toksikologi

Prinsip umumPrinsip umum Bahan kimia dapat menimbulkan efek toksik hanya jika bahan kimia tersebut berhubungan langsung dengan sel atau organ sasaran

Jumlah bahan kimia yg memejani sel sasaran dapat menentukan apakah bahan tersebut dapat atau tidak dpt menimbulkan efek toksik

Sel dr berbagai spesies yg mempunyai kesamaaan fungsi dan lintasan metabolisme mempunyai akibat yang sama jika terkena bahan kimia yang sama

Perubahan bahan struktur (kimia) suatu senyawa dapat berakibat perubahan besar pada aksi biologiknya

Nilai ambang ToksisitasNilai ambang Toksisitas

Merupakan dosis atau tingkat pemejanan minimal yang dapat menyebabkan perubahan biologik melebihi batas kemampuan adaptasi homeostasis.

Dibawah nilai tersebut dianggap aman, sedang di atasnya dapat menimbulkan efek toksik.

Sulit tentukan nilai ambang efek karsinogenik dan mutagenik

Uji Toksisitas Karena pertimbangan moral etik dan hukum penelitian toksikologik eksperimental tidak dilakukan pd manusia

Pada hewan uji in vivo / in vitro

Rancangan yang baik dan penelitian yang seksama (properly qualified ) dpt memberikan gambaran efek toksik pd manusia

Faktor – faktor yang berpengaruh pd hasil uji toksisitas

1. Faktor bahan ujiFaktor bahan uji◦ Sifat fisikokimia◦ Kemurnian◦ Bentuk sediaan ◦ dosis

2. Faktor Hewan Uji2. Faktor Hewan Uji◦ Jenis dan galur◦ Umur◦ Jenis kelamin◦ Berat badan◦ Status kesehatan

Faktor cara pelaksanaan ujiFaktor cara pelaksanaan uji ◦ Pemeliharaan hewan uji◦ Petugas yang berpengalaman◦ Pemilihan metode statistik◦ Jumlah hewan uji◦ Kecermatan pengamatan dan pengukuran◦ Ketelitian alat ukur◦ Ketepatan prosedur ◦ Keadaan peneliti

Keterbatasan Uji Toksisitas pada hewan ujiKeterbatasan Uji Toksisitas pada hewan uji

Bbrp manifestasi toksik tidak nampak pd

hewan uji

Perbedaan respon antar spesies

LD 50 yg sama belum tentu profil toksisitasnya sama

UJI TOKSISITAS Uji Toksisitas AkutUji Toksisitas AkutMendapatkan informasi tentang dosis yg dpt mematikan 50% hewan uji (LD50) suatu bahan serta gejala keracunan, penyebab kematian dan urutan proses kematian

Uji Toksisitas Jangka PanjangUji Toksisitas Jangka Panjang

Meliputi toksisitas subkronik dan kronik

Uji toksistas khususUji toksistas khusus : uji toksisitas jangka panjang utk mendptkan data efek toksik yg bersifat khusus spt efek teratogenik, karsinogenik dan ketergantungan

Lama Uji toksisitasLama masuknya Lama masuknya

dalam kadaan dalam kadaan sehari-harisehari-hari

Lama Pemberian dlm uji toksisitasLama Pemberian dlm uji toksisitas

akutakut subakutsubakut kronikkronik

Satu kali atau Satu kali atau beberapa dosisbeberapa dosis

Kurang dari 1 Kurang dari 1 mingguminggu

Lebih dari 4 Lebih dari 4 mingguminggu

Satu kaliSatu kali

Satu kaliSatu kali

Satu kaliSatu kali

Paling tidak 2 Paling tidak 2 mingguminggu

13-26 minggu13-26 minggu

Paling tidak Paling tidak 26 minggu26 minggu

Tidak perluTidak perlu

Paling tidak 6 Paling tidak 6 bulanbulan

Paling tidak 1 Paling tidak 1 tahuntahun

Uji Toksistas Akut Ketoksikan akutKetoksikan akut:Derajad efek toksik suatu senyawa (bahan) yang terjadi dalam waktu singkat setelah pemberian dalam dosis tunggal.

Uji toksisitas akutUji toksisitas akutUnt uk menetapkan potensi ketoksikan akut (LD50). (tolok ukur kuantitatiftolok ukur kuantitatif) Selain itu diamati gejala keracunan, sistem biologik yg paling peka, mekanisme keracunan yg berakibat kematian, serta ada tidaknya perbedaan toksisitas antar spesies (tolok ukur kualitatiftolok ukur kualitatif)

Uji Toksisitas Akut Sebaiknya menggunakan mamalia dr

2 mcm spesies (rodensia dan non-rodensia)

Hewan uji sehat berasal dr satu galur yg jelas

Menggunakan paling tidak 4 peringkat dosis yg terdiri dr 8-10 ekor

(pendapat lain min 4 ekor)

Dosis dibuat berdasar kelipatan logaritmik tetap

Dosis terendahDosis terendah :

Dosis tertinggi yang tidak menyebabkan kematian hewan uji

Dosis tertinggiDosis tertinggi :◦ Dosis terendah yang menyebabkan seluruh atau hampir seluruh hewan uji mati◦ Dpt dicari dengan dosis yang secara tehnis dapat diberikan pada hewan uji

Kisaran dosis diperkirakan menyebabkan 10-90% kematian hewan uji pd masa akhir uji

Cara pemberian sesuai dgn cara masuknya pd manusia mempermudah ekstrapolasi

LD 50 dihitung setelah pengamatan 24 jam

Namun gejala keracunan (kematian) dpt berjalan lambat (delayed toxicity) sehingga gejala keracunan dapat diamati selama 7-14 hari.

Cara menghitung LD 50Cara menghitung LD 50

1. Perhitungan dengan grafik Miller dan Perhitungan dengan grafik Miller dan TainterTainter (1944)◦ Menggunakan kertas grafik logaritmik-probit

(skala logaritmik pd absis, skala probit pd ordinat)◦ Probit : transformasi dr hasil pengukuran yg

digambarkan dlm kurva sigmoid (hubungan antara respon kuantal dgn logaritme dosis) menjadi kurva yg lurus

2. Cara aritmatik Reed dan Muench (1938)

3. cara Aritmatik dr Karber (1931)

4. Cara CS. Weill (1952)

Lihat copy-an

Kategori potensi ketoksikanKategori potensi ketoksikan : Sangat toksis (extremely toxic), LD50<1 mg/kgBB Toksis sekali (highly toxic) 1-50 mg/kgBB Toksis (moderately toxic) 50-5000 mg/kgBB Tidak begitu toksis (low toxic) 500-5000 mg/kg BB Tidak toksis (practically non toxic) 5-15 g/kgBB Tidak membahayakan sama sekali>15 g/kgBB

LD 50 beberapa bahan kimia yang diberikan melalui cara yang berbeda pada mencit

Cara Cara pemberianpemberian

LDLD5050 (mg/kg BB) pada mencit dari (mg/kg BB) pada mencit dari

ProkainProkain DFPDFP fenobarbitalfenobarbital

IVIV 4545 0,340,34 8080

IPIP 230230 1,001,00 130130

IMIM 630630 0,850,85 124124

SCSC 800800 1,001,00 130130

OralOral 500500 0,900,90 280280

DFP= diisoprophyfluorophosphat

Uji toksisitas subkronis Merupakan longterm toxicity

Untuk mendapatkan data tentang keracunan bahan kimia yg digunakan secara sengaja atau tidak sengaja masuk ke dalam tubuh berulangkali atau dlm wkt lama.

Perlu dilakukan didasarkan asumsi jika tidak ada efek yg timbul pd dosis tunggal tetapi dpt timbul jika dosis berulang dan jangka waktu lama

Efek toksik dpt timbul krn perkembangan tubuh krn umur (aging process) spt sensitifitas jaringan, perubahan kapasitas kemampuan fisiologik, abnormalitas / penyakit yg muncul spontan

Diamati lesi pd organ tubuh, organ apa yg rentan, bgmn sifat lesi (reversible/ireversible), mulai dosis berapa efek toksik mulai timbul

UJi Toksisitas Subkronis Hewan ujiHewan uji ◦ Satu spesies rodent dan satu spesies nonrodent

Peringkat dosisPeringkat dosis◦ dosis terendah: yang tidak menimbulkan gejala toksik

akut◦ Dosis tertinggi : yang menimbulkan gejala keracunan

akut tapi tidak menyebabkan kematian

Lama pemberian

Umumnya dilakukan 90 hari berturut-turut

Lama masuknya bahan uji Lama masuknya bahan uji dalam keadaan sehari-hari dalam keadaan sehari-hari

Lama pemberian pada Lama pemberian pada uji toksisitas akutuji toksisitas akut

-satu kali atau beberapa dosis-satu kali atau beberapa dosis

-kurang dari satu minggu-kurang dari satu minggu

-lebih dari 4 minggu-lebih dari 4 minggu

-paling tidak 2 minggu-paling tidak 2 minggu

-13-26 minggu-13-26 minggu

-paling tidak 26 minggu-paling tidak 26 minggu

Cara pemberian obat/bahan ujiCara pemberian obat/bahan uji◦ Disesuaikan dgn cara masuknya ke dlm tubuh

dlm keadaan sehari-hari (termasuk cara inhalasi)

◦ Dosis sesuai berat badan/luas permukaan tubuh- dpt berubah scr periodik

◦ Pemberian bersama pakan/air minum diperhatikan : dosis dan kemungkinan adanya interaksi

Pengamatan gejala klinikPengamatan gejala klinik◦ Berat badan diukur tiap minggu◦ Asupan pakan dan minum tiap hari◦ Pemeriksaan fisik spt :

Aktifitas lokomotor, reaksi aneh,suara, konvulsi, responsi somatik, agresivitas, , mata, defekasi, ekor, tremor, kesadaran, sensitifitas thd suara, salivasi, piloereksi, jantung dll

Uji fungsi biokhemis organ tertentuUji fungsi biokhemis organ tertentu◦ Analisis darah spt kadar gula, protein,

kolesterol, asam lemak, bilirubin, enzim sesuai arah uji toksisitas

◦ Dilakukan pd hari ke 0 dan tiap 30 hari selama penelitian berlangsung (paling sedikit 3x)

Pemeriksaan hasil metabolismePemeriksaan hasil metabolisme ◦ Analisis darah, urin atau homogenat utk memberikan

inform. Kinetika bahan uji atau efeknya pd metabolisme

Pemeriksaan hematologikPemeriksaan hematologik◦ Kuantitatif (jumlah sel) dan

kualitatif (morfologik)

Pemeriksaan postmortalPemeriksaan postmortal◦ Pengamatan makros-mikros pd organ◦ Pengamatan abnormalitas bentuk, ukuran,

berat organ dan homogenitas jaringan◦ Perlu diperhatikan bahwa hasil pemeriksaan

mikros dpt dipengaruhi oleh cara pemrosesan pembuatan preparatnya.

Uji Toksisitas Kronis Utk mengetahui efek toksik dari suatu bahan uji dengan dosis yang setara dgn pemakaian sehari-hari yg diberikan dlm waktu lama dan utk menunjukkan ada tidaknya efek toksik yg bersifat khusus

Hewan uji Hewan uji ◦ Satu jenis hewan rodensia dan satu jenis hewan

non rodensia, umur dewasa, 2 jenis kelamin◦ Tiap kelompok rodensia min. 20 ekor,

nonrodensia min 4 ekor Cara pemberian bahan ujiCara pemberian bahan uji

◦ Sesuai dgn cara sehari-hari

Peringkat dosisPeringkat dosis

Paling tidak 3 peringkat dosis

Dosis terkecil : dosis yg pd uji toksisitas akut tidak menimbulkan gejala keracunan

Dosis terbesar : dosis yg pada uji toksisitas akut menimbulkan beberapa kematian hwn uji.

Dosis antara termasuk dosis yg digunakan dalam keadaan sehari-hari

Lama pemberian bahan uji dan pengamatanLama masuknya bahan Lama masuknya bahan uji dalam keadaan sehari-uji dalam keadaan sehari-harihari

Lama pemberian pada uji Lama pemberian pada uji toksisitas kroniktoksisitas kronik

-satu kali atau beberapa dosis-satu kali atau beberapa dosis

-Kurang dari satu minggu-Kurang dari satu minggu

-Lebih dari 4 minggu-Lebih dari 4 minggu

-tidak diperlukan-tidak diperlukan

-paling tidak 6 bulan-paling tidak 6 bulan

-paling tidak satu tahun-paling tidak satu tahun

Pemeriksaan fisik dan klinik ◦ (spt uji toks. Subkronis)

Berat badan diperiksa paling tidak seminggu sekali

Tiga bulan pertama asupan pakan minum dan urin yg dikeluarkan 24 jam, diamati tiap tiap minggu. Selanjutnya tiap bulan

Pemeriksaan biokhemis min. 3x

Analisis darah dan urin tiap 6-12 minggu

Reproductive Toxicology

Utk mengetahui efek toksik dr suatu bahan (agen eksogen) pada sistem reproduksi

Efek terhadap libido, sterilitas, mutagenesis, kematian fetus, kematian perinatal dll

Pada hewan uji dapat diamati efek terhadap:

JantanJantan Spermatogenesis Testiculer pathogenesis Epididymal sperm Celuller biochemistry Fertility In vitro fertilization Hormon profile Motility etc

BetinaBetina Embriogenesis Ovarian pathogenesis Estrus cycle Fertility Hormon profile In vitro fertilization etc

Abnormalitas morfologi sperma

Reproductive toxicology on female rodent (mice, rat)

euthanasia

42

days19-20

220

mating parturition

gestation lactation

weaning

treatment

15 days

euthanasia

Uji Toksisitas KhususUji teratogenesis

Perkembangan dan pertumbuhan embrio (mudigah) terutama fase organogenesis rentan terhadap gangguan proliferasi dan deferensiasi

Berakibat malformasi (struktural, fungsional, biokimia) dan kematian embrio atau fetus

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 280

organogenesis

histogenesis

maturasi

Masa embrio Masa fetus (hari)

Tahap –tahap embriogenesis pd manusia

Masa organogenesis pd bbrp spesies

Hewan Hewan ujiuji

Masa organogenesisMasa organogenesis

Hari ke-Hari ke-

Lahir hari ke-Lahir hari ke-

RatRat 6-156-15 2222

MencitMencit 6-156-15 1919

kelincikelinci 6-186-18 3333

MarmotMarmot 10-1810-18 6666

HamsterHamster 8-128-12 1515

manusiamanusia 21-5621-56 267267

Zat yg bersifat embriotoksik atau fetotoksik sebabkan kematian janinkeguguran

Zat teratogenik dapat tidak toksik pada induknya tapi pengaruhi perkembangan dan pertumbuhan janin

Kematian janin tanpa malformasi dapat diakibatkan krn pemejanan zat teratogen sebelum masa deferensiasi

Malformasi terjadi jika pajanan zat pada masa organogenesis

Jika pajanan terjadi pd masa pertumbuhan berakibat kelambatan masa pertumbuhan

Periode kritis embriogenesis pd rat

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

implan

Nervous sistem

eye

heart

face

kidneylimbs

palate

External genitalia

day

Contoh zat yg bersifat teratogen pd hewan dan manusiaNo.No. Nama zatNama zat No.No. Nama ZatNama Zat

1.1.

2..2..

3.3.

4.4.

5.5.

6.6.

7.7.

8.8.

9.9.

TalidomidTalidomid

TiourasilTiourasil

KlorpropamidKlorpropamid

KortisonKortison

Etinil testoteronEtinil testoteron

KlorambusilKlorambusil

Nitrogen mustardNitrogen mustard

UretanUretan

kolsikinkolsikin

10.10.

11.11.

12.12.

13.13.

14.14.

15.15.

16.16.

17.17.

18.18.

Hipervitaminosis AHipervitaminosis A

Kelebihan a. nikotinatKelebihan a. nikotinat

Biru tripanBiru tripan

Biru evanBiru evan

Aktinomisin DAktinomisin D

TetrasiklinTetrasiklin

Fenilmerkuri asetatFenilmerkuri asetat

Timah hitamTimah hitam

taliumtalium

UJI TERATOGENESIS Hewan uji yg sering digunakan adalah mice, rat dan kelinci (didasarkan kedekatan ciri dan sifat tertentu pd manusia)

Penelitian dgn mudigah ayam ternyata terlalu sensitif, hasil berbeda pada manusia

Hewan uji babi digunakan krn sifat biologik banyak anak dan peka terhadap teratogen

Penggunaan hewan uji kera kedekatan filogenetik dgn manusia

Uji teratogenesis Hewan uji

◦ Jumlah Harus memenuhi sarat statistik◦ Jika angka kejadian malformasi 0,5%, berarti 1 malformasi hanya

ditemukan pada 200 ekor hewan uji

Hewan uji yg digunakan yang positif dibuahi (pada mice/rat adanya vaginal plug)Bahan uji diberikan mulai hari tersebut

Hewan uji dikorbankan sebelum perkiraan lahir (anak yg cacat biasanya dimakan induknya)

PengamatanPengamatan :

Jumlah implantasi (ada nodul yg kaya vaskularisasi)

Jika ada selisih antara implantasi total dengan jumlah korpora luteaterjadi preimplantation loss (resorpsi awal)

Jumlah resorpsi : selisih jumlah persarangan dengan jumlah janin yg tetap hidup sampai cukup umur

Semua janin (hidup/mati) ditimbang, dihitung, diperiksa ada tidaknya malformasi (kelainan struktur, fungsi dan biokemis)

Cairan amnion dicatat volume, warna dan kelainan lainnya

Pemeriksaan histopatologik plasenta

Uji karsinogenesis

Uji Efek Toksik Lokal pada Kulit(ketoksikan akut)

Efek toksik yang timbul dimana bahan tersebut kontak langsung dengan tubuh

Efek iritatif,korosi, alergi

Efek Iritatif

Hewan uji yg sering digunakan kelinci, marmut, tikus putih

Jika bahan uji merupakan bahan yg sengaja/tidak sengaja terjadi kontak pada kulit berkali-kaliperlu uji toksisitas utk melihat efek sistemik

Hewan uji dicukur punggungnya,

Bahan uji dioleskan , ditutup dengan selotip

Setelah 24, selotip dibuka diperiksa efek iritasinya

Evaluasi berupa skor terhadap kemerahan dan edema yg terjadi

0 = tidak ada kemerahan

1 = merah muda

2 = eritema

3 = merah sekali

4 = merah menyala dengan perluasan daerah

0 = tidak ada edem

1 = edema sangat ringan

2 = edema ringan

3 = edema sedang (1 mm)

4 = edema berat (>1 mm)

Uji Fototoksik dan fotoalergik

Reaksi fototoksik disebabkan karena energi sinar ultraviolet dapat mengaktifkan bahan dan mampu menimbulkan perubahan biologik pada sel/jaringan tubuh

Reaksi fotoalergik disebabkan karena energi sinar ultraviolet memacu pembentukan hapten sehingga timbul sensitisasi alergi pada kulit.

Seperti uji efek iritatif, tetapi kemudian daerah yg diolesi bahan uji disinari sinar ultraviolet

Referensi : ◦ Donald J.Ecobichon The Basis of Toxicity TestingThe Basis of Toxicity Testing◦ Ngatijan, Metodologi Penelitian dalam Toksikologi, Metodologi Penelitian dalam Toksikologi