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Universidad Nacional del AltiplanoFACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICASEscuela Profesional de Biologa

ACTIVIDAD ANTIBACTERIANAIN VITRO DEL ACEITE ESENCIAL DEL CHIRI-CHIRI Grindelia boliviana R., FRENTE A Staphylococcus aureus ATCC

TESISPRESENTADO POR EL BACHILLER: JORGE GUEVARA RAMOS

PARA OPTAR EL TITULO DE:LICENCIADO EN BIOLOGA

PUNO PER20141

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANOFACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICASESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGA

ACTIVIDAD ANTIBACTERIANAIN VITRO DEL ACEITE ESENCIAL DEL CHIRI-CHIRI Grindelia boliviana R., FRENTE A Staphylococcus aureus ATCCTESIS PRESENTADO POR:Br. JORGE GUEVARA RAMOS

PARA OPTAR EL TITULO DE LICENCIADO EN BIOLOGAAPROBADO POR:

PRESIDENTE : M.Sc. Dante Choquehuanca Panclas

PRIMER MIEMBRO : M.Sc. Gilmar Goyzueta Camacho

SEGUNDO MIEMBRO :M.g. Dante Mamani Sairitupac

DIRECTOR DE TESIS:M.g. Ciria Ivonne Trigos Rondn

PUNO - PER2014DEDICATORIA

A mis queridos padres Gino y Soledad, por darme la vida y apoyo moral, su dedicacin y ejemplo sern siempre mi camino para alcanzar mis sueos.

A mis hermanos Elizabeth y Gino, su ejemplo y cario siempre me permiten alcanzar cada uno de mis sueos. A cada uno de mis sobrinos, siempre son la razn y motivacin para seguir adelante.

A mi abuelita Mery, mis tos Jorge Walter, quienes fueron ejemplo de lucha y valenta frente a las adversidades y hoy guan mis pasos.

JORGE

AGRADECIMIENTOS

A mi Directora de tesis M.g. Ciria Ivonne Trigos Rondn, su constante apoyo ha hecho posible la culminacin de la presente investigacin.

Al M.Sc. Dante Choquehuanca Panclas, sus consejos oportunos han sido primordiales en el logro de mis aspiraciones.

A la M.Sc. Gilmar Goyzueta Camacho, sus valiosas sugerencias han contribuido a la mejora de mi trabajo de tesis.

Al M.g. Dante Mamani Sairitupac, sus consejos y exigencia han marcado el perfil de mi objetivo acadmico.

Al Lic. en Biologa Miguel A. Lpez Ruelas, por su valioso apoyo en el anlisis estadstico de los datos.

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INDICE DE CONTENIDO Pg._Toc394479401RESUMENI.INTRODUCCIN1II.REVISIN BIBLIOGRFICA42.1.Antecedentes42.2.Marco terico92.2.3.Aceites esenciales142.2.4.Principios activos de las plantas192.3.Marco conceptual24III.MTODO DE INVESTIGACIN263.1.mbito de estudio263.2.Tipo de estudio263.3.Muestra263.4.Diseo de investigacin263.5.Materiales273.6.Metodologa283.7.Mtodo estadstico33IV.RESULTADOS Y DISCUSIONES364.1.Efecto bactericida del aceite esencial del Chiri-chiri (Grindelia boliviana R) frente a Staphylococcus aureus ATCC in vitro.364.2.Concentracin mnima inhibitoria (CMI) del aceite esencial de Chiri-chiri (Grindelia boliviana R) para Staphylococcus aureus ATCC in vitro.404.3.Comparacin del efecto bactericida del aceite esencial de Chiri-chiri (Grindelia boliviana R) y el antibitico Vancomicina frente a Staphylococcus aureus ATCC in vitro.42CONCLUSIONES45RECOMENDACIONES46BIBLIOGRAFA CITADA47ANEXOS 51

INDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Efecto bactericida en halos de inhibicin (mm) del aceite esencial del Chiri-chiri (Grindelia boliviana R) frente a Staphylococcus aureus ATCC in vitro36Cuadro 2. Prueba de Tukey para efecto bactericida en halos de inhibicin (mm) del aceite esencial del Chiri-chiri (Grindelia boliviana R) frente a Staphylococcus aureus ATCC in vitro38Cuadro 3. Inhibicin porcentual del aceite esencial del Chiri-chiri (Grindelia boliviana R) frente a Staphylococcus aureus ATCC in vitro40Cuadro 4. Efecto bactericida en halos de inhibicin (mm) del aceite esencial del Chiri-chiri (Grindelia boliviana R) y del antibitico vancomicina frente a Staphylococcus aureus ATCC in vitro42Cuadro 5. Prueba de Tukey de halos de inhibicin (mm) del aceite esencial del Chiri-chiri (Grindelia boliviana R) y del antibitico vancomicina frente a Staphylococcus aureus ATCC in vitro43

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Plantas en flor de Grindelia boliviana R.11Figura 2. Efecto bactericida en halos de inhibicin (mm) del aceite esencial del Chiri-chiri (Grindelia boliviana R) frente a Staphylococcus aureus ATCC in vitro36Figura 3. Efecto bactericida (%) del aceite esencial del Chiri-chiri (Grindelia boliviana R) frente a Staphylococcus aureus ATCC in vitro40Figura 4. Efecto bactericida en halos de inhibicin (mm) del aceite esencial del Chiri-chiri (Grindelia boliviana R) y del antibitico vancomicina frente a Staphylococcus aureus ATCC in vitro42

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RESUMEN

El estudio se realiz en el laboratorio de Microbiologa en la Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional del Altiplano de Puno, durante los meses de diciembre 2013 a abril 2014, cuyos objetivos fueron a) evaluar la actividad antibacteriana del aceite esencial del chiri-chiri (Grindelia boliviana R) in vitro frente a Staphylococcus aureus ATCC, b) determinar la concentracin mnima inhibitoria (CMI) y c) comparar el efecto bactericida del aceite esencial de chiri-chiri y el antibitico Vancomicina. Se utiliz el mtodo de arrastre a vapor para obtener el aceite esencial y el mtodo de difusin en agar para la evaluacin del efecto bactericida, teniendo como control positivo el antibitico vancomicina. Se aplic estadstica descriptiva, anlisis de varianza en un sentido, prueba de rango mltiple de Tukey y una ecuacin logartmica para estimar la concentracin mnima inhibitoria (y=bln(X)+a). Resultados: El aceite esencial del "chiri-chiri" (Grindelia boliviana) inhibe el crecimiento de Staphylococcus aureus ATCC in vitro a partir de la concentracin de 5l/l con 5.740.45 mm de halo de inhibicin, el mayor efecto bactericida se observ en la concentracin de 75l/l con 14.240.44 mm de halo, existiendo diferencia estadstica entre las seis concentraciones utilizadas (P=0.0001). La concentracin mnima inhibitoria (CMI) del aceite esencial de "chiri-chiri" (Grindelia boliviana) frente a Staphylococcus aureus ATCC in vitro fue estimada en 1.12 l/l. El antibitico vancomicina mostr el mayor efecto bactericida en comparacin al aceite esencial del "chiri-chiri", con halo de inhibicin de 34.661.71 mm, se determin diferencia estadstica en favor de la vancomicina respecto a todas las concentraciones de aceite esencial de chiri-chiri (P=0.0001).

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I. INTRODUCCIN

La bacteria patgena Staphylococcus aureus se encuentra involucrada en una diversidad de infecciones e intoxicaciones en el ser humano, presentando diversidad de factores de virulencia, as como elevada capacidad de generar resistencia a los antimicrobianos. En hospitales de Lima Per se reporta la presencia de este patgeno en 55.2% en muestras de infecciones en el hospital Cayetano Heredia, 29.8% en el Instituto Nacional de Enfermedades Neoplsicas y 15% en el Instituto de Salud del Nio, siendo una de las bacterias patgenas ms frecuentes en las infecciones reportadas (Tamariz et al, 2009). En la ciudad de Juliaca, en el hospital Carlos Monge Medrano se determin que el principal agente causal de infecciones fueron las bacterias en un 92% y 8% de causa viral, siendo Staphylococcus aureus el patgeno ms frecuente (Velzquez y Meza, 2005).La recurrencia de Staphylococcus aureus se ve favorecida por el hecho de que esta especie habita tanto las mucosas como la piel de los seres humanos, lo que permite que a travs de heridas, pueda penetrar en el torrente sanguneo del paciente, por medio del contacto directo o indirecto con el personal sanitario, con un objeto contaminado o incluso con otro paciente. Puede producir una amplia gama de enfermedades, que van desde infecciones cutneas y de las mucosas relativamente benignas, tales como funiculitis, forunculosis o conjuntivitis, hasta enfermedades de riesgo vital, como celulitis, abscesos profundos, osteomielitis, meningitis, sepsis, endocarditis o neumona. Tambin puede afectar al aparato gastrointestinal, ya sea por su presencia fsica o por la ingesta de la entero toxina estafiloccica secretada por esta bacteria (Hurtado y Brito, 2002).Se conoce que bacterias patgenas, entre ellas S. aureus, son responsables de ms de 5000 muertes diarias en el mundo (Benites et al., 2011). El surgimiento de cepas resistentes a antibiticos comerciales ha resultado en un serio problema de salud, obligando a la bsqueda de nuevas fuentes antimicrobianas, encontrndose en los aceites esenciales de plantas medicinales y aromticas un alto potencial para ello.Por otro lado se conoce que los antibiticos comerciales causan reacciones alrgicas, que afecta entre el 2 y 8% de los pacientes hospitalizados, generalmente producida por administracin de betalactmicos, sulfas y quinolonas (Schlessinger, 2009), por lo cual es de inters probar sustancias naturales que puedan ser tiles en el tratamiento de infecciones en pacientes con antecedentes alrgicos a antibiticos comerciales.El Per presenta una biodiversidad de plantas medicinales nativas, siendo utilizadas en forma emprica por sus bondades teraputicas en el cuidado de la salud. Dentro de este contexto, la regin andina del Per posee una variada flora destacndose la especie conocida como chiri-chiri (Grindelia boliviana), esta especie vegetal se desarrolla sobre los 3800 msnm y es de amplia distribucin geogrfica en la regin Puno, se utiliza tradicionalmente como anti inflamatorio y tambin para curar heridas en la piel (Mantilla, 1991).Razn por la cual se plante el trabajo de investigacin que tiene como finalidad evaluar la actividad antibacteriana in vitro del aceite esencial del chiri-chiri (Grindelia boliviana R) frente a Staphylococcus aureus ATCC, as como comparar su efecto con un antibitico comercial vancomicina, para generar conocimiento que forme parte del desarrollo cientfico de la sociedad y estudiar las propiedades antimicrobianas de sta planta del altiplano peruano, ya que resulta importante buscar nuevas sustancias con actividad antibitica, frente a microorganismos resistentes y con alta capacidad infectiva, de esta manera contribuir a la calidad de vida y salud del ser humano. El estudio permite ofrecer una alternativa importante en el enfoque tradicional del tratamiento de infecciones causadas por Staphylococcus aureus, mediante el estudio de los efectos antibiticos in vitro del chiri-chiri sobre esta bacteria patgena, as como la utilizacin de un antibitico comercial como control positivo, para comparar los efectos antibiticos de ambos.Los objetivos del estudio fueron:

Objetivo generalEvaluar la actividad antibacteriana del aceite esencial del chiri-chiri (Grindelia boliviana R) in vitro frente a Staphylococcus aureus ATCC.

Objetivos especficos1. Evaluar el efecto bactericida del aceite esencial del chiri-chiri (Grindelia boliviana R) frente a Staphylococcus aureus ATCC in vitro.

2. Determinar la concentracin mnima inhibitoria (CMI) del aceite esencial de chiri-chiri (Grindelia boliviana R) para Staphylococcus aureus ATCC in vitro.

3. Comparar el efecto bactericida del aceite esencial de chiri-chiri (Grindelia boliviana R) y el antibitico Vancomicina frente a Staphylococcus aureus ATCC in vitro.

II. REVISIN BIBLIOGRFICA

2.1. Antecedentesa. A nivel internacionalPino, et al., (1997), realizaron la investigacin Composicin y propiedades antibacterianas del aceite esencial de Lippia alba (Mil) Brown, realizado en el Instituto de Investigacin de Industria Alimentaria de Cuba, estudiaron la composicin y propiedades antibacterianas del aceite esencial de Lippia alba, con el objetivo de evaluar la actividad antibacteriana sobre 9 especies de bacterias. Los resultados indican que el aceite esencial estuvo compuesto principalmente por carvona 40%, limoneno 5.76%, b-guaieno 9.84%, piperitenona 8.26%. El aceite present actividad antibacteriana, siendo mayor en general sobre los grmenes gram positivos, con valores en las concentraciones mnimas inhibitorias entre 0.3 mg/ml y 2.5 mg/ml; Escherichia coli fue inhibida a una CMI de 2.5 mg/ml.Flores et al., (1999), realizaron la investigacin: Aceites esenciales con propiedades antimicrobianas en aceites esenciales y sus propiedades antimicrobianas, realizado en el colegio de Farmacia y Bioqumica la Paz Bolivia, con el objetivo de evaluar las propiedades bactericidas de varias plantas y frutos. Los resultados reportan concentraciones inhibitorias de diferentes aceites esenciales para el hongo Neurospora crassa: lima (Citrus limetta) 0.5 mg/ml. Para Staphylococcus aureus: romero (Rosmarinus oficinalis) 1 mg/ml. Adems, los aceites de perejil (Petroselium sativum), Khoa (Satrela boliviana), molle (Chinas molle), naranja (Citrus aurantiun), toronja (Citrus paradissi) y mandarina (Citrus mobilis), inhibieron el crecimiento tanto de hongos a 0.5 mg/ml, como de bacterias a 1 mg/ml. Los aceites de perejil y molle a 3.7 mg/ml y khoa a 7.5 mg/ml inhibieron el crecimiento de Shigella flexneri.Primo et al., (2002), realizaron el estudio Determinacin de la actividad antibacteriana y antiviral del aceite esencial de Minthostachys verticillata (Griseb), realizado en la Universidad Nacional de Rio Cuarto Brasil. Los resultados muestran que existe actividad antibacteriana y antiviral del aceite esencial de Minthostachys verticillata in vitro, y del aceite esencial de la peperina sobre el virus Herpes simple tipo I (HSV-1) y el virus de la pseudorrabia (PrV). La accin antiviral observada fue especfica ya que se manifest en concentraciones no toxicas para las clulas husped. Los ndices teraputicos obtenidos fueron 10 mg/ml y 9.5 mg/ml para HSV-1 y PrV, respectivamente. Las bacterias Gram positivas mostraron mayor sensibilidad con 5 mg/ml y Gram negativas con 10 mg/ml. El aceite esencial de esta planta contiene poligona 44.56%, mentona 39.51%, cineol 0.11%, limonemo 2.03%, b-pineno 0.76%, a-pineno 0.62%; si bien el mecanismo de accin por el cual este tipo de sustancias ejerce actividad antiviral es desconocido, es posible que su sitio blanco sea los lpidos presentes en la envoltura viral.Martnez et al., (2003), realizaron el estudio Actividad antibacteriana del aceite esencial de mandarina, realizado en la Universidad de Venezuela. Los resultados demostraron actividad antibacteriana y concentracin mnima inhibitoria (CMI) del aceite esencial de la mandarina (Citrus reticulata) variedad Dancy, y las cepas bacterianas que se utilizaron fueron: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomona aeruginosa, y Eschechia coli. La actividad antibacteriana se determin por el mtodo de difusin en agar, utilizando las concentraciones de aceite; 1; 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90 y 100%. El aceite esencial present actividad antibacteriana del tipo bactericida contra B. subtilis, S. aureus y L. monocytogenes a todas las concentraciones excepto al 1%. La CMI del aceite esencial de mandarina variedad Dancy para B. subtilis fue de 19%, S. aureus y L. monocytogenes fue de 17%.b. A nivel nacional y departamentalCastro (2000), realizo el estudio Evaluacin de la actividad in vitro del aceite esencial de Matricaria recutita (manzanilla), sobre cepas puras extradas de lesiones bucofarngeas de Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus, estudio realizado en la Universidad Catlica Santa Mara, Facultad de Farmacia y Bioqumica, de la ciudad de Arequipa, Per. Los resultados fueron: el aceite esencial de la manzanilla present actividad bactericida con una concentracin inhibitoria mnima del 4% en el caso Streptococcus pyogenes y 3% para Staphylococcus aureus. La concentracin mnima bactericida fue de 6% para Streptococcus pyogenes y 5 %en el caso de Staphylococcus aureus.

Vengoa et al. (2000), realizaron el estudio Actividad antibacteriana in vitro de la Grindelia boliviana rusby (chiri chiri) en cepas de Staphylococcus aureus, evaluaron in vitro la actividad antibacteriana de la decoccin (DE), extracto alcohlico (EA) y aceite esencial (AE) de Grindelia boliviana y determinar su Concentracin Inhibitoria Mnima (CIM) frente a cepas de Staphylococcus aureus (Si) ATCC 25923 y Streptococcus pyogenes (Spa) EMB 217. Para hallar la CIM para cada forma medicamentosa frente a las dos cepas estndar. Los resultados fueron: se encontr que la CIM para S. aureus con decoccin fue 640 mg; con extracto alcohlico: 320 mg y aceite esencial: 2500 mg y para el S. pyogenes con decoccin: 320 mg; con extracto alcohlico: 160 mg (10 al) y con aceite esencial: 1250mg. Se hallaron halos de inhibicin para las tres formas de preparacin. Se concluye que: La decoccin, extracto alcohlico y aceite esencial de la manzanilla tienen actividad antibacteriana in vitro. La forma medicamentosa con mayor actividad antibacteriana fue el aceite esencial seguida del extracto alcohlico, evaluados por la tcnica de excavacin.

Albado et al., (2001), realizaron el estudio Composicin qumica y actividad antibacteriana del aceite esencial del Origanum vulgare (organo), estudiaron la actividad antimicrobiana del aceite esencial (Carvacrol) del Origanum vulgare. El aceite esencial obtenido por destilacin por arrastre a vapor de agua, a partir de las hojas y flores desecadas de O. vulgare; la actividad antimicrobiana del aceite de O. vulgare se realiz por el mtodo semi cuantitativo de incorporacin y de disco difusin en agar, los resultados de la densidad especifica del producto result 0.9234 a 20C y el ndice de refraccin 1.4774; el cromatograma mostr un contenido de 9% de Carvacrol, 12.19% de Terpineol, 6.86% de Pcimeno y la presencia de otros compuesto relacionados metablicamente con los tres antes citados. Las bacterias Gram-negativas: Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa, Salmonella tiphymurium, Salmonella choleraesuis y Vibrio cholerae y las bacterias Gram-positivas: Staphylococcus aureus y Bacillus cereus, mostraron diferentes grados de sensibilidad. De los microrganismos evaluados solo Pseudomonas aeruginosa mostr resistencia. El aceite esencial posee actividad microbiana contra todas las bacterias evaluadas, excepto para P. aeruginosa.Alzamora et al., (2001), realizaron el estudio Medicina tradicional en el Per, actividad antibacteriana in vitro de los aceites esenciales extrados de algunas plantas aromticas, relaizado en la Universidad Mayor de San Marcos en la ciudad de Lima, con el objetivo de investigar la actividad antimicrobiana in vitro de los aceites esenciales extrados de plantas aromticas, utilizando los aceites esenciales de cinco plantas empleados en la medicina tradicional del Per Eucalyptus globulos Eucalipto, Cymbopogon citratus (D.C.) Staff, Hierba luisa, Tagetes pusillalag Anis serrano, Senesio tephrosioidesTurez, Huamanrripa y Lepechinia meyenii (walp) Salvia. Los aceites esenciales obtenidos por destilacin por arrastre al vapor se enfrentaron a Salmonella typhi 6539, S. typhimuriun, S. enteritidis INS. Vibrio cholerae. Pseudomona auriginosa, Shiguella flexneri INS, Staphylococcus aureus, S. aureus y Candida albicans, se emple discos de antibiticos como controles. Los resultados fueron: los aceites esenciales mostraron efecto variado sobre gramnegativo ninguno inhibi a Pseudomona aeuruginosa. Los resultados obtenidos permiten validar el uso popular del ans serrano y la hierba luisa en el tratamiento de afecciones intestinales, como la Salmonelosis y el clera.Reyes et al. (2003), realizaron el estudio Actividad anti-inflamatoria de Grindelia boliviana (chiri-chiri), en ratas, realizado en la Universidad Agraria La Molina de Lima, el objetivo fue evaluar la actividad anti-inflamatoria de Grindelia boliviana Rusby Chiri-Chiri, en ratas. La evaluacin fue por el mtodo del Edema Suplantar (mesurado con Pletismmetro) en 40 ratas albinas: Blanco (sin tratamiento), dos grupos control AINE (naproxeno2%) y AIE (fluancinolide 0.05%); y dos grupos con extracto acuoso de tallos y hojas al 25% y50% de concentracin. La aplicacin fue por va tpica. Los resultados fueron: los tratamientos con extracto acuoso de chiri-Chiri al 25% y 50% disminuyen el proceso inflamatorio agudo inducido por la carragenina. La concentracin ms efectiva fue de 25% (100% de inhibicin de la inflamacin) a las 6 horas de evaluacin, sobre los dems tratamientos. El tratamiento estadstico mediante la prueba de Duncan y Anlisis de varianza (p 0,05); las concentraciones de 50 l/l y 75 l/l de aceite esencial mostraron los mayores efectos de sensibilidad. La concentracin mnima inhibitoria (CMI) fue 32.81 l/l que es la concentracin del aceite esencial de ajenjo necesaria para impedir o inhibir el crecimiento en 90% de Escherichia coli enteropatgena, mientras que se obtuvo 1% de inhibicin con las dosis de 1.88 a 2.06 l/l.

2.2. Marco terico2.2.1. Taxonoma y caractersticas del Chiri-chiri (Grindelia boliviana Rusby) La taxonoma de la especie es:Reyno: PlantaeDivisin: FanerogamasFamilia: AsteraceaeGenero: GrindeliaNombre cientfico: Grindelia bolivianaNombre comn: "chiri-chiri"En idioma colla aymar: "chiri chiri"En idioma khechua: chili chili(Mantilla, 1991)a. CaractersticasArbusto de 50 cm de alto, con abundantes hojas que presentan una sustancia mucilaginosa que le da un olor caracterstico. La inflorescencia es de 4 cm de dimetro. Sus hojas alternas son ovaladas, las de abajo son espatuladas, las de arriba son lanceoladas oblongadas, de color verde claro. Las flores son tubulares de color amarillo fuerte, radiadas, grandes, solitarias y terminales. Los frutos son aquenios cuadrangulares. Crece en laderas secas y pedregosas, a altitudes entre 3000 a 4100 msnm, florece entre los meses de enero a mayo (Mantilla, 1991).b. Antecedentes histricosEs una planta herbcea de la familia de las compuestas o compositae, netamente originaria del altiplano peruano-boliviano, antes conocido como alto Per. Los mdicos kollas aymaras la llevaron a todo el continente americano, antes de la invasin espaola de 1532, segn afirman los protomdicos en las crnicas de la colonia. De esta planta medicinal existen ms de 25 especies, es resinosa, perenne y erecta, con tallo bastante ramificado y estriado que mide ms o menos de 60 a 80 cm de altura (Pavlow, 1980).c. Uso tradicional del chiri-chiriEl chiri-chiri posee alcaloides, Grindelina, polifenoles cidos vanillico, p-cumrico y para hidroxibenzoico, flavonoides derivados del quercetol, luteolol y del kaempferol, alcanos hentriacontano, resina, cidos grindlico y oxigrindlico, aceite esencial borneol y cido robstico, saponinas glucosdicas, matricarianol, taninos glicos, fitosterolesgrindelol y principios amargos (Pavlow, 1980).Entre los usos tradicionales es expectorante y antiinflamatoria; es eficaz para las afecciones de las vas respiratorias, bronquitis, asma, tosferina, catarro, pulmona, bronconeumona, laringitis y faringitis. Se usa las flores y las hojas; 1 cucharada para un litro de agua en infusin, con miel de abejas o con chancaca negra, se recomienda tomar 3 veces al da, con 1 limn cada taza, en ayunas, antes de almorzar y antes de acostarse (Mantilla, 1991).Se ha aplicado esta planta medicinal en pacientes que sufran de cistitis, como diurtico general; es balsmica y aromtica. Es un excelente antisptico contra gripe, catarro, tos, resfriados. Tambin se han preparado parches con esta hierba, con vaselina, pomadas para fricciones contra el reumatismo y dolores musculares, quedando los pacientes sanos y fuertes con la medicina natural, tanto en Bolivia como a nivel mundial, recomendndose que mujeres embarazadas y nios no deban usar la planta internamente. Las hojas trituradas y mezcladas con orina son utilizadas para tratar golpes, dislocaduras, fracturas o desgarros musculares. Tambin es usada en infusiones para combatir resfros (Pavlow, 1980).Segn la composicin qumica que muestra el gnero Grindelia se cree que la actividad antibacteriana se debera a la presencia de Diterpenos, flavonoides y poliacetilenos corno lo reportado en otras plantas, la accin antibacteriana demostrada por el aceite esencial se basara tambin en los compuestos qumicos como el borneol, terpinol, A-pineno y B-pineno (Martnez, 1994).

Figura 1. Plantas en flor de Grindelia boliviana R.

2.2.2. Compuestos qumicos presentes en el genero Grindeliaa. DiterpenosDefinicin: son terpenos formados con cuatro unidades isoprnicas, procedentes del metabolismo del geranilgeranil pirofosfato (GGPP), estn presentes en los vegetales. Algunos son universales, como las giberelinas, pero otros tienen una distribucin restringida. Son abundantes en Lmiales y Asterales, en Asteraceae se han descrito ms de 1.200 diterpenos (Cotillo, 1990).El inters teraputico es limitado, se utiliza como antimittico (anticanceroso), sobre todo contra el cncer de ovario. Algunas potencialidades teraputicas de los diterpenos en general incluyen:, quinonas diterpnicas de Salvia miltiorrhiza, antitumorales de diterpenos tetracclicos (orionina, lasiokaurina, etc.) de Isodon (Lamiaceae), etc. Hay que destacar la actividad co-cancergena de los steres diterpenos de Euphorbiaceae y Thymelaeaceae, incluyen actividad citotxica. Tambin es importante sealar las propiedades antioxidades de los diterpenos fenlicos de algunas labiadas (romero, salvia oficinal); las propiedades edulcorantes del estevisido de la estevia o hierba azucarada del Paraguay. La funcin de los diterpenos no es del todo conocida, excepto las giberelinas, se supone que juegan un papel en la proteccin frente a los depredadores, otros son constituyentes de los revestimientos foliares que limitan las prdidas de agua en la planta (Cotillo, 1990).b. FlavonoidesFlavonoide (del latn flavus, "amarillo") es el trmino genrico con que se identifica a una serie de metabolitos secundarios de las plantas. Son sintetizados a partir de una molcula de fenilalanina y 3 de malonil-CoA, a travs de lo que se conoce como "va biosinttica de los flavonoides", cuyo producto, la estructura base, se cicla gracias a una enzima isomerasa. La estructura base, un esqueleto C6-C3-C6, puede sufrir posteriormente muchas modificaciones y adiciones de grupos funcionales, por lo que los flavonoides son una familia muy diversa de compuestos, aunque todos los productos finales se caracterizan por ser polifenlicos y solubles en agua. Los flavonoides que conservan su esqueleto pueden clasificarse, segn las isomerizaciones y los grupos funcionales que les son adicionados, en 6 clases principales: las chalconas, las flavonas, los flavonoles, los flavandioles, las antocianinas, y los taninos condensados, ms una sptima clase, las auronas, tenidas en cuenta por algunos autores por estar presentes en una cantidad considerable de plantas. Tambin el esqueleto puede sufrir modificaciones, convirtindose entonces en el esqueleto de los isoflavonoides o el de los neoflavonoides, que por lo tanto tambin son derivados de los flavonoides (Goodman y Gilman, 1991).Los flavonoides protegen del dao de los oxidantes, como los rayos UV; la polucin ambiental (minerales txicos como el plomo y el mercurio); algunas sustancias qumicas presentes en los alimentos (colorantes, conservantes, etc). Como el organismo humano no tiene la capacidad de sintetizar estas sustancias qumicas, las obtiene enteramente de los alimentos que ingiere, no son considerados vitaminas. Al limitar la accin de los radicales libres (que son oxidantes), los flavonoides reducen el riesgo de cncer, mejoran los sntomas alrgicos y de artritis, aumentan la actividad de la vitamina C, bloquean la progresin de las cataratas y la degeneracin macular, evitan las tufaradas de calor en la menopausia y combaten otros sntomas. En general los flavonoides son de sabor amargo, llegando incluso a provocar sensaciones de astringencia si la concentracin de taninos condensados es muy alta. El sabor puede variar dependiendo de las sustituciones presentadas en el esqueleto llegando incluso a usarse como edulcorantes similares a la glucosa (Goodman y Gilman. 1991).Algunos de los efectos favorables de los flavonoides pueden ser: Propiedades anticancerosas: han demostrado ser tremendamente eficaces en el tratamiento del cncer. Se sabe que muchos inhiben el crecimiento de las clulas cancerosas. Se ha probado contra el cncer de hgado. Disminucin del colesterol: poseen la capacidad de disminuir la concentracin de colesterol y de triglicridos. Antinflamatorios y analgsicos: la hesperidina por sus propiedades antiinflamatorias y analgsicas, se ha utilizado para el tratamiento de ciertas enfermedades como la artritis. Los taninos tienen propiedades astringentes, vasoconstrictoras y antiinflamatoria, pudindose utilizar en el tratamiento de las hemorroides. Antimicrobianos: isoflavonoides, furanocumarinas y estilbenos han demostrado tener propiedades antibacterianas, antivirales y anti fngicas. Propiedades antioxidantes: En las plantas los flavonoides actan como antioxidantes, especialmente las catequinas del t verde (Winkel-Shirley, 2001).

c. PoliacetilenosLos Poliacetilenos o Polinos son un grupo de compuestos orgnicos con alternancia de enlaces covalentes simples y triples. El ejemplo ms simple es el diacetileno o buta-1,3-diino.HCC-CCH. Al igual que los cumuleno s, los poliacetilenos se distinguen de las otras cadenas orgnicas por su rigidez, lo que los hace viables para nanotecnologa molecular. Los poliacetilenos se encuentran en las nubes moleculares interestelares en donde el hidrgeno es escaso (Goodman y Gilman. 1991).El poliacetileno sinttico ms largo que se ha reportado contiene 22 unidades de acetileno y se encuentra sustituido con grupos trisopropilsililo en los extremos. El poliacetileno de longitud infinita es un compuesto hipottico llamado carbino, uno de los al tropos de carbono.Los mono y poliacetilenos naturales se encuentran en muchas plantas y muchos de ellos tienen propiedades farmacolgicas y toxicolgicas. Los tallos y las hojas de especies pertenecientes a la familia compuesta han sido utilizados para el tratamiento del cncer en Indonesia. Estas especies han sido utilizadas para tratar infecciones de la piel y como desparasitantes intestinales por nativos de frica y Canad (Pavlow, 1980).Debido a las posibles propiedades medicinales de los poliacetilenos, varios procedimientos de sntesis se estn estudiando con la esperanza de que estos se puedan replicar industrialmente por sntesis orgnica (Pavlow, 1980).2.2.3. Aceites esencialesLos Aceites Esenciales o esencias vegetales son productos qumicos que forman las esencias odorferas de un gran nmero de vegetales. El trmino aceite esencial se aplica tambin a las sustancias sintticas similares preparadas a partir del alquitrn de hulla, y a las sustancias semi sintticas preparadas a partir de los aceites naturales esenciales. Los aceites esenciales son lquidos voltiles, en su mayora insolubles en agua, pero fcilmente solubles en alcohol, ter y aceites vegetales y minerales. Por lo general no son oleosos al tacto. Pueden agruparse en cinco clases, dependiendo de su estructura qumica: alcoholes, steres, aldehdos, cetonas y lactonas y xidos (Van Ginkel, 2003).Los aceites esenciales proceden de las flores, frutos, hojas, races, semillas y corteza de los vegetales. El aceite de espliego, por ejemplo, procede de una flor, el aceite de pachul, de una hoja, y el aceite de naranja, de un fruto. Los aceites se forman en las partes verdes (con clorofila) del vegetal y al crecer la planta son transportadas a otros tejidos, en concreto a los brotes en flor. Se desconoce la funcin exacta de un aceite esencial en un vegetal; puede ser para atraer los insectos para la polinizacin, o para repeler a los insectos nocivos, o puede ser simplemente un producto metablico intermedio (Van Ginkel, 2003).

a. Caractersticas Fsicas de los Aceites EsencialesLos aceites esenciales son voltiles y son lquidos a temperatura ambiente. Recin destilados son incoloros o ligeramente amarillos. Su densidad es inferior a la del agua (la esencia de sasafrs o de clavo constituyen excepciones). Casi siempre dotados de poder rotatorio, tienen un ndice de refraccin elevado. Son solubles en alcoholes y en disolventes orgnicos habituales, como ter o cloroformo, y alcohol de alta gradacin. Son liposolubles y muy poco solubles en agua, pero son arrastrables por el vapor de agua.b. Caractersticas Qumicas de los Aceites EsencialesLos componentes de los aceites se clasifican en terpenoides y no terpenoides. No Terpenoides: En este grupo tenemos sustancias alifticas de cadena corta, sustancias aromticas, sustancias con azufre y sustancias nitrogenadas. No son tan importantes como los terpenoides en cuanto a sus usos y aplicaciones. Terpenoides: Son los ms importantes en cuanto a propiedades y comercialmente. Los terpenos derivan, de unidades de isopreno (C5) unidas en cadena. Los terpenos son una clase de sustancia qumica que se halla en los aceites esenciales, resinas y otras sustancias aromticas de muchas plantas, como los pinos y muchos ctricos. Principalmente encontramos en los aceites mono terpenos (C10), aunque tambin son comunes los sesquiterpenos (C15) y los diterpenos (C20). Pueden ser alifticos, cclicos o aromticos.(Van Ginkel, 2003) Segn los grupos funcionales que tengan pueden ser: Alcoholes (mentol, bisabolol) y fenoles (timol, carvacrol) Aldehdos (geranial, citral) y cetonas (alcanfor, thuyona) steres (acetato de bornilo, acetato de linalilo, salicilato de metilo, compuesto antiinflamatorio parecido a la aspirina). teres (1,8 cineol) y perxidos (ascaridol) Hidrocarburos (limoneno, y pineno) (Goodman y Gilman. 1991).

c. Obtencin de los Aceites EsencialesLos aceites esenciales se obtienen por los mtodos: Enfleurage, extraccin con solventes, extraccin por prensado, extraccin con fluidos supercrticos, hidrodestilacin y extraccin por arrastre con vapor. Actualmente los aceites esenciales sintticos u obtenidos de fuentes naturales por cualquiera de estos mtodos, se purifican normalmente por destilacin al vaco. El mtodo mas utilizado para la extraccin de aceite esencial es el de arrastre a vapor (Van Ginkel, 2003).Extraccin por arrastre con vaporPor efecto de la temperatura del vapor (100C) en un cierto tiempo, el tejido vegetal se rompe liberando el aceite esencial, el cual presenta a estas condiciones una presin de vapor.Las plantas se colocan sobre un fondo perforado o criba ubicado a cierta distancia del fondo de un tanque llamado alambique. La parte ms baja de esta contiene agua hasta una altura algo menor que el nivel de la criba. El calentamiento se produce con vapor saturado que se provee de una fuente de calor que compone el equipo, fluye mojado y a presin baja, penetrando a travs del material vegetal. Los componentes se volatilizan, y condensan en un refrigerante, siendo recogidos en un vaso florentino, donde se separa el agua del aceite por diferencia de densidad (Van Ginkel, 2003).

a) La extraccin por arrastre con vapor es una tcnica para la separacin de sustancias insolubles en agua y ligeramente voltiles de otros productos no voltiles.b) Las sustancias arrastrables con vapor son inmiscibles en agua, tienen presin de vapor baja y punto de ebullicin alto.c) Los vapores saturados de los lquidos inmiscibles siguen la ley de Dalton sobre las presiones parciales.d) Al destilar una mezcla de dos lquidos inmiscibles, su punto de ebullicin ser la temperatura a la cual a suma de las presiones de vapor de cada lquido es igual a la presin atmosfrica.e) La destilacin por arrastre de vapor sirve para separar aceites esenciales de tejidos vegetales. Los aceites esenciales son mezclas complejas de hidrocarburos, terpenos, alcoholes, compuestos carbonlicos, aldehdos aromticos y fenoles.f) La pureza y el rendimiento del aceite esencial depender de la tcnica que se utilice para el aislamiento (vila, 2001).Factores que Influyen en la extraccin.Tiempo de secado del material .El eucalipto puede durar hasta 4 meses. La limonaria, la albahaca, la menta, la citronella si quedan en arrumes, generan hongos, los que transfieren un olor terroso mohoso al aceite, debido a la formacin de cidos grasos; por esto si el material no se procesa pronto ( 3 das) se dispone en literas para su oreo.d. ProductosEn un aceite esencial pueden encontrarse hidrocarburos aliciclicos y aromticos, as como sus derivados oxigenados; Ej: alcoholes, aldehdos, cetonas, steres, etc., substancias azufradas y nitrogenadas. Los compuestos mas frecuentes derivan biolgicamente del cido mevalnico; se les cataloga como terpenos: mono terpenos (C10) y sesquiter penos (C15) (Bruneton, 2001).e. Usos de los Aceites EsencialesIndustria Alimentaria Se emplean para condimentar carnes preparadas, embutidos, sopas, helados, queso, etc. Los aceites ms empleados por esta industria son el Cilantro, Naranja y Menta, entre otros. Tambin son utilizados en la preparacin de bebidas alcohlicas y no alcohlicas, especialmente refrescos. Con respecto a esta utilidad podemos citar las esencias extradas del naranjo, limn, mentas e hinojo, entre otros. Estas esencias tambin se emplean en la produccin de caramelos, chocolates y otras golosinas (Bruneton, 2001).

Industria Farmacutica Se usan en cremas dentales (aceite de menta e hinojo), analgsicos e inhalantes para descongestionar las vas respiratorias (eucalipto). El ecucaliptol es muy empleado en odontologa. Son utilizados en la fabricacin de neutralizantes de sabor desagradable de muchos medicamentos (naranjas y menta, entre otros) (vila, 2001).Industria de Cosmticos Esta industria emplea los aceites esenciales en la produccin de cosmticos, jabones, colonias, perfumes y maquillaje. En este campo se pueden citar lo aceites de geranio, lavanda, rosas y pachouli. Desodorantes Industriales: Actualmente se ha desarrollado el uso de esencias para disimular el olor desagradable de algunos productos industriales como el caucho, los plsticos y las pinturas. La industria de las pinturas emplea limoneno como disolvente biodegradable. Tambin se imparte olor a juguetes. En textiles, como enmascarado res de olores en tratamientos con mordientes antes y despus del teido. En papelera, para impregnar de fragancias cuadernos, tarjetas, papel higinico, toallas faciales (Bruneton, 2001).Industria de productos de uso veterinario Esta industria emplea el aceite esencial de Chenopodium ambrosoid es muy apreciado por su contenido de ascaridol, vermfugo. Tambin requiere limoneno y mentol como insecticidas. Biocidas e insecticidasExisten esencias con propiedades bactericidas, como el tomillo, clavo, salvia, mentas, organo, pino, etc. Otras son insecticidas:- Contra hormigas: Menthaspicata (spearmint), Tanacetumy poleo.- Contra fidos: ajo, otros Allium, coriandro, ans, albahaca.- Contra pulgas: lavanda, mentas etc.- Contra moscas: ruda, citronela, menta, etc.- Contra piojos: Menthaspicata, albahaca, ruda, etc.- Contra polilla: mentas, Hisopo, romero, etc.- Contra colepteros: Tanacetum, comino, ajenjo y tomillo, etc.- Contra cucarachas: menta, ajenjo, eucalipto, laurel, etc.- Contra nematodos: Tagetes, salvia, calndula, Aspragus, etc.

Los aceites esenciales se utilizan para dar sabor y aroma al caf, el t, los vinos y las bebidas alcohlicas. Son los ingredientes bsicos en la industria de los perfumes y se utilizan en jabones, desinfectantes y productos similares. Tambin tienen importancia en medicina, tanto por su sabor como por su efecto calmante del dolor y su valor fisiolgico (Bruneton, 2001).2.2.4. Principios activos de las plantasLos principios activos son sustancias que se encuentran en las distintas partes u rganos de las plantas y que alteran o modifican el funcionamiento de rganos y sistemas del cuerpo humano y animal. La investigacin cientfica ha permitido descubrir una variada gama de principios activos, de los cuales los ms importantes desde el punto de vista de la salud, son los aceites esenciales, los alcaloides, los glucsidos o hetersidos, los muclagos, gomas y los taninos. Existen en las plantas otros principios activos relevantes denominados nutrientes esenciales, como las vitaminas, minerales, aminocidos, carbohidratos y fibras, azcares diversos, cidos orgnicos, lpidos y los antibiticos.Los principios activos se clasifican, segn su estructura qumica, en grupos:Productos resultantes del metabolismo primario (procesos qumicos que intervienen en forma directa en la supervivencia, crecimiento y reproduccin): Glcidos, lpidos, derivados de aminocidos. Productos derivados del metabolismo secundario (no son esenciales para el metabolismo sino que son sintetizadas como defensa, adaptacin, etc.), son los ms importantes como principios activos: Hetersidos. Antraquinnicos, Cardiotnicos, Cianognicos, Cumarnicos, Fenlicos, Flavnicos, Ranunculsidos, Saponsidos, Sulfurados, Polifenoles. cidos fenlicos; Cumarinas; Flavonoides; Lignanos; Taninos; Quinonas. Terpenoides. Aceites esenciales; Iridoides; Lactonas; Diterpenos; Saponinas (Van Ginkel, 2003).

2.2.5. Caractersticas de Staphylococcus aureusEl prototipo de los estafilococos patgenos es S. aureus que es el agente causal de la mayora de las infecciones, son cocos Gram positivos de 0.5 - 1 um de dimetro, son inmviles, fermentan los azucares, no esporulan, productores de catalasa y generalmente no son capsulados (Murray, 2006). Se agrupa en forma de racimos y se consideran bacterias poco exigentes, que crecen en medios comunes y ofrecen cierta resistencia a los agentes extraos. Se encuentran generalmente en el medio ambiente que rodea al hombre, formando parte de la flora normal de la piel y las mucosas. Su estructura antignica de este microorganismo es bastante compleja, se han determinado cerca de 30 antgenos diferentes en su pared celular (Ziad, 2000).

Taxonoma de Staphylococcus aureus.La clasificacin sistmica segn la nueva edicin del manual de bacteriologa sistmica de (Bettin et al, 2003):DOMINIO: Procarionte FILO: Firmicutis CLASE: Schyzomicetes ORDEN: Baciliales (Eubacteriales) FAMILIA: Staphylococcaceae GENERO: Staphylococcus ESPECIE: aureus

a. Generalidades de Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus es un microorganismo de gran importancia mdica. Desde hace muchos aos se le ha reconocido como uno de los principales agentes patgenos para el humano. S. aureus forma parte de la familia Microccocaceae, gnero Staphylococcus, el cual contiene ms de 30 especies diferentes y muchas de stas son habitantes naturales de la piel y las membranas mucosas del hombre. Es un coco gram-positivo, no mvil. Puede encontrarse solo, en pares, en cadenas cortas o en racimos. Es un anaerobio facultativo, pero crece mejor en condiciones aerobias. El microorganismo produce catalasa, coagulasa y crece rpidamente en agar sangre. Sus colonias miden de 1 a 3 mm, producen un tpico pigmento amarillo debido a la presencia de carotenoides y muchas cepas producen hemlisis a las 24-36 horas. (Velzquez, 2005 y Kanafani, 2006). b. Factores de virulencia de Staphylococcus aureusLos estafilococos poseen numerosas protenas de superficie. As la mayora de las cepas de S. aureus contiene un factor de agregacin llamado coagulasa ligada, protena que constituye un factor de virulencia. Se une al fibringeno y lo convierte en fibrina insoluble, lo que hace que los estafilococos se agreguen en forma de grupos. La deteccin de esta protena constituye la prueba principal de identificacin de S. aureus. Posee otras protenas de superficie importantes tambin para la adherencia a las protenas de la matriz y tejidos del anfitrin (p.ej. fibronectina, fibringeno, elastina, colgeno) (Murray et al, 2006).

c. Patogenicidad de Staphylococus aureusDe 20 a 50% d los humanos albergan a S. aureus en la nariz. La capacidad patgena de de una cepa determinada de S. aureus es un efecto combinado de factores extracelulares y toxinas aunado a als propiedades invasora de las cepas en un extremo de la diversidad de la enfermedad se encuentra la intoxicacin alimetaria de estafilococos, atribuible nicamente a la ingestin de eterotoxinas preformadas; en el otro extremo estn las bacterias estafilocicas y los abscesos diseminados en todo los rganos (Jawetz, 2005).

d. Enfermedades producidas por S. aureusIntoxicacin alimentaria. Mediada por enterotoxinas que producen diarreas, vmitos, nuseas y espasmos abdominales dolorosos; se produce por consumo de alimentos contaminados con S. aureus. El tiempo de incubacin de la enfermedad es muy corto: de dos a seis horas. El tratamiento con antibiticos no es til debido a que los sntomas son causados por una toxina y no por la multiplicacin de las bacterias (Jawetz, 2005). Sindrome del Shock Toxico. Es causado por cepas de S. aureus que producen la toxina asociada al sndrome del shock toxico, la cual es absorbida por el torrente sanguneo produciendo fiebre elevada, erupciones de color rojo brillante por todo el cuerpo y ocasionando una disminucin de la presin sangunea. El Saureus asociado con el sndrome de choque toxico se puede encontrar en la vagina, tampones, heridas, en otras infecciones localizadas o en la garganta, pero casi nunca en el torrente sanguneo (Jawetz, 2005). Imptigo.- Es una infeccin de la piel caracterizada por ampollas que pueden estar localizadas en cualquier parte del cuerpo, aunque por lo general se observan alrededor de la nariz o la boca. Puede ser causado por uno de dos tipos de bacterias: S. pyogenes y S. aureus. Infecciones del tracto respiratorio superior e inferior.- Puede ser un patgeno o co-patgeno, produciendo diversas infecciones tales como: faringitis y neumona. Endocarditis bacteriana.- puede producir insuficiencia cardiaca, siendo la endocarditis en humanos la ms frecuente, subsecuente a la infeccin por Staphylococcus aureus.e. Epidemiologa de S. aureus. S. aureus es una de las bacterias patgenas ms importantes a nivel global. Cerca de un cuarto de la poblacin porta alguna de sus cepas en cierta etapa de su vida o todo el tiempo. Si en las personas se desarrolla una infeccin por esta bacteria es muy probable que la responsable sea una de las propias cepas de S. aureus que colonizan el organismo. En aos recientes las infecciones por S. aureus han reemergido debido a que la bacteria se ha vuelto resistente a los antibiticos con los que normalmente se le combate (Howe et al, 1996 y Velzquez, 2005).Las cepas SARM se introducen en el medio hospitalario a travs de pacientes, visitantes o trabajadores sanitarios. El reservorio fundamental lo constituyen los pacientes ingresados que estn infectados o colonizados, extendindose a otros pacientes principalmente por medio de las manos del personal sanitario (infeccin cruzada). A medida que progresa un brote epidmico, aumenta el nmero de portadores nasales de SARM que constituyen, a menudo, la propia fuente de infeccin. La transmisin a travs del entorno inanimado (reservorio ambiental) puede ser digna de mencin, especialmente en ciertas reas, como en las Unidades de Cuidados Intensivos. Desde hace muchos aos se han reportado brotes epidmicos de S. aureus por todo el mundo (Kanafani et al, 2006). f. Antimicrobianos para Staphylococcus aureus.Los antimicrobianos se desarrollaron en los ltimos 60 aos. Muchas enfermedades infecciosas consideradas incurables y letales son ahora susceptibles de tratamiento. La potencia notable y la actividad especfica de los frmacos antimicrobianos se deben a su selectividad sobre blancos especficos que son nicos en los microorganismos. Entre estos blancos estn las enzimas que sintetizan la pared celular, los ribosomas, las enzimas requeridas en la sntesis de nucletidos y la replicacin de DNA. Una Consecuencia inevitable del uso de los antimicrobianos es la seleccin de microorganismos resistentes (Katzung, 2005). a. Glicopeptidos (Vancomicina y Teicoplanina)Mecanismo de accin: la vancomicina inhibe la sntesis de la pared celular por unin firme al extremo D-Ala-D-Ala del pentapeptido peptidoglucano de sntesis reciente. Esto inhibe a la transglicosilasa y evita la mayor elongacin del peptidoglucano y sus enlaces cruzados. El peptidoglucano se debilita as y las clulas se hacen susceptibles a la lisis. La membrana tambin se daa lo que hace efecto a su efecto antibacteriano (Katzung, 2005).Resistencia: la resistencia de los enterococos a la vancomicina se debe a la modificacin del sitio de unin D-Ala-D-Ala del bloque de construccin, peptidoglicano, donde el D-Ala terminal es sustituido por D-lactato. Esto produce la prdida de un enlace de hidrogeno critico que facilita la unin de alta afinidad de la vancomicina a su sitio de accin y la prdida de actividad. Ese mecanismo tambin est presente en cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la vancomicina (Katzung, 2005). 2.3. Marco conceptualAceite Esencial: son productos qumicos que forman las esencias odorferas de un gran nmero de vegetales (Bruneton, 2001).Antimicrobianos: sustancia que mata o inhibe el crecimiento de microbios, tales como bacterias, hongos, parsitos o virus (Guerrero, 2001). Bactericida: Es cuando el antimicrobiano destruye al germen, son bactericidas tpicos las beta lacta masas y los amino glucsidos (Guerrero, 2001).Bacteriosttico: Es cuando el antimicrobiano inhibe temporalmente el crecimiento o multiplicacin del germen, para ser destruido el germen debe ser ayudado por el sistema inmunolgico del husped (Bruneton, 2001).Cepa: Cultivo puro formado por bacterias descendientes de un solo aislamiento (INS, 2002).Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI): Corresponde a la concentracin ms dbil de un antibitico capaz de inhibir el crecimiento visible de una cepa bacteriana al cabo de 18 24 horas de incubacin (INS, 2002).Concentracin Mnima Bactericida (CMB): Es la mnima cantidad de antibitico capaz de destruir el 99.9% de una muestra inoculada en condiciones estandarizadas (INS, 2002).Entero toxina: Es una sustancia daina producida por ciertas bacterias y que es especialmente peligrosa para partes del tracto gastrointestinal (Guerrero, 2001).Escala de Mc. Farland: Estndar de turbidez de sulfato de bario. La escala usada para el inculo de las pruebas de susceptibilidad por el mtodo de disco difusin es 0.5 (INS, 2002).Principio Activo: Los principios activos son la sustancia a la cual se debe el efecto farmacolgico de un medicamento, en un principio eran hierbas y sustancias naturales (Bruneton, 2001).Resistencia: Son mecanismos de defensa que crean los grmenes para evitar que los antimicrobianos los destruyan, se produce no genticamente (metablicamente inactivos, sin estructura blanco) y genticamente (mutacin, plasmodios) (Guerrero, 2001).Resistente (R): Categora clnica definida para las pruebas de susceptibilidad in vitro. Las cepas bacterianas incluidas en esta categora no son inhibidas por las concentraciones sricas del antibitico normalmente alcanzadas con las dosis habituales del mismo (INS, 2002).Sensible (S): Categora clnica definida para las pruebas de susceptibilidad in vitro. Implica que una infeccin debida a la cepa bacteriana estudiada puede ser tratada apropiadamente con la dosis de antibitico recomendada para el tipo de infeccin y la especie infectante, a menos que existan contraindicaciones (INS, 2002).

III. MTODO DE INVESTIGACIN

3.1. mbito de estudioEl estudio se realiz en la ciudad de Puno, ubicado en coordenadas UTM: 19 L 0393076 E8242866 N, a una altitud de 3838 msnm, la recoleccin de plantas de chiri-chiri (Grindelia boliviana R.), se efectu en su hbitat silvestre en cercanas al barrio Torres de San Carlos de la ciudad de Puno, la obtencin del aceite esencial del chiri-chiri, se realiz mediante el mtodo de arrastre al vapor en la Facultad de Ciencias Agrarias, Escuela Profesional de Agroindustria de la Universidad Nacional del Altiplano. El experimento de evaluacin de la actividad antimicrobiana se realiz en el laboratorio de Microbiologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional del Altiplano Puno.3.2. Tipo de estudioEl trabajo de investigacin fue del tipo cuasi experimental utilizando un control positivo (antibitico vancomicina). Se analiz el efecto que tiene el factor en estudio (aceite esencial), mediante la medicin de la variable de respuesta inhibicin del crecimiento bacteriano expresada en halos de inhibicin en mm.3.3. MuestraLa muestra de la especie vegetal chiri-chiri (Grindelia boliviana R), se colect de una poblacin silvestre existente en el barrio Torres de San Carlos de la ciudad de Puno, el mismo que se realiz a las 7 am, tomndose plantas enteras en un peso de 10 kg. La bacteria patgena Staphylococcus aureus cepas ATCC, fueron obtenidas del Instituto Nacional de Salud en la ciudad de Lima, Per.3.4. Diseo de investigacinLa distribucin de unidades experimentales para el estudio del efecto del aceite esencial de chiri-chiri frente a Staphylococcus aureus ATCC, correspondi a un diseo completamente al azar (D.C.A), la disposicin de unidades experimentales fue de la siguiente manera:AntibiticoAceite esencial de chiri-chiri Grindelia boliviana R

Repet.Vancomicina1 l/l5l/l10l/l25l/l35l/l50l/lTotal

111111117

211111117

311111117

411111117

511111117

Total555555535

Se trabajo con 35 unidades experimentales, conformado por 5 repeticiones por cada dosis utilizada, adems se utiliz un control positivo el antibitico comercial vancomicina que sirvi para estimar el porcentaje inhibitorio, ya que se conoce que Staphylococcus aureus ATCC es sensible a este antibitico.3.5. MaterialesMaterial BiolgicoCepa ATCC de Staphylococcus aureusPlantas de "Chiri -chiri" (Grindelia boliviana R)Material de VidrioBuretas.Probetas.Frascos acaramelados con tapa estril.Pipeta.Placas Petri de vidrio Prex.Equipos y Materiales.Refrigeradora.Incubadora.Estufa de esterilizacin.Esterilizadores (autoclave).Destilador por arrastre a vapor.Pipetas calibradas de 0,1 l, 0,5l y 1,0l.Mechero Bunsen.Balanza.Soporte Universal.Esptula de Driblasky.Medios de Cultivo.Agar MullerHinton.Agar Mackonkey.Caldo Indol.Caldo nutritivo.Material Fungible.Agua destilada.Alcohol.Escobillas.Bolsas de papel.Tijeras podadoras.Guantes.Guantes de Goma.Algodn.Lpiz de cera.Papel Kraft.Tiras medidoras de pH.Pabilo.Punteras de plstico.Azas de Kholle.3.6. Metodologaa. Recoleccin de plantasPara la recoleccin se tuvo en cuenta que la planta de "chiri -chiri" (Grindelia boliviana R) se encuentre en estado de madurez fisiolgica (con flores), que pueda contener los principios activos, la recoleccin se efectu por la maana (7 am) en el barrio Torres de San Carlos de la ciudad de Puno, se cortaron los tallos con tijeras de podar obteniendo la planta sin raz, para su posterior secado en sombra y en un ambiente cerrado. Se colect 10 kg de biomasa (Pineda, 2001).

b. Secado del material vegetalFundamento.- Es la eliminacin del agua de los tejidos y clulas de la planta, para evitar la alteracin de los componentes de la planta por la humedad persistente. Las hojas deben ser secadas con el tallo sin desprenderlas (Tadeo, 2004).Procedimiento.- El secado se realiz en un ambiente protegido de la luz solar, ventilada y sin superponer los tallos para su desecacin ptima por el lapso de 10 das para obtener un secado adecuado de la materia vegetal.c. Destilacin por arrastre a vapor (Tadeo, 2004).Fundamento.- Consiste en calentar la planta hasta que sus componentes ms voltiles pasen a la fase de vapor y a continuacin se enfra el vapor para recuperar dichos componentes en forma lquida por medio de la condensacin (el aceite esencial) (Tadeo, 2004).Procedimiento Se separaron manualmente las hojas de los tallos de la planta, y se carga en un hidrodestilador, de manera que forme un lecho fijo compacto, colocndose un total de 2 kg. El vapor de agua se inyect mediante un distribuidor interno, prximo a su base y con la presin suficiente para vencer la resistencia hidrulica del lecho. Conforme el vapor se pone en contacto con el lecho, la materia prima se calienta y liberando el aceite esencial contenido y ste, a su vez, debido a su alta volatilidad se evapora. Al ser soluble en el vapor circundante, el aceite esencial es arrastrado, corriente arriba hacia el tope del hidrodestilador. La mezcla, vapor saturado y aceite esencial, fue condensado y enfriado, hasta temperatura ambiente en un condensador cuello de cisne o prolongacin curvada del conducto, a la salida del hidrodestilador. A la salida del condensador, se obtuvo una emulsin lquida heterognea. La cual, se separo en un decantador dinmico o bureta. Este equipo est lleno de agua fra al inicio de la operacin y el aceite esencial se fue acumulando, debido a su casi inmiscibilidad en el agua y a la diferencia de densidad y viscosidad con el agua. Posee un ramal lateral, por el cual, el agua es desplazada para favorecer la acumulacin del aceite. El vapor condensado acompaante del aceite esencial y que tambin se obtiene en la bureta, es llamado agua floral, posee una pequea concentracin de los compuestos qumicos solubles del aceite esencial, lo cual le otorga un ligero aroma, semejante al aceite obtenido. El proceso termin cuando el volumen del aceite esencial acumulado en la bureta no varo con el tiempo. A continuacin, el aceite fue retirado de la bureta y almacenado en frascos acaramelados estriles con tapa. Para conservar el aceite esencial se coloc sulfato de sodio, para evitar la hidratacin por la humedad ambiental, luego los frascos se rotularon y se mantuvieron en refrigeracin.

d. Obtencin de la cepas de Staphylococcus aureusSe utiliz cepas ATCC de Staphylococcus aureus, provenientes del Instituto Nacional de Salud de la ciudad de Lima. Preparacin del medio de cultivo agar Mller Hinton (INS, 2002)Fundamento.- El agar Mller-Hinton se considera el mejor medio para las pruebas de sensibilidad de rutina dado que muestran buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad, contiene bajo nivel de inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina, es adecuado para el desarrollo de la mayora de las bacterias patgenas y existen suficientes datos recopilados que avalan la experiencia de las pruebas de sensibilidad realizadas en este medio.Procedimiento.- Segn su especificacin para su respectiva hidratacin, se prepar la cantidad de 3 g de agar con 80 ml de agua destilada para 4 placas. Luego se llev el medio a esterilizacin en autoclave a 120 C por 30 minutos. Antes que el medio de cultivo se enfre, se realiz el plaqueo, vertiendo aproximadamente 20 ml de medio Mller Hinton en cada placa estril vaca, luego se esper su solidificacin y se verific el pH (7.2-7.4); empleando tiras reactivas.

e. Preparacin del estndar Mc Farland (INS, 2002)Fundamento.- El inoculo bacteriano debe contener una cantidad normatizada de unidades formadoras de colonias (UFC), para minimizar la variacin de la poblacin bacteriana, esta cantidad es de 1x103 UFC/ml la que se determin mediante el estndar de Mc Farland.Procedimiento.- Para estandarizar la densidad ptica del inculo se utiliz una suspensin de sulfato de bario como estndar de turbidez (0.5 de la escala de Mc Farland). Para prepararlo se procedi de la siguiente manera: Se agrega 0,5 ml de BaCl2 a 99,5 ml de H2SO4. Luego se verifica la densidad correcta del estndar usando un espectrofotmetro; la absorbancia a 625 nm debe ser 0,03 - 0,10 para el estndar 0,5 de Mc Farland. Se distribuyen 2 - 4 ml de la solucin en tubos similares a los que se usan para preparar los inculos y se mantienen guardados a temperatura ambiente al abrigo de la luz. Antes de su uso y para lograr una turbidez homognea, se agita vigorosamente cada estndar.f. Preparacin del inculoLas cepas ATCC (American Tipy Culture Colletion) Staphylococcus aureus fueron adquiridas de INS Lima, las cuales fueron inoculadas en medio de cultivo Mac Conkey, con 24 a 48 horas de ser cultivados, a partir del cual se seleccionaron y recogieron con asa de kolle, 4 a 5 colonias, bien aisladas y con similar morfologa, teniendo el cuidado de no recoger medio de cultivo. Con estas colonias se prepar una suspensin en 4 5 ml en solucin salina. Luego la suspensin bacteriana fue incubada a 35C hasta alcanzar o exceder la turbidez del estndar (2 horas). Finalmente se realiz el ajuste a la turbidez del inculo por comparacin visual, agregando solucin salina, hasta una turbidez equivalente al tubo 0.5 del estndar de Mc. Farland, para ello, se observaron los tubos contra un fondo blanco con una lnea negra como contraste.

g. Prueba de inhibicin para determinar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de Grindelia boliviana R. por el Mtodo de difusin en agar Kirby-Bahuer (INLASA, 2003).Fundamento.- La tcnica de dilucin en agar segn Kirby-Bahuer, se utiliz para medir cuantitativamente la actividad "in vitro" de un antimicrobiano frente a un cultivo bacteriano. Estos mtodos se basan en la preparacin de una serie de placas con caldo o agar, respectivamente, a los cuales se les agrega el antibitico o aceite esencial en distintas concentraciones. Luego se inoculan cada uno de las placas con una suspensin estandarizada del microorganismo en estudio. Las pruebas se examinan despus de incubar 18 a 24 hs. a 35C y se determina la concentracin mnima inhibitoria (CMI) del antimicrobiano frente al microorganismo ensayado.Aplicacin de los discos en las placas inoculadas Se colocaron los discos sobre la superficie del agar Mller-Hinton, inoculada con pinza estril aplicando una ligera presin a una distancia no menor a 24 mm desde un centro al otro. Debido a que algunas drogas difunden casi instantneamente, un disco no debe ser removido una vez que tom contacto con la superficie del agar. No deben colocarse ms de 6 discos por placa. Incubar las placas invertidas a 35C dentro de los 15 minutos posteriores a que los discos fueron aplicados.Lectura de las placas e interpretacin de resultados Despus de 16 a 18 horas de incubacin se examin cada placa y medimos los dimetros de las zonas de inhibicin, las zonas de inhibicin debieron estar uniformemente circulares y se observ desarrollo confluente. Como el microorganismo estudiado fue un Staphylococcus, se incub por 24 horas para evaluar el efecto de la vancomicina, Para evaluar el punto final se considerel el rea que no muestre desarrollo obvio a observacin directa, no incluyendo halo de crecimiento o colonias muy pequeas que pudieran ser detectadas solo con mucha dificultad en el borde de la zona.

h. Determinacin de la concentracin mnima inhibitoria (CMI)Fundamento.- El valor de la CMI se obtuvo por el mtodo de difusin en agar, que permite determinar la concentracin de antibitico o aceite esencial que se necesita alcanzar en el sitio de infeccin para inhibir al microorganismo infectante. La CMI, sin embargo, no representa un valor absoluto, la CMI real puede estar entre la menor concentracin de antibitico que inhibe al microorganismo y la siguiente donde se observa desarrollo del mismo (Cruz-Carrillo, et al, 2010).Procedimiento.- Se observ la inhibicin del desarrollo bacteriano a las 24 horas en las placas Petri y se determina en funcin a las placas con aceite de chiri-chiri, en donde midiendo el halo de inhibicin, permite mediante el uso del control positivo (vancomicina), convertir los dimetros de halos de inhibicin en porcentaje de inhibicin, bajo la siguiente frmula de clculo (Cruz-Carrillo, et al, 2010):

Una vez obtenido el efecto inhibitorio en porcentaje, se procedi al ajuste de una ecuacin logartmica, a partir de la cual se obtiene la CMI, como el valor de concentracin del aceite esencial a partir del cual se obtiene la inhibicin de la bacteria patgena.

3.7. Mtodo estadsticoSe evalu las diferencias estadsticas entre los tratamientos y concentraciones de aceite esencial del chiri-chiri y el control de los bioensayos, para lo cual se utiliz el anlisis de varianza en un sentido (ANOVA), para determinar la existencia de diferencias entre las dosis respecto a la inhibicin producida en Staphylococcus aureus ATCC por el efecto de aceite esencial del "chiri -chiri" (Grindelia boliviana R.), el anlisis de varianza se realiz utilizando el siguiente modelo lineal aditivo:

Donde:

Variable de respuesta (halo de inhibicin en mm)

Promedio general

Efecto de la i-sima dosis de aceite esencial de chiri-chiri

Efecto del error experimental Adicionalmente la concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) se obtuvo ajustado una funcin logartmica, mediante el mtodo estadstico de mnimos cuadrados ordinarios, que permite obtener los porcentajes de inhibicin y la dosis a la cual corresponde la CMI, el modelo logartmico fue el siguiente:

Donde:Y=Porcentaje de inhibicinX=Concentraciones del aceite esencialb= Pendientea= Intercepto

Las pruebas estadsticas se evaluaron:Si el resultado es p < a 0.05 las pruebas son significativasSi el resultado es p > a 0.05 las pruebas no son significativas

Prueba de rango mltiple de Tukey.Procedimiento:1) Encontrar el error estndar de la media: S

r: Nmero de repeticionesCMEE: Cuadrado Medio del Error Experimental

2) Encontrar la Amplitud Estudiantizada Significativas de Tukey: AES(D)

3)Determinar la Amplitud Lmite de SignificacinAmplitud Lmite de Significacin de Tukey: ALS (D)

4) Ordenar los promedios de los tratamientos en serie por su magnitud en forma decreciente y realizar las diferencias de medias entre los mismos.

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

4.1. Efecto bactericida del aceite esencial del Chiri-chiri (Grindelia boliviana R) frente a Staphylococcus aureus ATCC in vitro.

Cuadro 1. Efecto bactericida en halos de inhibicin (mm) del aceite esencial del Chiri-chiri (Grindelia boliviana R) frente a Staphylococcus aureus ATCC in vitroConcentraciones1l/l5l/l10l/l25l/l35l/l50l/l75l/l

No. repeticiones5555555

Mnimo05.1006.3007.5009.5009.80012.800

Mximo07.5009.60010.60012.40013.50015.400

Promedio05.7407.4209.10010.76011.32014.240

Error estndar-0.450.590.600.510.760.44

Fuente: elaboracin propia, 2014

Figura 2. Efecto bactericida en halos de inhibicin (mm) del aceite esencial del Chiri-chiri (Grindelia boliviana R) frente a Staphylococcus aureus ATCC in vitro

En el cuadro 1 y figura 2, la concentracin de 1l/l de aceite esencial de Grindelia boliviana, no muestra ningn efecto bactericida sobre Staphylococcus aureus ATCC in vitro, debido a que no se observ la formacin del halo de inhibicin, con la dosis de 5l/l se obtuvo un promedio de 5.740.45 mm de halo de inhibicin, con la concentracin de 10l/l se obtuvo 7.420.59 mm, con la de 25l/l se tiene 9.10.60 mm, la concentracin de 35l/l present el halo inhibitorio de 10.760.51 mm, con la concentracin de 50l/l el promedio fue 11.320.76 mm por ltimo la dosis ms alta de 75l/l present el halo de 14.240.44 mm. De los resultados del efecto bactericida, se observa que existe una respuesta directamente proporcional de Staphylococcus aureus ATCC frente a las diferentes concentraciones utilizadas de aceite esencial de Grindelia boliviana, lo que indica que al incrementar la concentracin de aceite esencial el efecto bactericida aumenta tambin proporcionalmente, lo que se expresa en un mayor dimetro del halo de inhibicin que se forma en la placa cultivada con la bacteria patgena en estudio. En la concentracin de 1l/l de aceite esencial la bacteria patgena presenta resistencia, a partir de la concentracin de 5l/l se observa sensibilidad de Staphylococcus aureus ATCC al aceite esencial de chiri-chiri.El anlisis de varianza (anexo 2.1), para los dimetros de los halos de inhibicin formados por el aceite esencial de Grindelia boliviana en el cultivo de la bacteria patgena Staphylococcus aureus ATCC, indica que se encontr diferencia estadstica altamente significativa (P=0.0001) entre las concentraciones de aceite esencial utilizada, lo que permite sealar que existe un efecto diferente de cada dosis respecto al halo de inhibicin formado, para obtener un ordenamiento del efecto de cada concentracin en el siguiente cuadro se muestra los resultados de la prueba de rango mltiple de Tukey.

Cuadro 2. Prueba de Tukey para efecto bactericida en halos de inhibicin (mm) del aceite esencial del Chiri-chiri (Grindelia boliviana R) frente a Staphylococcus aureus ATCC in vitroConcentracionesPromedioGrupos de Tukey

7514.24A

5011.32B

3510.76B

259.10BC

107.42CD

55.74D

*Promedios con letra diferente son estadsticamente diferentes entre si (P