Angiogenesis dalam pterigium: studi densitas mikrovaskular, vascular endothelial growth factor, dan thrombospondin-1.

M Aspiotis1, E Tsanou2, S Gorezis1, E Ioachim2, A Skyrlas2, M Stefaniotou1 and V Malamou-Mitsi2

1. 1Department of Ophthalmology, University of Ioannina, Ioannina, Epirus, Greece2. 2Department of Pathology–Cytology, University of Ioannina, Ioannina, Epirus, GreeceCorrespondence: M Aspiotis, Department of Ophthalmology, University of Ioannina, Ioannina, Epirus 45110, Greece. Tel: +30 26510 77747; Fax: +30 26510 32266. E-mail: gorezis@hotmail.com

Received 5 December 2005; Revised 25 May 2006; Accepted 25 May 2006; Published online 23 June 2006.

Penelitian retrospektif ini bertujuan untuk menjelaskan peranan angiogenensis dalam patogenesis pterigium. Kami mengevaluasi microvessel density (MVD) dan ekspresi vascular endothelial growth factor (VEGF) dan thrombospondin-1 (TSP-1).

Pterigium merupakan lesi permukaan okular yang tumbuh dari epitel limbus menuju ke kornea secara sentripetal diikuti oleh epitel konyungtiva. Secara histologis, pada pterigium yang tumbuh secara aktif terdapat perubahan degeneratif dan hiperplasia. Patogenesis pterigium masih kontroversial, meskipun studi epidemiologi telah membuktikan bahwa radiasi ultraviolet adalah agen etiologi pterigium.5 Selain itu, banyak faktor pertumbuhan fibroangiogenik yang terlibat dalam patogenesis pterigium, seperti tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha), basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet-derived growth factor (PDGF), dan transforming growth factor-β (TGF-beta). Immunoreaktivitas faktor pertumbuhan ini terletak di dalam sel epitel, sel endotel pembuluh darah, membran basement pembuluh darah dan epitel, fibroblas, dan infiltrasi sel-sel inflamasi di pterigium.6 Sel epitel konjungtiva mampu menghasilkan sitokin proinflamasi, seperti TNF-α dan IL-1β, yang merangsang proliferasi fibroblastik kapsul Tenon, dalam kultur jaringan.7 Angiogenesis didefinisikan sebagai pembentukan pembuluh darah baru dari pembuluh darah yang sudah ada dan mendasari sebagian besar proses fisiologis,8 seperti pertumbuhan dan diferensiasi, ovulasi, proses penyembuhan luka, dan kondisi abnormal seperti neoplasia dan penyakit mata, yang menyebabkan kehilangan penglihatan yang berat.9

Proses angiogenesis diatur oleh keseimbangan kompleks faktor regulasi positif dan negatif. Salah satu faktor angiogenik yang paling ampuh dan spesifik adalah VEGF, yang juga dikenal sebagai faktor permeabilitas pembuluh darah dan vasculotropin.10 VEGF merupakan glikoprotein pengikat heparin yang memiliki beberapa efek penting pada sel-sel endotel vaskular. Faktor pertumbuhan ini dapat memberikan respon terhadap rangsangan lingkungan, terutama hipoksia, sitokin tertentu, dan estradiol.11, 12, 13 Saat ini , VEGF dianggap sebagai mitogen yang paling selektif untuk sel endotel,14 meningkatkan permeabilitas vaskuler,15 menginduksi perubahan aliran ion, proliferasi sel, 16 dan migrasi dan pelepasan proteinase.17

Sebagai penyeimbang, thrombospondin - 1 (TSP-1) merupakan trombosit multifungsi dan protein matriks ekstraselular.18 TSP-1 terlibat dalam beragam proses seperti regulasi pertumbuhan sel, motilitas sel, peradangan, dan penyembuhan luka. Dalam penelitian ini, kami menilai keterkaitan densitas mikrovaskular/ microvessel density (MVD), diperiksa dengan CD31, dengan ekspresi angiogenik faktor VEGF dan inhibitor endogen angiogenesis TSP-1 pada pasien dengan pterigium dan konjungtiva bulbar, dalam upaya untuk menjelaskan peran faktor-faktor tertentu yang terkait dengan angiogenesis dalam patogenesis pterigium.

Metode : 52 pterigium yang telah dieksisi dan tujuh konjungtiva normal diteliti secara imunohistokimia dengan menggunakan streptavidin-biotin method pada jaringan yang disimpan dalam paraffin. Antibodi monoklonal ditargetkan terhadap CD31, VEGF, dan protein TSP-1. Antibodi monoklonal yang ditargetkan terhadap CD31, VEGF, dan protein TSP - 1.

Hasilnya, pterigium secara signifikan memiliki rata-rata jumlah mikrovaskular yang lebih tinggi dibandingkan dengan konjungtiva normal. Pada 24 dari 52 kasus pterigium (46,2 %), ditemukan ekspresi VEGF yang tinggi, sedangkan persentase rata-rata sel epitel VEGF-positif adalah 58,03 %. Selain itu, konjungtiva normal mengekspresikan VEGF yang tinggi dalam sel epitel. Sebaliknya, kehadiran imunoreaktifitas VEGF dalam sel endotel dan stroma pembuluh darah secara signifikan lebih tinggi dalam jaringan pterigium (P < 0,0001). Pewarnaan stroma untuk TSP-1 terdeteksi hanya pada 29 dari 52 kasus (55,8 %) dan tidak ditemukan korelasi dengan konjungtiva yang normal. Akhirnya, ditemukan korelasi positif yang signifikan secara statistik antara nilai MVD dan ekspresi VEGF dalam stroma (P = 0.049).

Dalam penelitian ini, overekspresi VEGF di pterigium dan banyaknya mikrovaskular yang positif terhadap CD31 tampaknya sesuai dengan penelitian sebelumnya 25, 26, 27 yang membuktikan neoangiogenesis sebagai kontributor potensial yang penting dalam patogenesis pterigium. Kami menemukan bahwa terdepat ekspresi VEGF yang banyak dalam sel endotel dan stroma pterigium, namun tidak pada sel epitel. Kami menekankan bahwa VEGF terbukti ditemukan pada konjungtiva normal dan jaringan okular lainnya dengan angiogenesis.

Kami menekankan pada hasil penelitian yang berbeda dengan pengamat sebelumnya yang menemukan bahwa terdapat ekspresi pterygium yang lebih tinggi secara signifikan pada pterigium dibandingkan dengan jaringan normal. Ekspresi VEGF yang tinggi pada sel epitel konjungtiva normal mungkin tidak mampu merangsang angiogenesis, sesuai dengan rendahnya MVD. Fenomena ini mungkin disebabkan oleh tidak adanya VEGF pada sel endotel dan stroma. Sebaliknya, ekspresi VEGF pada sel endotel maupun stroma pterigium mungkin mampu merangsang aktivitas angiogenik secara signifikan, terbukti dengan nilai MVD yang tinggi. Akumulasi VEGF pada sel epitel menggambarkan produksi, sedangkan akumulasi dalam sel endotel dan stroma menggambarkan aktivitas

angiogenik. Berdasarkan hasil penelitan ini kami berhipotesis bahwa stroma cukup penting dalam patogenesis pterygium.33

Salah satu temuan penting dari penelitian ini adalah tidak adanya karakteristik TSP-1, suatu inhibitor angiogenesis, pada hampir setengah (44,2%) kasus ptergium. Peran TSP-1 dalam regulasi angiogenesis tidak jelas. Dampak positif dan negatif dari TSP-1 di angiogenesis telah dilaporkan. TSP-1 memiliki aktivitas antiangiogenik yang terlibat dalam interaksi CD36 reseptor sel endotel mikrovaskuler dan in vivo dan in vitro. Penelitian in vivo dan in vitro 35,36, 37, 38 telah menunjukkan bahwa protein ini mungkin menghambat angiogenesis. Berdasarkan temuan di atas, dapat disimpulkan bahwa overekspresi faktor angiogenik dan bersamaan dengan penurunan ekspresi inhibitor angiogenesis mungkin menyediakan satu jalur untuk mekanisme patogen dari pterigium serta kemungkinan intervensi terapi untuk menghindari rekurensi pterigium.

References:

3. Spencer WH. Ophthalmic Pathology: An Atlas and Textbook, 3rd edn. WB Saunders Co: Philadelphia, 1985, pp 304.

4. Reese AB. Tumors of the Eye, 3rd edn. Harper & Row: New York, 1976, pp 53–55.

5. Cameron ME. Histology of pterygium: an electron microscopic study. Br J Ophthalmol 1983; 67: 604–608. | PubMed | ISI | ChemPort |

6. Hill JC, Maske R. Pathogenesis of pterygium. Eye 1989; 3: 218–226 (review). | PubMed | ISI |

7. Taylor HR, West SK, Rosenthal FS, Munoz B, Newland HS, Emmett EA. Corneal changes associated with chronic UV irradiation. Arch Ophthalmol 1989; 107: 1481–1484. | PubMed | ISI | ChemPort |

8. Kria L, Ohira A, Amemiya T. Immunohistochemical localization of basic fibroblast growth factor, platelet derived growth factor, transforming growth factor- and tumor necrosis factor- in the pterygium. Acta Histochem 1996; 98: 195–201. | PubMed | ISI | ChemPort |

9. Cunliffe IA, Richardson PS, Rees RC, Rennie IG. Effect of TNF, IL-1, and IL-6 on the proliferation of human Tenon's capsule fibroblasts in tissue culture. Br J Ophthalmol 1995; 79: 590–595. | PubMed | ISI | ChemPort |

10. Folkman J, Klagsbrun M. Angiogenic factors. Science 1987; 235: 442–447. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |

11. Tsanou E, Ioachim E, Stefaniotou M, Gorezis S, Charalabopoulos K, Bagli H et al. Immunohistochemical study of angiogenesis and proliferative activity in epiretinal membranes. Int J Clin Pract 2005; 59: 1157–1161. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |

12. Ferrara N. Vascular endothelial growth factor. Eur J Cancer 1996; 32: 2413–2422. | Article |

13. Drovak HF, Brown LF, Detmar M, Dvorak AM. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability and angiogenesis. Am J Pathol 1995; 146: 1029–1039. | PubMed | ISI | ChemPort |

14. Ferrara N, Alitalo K. Clinical application of angiogenic growth factors and their inhibitors. Nat Med 1999; 5: 1359–1364. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |

15. Nicosia RF. What is the role of vascular endothelial growth factor-related molecules in tumor angiogenesis? Am J Pathol 1998; 153: 11–16. | PubMed | ISI | ChemPort |

16. Leung DW, Cachianes G, Kuang WJ, Goeddel DV, Ferrara N. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science 1989; 246: 1306–

1309. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |

17. Senger DR, Galli SJ, Dvorak AM, Perruzzi CA, Harvey VS, Dvorak HF. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science 1983; 219: 983–985. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |

18. Dvorak HF. Tumours: wounds that do not heal—similarity between tumour stroma generation and wound healing. N Engl J Med 1983; 315: 1650–1658.

19. Unemori EN, Ferrara N, Bauer EA, Amento E. Vascular endothelial growth factor induces interstitial collagenase expression in human endothelial cells. J Cell Physiol 1992; 153: 557–562. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |

20. Roberts DD. Regulation of tumor growth and metastasis by thrombospondin-1. FASEB J 1996; 10: 1183–1191 (review). | PubMed | ISI | ChemPort |

21. Taraboletti G, Roberts D, Liotta LA, Giavazzi R. Platelet thrombospondin modulates endothelial cell adhesion, motility, and growth: a potential angiogenesis regulatory factor. J Cell Biol 1990; 111: 765–772. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |

22. Dushku N, Reid TW. Immunohistochemical evidence that human pterygia originate from an invasion of vimentin-expressing altered limbal epithelial basal cells. Curr Eye Res 1994; 13: 473–481. | PubMed | ISI | ChemPort |

23. Karukonda SR, Thompson HW, Beuerman RW, Lam DS, Wilson R, Chew SJ et al. Cell cycle kinetics in pterygium at three latitudes. Br J Ophthalmol 1995; 79: 313–317. | PubMed | ISI | ChemPort |

24. Ioachim-Velogianni E, Tsironi E, Agnantis N, Datseris G, Psilas K. HLA-DR antigen expression in pterygium epithelial cells and lymphocyte subpopulations: an immunohistochemistry study. Ger J Ophthalmol 1995; 4: 123–129. | PubMed | ChemPort |

25. Dushku N, Reid TW. P53 expression in altered limbal basal cells of pingueculae, pterygia and limbal tumors. Curr Eye Res 1997; 16: 1179–1192. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |

26. Tan DT, Tang WY, Liu YP, Goh HS, Smith DR. Apoptosis and apoptosis related gene expression in normal conjunctiva and pterygium. Br J Ophthalmol 2000; 84: 212–216. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |

27. Di Girolamo N, McCluskey P, Lloyd A, Coroneo MT, Wakefield D. Expression of MMPs and TIMPs in human pterygia and cultured pterygium epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000; 41: 671–679. | PubMed | ISI | ChemPort |

28. Seifert P, Sekundo W. Capillaries in the epithelium of pterygium. Br J Ophthalmol 1998; 82: 77–81. | PubMed | ISI | ChemPort |

29. Lee DH, Cho HJ, Kim JT, Choi JS, Joo CK. Expression of vascular endothelial growth factor and inducible nitric oxide synthase in pterygia. Cornea 2001; 20: 738–742. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |

30. Kim I, Ryan AM, Rohan R, Amano S, Agular S, Miller JW et al. Constitutive expression of VEGF, VEGFR-1, and VEGFR-2 in normal eyes. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999; 40: 2115–2121. | PubMed | ISI | ChemPort |

31. Marcovich AL, Morad Y, Sandbank J, Huszar M, Rosner M, Pollack A et al. Angiogenesis in pterygium: morphometric and immunohistochemical study. Curr Eye Res 2002; 25: 17–22. | Article | PubMed | ISI |

32. Gebhardt M, Mentlein R, Schaudig U, Pufe T, Recker K, Nölle B et al. Differential expression of vascular endothelial growth factor implies the limbal origin of pterygia. Ophthalmology 2005; 112: 1023–1030. | Article | PubMed | ISI |

33. Jin J, Guan M, Sima J, Gao G, Zhang M, Liu Z et al. Decreased pigment epithelium-derived factor

and increased vascular endothelial growth factor levels in pterygia. Cornea 2003; 22: 473–477. | Article | PubMed | ISI |

34. Van Setten G, Aspiotis M, Blalock T, Grotemdorst G, Schultz G. Connective tissue growth factor in pterygium: simultaneous presence of vascular endothelial growth factor-possible contributing factor to conjunctival scarring. Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol 2003; 241: 135–139. | ChemPort |

35. Solomon A, Li DQ, Lee SB, Tseng SC. Regulation of collagenase, stromelysin, and urokinase-type plasminogen activator in primary pterygium body fibroblasts by inflammatory cytokines. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000; 41: 2154–2163. | PubMed | ChemPort |

36. Roberts AB, Sporn MB. Growth factors and transformation. Cancer Surv 1986; 5: 405–412. | PubMed | ISI | ChemPort |

37. Jimenez B, Volpert OV, Crawford SE, Febbraio M, Silverstein RL, Bouck N. Signals leading to apoptosis-dependent inhibition of neovascularization by thrombospondin-1. Nat Med 2000; 6: 41–48. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |

38. Iruela-Arispe ML, Bornstein P, Sage H. Thrombospondin exerts an antiangiogenic effect on cord formation by endothelial cells in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 5026–5030. | Article | PubMed | ChemPort |

39. Good DJ, Polverini PJ, Rastinejad F, Le Beau MM, Lemons RS, Frazier WA et al. A tumor suppressor-dependent inhibitor of angiogenesis is immunologically and functionally indistinguishable from a fragment of thrombospondin. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 6624–6628. | Article | PubMed | ChemPort |

40. Tolsma SS, Volpert OV, Good DJ, Frazier WA, Polverini PJ, Bouck N. Peptides derived from two separate domains of the matrix protein thrombospondin-1 have anti-angiogenic activity. J Cell Biol 1993; 122: 497–511. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |

41. Nicosia RF, Tuszynski GP. Matrix-bound thrombospondin promotes angiogenesis in vitro. J Cell Biol 1994; 124: 183–193. | Article | PubMed | ISI | ChemPort |