actions of neuropeptide y and growth hormone secretagogues in the arcuate nucleus and ventromedial...

8
Actions of neuropeptide Y and growth hormone secretagogues in the arcuate nucleus and ventromedial hypothalamic nucleus Ekkasit Kumarnsit, Louise E. Johnstone and Gareth Leng School of Biomedical and Clinical Laboratory Sciences, College of Medical and Veterinary Sciences, The University of Edinburgh, Hugh Robson Building, George Square, Edinburgh EH8 9XD, UK Keywords: electrophysiology, growth hormone, in vitro, rat Abstract Systemic or central administration of growth-hormone secretagogues (GHS) induces dense Fos expression in the arcuate nucleus but little or no Fos expression in the ventromedial hypothalamic nucleus, although both sites show intense expression of mRNA for the GHS receptor. Here, we recorded the electrical activity of single neurons from the arcuate nucleus and from the ventromedial hypothalamic nucleus in a rat hypothalamic slice preparation, and compared responses of these two populations to GHS. At both sites, the predominant neuronal response to GHS was a long-lasting excitation, indicating that GHS receptors at both sites are functional and similarly coupled to electrical excitation. We also tested neurons at both sites for their responses to neuropeptide Y and to somatostatin; at both sites the predominant response to each of these peptides was inhibitory. The arcuate cells that are activated by GHS include neuropeptide Y cells and growth hormone-releasing hormone cells. It seems possible that neuropeptide Y released in the ventromedial hypothalamus from the terminals of arcuate neurons counteracts the activation of ventromedial hypothalamic neurons by GHS in vivo, or that somatostatin released following liberation of growth hormone may do so. Introduction Growth hormone secretagogues (GHS) induce growth hormone (GH) release by actions at the pituitary and hypothalamus that are indepen- dent of the GH-releasing hormone (GHRH) receptor. In 1996, the GHS receptor (GHS-R) was cloned (Howard et al., 1996) and high levels of GHS-R mRNA were found to be localized within the hypothalamus including the arcuate nucleus and ventromedial hypothalamus (Guan et al., 1997). Recently, ghrelin, synthesized in the stomach and hypothalamus, was identi®ed and recognized as an endogenous ligand for the GHS receptor (Kojima et al., 1999). Ghrelin potently induces GH secretion (Kojima et al., 1999) and increases food intake (Naka- zato et al., 2001; Wren et al., 2001; Lawrence et al., 2002). Direct evidence that the arcuate nucleus is a site of action of GHS came ®rst from electrophysiological studies of arcuate neurons. Intra- venous injection of GH-releasing peptide-6 (GHRP-6) elicited elec- trical activation of arcuate neurons antidromically identi®ed as projecting to the median eminence (Dickson et al., 1995b). These effects were speci®c to the arcuate nucleus as systemically applied GHRP-6 only evoked signi®cant Fos expression in the arcuate nucleus. By contrast with GHRP-6, neither GHRH nor insulin-like growth factor-1 nor GH itself induced Fos expression in the arcuate nucleus, indicating that the response to GHRP-6 was not secondary to stimula- tion of GH release (Dickson et al., 1995a). Given the speci®c localization of GHRP-6-induced Fos expression to the arcuate nucleus, it was surprising that the distribution of GHS receptor expression was not con®ned to the arcuate nucleus, but was also prominent in the ventromedial nucleus of the hypothalamus (VMH) (Bennett et al., 1997). Additionally, extracellular recordings showed excitation of VMH neurons following bath application of GHRP-6 to hypothalamic brain slices (Hewson et al., 1999). Co-localization studies of GHRP-6-induced Fos expression demon- strated that GHRP-6 mostly activates GHRH mRNA- and neuropep- tide Y (NPY) mRNA-containing cells in the arcuate nucleus (Dickson & Luckman, 1997). Subsequent studies have shown colocalization of GHS receptors in NPY neurons in the arcuate nucleus (Willesen et al., 1999). However, the functional identity of GHS-activated arcuate neurons has remained unclear. GHRH neurons are activated and GHS-induced Fos expression is attenuated by a central action of somatostatin (Bailey et al., 1999) indicating a functional association of secretagogue effects with regulation of GH secretion. However, not all GHS-responsive neurons are inhibited by somatostatin, indicating that another func- tionally independent population in the arcuate nucleus is activated by secretagogues. Whether the activation of arcuate NPY neurons is functionally associated with secretagogue effects on GH secretion or is part of an independent physiological response is unclear. A population of arcuate NPY neurons are believed to have a major role in the regulation of food intake, and there have been reports that some arcuate NPY neurons are glucose-sensitive (Muroya et al., 1999) This study aimed to compare the effects of the nonpeptidyl secre- tagogue GHS agonist 1 (AGO-1: Nargund et al., 2001) and GHRP-6 on both brain regions, and to establish the functional responsiveness of neurons in these regions to somatostatin and NPY. European Journal of Neuroscience, Vol. 17, pp. 937±944, 2003 ß Federation of European Neuroscience Societies doi:10.1046/j.1460-9568.2003.02521.x Correspondence: Professor Gareth Leng, as above. E-mail: [email protected] Received 2 October 2002, revised 6 December 2002, accepted 3 January 2003

Upload: ekkasit-kumarnsit

Post on 06-Jul-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

������� �� ������� ��� ������ ��������������� �� �� ����� ���� �� ������ ��� ������������ ����

������� ��������� ���� �� �������� ��� ����� ��������� � ��� ����� ��� �������� ���������� ��� �� �� ���� � � � ����� ��� � � ������ ��� �� �� �� ���� ����� � �������������� ������ �������� ��� �!��� � ��������� ��" #$%� �&

��������' � ����(���������� ���)�� ������ � ����� ���

��������

������ �� ������ � ������������ �� ������!������ ��������� "�# $ �� �� �� %�� &������� �� �� ����� ���� ������� �� �� %�� &������� �� �� ������ ��� ������������ ����� ������� ���� ���� ���� ����� &������� �� �'(� ��� ���# ������� #�� � ���� �� �������� �������� �� ����� ����� ���� �� ����� ���� �� ���� �� ������ ��� ���������������� �� � ��� ������������ ���� ����������� �� ������ ������� �� ��� ��� ���������� �� �# � �� ���� ����� ���� ������� ������ ������ �� �# ��� � ����!������� &��������� �� ������� ���� �# ������� �� ���� ���� �� ��������� �� ��������� ���� �� �������� &���������) ���� ��� ����� �� ���� ���� ��� ���� ������� �� ������� ��� �� ������������*�� ���� ���� �� �� ������� ������ �� ��� �� ��� ���� � ��� ����������� +� ����� ���� ���� �� ������� �� �# ���� ������� � ���� �� ������ ������!������� ������ ����� ,� ��� ������� ���� ������� � ���� �� �� ������ �������������� ���� �� �������� �� ����� ����� ��������� �� ���������� �� ������ ��� ������������ ����� �� �# �� ������� ���� ������������ ���� ��������� ��������� �� ������ ������ ��� � ���

,���� �����

������ ������ ���� � � ����� ����� ����� ������ ����

��� �� ������ �� �� ��������� ��� ����������� ���� �� ������

��� �� �� �������� ������ ������ ������� �� ��� ! �� ���

������ ������� �� ����� ������� �� ���! ��� � ��� �� � �"� ��

����� ��#$ �� ����� �� � ������%� ������ �� �����������

�������� �� ������ ����� ��� "��������� ����������� �����

�� ���! ���&�� ������! �����! �����%� �� �� ������ ���

�����������! �� �����'� ��� ��� ��%� � �� ��� ��� �� ���

��� �� ��� ������ �(�)��� �� ���! ������ ������ ������� �����

�� ������ �(�)��� �� ���! ����� ��� ����� ���� ����* �#�*��

%��� �� ���! +,,�- .�� �� ���! +,,�- /����� �� ���! +,,+��

0���� "���� ���� �� ������ ����� � � �� �� ������ �� ���

��� '�� ���� ������������ ���� ���� �� ������ ������ ������

"��� ��)����� �� �������� ������ ����1� � ������ ���

������ ����"����� �� ������ ����� �������������� �����'� �

���)���� �� �� ����� ����� �0��*�� �� ���! ���2��� 3�

���� �� ���'� �� �� ������ ����� � ��������� ������

���1� ���� "�*� � ��'���� 4� 5����� �� �� ������ ������

6� ������� ���� ���1� ! ����� ���� ��� ���������* �����

�������� ��� �� ���� ������ 4� 5����� �� �� ������ �����!

��������� ���� �� ���� �� ���1� �� ��� ������� �� �������

���� �� �� ��� �0��*�� �� ���! ���2���

��"� �� ���'� ������%����� �� ���1� ������� 4� 5�����

�� �� ������ �����! �� �� ������� ���� �� ����������� �� ���

������ 5����� �� ��� ���'�� �� �� ������ �����! ��� ��

��� �������� �� �� "��������� ����� �� �� �����������

�78�� �6���� �� ���! ���&�� $�����������! 5���������� �������

���� 5�������� �� 78� ����� �������� ���� ����������� ��

���1� �� ������������ ����� ��� ����� �� ���! ������

9��������%����� ���� �� ���1� ������� 4� 5����� �����

����� ���� ���1� ����� ����"�� ���� ��#$� ��� �������

��� : �#1:� ��#$���������� ��� �� �� ������ ����� �0��*��

; /��*���! ���&�� ���<��� ���� ��" ���� ��������%����� ��

��� ������ �� #1: ����� �� �� ������ ����� �.���� �� ���!

������ ���"�! �� ���������� ������� �� ��������"��� ������

����� �� ������ �������

���� ����� �� ����"��� ��� ���������� 4� 5�����

� �������� �� � ������ ������ �� ���������� �6���� �� ���!

����� ��������� � ���������� ��������� �� ���� � � ����

���� � ������� �� �� ������� ���"�! ��� ��� ���������"

����� �� �������� �� ����������! ��������� ���� ������ �����

�������� �������� ���������� �� �� ������ ����� � ����"��� ��

���� � �� .���� �� ����"����� �� ������ #1: ����� �

������������ ������� ���� ���� � � ���� �� �� ������

�� � ���� �� �� �������� ������� ���� ���� � ������� $

���������� �� ������ #1: ����� �� ���"� �� ��" � ��)��

��� �� �� � ������� �� ���� ����*! ��� ��� ��" �� �����

���� �� ������ #1: ����� �� ���������" �8����� �� ���!

�����

3�� ���� ���� �� ������ �� ���� �� �� ���������� ���

�� � � ��� � ���� � �$�=��> #�� ��� �� ���! +,,�� ��� ���1� ��

���� ����� � ���! ��� �� ������ �� ���������� �����"� ��

����� �� �� � ��� �� ���������� ��� #1:�

������ ������ ������������ ��� ��� � �������� ���� � ��������� ������ ����������� ��������

���>�,��,? @)��? ,��2 A�+,,B�,+2+��5

�����������> 1����� ����� /� ! � ���"�

C�����> ������/� D������*

����!�� � "��#�� ����� ��!���� $ %���&#�� ����� ������� � ������' ����

-������� �� ���� �

�������� �� ��� � ������

$�� 5������ �� ������*� �� ���� ��������� ���� �� $�����

�������'� 1������� $�� ��A ��� ��� =�'� �<������� 8��

���� � 0���� ��� �+,,EB2, � �� ���� ��� ��������� �� �

��������� �"������� ���� �+�� �� �� > �+�� ���* ����� 4��� ���

���� �� �"������ �� ��#���&� ��� �� ��������� ��� ���� �����

<���*�� ���"�� ��� �����! �� ��! �� ��� ��������� ����� � ��

����� ����� ��� �� �������� �� ������ ������������ ����*� 3�

�� ��� ������ ���� � ����� ���� �� ���" 5����������������

���! ��� �� ��� ���� �������� �� ������ ����� ��� 78� ��

������� $ ��� �� ������ ��� ����� �� '5� ���� �� ���� �� �� �

������ "������� �9����� �������� /��! F(� ���� �� �����

����� �� ����� �� ����� 3� �� �� ��� '5� ���� ��

"������� ������ ��� ���� � ���� ������ ����'���� �������

���� G��� ��9�4! ���������� �� �8> #�9�! �+2- (9�! 2- (�+1=?!

��+2- 9�9�+! +�2- 8 �=?! ��+2- #��9=B! + - ��� ����! �,�!

�5� ���� ���� �2H =+@2H 9=+� 3� ������������ ����� ����*

�� ��� ��������� ���� ��� ?,,��� ���� 3��! ��� ��� �� ��� ��

���� ����������� ����� � �� ����� "������! ��� �� ��� �����

����� �� �5� ���� �9�4 �� ���� �������� ���� 5����������

������� �

=� ��� ��������� �� ������ ����� ��� �� 78� ����� ��

��� ����� �� �� ������� ������� ������! ��� �����������

������ ���� �5� ���� �9�4 �� BB �9 �� ��2�/@��� ��� �

��������� ����� C��� ��� �� �������� ��� �� ��� � � �� �� �E

��<��� ������� ������ ���� ������ ������� �

��������� ������� �� �����

��� ����������� ��,E+,8�� �� '��� ���� �9�4 ��� �����!

���� "���� �������! ������ ���� �� ������ ����� �� �� 78�! ��

����� �� ��* ����"��� �� �� � ��� ��� 5���������� �������

�����<�� ��� ������ ����"��� �� �����'� ����� � �� $5������

+6 �����'� �$5�� ��������! F�$�� 3� ������ ����"��� ��

��<���� "�� � �?,� ������ ������� ����� ������� �9C0! 9������ !

F(� ��� ���* + ������ �9C0��

$ ���� ����� �� ������� ����� ����"��� �� ������ ��� ��

��� �2��� ���� ��� ������������ 6���� ��� �� ��� ���� ��

�������� �� ���� � � ���$�=�� �8��*! F�$�! ���1�

�8��*! F(�! ���������� ��� ��! F�$�! #1: �3���� 9��*�� /��!

F(� ��� �� #1:�:� ���� ���� I��,?A&, �8��*! F�$�� I��,?A&,

�� �� � ����"��� ��� ������ ��� �� #1:�:� ������ �(� ,�2? �8�

��� ����� �� ����5� ��� ���� �� #1:������� ���� �(����

���� �� ���! ������ $�� ��� �� ������ �� ���� '��� ������������ ��

�� ���������� "���� �� �5� ���� �9�4 ��� ������ �� �� ��� ��

������� �� ������� ���� ��� �� ��� �� � ������� ���� �� ��

5������ ���� 9�+� ���"��! �� ��������� �� �� ������ �����

�� ��������� �� ���������� ���� 8 �=? ���� 9�+� �����!

���������� �� �8> #�9�! �+2- (9�! 2- (�+1=?! ��+2- 9�9�+! ,�+2-

8 9�! ���- 8 �=? B� B- #��9=B! + - ��� ����! �,�� C��� �����

��� �� �� ��� ���� �� ������� �

������ ������

3� ������ ����"��� �� ���,���� ����� ��������� ���� ���

����������� �� ������ �� ����� ���! ��� �� �0 �� �� ����� ��

��������� � � ���� �� 5���� �������������� "���������� ��

����"���� $��� ��������� �� � �� �� 5������ ���� ��� ��� !

�� ���������� ���� �� ������ ��� � ������ ��� �����

�� ���� ��� ������ �� "�� ����"����� ����� 4�� �� ���

�� � � ��� ��� ����������! ���� �� ������ ��5���� �,E

�2��� ���� ��� �����������! ��� �� ����"��� �� �� ����� 2E�2���

���� ����������� �� ���� ��� ��������� ���� �� ������� ������

3� �������������� ������ ����"��� �� ��� ����� �� �������

���� ����"��� �� �� ������� ����� ��� ������J ���� ���! ���

��� �� � � ��'���� ������� �� (� ,�,+! ��� �� ��� ���%� �

�������� �� 5����� 0����� ����"��� ������ �� ��� ������ ��

����������� �� ������* ����"��! ��� � ������� ������ �� ������

������ �� ���'���� �� "��������! ��� �� ����� �"��� ��

������� ��� ����! ��� �� ������� ��������� �� ��� ������

���� �������� '��� ������! ��� �� ��� ������ �� ������ 4��

#1:! ���� �� ��� ����� ��� �������! ��� �� ����� +E

�+��� ���� ����������� �� #1: �� ���� ��� �������

'����

����� 5���������� ������� �� ��� ���� ��& ����������

����" ����� �� �� "��������� � ��� �� �� ������ ����� ���

���� &B ���������� ����" ����� �� �� 78�� C��� ��� ��

������ ���� � ������� ���� 3� ��� �������� '��� ��� ��

��+� ,�� ��*@ ����� �C8- ��� ,�+E?�2 ��*@� ��� ������

�����! ��� ,�A� ,�� ��*@ ���� ,��EB�+ ��*@� ��� 78�

������

���� �� 9�������� �� ���� �� ����� �� �� ������ ����� ��� 78� ������ C��� ��� �� ��� �� �� ��� ���� ����� � �� � ���! ��� �������� ���$�=�� ��,�A

8� �� ���1� ��,�&8�� C��� ��� ��� �� ����

�� '��� ��� ����� �0�! �"�� � �"� �,��� �� ����"��� � �5��� 3� �����" �� ���*� �� ���� �� ����� ��� �� ����� �������� �� ������� ���� �� � ��'���� �� ���� #�� ����! �� �� ������ �����! ������������ ���� �� ���$�=�� ��� ���1� �� "�� ������! ��� ������������ ���� �� 5��������� #�� ��� ����! �� �� 78�! 5������������ �� ���1� �� "� ��� ������ ���� �� �� ������ ������

�BA C� (������� �� ���

� +,,B 4������� �� C������ #������� ������! ������ ������ �����������! ��! �B&E�??

�������� �� �� � �� ���� � �� ���� ����� �

$��� ������� 5������ ���� ���$�=�� �� � ��� �� ������������

��� �������� �� �����������! ���� �� �,�A8 ��� +��� ��

����� �� B ������ �����! ��� ��� �� ���� �� �� �����

���� 5�������� �� ��� ����� ���� ���� �� �� ��� ��A@B �

���� � � ��'���� ����� �� '��� ��� ���� ���$�=�� ������

�������� �4� � ��� +�� 4���� ����� ���� 5���� �� ���$�=��!

�� ��� '��� ��� �� ��� ���� ��� ������ ���� ��,� ,�+ ��

��A� ,�B ��*@ �4� � B�� 3� '��� ��� � �� �� ����� � ��

����� ���� 5���� �� ���$�=��! ����� �� ��� ������! ���

����� � ��* ���+,��� �4� � B�� 3� '��� ��� ������ �"��� ��

��� ��� ��� �� ��� 2,��� ����� ? �� �A ��� ������ �� ������

������ ��� ���� �������� ����������� �� ���$�=��� ���$�=��

�������� ���� ��� ����� +�+� ��� �� �� � ,�A ��*@� ��� �?

���� �� � ��'���� �����

��������� � ������

���� �� ���1� �� 5����� �� ?& ������ �����- ���

�� ����'� � 5����! �������� �� ��������" � ���" �4� � ���

C� ��� ��� ���� � � ��'���� ����� �� '��� ��� �4� � ��� B�

���! �2��� ���� 5���� �� ���1� ! �� ��� '��� ��� ��

��� ���� ��� ������ ���� ,�A� ,�� �� +��� ,�B ��*@� 3�

'��� ��� �� �����" ��� � �� �� ����� � �� ����� ����

5���� �� ���1� �4� � +�! ����� ��� ������! ����� � ��* ��

�+,��� ��� �� ��� ��� ������ �"��� ��� �� ��� 2,��� �����

��� �� �A ��� ������ �� ������ ������ ��� ����� $����� � ��

���������� ���� �� ���1� �� 5��������! � �� ��� ��

� ��'������ ��������! ��� �� ��� '��� ��� �� �� � ��

����� ���� ��A� ��+ �� ��,� ,�+ ��*@� 3� ���� �����

� ������� ���� 5���� �� ���1� ��� �� ��5���� ����,����

3������! �� ��� '��� ��� �������� ������ ������

������� �"�� 3������� ����� ���� �� � ��'���� ����

�� ���1� �

���� +� C5���� �� ��� ������ ��� �� 78� ����� 5���� �������� �+���� 5���� �� ���� ���$�=�� ��,�A

8� �� ���1� ��,�&8�� C���

����� ��� '��� ��� �� �,� ���� #�� �� ��� ������ ���� 5���� ������ 5�������� �����

���� B� $"�� ���� �� ����� �� �� ������ ����� ��� 78� �� ����C��� ���� ������ �� ��� ���� �� '��� ��� ���C8� �������� � +����5���� �� ���� ���$�=�� ��,�A

8� �� ���1� ��,�&8�! �"�� � ���

��� ��� ���� � K5����J �� 4� � �� #�� ����! �� �� ������ �����! ���"�� ���� �� ���$�=�� ��� ���1� �� "�� ������! �������� ���� ������ 5���������

� +,,B 4������� �� C������ #������� ������! ������ ������ �����������! ��! �B&E�??

#1: ��� ��� ������ �� �� �������� ����������� �B�

3�� �� �,�&8 ���1� �������! �� ��� ������ �����! �

������ ����� �� '��� ��� � ���� "�*� �� �,�A8 ���$�=�

�! ��� �� ���� �� "�� ������ �� ������ ��� ���������

��������� � ������ �� �� ���

3� ���� �� �,�&8 ���1� �� ?2 ��� �4� �EB� �� 5������

3�� ��� �� �������� ��� �, ���� �� � ��'���� ����! ���

��� �BB@?2� ���� � ��'���� ����� �� '��� ���� 3� ���

'��� ��� �� ��� ���� �� BB ������ ���� ,�A� ,�� ��

�� � ,�+ ��*@� 3� ����� � �� � ��� � ���1� �����

�� ����� ���- ����� ��� ������ �� ���� �������� ��

�����! ��*�� �� ��,���! ��� �� ��� ��� ������ �"���

��� �� ��� 2,����

3�� �� ���� �� 78� ����� �� ���1� �� ������

������ �� ��� �� ������ �����! ��� �� ���������� �� �����"

����� �� "� �� �� ���� �� �� ������ ����� �(� ,�,2- 4���J

C5��� 3���

������ �� � � ��!��� �� ���"�#�� �������

3� ������ �� �� ���� �� ���$�=�� �� 5����� 9�+� ��

5����� �� B, ������ ������ ������� ����� ���� ������� ��

�9�4 ���������� +�2�8 9�9�+� �� ���� ���� '��� ����"���! ���

������� �� ������ �� ������ �� �� ����9�+������ �4� � ?��

�� ��� 5������! ���"�� �� 5����� 9�+� ����� �� � ���

����� �� �������� ����"���! ��� �� ��� �� ��� ��� �������

���"�! �+ ��� ���� � �������� �� �������� ����"��� �� � ���!

���� �"�! ��� �� �� ��� ��� ���� ���$�=�� �� ����9�+�

������ =� �� �+ ���! '" �� 5����- �� �� ��* �� ��

����! �� ��� '��� ��� �� �� '" ��� �� �"��� ���� , ��

2�B� ��2 ��*@� =� �� ��� ���� ��� ��� �����! ���� �� ��� �

���� ������� ���$�=�� ���� ����� �� ������ ������ 3�� ��

�� ��� ����� �� ��� ��� � ��'���� ���� �� ���$�=��! ���

�� ������ ���� � ���� �����

3�� �� ��� �� ������ ����� ������ �� ����� 5���� ��

���$�=�� �� ����9�+� �����! ��������� ���� ��� ���� ��

��� ������ ���� ���� 9�+� ���� �� ���� ������� ����� �����

���� ���� ����� �� �� ����

������ �� $�% �� �� �� � � ��� �

��5�� ������ ����� �� ��� ���� #1: �� �,�&8 ��� +����

4�" �� �� ��� ���� ���� ��� � ��'���� ���������� ���� ��

#1:! ���� � ���� �� ��� '��� ��� �� �,�2 ��*@ �� �� ��* ��

���������� �4� � 2�� $ ������ ++ ��� �� ��� ���� #1:�� �,� 8�

���� ?� 9�+�������� �� ������� ���� �� ���$�=�� �� �� ������������ 3� ��� ���� ��� � ��� ���� ������ �� ���$�=�� �� ��� 9�+��3� ����� ���� ��� �� 5���� �� � ��� �������" �� ��� 9�+� ���� ����<����� 5���� �� ���$�=�� ���� ������ ������ 9�+�� 3� ��������� ��� � ��� �������" �� ���$�=�� �� ���� ��� �� ������ 9�+��

���� 2� $"�� ���� �� ����� �� �� ������ ����� ��� 78� �� #1:�C��� ���� ������ �� ��� ���� �� '��� ��� ���C8� �������� � +����5���� �� #1: ��,�& �� �,�

8� �"�� � ��� ��� ��� ���� � K��������J�� 4� � � #�� �� ��������� �� �� ���� �� #1:! ��� �� ��������� ����� ���� ���'� �� �� ������ ����� ��� 78��

� +,,B 4������� �� C������ #������� ������! ������ ������ �����������! ��! �B&E�??

�?, C� (������� �� ���

�� �,@++ ���! �� ��� '��� ��� ����� ���*��� � ��� � #1:

����� �� ����� ���! ��� ���������� �� ��5�����2��� ���� #1:

������������� �4� 2E&�� 3� ��� '��� ��� �� �� �������� ���!

���� + ��� �+��� ���� 5���� �� #1:! �� ����� ����

+�,� ,�? �� ��B� ,�B ��*@� $�� �� �� ���" ��� �� ��"�����

��� ���� ���1� ��� �B ��� ���� �� �������� �� ���1�

�� ��<����� ��� ���� �,� 8 #1: �4� � �� =� ��! �5 ��

��������! ��� �� �������� ��� '" �� ��������"�

������ �� $�% �� �� ���

3��������� 78� ����� �� ��� ���� #1: �� �,� 8 ��� +����

3�� ��� �� 5���� ��� �� ���� �� � ��'���� ����! ���

��� �+2@B�� �� �������� �4� 2E&�� 3� ���� �� ��5����

�2��� ���� 5���� �� #1:� 3� ��� '��� ��� �� �������� ���

��� ���� ��B� ,�� �� ,�&� ,�� ��*@ �4� � 2�� 3� B� ���

������� +2 ���� ��� ��"����� ���� 5�������� �� ���� ��

���1� ���� ���� ���� #1: �4� � �� �"��� �� ��

� AH� �� �������� �� #1:! �� �� 5���� ��� "� ��

��������"�

3�� #1: �� ������������ ���������� �� ���� �� ������

����� ��� �� �� 78� �4� � &�! ��� ��� 78� ����� ���� ��

5���� �� ���1� �� �������� �� #1:� 3� ������ �� ����������

�� #1: �� ������ ��� ����� �� �� ������ ����� ��� 78�

�4� � A�! ��� �� ������ �� �� ������ �� 5�������� �� ���1� �� ��

78��

������ �� %� ������

3� ����" #1: :� ������ ���� ����! I��,?A&,! �� �� �� ��

78� ����� ���� ������ �� ���� ���1� ��� #1:� $��� ���

��� �� �������� ��� �������� �� ���1� ��,�&8� ��� #1:

��,� 8�! �����"��! ��� �� 5��� �� �� ���� ���� ���

2���� 3� �� ������������ �� #1: �� ������ B��� ����

� ����� �������� ���� �� ���� ����� $� ���� ���� ���������

���� �� �,�A8 ��� ��� ���� ��� �,�&

8 ���� ��� ���� ���

�� �� ���� ���������� �� �� ���� �� #1:� $� �,� 8! ���"�! ��

���� ���� �������� ����*� �� ���������� ���� �� #1: �� ���

�� ��� ��� ���! ��� ����� �� ���� �� �� ����� ��� �4� � ���

������ �� ��!���� �� �� �� � � ��� �

���� �� ���������� �� 5����� �� ++ ������ ������ 3�

��� �� ��� ���� ���������� �� �,�A8 ��� +���� 4��� �� ��

�� � ��'������ �������� ����� ���� ,�� �� ��2� ,�& ��*@�! ���

�5 �� ��������"� $ ������ �, ��� �� ��� ���� ������

����� �� �,�&8! ��� ��� +���� =� ��! ��� �� ��������! �� ��

�������� ��� �5 �� ��������"� 4������! ��� ��� �� ���

���� �,�&8 ���������� �� ����9�+� �����! ��� ���� �� ������

���� 3��! �� ++ ��� ��"�� ��� ���� "����� �� �� ����������

��� �� ������� ���������! ��� �?�H� �� ����� �� � �������� ��

���������� �� ������������ �� ��,�&8 �4� � �,��

������ �� ��!���� �� �� ���

#�� 78� ����� �� ��� ���� ���������� �� �,�&8 ���

+���� 3�� ��� �� ��������! ��� �� 5���� ��� '" ��

���� � C5���� �� �� ������ ��� �� � 78� ����� �������� �������� � +���� 5���� �� #1:���� 5�������� �� ���1� ��,�&

8�� C��� ����� ���'��� ��� �� �,� ����

���� &� 9�������� �� ���� �� ����� �� �� ������ ����� ��� 78� ��#1:� C��� ��� �� ��� �� �� ��� ���� ����� � �� � ���! ��� ����#1: ��,�

8�� C��� ��� ��� �� ���� �� '��� ��� ������0�! �"�� ��"� �,��� �� ����"��� � �5��� 3� ��� ��" �� ���*� �� ������ ����� ��� �� ����� �������� �� ����� �� ���� �� � ��'������ ���� #�� ����! �� �� ������ �����! �� ���������� ���� �� #1: ������������! ��� ��� �� "� ��� � �� �� 78��

� +,,B 4������� �� C������ #������� ������! ������ ������ �����������! ��! �B&E�??

#1: ��� ��� ������ �� �� �������� ����������� �?�

��������"� ��5 ���� ��� �� 5��� �� ���������� �� �,� 8

��� +���- ���� �� �� �� � ��'������ �������� ��� ��� ��

��������"� 3� ��� '��� ��� �� �� ���� �������� ��� ��

����� ���� �� � ,�2 �� ��B� ,� ��*@ �4� � �,��

3�� ���������� �� ������������ ���������� �� �������� ����"�

��� �� ����� �� ���� �� ������ ����� ��� �� 78��

.��������

3� ���� �� �� �������� �� ���� � � ���1� ��� ��

�������� � ���� ���$�=�� �� �� �������� ����"��� �� ������

����� �� ������� �� ��� ����� 6��� ��� ������ � ����!

�������� ���������� 5�������� ��� �"� � � ���� ��� ������� 3��

��� ��� ��� ������ � �������� �� ���� � "�� ������ �� ��

���� � �� �������%� ��� ���� ����� ���"�� �������������

�� ���1� �0��*�� �� ���! ���2��- �� ����������! �� ���� ��

���� �,� ���������� ���� �� ���������� �� �� ������ ����� ��� �� ��78�� �3�� ����� C5���� �� � �� � ��� �������� �������� � +����5���� �� ���������� ��,�A

8�� �/��� ����� $"�� ���� ������� �� �� ������ ����� ��� 78� �� ����� ����������� �� #1:� C������� ������ �� ��� ���� �� '��� ��� �� �C8� �������� � +����5���� �� ���������� ��,�

8� �"�� � ��� ��� ��� ���� � K���������J�

���� A� /����� �� ���� �� #1:��� ���1� � 7��� �� �� ��� ���� �� '��� �����C8� 4�� ���������! �� ��� �� �� ���� �� ���1� ��� #1: �� ��������� �� ���� �� ������ ����� ��� �,� ��� �� 78���� �&� �� ���� �� #1: � �� ��������� ���� 5���� �� #1:!��*�� �� �2���� 3� ���� �� ���1� �� �� 78� ��� BB� ������������� � ������ ������ � �� ���� �� #1:! ���� ���� �� ���1� �� �� ������ ����� ��� �A� �� �����

���� �� C5���� �� � �� � ����� �� �� 78� ����� ���������� �� ������ #1: ���� ����� 5�������� �� ���1� ! ��� ���� ���� �� �� �������������� �� #1: �� �� ���� �� �� ����" :� ���� ���� I��,?A&,�

� +,,B 4������� �� C������ #������� ������! ������ ������ �����������! ��! �B&E�??

�?+ C� (������� �� ���

�����"� �� !�! ���� ����� ������������� �� ���1� �

������ �� ���� � �� !��� �������� ����� ������������ 3�� �� �����

���� �� ������ ��� ��� ���� �� �� ���� �� !�! �� ��� ����

�G�� �� ��� ���� �� ��������� �� ���� � � ���� �� �����!

��� �� ��� ���� �� ���� ��<��� � �������� �� ������"������

8���"�! �� ��� �������� �� ���� �� ��� �<��� �� ��������

���� �� �� ���� � ��

3�� ��" �� � �� ��"��� ���� �� �� ������������ ����

���� �� ������������ ����� �� !��� �� �� ���� � ��

���� �� ��� ������ ���� ������������ 5�������� ���� ��

�� � ������������ �� ���1� ��,�28� �� ���� �� ������ �����

��� �� 78�! ��� ��� ���� ���������� ���� �� �� ������

����� �� ���������� ��,�28�� $ ��<��� ���� ��� ��

�������� ���� � � 91�2?2� 2�� �� �,�&8 ������ ���� �����

� ����� �� ������ ����� �� ����"��� ��� �� ��*@�! ��� ���

���� ���"��� "���� ���� �� ������ �� �� ���� � � ��

������ ����� ����� �� ���! ������ 3� ���� ����! ���� ���

���� ������������ �� ���1� ��� ���������� ����� �,�&8� ����

��"�����! ������ �� ���������� ��! � ��� �� �� ��� ����

78� ����� �� ��� ������������ �������� �� ����������! ���

���� #1: � � ����� ��������� �� �������� ����"��� �� �� ������

����� ��� �� �� 78� ���! �� ����������! ��� ���� � �������

�" ����� �� �������� �� ���� �� #1:� $� ��� �� �� ��

���������� ���� �� #1:����� �� � ������ ����� � :� �������

3� ���� �� 78� ����� �� ���� � � �� ������ ��

��� �� ������ �����! ���� �� ���������� �� �����" �����

�� "� �� ��� 3� '���� ����� ������� ���� �� �� � �����

�� ����� ��#$ 5����� �� �� 78�! ��� �� �� ������� ���� ��

���*�� ���� �� 4� 5����� �� ��� � ��� �������� �����

������������� �� ���� � �! ���� ���� ��������� �� 4�

5����� �� �� ������ ����� �0��*�� �� ���! ���2�- 6����

�� ���! ������ 3�� �� �����" ���� �� 4� 5����� �� ��

78� �� ��� �G�� �� ���* �� � ������������ 5�������� ������ ��

���� 3� ���� �� 4� 5����� � ��� ���� 5������ �� ������

��������� �� ��� ���� �� ����� ����������� ���� �� ��������

���� �/����� �� ���! +,,+�� =� ���� ����� �� ������ ��*

��� ������� ������ ��������� �� 4� �� �� 78� ��������

������ ��� ������������� �/����� �� ���! +,,+�! ��� ���� ��"

������ �� ������� 4� 5����� �� �� 78�! ��� ������ ����

�� ���� �" ��5���� 4� 5����� �� �� ������ ����� �0��*�

�� �� ���! ���2���

3� ������ ����� ����"��� �� ��� ��������� ������ � ���

���������� ���� 5�� #1: �.���� �� ���! �����! ��� �� � ��"

���� ���� #1: � � ������� ��������� �� 78� ������ $� ��� ��

#1:������� ����� ���)�� �� �� 78� �C"���� ; ��L*���! ��A��� ��

�� 78�! AH �� ���������" ����� �� �������� �� #1:! ��

�� �"�� �� 2,H� 3�� ����"����� �� ������ #1: ��� �� ��� ���

��� �� �� ���������� �� ������� ����"��� �� �� 78� ���� ���������

�� 5�������� ���� �� ��� ���� 3� ���* �� 4� 5����� ���

��� ������� #1: � � ���������� ���� ���� �� ��� �� �� �������

����� �� 4� 5����� �� 78� �����! � ��� � �� �� ������

�� �������� ������ �������� ����"����

9����� �� �����"� �� ����� �� #1: �� ��� ����

������ ��� ��� ���� ����� ��� #1: ����� �� �� ��

�� ���� ����� � ��� �� ����"���- �� �������� ������ �� ��� #1:

� ���� ��� ���� ���� ��������" ������ �� ���� ���� ����

#1:� 9������� ��� � � �� � ����� �� #1: '�� �� �� 78�

�9�������� �� ���! ��A2��

���� ���� ��" ���� ���� �������� �� �� ������ �����

��"�� ������������ ������ ���� ����* �3����� �� ���! +,,+�!

��� �� � ��*�� ���� �� ������ �� ���1� ��� #1: �� �� 78�

�� ������� ���� ������� ��"��"� �� �� ������� �� ���� � 3�

78� � �� ��)�� K����� ����J �� �� ����������� ������� ���

; �����! ��?,�! ���� #1: ��� �� ���� � � �� ���� "��

����� ��5� ��� �������� �9���* �� ���! ��A?- #�*�%��� �� ���!

+,,�- .�� �� ���! +,,�- /����� �� ���! +,,+�� ���"�! ����� ����

��"�� ������ ������ �� �� 78�! �� ��� ��� �� ��5� ���

��" ������ ������ �� 78� ������

6��� ���������� ���� �� ���������� �� ��� ����� ��

78� ����� �� !���! �� � ��� ����� ���� ����"����� �� ����������

����� �� ��� ��� ��������� �� 5�������� ���� �� ��� �� ��

78� �� !�!� �� �� ������ �����! 4� 5����� ������ ��

���1� � �������� �� 5� ��� ������������� �� ����������

�0��*�� �� ���! ���&�� �� �� ���! ���� � ��� �� �� ���! �����

��)����� �� ��� ����� 4� 5����� �� �� ���"��������� �����!

�������� �� �� ���������� ���������� ����� �M�� �� ���!

���&�� 3� ����� 5�� �� ������ ��#$ �6����� �� ���!

���+�! ��� ���� ����"����� �� ��� ����� �� � ������� ��

��������� �� �� ��� �� ���� C5� ��� �� ������� ����

������ 4� 5����� �� �� ������ ����� �� ���! ��� ��� ���� �

���� �� ���� ��� ��� ���� ���* ���������� ��3�+ ������

�M�� �� ���! ���&�� 3�� �� � ��*�� ����! ���� ��� ����"����� ��

���� �����! �� � ���� ��� �� ���* ���� ���"���������

���������� ����� ����� �� ���� ������� ���� ����� �M��

�� ���! ���&�� �� ��� ����� ����������� ���� ����"� ���1� ��� � �

������ ���� ������� �� ���������� ��#$ 5����� �� ��

���"��������� �����! ������� ���� ����"����� �������� ���

������� �6���� �� ���! ������

.���� ���"��������� ���������� ����� � ���� 78� ���

��� � ��� *����� 3�� �� ��� ���������� ��� �� �� ������

�����! ��� ��� ���������� ���)�� �������� ����� ���� �� ��

����� ������ �� ��"��� ����! ���������� ��#$ 5���

��� �� ������%� �� B,H �� ������ ����� ���� 5�� ����������

��#$ �.���� �� ���! ������ ���"�! �� ������ ����������

����� �� ��� 5�� �� � ��#$ �� ���� �� ����� ���

�0��*�� ; /��*���! ���&�! ��� ���������� ��#$ 5����� ��

�� ������ �����! ����* ���� �� �� ���"��������� �����! �

������ � �������� ������� ����"� ������� �� ��� �6���� �� ���!

������

������� �����

3� ������ ����* 0� $*�� (�������! 3�*��� ����� �������! 6����1������������ 9�� /��! 3�*���! I���� ��� 0� 0�� 8��#��! 8��*����� /���������! 0������� �� =���� ��� 8������� �����! �������! #I! F�$ ��� �� ��� �� �� :� ���� ���� I��,?A&,� 3�� ���* ��������� �� 8��* ����� /��������� ��� � C������ 9������� ����N/�3�����E,+,BA�

������������

�9�4! ����'���� ���������� G���- $�=��! � ���� �- ��! ����� ������-����! ����� ������������ ������- ���1� ! ����� ������������ ������ - ���! ����� ������ ���� � �- �����! ����������� ���� � � ������- ��#$! �� � ���������� ����- #1:!��������� :- 78�! "��������� ����� �� �� ������������

'�����

6����! $���! ���! 8�! 6����! 9���! 6����! 1�8�! 8��������! /�1�! �����! /�9�!�����! ����! /� ! �� ; 0��*��! ��/� ������ 9������ ������ ������� �� ����� ������ ���� � �> C���� �� 4� 5����� ��� ����� �5����� �� �� ��� ������ ������ ������������)'� ��� ������

6����! 1�$�! 3����! ��6�! ������! $�0�! 4� ���! ��0�! 7�� �� 1�� !/���! �����! ���� ; �������! ��9� ����&� ������������ ����� ���������� � �������� ������� 5����� � � ����� �� ����� �������� �� ���� ��������)'� ���� �����

� +,,B 4������� �� C������ #������� ������! ������ ������ �����������! ��! �B&E�??

#1: ��� ��� ������ �� �� �������� ����������� �?B

6�����! (�$�! (��� ��� ! C�6�! 9������! 0�(� ; �����! ��$� ����+� ������������ ������ �� � ���������� ���� ����������� �� �� ����� ������ ����� ��� �� ��������%����� �� ������������ ���������� ��������������)'� ���� �������

9��������! 6�8�! 0�8� ��! 0�$�! 8����! 7�I�! 1��*�! 7�8�! �� ���! 0�$�; =J0�����! 3�/� ���A2� 3� ������� �� ����������:���������� ����� �� ��� ������ ������������ ��� ���������

9���*! I�3�! (����! 1���! 9�����! .��� ; (����! ��1� ���A?� #�������� :�������� ��������� ��������� ������� ���� ���"��� �� ���� ������*��)'� ���� �������

0��*��! ��/�! 0���������7������! =� ; /� ! �� ����2�� ����'���� �+,�+��� ��� ���,��� ��� ��� ������ 4� 5����� �� �� ������������������ ����� �������� ����� ��)����� �� �������� ������ � ������������ ���� ������

0��*��! ��/�! /� ! ��! 0�����! ��C� ; �����! ���� ����2�� 9����� ������ ������� ��� ��������� ����� ������ ���� � � �� �� ���� ������*������)'� ��� ������

0��*��! ��/� ; /��*���! ��8� ����&� ��������� �� �* � �� � ����������� ���� �� ��������� : ��� ����� ������ ���������� ������ ����� �� �� ��� ������ ����� �������� ����� ��)����� ���� �� ���� � �! �������� ������ � ��������)'� �������

0��*��! ��/�! 7������! =�! 6����! $���3� ; /� ! �� ����&� $��������� �� �� ����� ������ ���� � � ��������� �� 4� ������ �� �� ��� ����������� �� ������ ���������� ������� ������������)'� ��� ��������

C"����! 6�I� ; ��L*���! 3� ���A�� 3� ��5���� �� ��������� : ���� ��������� ��� ���� �� �� 9#�� � ����� ��� ��� ��� ��� ��� ������ �� ���� !�"#� $� %� &'� ��������� -� ()*�� +"�&&� ,�- .�"�� //� �����

����! O�8�! :���! 1�����! =�9�! 8�(! (�(�! 4� ���! ��0�! ���������� �)�!0�I�! �����! ����! 7�� �� 1�� ! /��� ;������! $�0� ����&� 0���������� ����#$ ������ �� ����� ������ ���� � � ������ �� ����� ����������� ���� .�� /���� ���� ��� ������

������ ���! $�.� ; �����! ��.� ���?,� ������������ ���� ��� ���������� �� ���� 0���� ���� ��� �������

����! $�(�! 7������! =�! 8�(�%�! 0�#�! 0�����! ��C� ; 0��*��! ��/������� ���1� ������� ���� �� �������� ����"��� �� �� � ��� �� ��������! "��������� ��� ���"��������� ����� �� � ������������ ������������� �� "����� �� �������������� ��� ��������

������! $�0�! 4� ���! ��0�! 9����! 0�4�! $���! I�1�! /�������! 1�$�! ��������! 9���! ������! 8�! �����*! 0�/�! 1�����! =�9�! $�����! I�! 1��!1���! 0��%! 9�! 9���! 8�! /��! (�! 8�(! (�(�! 1�� ! ����! 9���� ! /�:�!

C������! $�! 0��*"��%! 8�! ��"�! ��! �� ��! 8�! ���������� �)�! 0�I�!0��! 0�9�! 8�����! 0��� ; 7�� �� 1�� ! /��� ���� � $ ������ ����������� ��� ����������� ���� �������� �� ����� ������ ������������ ��� �����

(�������! $�! (����! 3�! �������! $�! ����! 8�! ��*�����! $�! 3���*�! 3�!3������! :�! 8�! 3�! 4�*�����! 3�! 4�*���! 3� ; �����! 8� ������ 3���"� ��������� : :� ������ ���� ���� I��,?A&,> � ����� ���� ������� ���� ���� ����"����������� /��1�&� /�1'�� ��� �&&�� ���������

(�)���! 8�! �����! ��! 0��! :�! #�*�%���! 8�! 8����! �� ; (�� ���! (������� ������ � � ������������������ ������� ����� ���� �������� ������� ��� �����0�

/�����! 9�6�! ����! $�9�! 6������! 4�8� ; /��*���! ��8� �+,,+� $��������� ����� ��� �� ���� � � ����� ���� ��� ����"�� ����������� ����� ��������)'� ���� ������

8�����! ��! :���! 3�! ������! �� ; 3�*� ���! 8� ������ ����������"����� �� �� ��� ������ ����� ������� ��������� :� �������� 2�������� ��������

#�*�%���! 8�! 8���*���! #�! 0��! :�! (�)���! 8�! 8����! ��! (�� ���! (� ;8���*���! �� �+,,�� $ ��� ��� ����� �� �� ������ � ������� �� ���� �������� ��� ��������

#�� ���! ��! :! M�! 3���! I�! /�! M�! ��� ! N�! 6�*��! ��! 8���! ��! 4� ���!��! 1�� ! ��! 9�� ! (�! ������! (�! I��*! 3�! ���*�! ��! 3��"�*������!9�! 9�����! /�! ������! $�! �����! �� ; 1������! $� �+,,�� /�� ?? ! ����� ������� ����� ������ ���� � �! +++�� $9� #�������8��� � 1234)#�� �� 567� �� ������

3�����! ��! (�� ��! I�! �����%�! 3�! ����! ��! �� �����! �� ; =�*���! ���+,,+� ������ ������� �� ��� ��� ���� ����* �� ������ ����� ���������� ��������)'� ���� ���������

.����! 8���! (�����! 1� ; ����! I� ������ 9��������%����� �� ����������� ���� � � ������ ��� #1:��#$ �� �� ������ ����� �� ������ ������������)'� ��� �0������

.��! $�8�! �����! 9�I�! $�����! 9���! 0�����! .���! ���! /�I�! 9���! 8�$�!6�������! ��/�! 3����! ��! ������! ��$�! �����! 8�$� ; 6����! �����+,,�� ������ ��� ������� �� ��� ����� �� ���� %��#����� ��� ��0����

M�� ! ��! 6����! $�! I��� ! 8���! �����! (�! 9��! ��:�! 3�������! 8�C�!7�� �� 1�� ! /���! �������! I�8�! /� ! �� ; �����! ���� ����&������������ ������ ����� + *���*��� ��� �� ��������� �� ������������� ���" �����* �� ������ ������ .�� ���������� ����0�����

� +,,B 4������� �� C������ #������� ������! ������ ������ �����������! ��! �B&E�??

�?? C� (������� �� ���