accelerated identification of proteins by mass spectrometry by
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ACCELERATED IDENTIFICATION OF
PROTEINS BY MASS SPECTROMETRY
BY EMPLOYING COVALENT PRE-GEL
STAINING WITH UNIBLUE A
Marco A. Mata-Gómez,Matthew T.
Yasui,Armando Guerrero-Rangel,Silvia
Valdés-Rodríguez, Robert Winkler
ABSTRACT
La identificación de proteínas por espectrometría de
masas es un método estándar de control de calidad
biofarmacéutica y la investigación bioquímica.
Antes de la identificación por espectrometría de
masas, las proteínas por lo general se pre-separaron
por electroforesis.
Posterior a esto se procede con los protocolos de
tinción de proteínas y debido a que estos consumen
mucho tiempo se debe prolongar el tiempo de
preparación de muestras para espectrometría de
masas.
Se investigaron las propiedades electroforéticas de
proteínas y péptidos derivatizados y se estudio su
comportamiento en la espectrometría de masas.
INTRODUCCIÓN
los medicamentos falsos amenazan la salud de los
pacientes, Esto hace que se genere una necesidad
sobre la confirmación de la identidad de las
moléculas.
Especialmente para los laboratorios que trabajan con
las proteínas, ya que éstas están generalmente
purificadas a partir de mezclas complejas y difíciles
de distinguir por sus propiedades bioquímicas.
Hoy en día, las proteínas en la mayoría de los casos
se identifican con base en datos de espectrometría de
masas (MS), ya que los métodos actuales de la EM
ofrecen alta sensibilidad, velocidad y precisión y por lo
tanto permiten conclusiones fiables sobre la
naturaleza de una proteína en un plazo razonable.
Por lo general, las proteínas tienen que ser separadas
previamente, antes de que puedan ser sometidos a
análisis de MS. Esto se hace de manera eficiente por
electroforesis en gel, que tiene la ventaja adicional
para eliminar los contaminantes de bajo peso
molecular tales como sales.
la tinción con Coomassie
coloidal es actualmente el
método de elección , si las
muestras están destinados
para su posterior análisis
mediante espectrometría de
masas . Sin embargo
, teniendo en cuenta los
protocolos más rápidos , a tres
horas son necesarias para la
tinción de Coomassie
coloidal, y otras cuatro horas
para la preparación de piezas
de gel seleccionados para MS
Los requisitos para tal método de tinción serían:
la rapidez
la visibilidad de las proteínas teñidas a la luz
natural
la compatibilidad con la electroforesis en gel
la compatibilidad con la espectrometría de masas
y de procesamiento de datos de los flujos de
trabajo actuales
adopción simple de los procedimientos de
laboratorio existentes.
RESULTADOS
595 nm
Es necesario remover
el colorante de las
proteínas después de
la tinción
Tres horas son
necesarias para la
tinción de Coomassie
coloidal
593.5 nm
No es necesario remover el colorante de las proteínas después de la tinción
El tiempo requerido para el análisis de proteínas puede ser reducido sustancialmente
Coomassie Uniblue A
PROCEDIMIENTO DE TINCIÓN
COVALENTE Y LAS PROPIEDADES
ELECTROFORÉTICAS DE PROTEÍNAS
DERIVATIZADAS
Uniblue A
solubilidad en agua
disponibilidad comercial con la pureza adecuada
bajo precio
SEPARACIÓN DE LAS PROTEÍNAS EN GELES DE
POLIACRILAMIDA CON DODECIL SULFATO DE SODIO
(SDS-PAGE)
Permite separar proteínas haciéndolas pasar por un
gel o resina: poliacrilamida de sodio Dodecil
Sulfato, la cual es un agente entrecruzador que
genera un polímero sobre el cual se adherirán las
proteínas.
sólo por TAMAÑO
SDS-PAGE
Al aplicar un campo eléctrico
a la muestra inmersa en el
tampón de carga, el
complejo proteína-SDS
migrará hacia el polo
positivo y se separará según
su tamaño.
Los polipéptidos de menor
peso molecular migrarán
más rápido. Los de alto peso
lo harán más lentamente.
RITUXIMABEs un quimérico anticuerpo
monoclonal contra la
proteínaCD20 , que se
encuentra principalmente en
la superficie del sistema
inmune células B .
son proteínas creadas a
través de la unión de dos o
más genes que
originalmente codificaban
proteínas diferentes.
LA SEPARACIÓN DE LAS PROTEÍNAS EN GELES DE
POLIACRILAMIDA CON DODECIL SULFATO DE SODIO
(SDS-PAGE)
Figura A. Visualización de
un gel de SDS-PAGE
teñido con Uniblue A.
Muestra de Rituximab, un
anticuerpo recombinante.
Figura B. Visualización de
un gel de SDS-PAGE
teñido con azul de
Coomassie. Muestra
Rituximab, un anticuerpo
recombinante.
VENTAJAS DEL UNIBLUE A
La movilidad electroforética de las proteínas no se
cambia de manera significativa por su tinción
covalente
Por SDS-PAGE la intensidad de la tinción y la
resolución son perfectamente adecuadas.
La carga negativa de Uniblue A no influye
fuertemente en el punto isoeléctrico de las
proteínas derivatizados.
requieren unos pocos minutos para la preparación
de la muestra.
