abp 34-36 “aprendiendo del estudio clínico del tgn1412” grupo a curso 09-10

ABP 34-36

“Aprendiendo del estudio clínico del TGN1412”

Grupo ACurso 09-10

Caso del TGN1412

• Marzo 2006 en “Parexel Clinical Pharmacology Research Unit”

• Ensayo de fármaco biotec TGN1412• Ac monoclonal humanizado superagonista de CD28 • Tratamiento de leucemia linfocítica y artritis reumatoide

• Estudio fase clínica I:6 afectados de fallo multiorgánico

Clínica Parexel. Londres

Respuesta inflamatoria

sistémica

Tormenta de citoquinas

Fallo multiorgánico

Requiere 2 señales

distintas

Activación de las células T

Requiere SÓLO

1 señal

MEDIANTE SUPERANTÍGENOS MEDIANTE ANTÍGENOS

Humanización del anticuerpo 5.11.A1

5.11.A1 – CD 28 Humano

TGN1412 – CD 28 Humano

Inmunoglobulinas

•Anticuerpo (Ig) = Fab (2 x (VL, CL, VH, CH1)) + Fc (CH2, CH3)

• VH y VL presentan subregiones hipervariables o CDR

(complementarity determining regions), cuya estructura

determina la especificidad por el Ag.

• De las dos regiones constantes (CH y CL), la CH es

esencial para las funciones efectoras de la Ig, que

dependen de la interacción con otras células del S.I. y con

moléculas del complemento.

ImnunoglobulinasDominio Ig

• Constan de 70-110 aa y se clasifican en diferentes tipos de acuerdo a su tamaño y función

• Sandwich de dos láminas β antiparalelas. Estabilizado por:

- Puentes de H

- Interacciones hidrofóbicas

- Puentes disulfuro

• Dominio Ig CONSTANTE:

una hoja de 3 cadenas beta y otra de 4

• Dominio Ig VARIABLE:

una hoja de 5 cadenas beta y otra de 4

• La superfamilia Ig está compuesta por proteínas

que presentan uno o más dominios Ig

• Implicadas en el reconocimiento, unión y

adhesión celular

• Se cree que todos los miembros de la

superfamilia derivan de un ancestro común

• Entre los miembros de la superfamilia:

- Inmunoglobulinas solubles

- Moléculas de coestimulación

ImnunoglobulinasSuperfamilia Ig

Tormenta citoquinas

Homólogos remotos

Diferente nivel de expresión CD28

Diferente CD28

Diferente CTLA-4Agregación de

TGN1412

Otras hipótesis

CD33

HIPÓTESIS

• Bases de datos• Experimentales• Computacionales

Métodos

Familias• Pfam• PROSITE

Secuencia•Swiss-Prot

Estructura• PDB• CATH• SCOP

Bases de datos de proteínas

• Baja resolución (análisis cualitativo)– Técnicas espectroscópicas

• Absorbancia UV-Vis• Fluorescencia

• Dicroísmo circular• Espectroscopía de infrarrojos• Resonancia paramagnética electrónica (EPR)• Resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H (1D y 2D)

– Difusión traslacional• Ultracentrifugación analítica• Dispersión de la luz• Cromatografía de filtración en gel

• Resolución media– Criomicroscopía electrónica– RMN de estado sólido

• Alta resolución– Cristalografía de rayos X– RMN multinuclear y multidimensional

Técnicas experimentales de determinación estructural

Dicroísmo circular Se basa en el cambio de configuración electrónica molecular de un estado fundamental a un estado excitado, debido a la absorción de radiación electromagnética polarizada circular.

• Un haz de luz polarizado circularmente está formado por dos haces de luz de polaridad plana.

- Se obtiene girando el plano de polarización de forma continua y en un solo sentido alrededor del eje de propagación de la fase luminosa.

Dicroísmo circular

Absorción diferencial entre las ondas EREL

Fenómeno de dicroísmo circular

• Un haz de luz polarizado es aquel que tiene su vibración electromagnética en un solo plano.

ER

EL

RL AAA

Ley de Lambert-Beer

ClA RL )(

RL Absorción diferencial:

La interacción de la radiación con la muestra induce un desfase y un cambio de magnitud diferenciales en ambos componentes circularmente polarizados de la luz(ER y EL), y estos fenómenos provocan una rotación del plano de polarización en un ángulo a y la distorsión de este plano genera una elipse en vez de una circunferencia

Descomposición de luz linealmente polarizada en dos componentes depolarización circular

La absorción preferencialde un componente semide como un valor deelipticidad(dicroísmocircular), que puede ser + o -

Dicroísmo circular

Los espectros de dicroísmo circular se obtienen generalmente en las regiones del ultravioleta cercano (250 a 350 nm) y lejano (180 a 250 nm) de la radiación electromagnética.

Espectro de dicroísmo circular de estructurassecundariaspuras

Aplicaciones y usos del DC

Determinación de la estructura secundaria de proteínas que no se pueden cristalizar o que es difícil (proteínas de membrana o de dentro de vesículas lipídicas)

Cambios estructurales inducidos por el entorno (pH, Tª, solventes...)

Estudio de interacciones proteína-proteína y ác.nucleico-proteína

Ventajas

Simple, rápido, no destructivo

Requiere concentraciones menores que para RMN

Podemos usar moléculas de cualquier tamaño

Herramienta complemento para técnicas más detalladas (cristalografía y RMN)

Dicroísmo circular

•Sólo determina la estructura secundaria•Los espectros de estructuras secundarias puras NO son comparables con espectros que solamente tienen una fracción de esa estructura•No hay consenso en el límite de las bandas del espectro de UV cercano y el UV lejano

• Espectrometría de absorción que utiliza la región infrarroja del espectro electromagnético

• Las moléculas absorben frecuencias específicas determinadas por su estructura (frecuencias resonantes)

• Frecuencia absorción= frecuencia a la que el enlace o grupo vibra

Espectroscopía de infrarrojo

1. Un haz policromático se separa en dos en el separador

2. Uno de los haces hijo atraviesa la muestra y el otro una referencia

3. El detector registra la intensidad del haz transmitido: varia según la interferencia sea constructiva o destructiva

1

2 3Detector

Regilla oMonocromador

Blanco

Muestra

Divisor de as

CPU

Amplificador

ImpresoraTeclado

OPantalla

Fuente de radiacióninfrarroja: laser,Globar o Nernst


• FTIR: Espectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier:

- Interferograma(intensidades vs tiempo)

- Espectro IR (intensidad vs frecuencia)

- Información estructural: estructura secundaria

Transformada de Fourier


• Permite el estudio de moléculas identificando sus grupos funcionales

• El grupo más característico y numeroso de las proteínas es el amida

• Modos de vibración del grupo amida:

• Aplicaciones: mediciones, control de calidad, mediciones dinámicas, cambios en el carácter o la cantidad de un enlace particular…

- Vibración NH (amida A)- Vibración amida I (enlace C=O): Correlación frecuencia – estructura - Vibración amida II- Otros: vibraciones amida (III, IV, V, VI y VII), estiramientos (NC, CN y CC) y las deformaciones (CCN y CNC)


• Sólo determina la estructura secundaria

•No hay consenso en el límite de las bandas

Funcionamiento de un microscopio electrònico:

1. Generación del haz de electrones por un cañón electrónico [2].

2. Los electrones [3] viajan en el vacío, y son acelerados por un alto voltaje y focalizado por medio de lentes magnéticas.

3. Los electrones atraviesan la muestra [7].4. Un conjunto de lentes magnéticas amplifican la señal

resultante y forman una imagen sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones.

5. Captamos la imagen con un ordenador, con el que se le puede dar color (ya que la imagen obtenida es en blanco y negro).

La microscopía electrónica utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imagenes microscópicas.

Microscopía electrónica

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/6e/Elektronenmikroskop.jpg

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/03/Electron_microscope.svg

Tinción negativa Criomicroscopía

Proteína

Capa de carbón

Haz de electrones

Haz de electrones

Proteína

Imagen final

Imagen final

La proteína se congela en nitrógeno líquido

Soporte de carbono

Los electrones que inciden sobre la sal del átomo pesado sufren una mayor dispersión y generan un fondo oscuro, mientras que los que atraviesan la proteína generan una imagen brillante

Los electrones que inciden sobre la proteína sufren más dispersión y generan una imagen oscura

Microscopía electrónica

•Necesidad de software para reconstrucción tridimensional.

Cristalografía de Rayos X

El haz escinde en diferentes direcciones por la simetría de los átomos y por el fenómeno de difracción

Incidencia de un haz de rayos X a través de un cristal (contiene la proteína en estudio)

Los rayos X son difractados por los electrones de las moléculas de proteína cristalizada (patrón de difracción)

La posición e intensidad de cada punto está determinada por las fases de las ondas que forma cada punto (mapa de densidad electrónica)

Construcción de modelo de proteína

RMN

Basado en propiedades mecánico-cuánticas de protones o neutrones: Spin

Aplicación de un campo magnético alterno perturbación del spin

Desaparición del campo posición inicial de spins

Cambio de estados liberación energética captada por receptor

Análisis computacional

Imagen

CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X

RMN

Ventajas Alta resolución a nivel atómico ( estructura de la

proteína a partir de la densidad electrónica )

La proteína se estudia suspendida en su medio

natural

Sin límite de tamaño molecular

Permite obtener información dinámica:

unión de ligandos y cambios de estructura

Inconvenientes Se necesita un monocristal(la cristalización puede generar distorsiones )

Limitación de tamaño (límite de 40kDa)

La proteína se encuentra fuera de su medio natural

Estructura poco definida

Cristalografía Rayos X vs RMN

Métodos

Tormenta citoquinas


HIPÓTESIS

Objetivo: Comparar la cantidad de CD28 en humanos y en macacos.

Numerosos estudios desmienten una concentración diferencial del receptor similar o igual

Hipótesis 1: Diferente concentración de CD28humano/macaco

Schraven B, Kalinke U. CD28 Superagonists: What Makes the Difference in Humans? Cell Press Immunity 2008.

Tormenta citoquinas


HIPÓTESIS

Diferente CD28

ObjetivoSaber si TGN1412 se une a una región distinta del CD28 o con distinta afinidad en las dos especies.

Métodos1. Comparación secuencias CD28 humano/CD28 macaco: clustalW

Department of Medicine, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina 27710, USA. The calm after the cytokine storm: lessons from the TGN1412 trial. J ClinInvest. 2008 Jun;118(6):2365.

Hipótesis 2: Diferencia entre CD28 humano/CD28 macaco

2. Localización y visualización en el modelo de las mutaciones en el receptor (VMD):- lugar de interacción?

3. Análisis de las energías de interacción: EBI-PISA

No Descartar hipótesis

Sí Modelaje CD28macaco - TGN1412

Comparación con CD28humano-TGN1412


Secuencias distintas de CD28 de macaco en SwissProt y en el artículo estudiado

PROBLEMA!!!



Mutaciones en la región transmembrana.

Tormenta citoquinas


HIPÓTESIS

Diferente CD28

Diferente CTLA4

Búsqueda de proteínas homólogas de CD28 con PSI-BLAST.

• TGN1412 se podría unir a CTLA-4

• Miramos unión del TGN1412 a CTLA-4 de las diferentes especies

Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4

¿Por qué es interesante mirar la unión a CTLA4?

• Es un inhibidor de la activación de

las células T

•Diferencias en la unión TGN1412-

CTLA-4 en diferentes especies podría

dar diferente nivel de inhibición


Objetivos

1. Averiguar si el TGN1412 se puede unir al CTLA-4

Métodos

2. Generación del modelo TGN1412-CTLA4 a partir del modelo de TGN1412-CD28

3. Comparación de la unión TGN1412-CTLA4 en humano con la unión TGN1412-

CD28 en humano

4. Comparación de la unión TGN1412-CTLA4 en macaco con la unión TGN1412-

CTLA4 en humano


ClustalW CD28humano – CTLA-4humano

CTLA-4 humanoCD28 humano

Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CD28 humano

CD28h + 5.11A1 (molde)

CD28h + TGN1412

CD28h + TGN1412 (molde)

CTLA4h + TGN1412

CTLA-4 humano – TGN1412CD28 humano – TGN1412


Átomo cadena Ligera Distancia (A) Átomo

CD28

1 TRP 32 [NE1] 3.12 ASP 494 [O]

2 GLN 92 [NE2] 3.53 ASP 495 [O]

Átomo cadena Pesada Distancia (A) Átomo CD28

1 THR 244 [OG1] 3.82 MET 531 [O]

2 SER 245 [OG ] 3.46 GLU 464 [OE2]

3 TYR 315 [OH] 2.57 GLU 529 [OE1]

4 TYR 315 [OH] 3.86 TYR 536 [OH]

5 ASP 318 [N] 3.64 TYR 493 [OH]

6 TYR 315 [O] 3.27 ARG 466 [NE]

7 GLY 316 [O] 3.63 ARG 466 [NE]

8 GLY 316 [O] 2.62 TYR 493 [OH]

9 ASP 318 [O] 3.17 LYS 495 [NZ]

CD28 humano – TGN1412

Átomo cadena Pesada

Distancia (A)

Átomo CD28

1 SER 245[ OG ] 3.13 GLU 463 [OE1]

2 SER 245[ OG ] 3.14 GLU 463 [OE2]

3 HIS 314[ NE2] 3.71 GLU 463 [OE2]

4 TYR 315[ OH ] 2.60 GLU 527 [OE2]

5 THR 244 [OG1] 3.78 MET 529 [O]

6 GLY 316 [O] 2.73 ARG 465 [NE]

7 TYR 315 [O] 2.85 ARG 465 [NE]

Átomo cadena Ligera

Distancia(A)

ÁtomoCD28

1 TRP 32 [NE1] 3.18 ASP 494 [O]

CTLA-4 humano – TGN1412


Residuo cadena Pesada

1 GLY 268

2 GLY 316

3 LEU 317

4 TRP 319

ResiduoCD28

1 VAL 481

2 PRO 533

3 PRO 534

4 GLY 497

Residuo Cadena ligera

1 TRP 32

2 GLY 91

I. hidrofóbicas


E.iónicos Átomo cadena pesada

Distancia(A)

ÁtomoCTLA4h

1 B:HIS 314[ NE2] 3.71 C:GLU 463[ OE2]

Residuo cadena Pesada

1 THR 242

2 THR 244

3 GLY 268

4 GLY 316

5 LEU 317

6 TRP 319

Átomo CTLA4h

1 MET 485

2 LEU 493

3 MET 529

4 PRO 532

5 ILE 497

Átomo cadena ligera

1 TRP 32

2 GLY 91

I. hidrofóbicas

CTLA-4 humano – TGN1412


CD28 humano – TGN1412 CTLA-4 humano – TGN1412

INTERACCIÓN Área de interacción (A2)

Energía (Kcal/mol)

Cadena pesada

CD28humano 449.3 -4.0

CadenaLigera

CD28 humano 180.1 -0.8


Energía (Kcal/mol)

Cadena pesada

CTLA-4 macaco 434,9 -5,5

CadenaLigera


cadenapesada

cadenaligera


CTLA-4 humano

ClustalW CTLA-4 humano – CTLA-4 macaco

Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco

CTLA-4 macaco

CTLA4h + TGN1412 (molde)

CTLA4m + TGN1412

CD28h + TGN1412 (molde)

CTLA4h + TGN1412

CTLA-4 humano – TGN1412 CTLA-4 macaco – TGN1412



Distancia (A)

Átomo CTLA-4

1 SER 245[ OG ] 3.13 GLU 463 [OE1]

2 SER 245[ OG ] 3.14 GLU 463 [OE2]

3 HIS 314[ NE2] 3.71 GLU 463 [OE2]

4 TYR 315[ OH ] 2.60 GLU 527 [OE2]

5 THR 244 [OG1] 3.78 MET 529 [O]

6 GLY 316 [O] 2.73 ARG 465 [NE]

7 TYR 315 [O] 2.85 ARG 465 [NE]


Distancia(A)

ÁtomoCTLA-4

1 TRP 32 [NE1] 3.18 ASP 494 [O]


Distancia (A)

Átomo CTLA-4

1 SER 245 [OG] 2.94 C:GLU 463[ OE1]

2 HIS 314 [NE2] 3.56 C:GLU 463[ OE2]

3 TYR 315 [OH] 3.03 C:GLU 527[ OE2]

4 THR 244[ OG1] 3.86 C:MET 529[ O ]

5 GLY 316[ O ] 3.36 C:ARG 465[ NH1]

6 TYR 247[ OH ] 3.62 C:ARG 465[ NH2]

Átomo cadenaligera

Distancia(A)

ÁtomoCTLA-4

1 TRP 32 [NE1] 3.12 ASP 494[O]

2 GLN 92 [ NE2 3.53 ASP 495[ O]

CTLA-4 humano – TGN1412 CTLA-4 macaco – TGN1412


CTLA-4 Humano – TGN1412

E.iónicos Átomo cadena pesada Distancia(A) ÁtomoCTLA4h

1 HIS 314[ NE2] 3.71 GLU 463[ OE2]

Átomo cadena pesada

1 THR 242

2 THR 244

3 GLY 268

4 GLY 316

5 LEU 317

6 TRP 319

Átomo CTLA4h

1 MET 485

2 LEU 493

3 MET 529

4 PRO 532

5 ILE 497 Átomo cadena ligera

1 TRP 32

2 GLY 91


1 GLY 268

2 GLY 316

3 TRP 319

Átomo CTLA4m

1 ALA 481

2 MET 485

3 LEU 493

4 ILE 497

5 MET 529

6 PRO 532


1 TRP 32

2 GLY 91

E.iónicos Átomo cadena esada Distancia(A) ÁtomoCTLA4m

1 B:HIS 314[ NE2] 3.56 C:GLU 463[ OE2]

CTLA- 4- Macaco – TGN1412

Interacciones hidrofóbicas Interacciones hidrofóbicas


CTLA4humano – TGN1412 CTLA4 macaco – TGN1412

cadenaligera

cadenapesada


Energía (Kcal/mol)

Cadena pesada

CTLA-4 humano 433,4 -6,4

CadenaLigera

CTLA-4 humano 170,6 -1,6


Energía (Kcal/mol)

Cadena pesada


CadenaLigera



Tormenta citoquinas


HIPÓTESIS

Diferente CD28

Diferente CTLA-4

Homólogos remotos

Mediante ModLink: búsqueda de homólogos remotos de TGN1412

Prot X

TGN1412

TGN1412 Diana Y Diana Y

Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor IX de coagulación?

Interleuquinas Interleuquinas

10C12 - Factor de

coagulación IX humano

BO2C11 – Factor VIII de

Coagulación humano


IL-2 IL-6 (Cytokine storm) 10C12Interactúa

TGN1412podría

interactuar

factor IX

??HIPÓTESIS

El TGN1412 podría activar la vía intrínseca de coagulación y

activar la trombina


10C12 + factor IX (molde)

TGN1412 + factor IX

10C12 con Factor de coagulación IX humano TGN1412 con Factor de coagulación IX humano


CDR del modelo TGN1412 con Factor de coagulación IX humano

CDR1

CDR2

CDR3


Ligera

CDR110C12 S G S T S N I G N N Y V S

TGN14 H A S Q N I Y - - V W L N

CDR210C12 D V S K R P STGN14 K A S N L H T

CDR310C12 A A W D D S L S E F L

TGN1412 Q Q G - - Q T Y P Y T

Pesada

CDR110C12 T Y A M H

TGN14 S Y Y I H

CDR210C12 I I S Y D G S K K Y Y A D S V K G

TGN14 C I Y P G N V N T N Y N E K F K D

CDR3

10C12 A S I A A A R V L D Y

TGN14 S H Y G L D W N F D V


IL-2 IL-6 (Cytokine storm)BO2C11Interactúa

TGN1412 podría interactuar

factor VIII

??HIPÓTESIS

El TGN1412 podría activar la vía extrínseca de coagulación y activar la trombina

Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación HUMANO?

BO2C11 + factor VIIIh (molde)TGN1412 + factor VIIIh

BO2C11 – Factor de coagulación VIII humano


TGN1412 -Factor de coagulación VIII humano

Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación?

CDR del modelo TGN1412 con Factor de coagulación VIII humano

CDR1

CDR2

CDR3


CDR1BO2C11 G Y T L T E L P V

TGN1412 G Y T F T S Y Y I

BO2C11 G S F D P E S G E S I Y A R E F Q G STGN1412 G C I Y P G N V N T N Y N E K F K D R

CDR2

BO2C11 C A V P D P - - D - A F D ITGN1412 C T R S H Y G L D W N F D V

CDR3

CDR1BO2C11 R A S Q S F S S S Y L

TGN1412 H A S Q N I Y - V W L

BO2C11 Y G A S T RTGN1412 Y K A S N L

CDR2

BO2C11 C Q K Y G T S ATGN1412 C Q Q G Q T Y P

CDR3

Cadena Pesada: Cadena Ligera:


“Epitope mapping using fragments of the factor VIII C2 domain indicated that BO2C11 does not recognize a linear epitope corresponding to a single stretch of

amino acid residues.30 Rather, it interacts with a conformational epitope composed of side chains from various regions within the C2 sequence that are

adjacent to each other in the folded protein”.

ENLACES HIDRÓGENO


Distancia (A)

ÁtomoFactor VIII

TRP 319[ N ] 2.75 ASN 457[ OD1]

THR 244[ O ] 3.41 ARG 474[ NH2]

GLY 316[ O ] 2.65 ARG 479[ NH2]

ASP 318[ OD1] 3.26 ARG 479[ NH2]

TYR 315[ OH ] 3.49 GLN 575[ N ]

TYR 315[ OH ] 2.70 GLN 575[ NE2]


Distancia (A)

ÁtomoFactor VIII

THR 93[ OG1] 3.74 THR 456[ OG1]

TRP 32[ NE1] 3.78 THR 456[ O ]

THR 93[ OG1] 3.39 ASN 457[ O ]



1 B:VAL 216

2 B:GLY 240

3 B:ILE 265

4 B:GLY 316

5 B:LEU 317

6 B:VAL 323

Átomo Factor VIII

1 C:PHE 455

2 C:MET 458

3 C:PHE 459

4 C:ALA 460

5 C:GLY 473

6 C:VAL 482

7 C:LEU 510

8 C:LEU 511

9 C:MET 514


1 A:VAL 31

2 A:LEU 54

3 A:GLY 91

4 A:PRO 95

HIDROFÓBICOS


Distancia (A)

ÁtomoFactor VIII

B:ASP 318[ OD1] 3.26 C:ARG 479[ NH2]


IÓNICOS



Energía (Kcal/mol)

Cadena pesada

CD28humano 449.3 -4.0

Cadena Ligera

CD28 humano 180.1 -0.8


Energía (Kcal/mol)

Cadena pesada

Factor VIIIhumano 786.5 -10.3

Cadena Ligera


Factor VIII humano – TGN1412

Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación?

Cadena Pesada

Cadena Ligera

TGN1412 - Factor coagulación VIII humano

TGN1412+ factor VIII humano (molde)TGN1412 + factor VIII ratón

Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación de RATÓN?

TGN1412 - Factor coagulación VIII ratón


ENLACES HIDRÓGENO


Distancia (A)

ÁtomoFactor VIII ratón

1 HIS 314[ ND1] 3.82 THR 512[ OG1]

2 TYR 247[ OH ] 3.58 ASN 457[ ND2]

3 TYR 266[ OH ] 2.98 ARG 474[ NE ]

4 SER 245[ O ] 3.02 ARG 474[ NH2]

5 GLY 316[ O ] 2.79 ARG 479[ NH1]

6 ASP 318[ OD1] 3.79 ARG 479[ NH2]

7 TYR 246[ OH ] 3.80 LEU 510[ N ]

8 TYR 315[ OH ] 3.47 GLN 575[ N ]

9 TYR 315[ OH ] 2.70 GLN 575[ NE2]


Distancia (A)

ÁtomoFactor VIII ratón

1 LYS 50[ NZ ] 3.58 GLN 481[ O ]


Átomo cadena pesada

Distancia(A)

ÁtomoFactor VIII

1 B:ASP 318[ OD1] 3.79 C:ARG 479[ NH2]


1 TRP 261

2 ILE 265

3 GLY 316

4 LEU 317

5 TRP 319

ÁtomoFactor VIII

1 MET 485

2 TRP 572

3 PHE 455

4 MET 458

5 PHE 459

6 TRP 462

7 GLY 473

8 LEU 510

9 PHE 511

10 MET 514


1 TRP 32

2 LEU 54

3 GLY 91

4 PRO 95

Factor VIII ratón – TGN1412


Energía (Kcal/mol)

Cadena pesada

Factor VIIIratón 763.1 -11.3

CadenaLigera

Factor VIIIratón 444.8 -3.2


Energía (Kcal/mol)

Cadena pesada


CadenaLigera


Factor VIII humano – TGN1412


Cadena Pesada

Cadena Ligera

Tormenta citoquinas


HIPÓTESIS

Diferente CD28

Diferente CTLA-4

Homólogos remotos

CD33

CD33: lectina tipo inmunoglobulina receptora de ácido siálico (Siglec)

Inhibe activación celular mediante vías ITIM (Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif)

– Células T macaco: alta cantidad de moléculas CD33

– Células T humanas: CD33 casi indetectable

ITIM

Hipótesis 5: Unión TGN1412 a CD33

ObjetivoEstudiar la posibilidad que TGN1412 se una a CD33 y se de una inhibición diferente enhumano y macaco.

Métodos

1. Estudio del docking de TGN1412 con CD33 con PyDock• Análisis de la zona de interacción• Análisis energético del docking

2. Estudio del docking de TGN1412 con CD28 con PyDock• Análisis de la zona de interacción• Análisis energético del docking

3. Comparación de ambas posibles uniones


Conf Ele Desol VDW Total Rank371 -6.107 -10.038 48.160 -11.328 1123 -10.542 -10.308 103.232 -10.527 2

386 -25.431 -3.065 189.127 -9.583 3

96 -21.999 2.408 104.411 -9.150 4

410 -10.925 -3.009 58.017 -8.133 5

Conf Ele Desol VDW Total Rank

375 -21.334 -3.191 74.247 -17.101 1436 -12.536 -3.681 14.179 -14.799 2389 -13.415 -11.770 108.398 -14.345 3

48 -20.658 -6.228 135.418 -13.344 4307 -17.842 -5.347 100.475 -13.142 5

TGN1412

CD33

TGN1412CD28

Energía TGN1412 – CD28 Energía TGN1412 – CD33


Tormenta citoquinas


HIPÓTESIS

Diferente CD28

Diferente CTLA-4

Homólogos remotos

CD33

Agregación de TGN1412

ObjetivoEstudiar la posibilidad que TGN1412 forme agregados con él mismo y precipite

Métodos

Estudio del docking de las diferentes cadenas del TGN1412 con PyDock:

1. Cadenas ligera-ligera2. Cadenas pesada-pesada 3. Cadenas pesada-ligera

Hipótesis 6: Agregación de TGN1412

IL-12 IL-6IL- 1

IFN-γ IL-18

Hipótesis 6: Agregación de TGN1412Respuesta Inmunitaria: Papel de celulas T , citoquinas, macrogafo, interleuquinas

AGREGACIÓN

Activación de la respuesta Inmunitaria:

células T, neutrófilos, macrógafos

Hipótesis 6: Agregación de TGN1412Agregación ligera-ligera /pesada-pesada/Ligera-pesada

Ligera-ligera

Pesada-pesada

Conf Ele96 Desolv VdW TOTAL Rank

51 6.275 -46.954 133.023 -27.377 1

389 -20.828 -15.414 121.636 -24.078 2

44 -9.586 -18.478 76.122 -20.452 3

17 -35.099 9.155 60.731 -19.907 4

96 -16.472 -14.478 118.688 -19.082 5

Conf Ele96 Desolv VdW TOTAL Rank

157 -6.127 -47.607 113.992 -42.335 1

277 -4.600 -41.685 47.053 -41.580 2

129 -8.570 -43.797 164.117 -35.955 3

28 -12.446 -37.274 154.795 -34.241 4

49 -11.884 -39.551 194.001 -32.035 5

Ligera-pesada

Conf Ele Desolv VdW TOTAL RANK

5 -4.220 -66.309 130.396 -57.489 1

170 -22.762 -52.977 209.062 -54.832 2

149 -9.269 -47.714 101.505 -46.833 3

1 -7.15 -58.709 260.565 -40.368 4

20 -8.751 -39.969 83.969 -40.323 5

Hipótesis 6: Agregación de TGN1412STAMP de ligera - pesada/Fab cristalizada

Hipótesis 3: Agregación de IgGsSuperfície de interacción del TGN1412

Residuos HC

Gln 253

Leu 259

Phe 309

Asn 320

Phe 321

Trp 324

Gly 325

Val 384

Thr 386

Residuos LC

Gln 38

Pro 44

Tyr 87

Thr 97

Phe 98

Gly 99

Residuos HC

Leu 34

Gln 39

Gly 42

Ser 163

Residuos LC

His 168

Phe 170

TOTAL

-57.489

-54.832

-46.833

-40.368

-40.323

TOTAL

-27.377

-24.078

-20.452

-19.907

-19.082

TOTAL

-42.335

-41.580

-35.955

-34.241

-32.035

Ligera-pesadaLigera-ligera Pesada-pesada Ligera-pesada Fab orig.

TOTAL

-43.933

-33.541

-23.512

-21.604

-20.784

Hipótesis 6: Agregación de TGN1412Agregación ligera-ligera /pesada-pesada/Ligera-pesada/Fab cristalizada

Hipótesis 3: Agregación de IgGs

¿Como podemos justificarla tormenta de citoquinas en humanos a partir de la

precipitación de TGN1412?

TOTAL

-11.328

-10.527

-9.583

-9.150

-8.133

TOTAL

-57.489

-54.832

-46.833

-40.368

-40.323

TOTAL

-27.377

-24.078

-20.452

-19.907

-19.082

TOTAL

-42.335

-41.580

-35.955

-34.241

-32.035

Ligera-pesada

Ligera-ligera

Pesada-pesada

CD33

TGN1412

Hipótesis 6: Agregación de TGN1412Comparación de energías de agregación respecto a la interacción con CD33

Tormenta citoquinas


HIPÓTESIS

Diferente CD28

Diferente CTLA-4

Homólogos remotos

CD33


Otras hipótesis

Otras hipótesis

• Homólogos remotos 1FYH (IFNγ-Rc complex)– Literatura:

» El Rc del IFNγ tiene ↑% láminas β (como el CD28). » Enfermos de SARS que sufrieron tormenta de citoquinas tenían ↑[IFNγ ]» Hipótesis: el TGN1412 se une al Rc de IFNγ y simula la tormenta de

citoquinas

• Activación del complemento por la Fc del TGN1412– Visilizumab fármaco inmunosupresor con la región constante mutada para

evitar unión a FcR. Tratamiento de Colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn.

Tormenta citoquinas


HIPÓTESIS

Diferente CD28

Diferente CTLA-4

Homólogos remotos

CD33


Otras hipótesis

1. Búsqueda de proteínas homólogas 1.1. source /cursos/BE/programari/bashrc_aules 1.2. Búsqueda en Swissprot con Psiblast proteínas homólogas (para generar PSSM): * blastpgp -i target.fa-d /cursos/BE/databases/blastdat/sprot.fas -j 10 –C target_pssm.sport -o target_sprot10.out 1.3. Aplicar la matriz de pesos obtenida para buscar en PDB: * blastpgp -i target.fa -d /cursos/BE/databases/blastdat/pdb_seq -j 1 -R target_pssm.sprot-o

target_pdb1.out

2. Escoger homólogos (en función E-value y resolución)3. Generar multifasta de homólogos incluyendo nuestra proteína * FetchFasta.pl -i homologos.dat -o homologos.fa -d /cursos/BE/databases/blastdat/sprot.fas * cat target.fa>>homologos.fa

BÚSQUEDA DE PROTEÍNAS HOMÓLOGAS: PSI - BLAST

* clustalw homologos.faALINEAMIENTOS POR SECUENCIA: CLUSTALW

* hmmbuild moldes.hmm moldes.aln * hmmcalibrate moldes.hmm * hmmalign moldes.hmm todas.fa> moldes_hmmer.aln

ALINEAMIENTOS POR ESTRUCTURA: HMMER

Programas y comandas utilizados

MODELLER MULTI-CHAIN

1. Separar las cadenas (PDBtoSplitChain)

2. Alinear cada una de las cadenas (clustalW)

3. Generar fichero .pir Una vez alineadas las cadenas, incluirlas en el .pir. Cada cadena debe estar separada con /. En la

cabecera hay que indicar: nº primer residuo: nombre primera cadena: número de último residuo de última cadena: nombre última cadena.

4. Generar fichero .faHay que generar un fichero fasta que incluya todas las cadenas que hay en el pdb

5. Generar fichero .pyPoner nombre de fichero .pir; poner nombre del pdb; poner nombre de la secuencia fasta

6. Ejecutar el modeller: mod9v7 prueba.py



STAMP

1. Crear archivo .domains (moldes.domains), donde pondremos las cadenas de los pdbs que nos interesan para el stamp.2. Hacer el stamp: stamp–l moldes.domains-rough -n 2 –prefix moldes >moldes.out

Se nos generan archivos moldes.1, moldes.2 .... Y el moldes.out, que nos explicará cómo ha agrupado los pdbs con sus RMSD correspondientes.

3. Convertimos el formato de alineamiento del archivo moldes.x que nos interese (1, 2, 3…) a un formato clustalW: aconvert-in b -out c <moldes.x>moldes_x.aln 4. Creamos un fichero .pdb a partir de nuestro alineamiento estructural:transform -f moldes.x -g -o moldes_stamp.pdb 5.Mirarlo con rasmol rasmolmoldes_stamp.pdb

PROSA

Shell prosaRead pdb ejemplo1.pdb obj1Read pdb ejemplo2.pdb obj2Analyse energy * plot

winsize * 30 Color * obj1 redColor * obj2 blue plot


Programas y comandas

PYDOCK

$ pydock T26 setup

Un fichero que contenga:

#!/bin/bash#$ -S /bin/bash#$ -q llicen.q#$ -o /homes/users/adminBE/test/work/send.o#$ -e /homes/users/adminBE/test/work/send.ecd /homes/users/adminBE/test/worksource /cursos/BE/programari/bashrc_lukepydock T26 zdockpydock T26 rotzdockpydock T26 dockserpydock T26 patch

$ qsub <fichero>$ qstat

adminBE@luke:~/test/work> pydockFor batch use: pydock -file <scriptfile> or pydock <dockname> <module>PyDock loaded... Now you can run pyDock commands interactively...>>> import pyDockMakePDB>>> pyDockMakePDB.main("T26",3,3)Reading pdb files...Conformation 3 done

Para crear PDB

Modlink http://sbi.imim.es/modlink/

Introducir la secuencia de la proteína problema

Analizar los resultados que nos da el programa


EBI PISA (http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver)

Introducir el código pdb.

Analizar las interacciones y la energía

http://sbi.imim.es/modlink/

http://sbi.imim.es/modlink/

http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver

1. Referente al pydock:

a) Funciona sin necesidad de introducir la comanda: $ pydock (fichero.ini) setupb) En el fichero .ene podemos ver las energías de dockingc) Las dos anteriores son correctasd) Resulta imposible generar un PDB del dockinge) Todas las anteriores son correctas

2. Referente a los aminoácidos:

f) La valina, la leucina i la alanina son aminoácidos hidrofóbicosg) La arginina y la lisina son aminoácidos cargadosh) Las dos anteriores son correctasi) La treonina i la serina son aminoácidos polaresj) Todas las anteriores son correctas

PEM

3. Respecto a los programas de visualización de proteínas:

a) Con Rasmolpodemos marcar enlaces de hidrógenob) Con VMD podemos marcar un aminoácido concretoc) Las dos anteriores son correctasd) Con VMD calculamos energías de dockinge) Todas las anteriores son falsas

4. El TGN1412:

f) Es un fármaco diseñado para el tratamiento de la artritis reumatoideg) Es una molécula con plegamiento de tipo todo-betah) Las dos anteriores son correctasi) Es un fármaco que ya está en el mercadoj) Todas las anteriores son correctas

PEM

5. Marca las afirmaciones correctas:

1. La RMN te permite determinar la estructura terciaria de la proteína2. La microscopía electrónica te genera imágenes en tres dimensiones3. El dicroísmo circular sólo te permite ver la estructura secundaria de la molécula

4. Los rayos X te permiten determinar la estructura de la proteína en solución

a) 1, 2 y 3b) 2 y 4c) 1 y 3d) 1, 2, 3, 4e) 4

6. Señala la opción correcta:

f) STAMP nos permite hacer alineamiento por estructurag) Con ClustalW podemos hacer alineamientos por secuenciah) Las dos anteriores son correctasi) Modeller necesita un alineamiento tipo.pir para actuarj) Todas las anteriores son correctas

PEM

7. Señala la respuesta correcta con respecto al Modlink:

a. Se usa para encontrar los homólogos más cercanos de una proteínab. El mejor resultado es el que tiene E-value de mayor valorc. Se usa para encontrar homologías lejanasd. Es útil para visualizar proteínase. Se usa para unir (link) varios modelos (Mod) en un solo PDB

8. Señala las respuestas correctas:

f. La ley de Lambert-Beer sirve para determinar la energía de enlaceg. En el interior de una proteína predominan los residuos hidrofóbicosh. El efecto hidrofóbico se rige por la ley de Coulombi. La energía de Van der Waals favorece que se superpongan los átomosj. Todas las anteriores son falsas

PEM

9. Señala las moléculas que pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas:

a. TGN1412b. CTLA4c. Las dos anterioresd. CD28e. Todas las anteriores

10. Sobre las bases de datos:

f. Swissprot contiene secuencias de proteínasg. Con PDB podemos obtener estructuras 3D de proteínash. Las dos anteriores son correctasi. Con SCOP no podemos obtener información estructural sobre familias proteicasj. Todas las anteriores son ciertas

PEM

abp 34-36 “aprendiendo del estudio clínico del tgn1412” grupo a curso 09-10

Documents