รายงานผลการวจย

เร�อง

การปรบปรงพนธขาวเหนยวหอมจากขาวเจาดวยวธผสมกลบโดยใช

เคร�องหมายโมเลกลชวยในการคดเลอก

Improvement of Aromatic Glutinous Rice from Non-glutinous Rice by

Using Marker-assisted Backcrossing

โดย

วราภรณ แสงทอง และคณะ

มหาวทยาลยแมโจ 2554

รหสโครงการวจย มจ. 1-54-04

รายงานผลการวจย

เร�อง การปรบปรงพนธขาวเหนยวหอมจากขาวเจาดวยวธผสมกลบโดยใชเคร�องหมาย

โมเลกลชวยในการคดเลอก

Improvement of Aromatic Glutinous Rice from Non-glutinous Rice by

Using Marker-assisted Backcrossing

ไดรบการจดสรรงบประมาณวจย ประจาป 2554

จานวน 341,600 บาท

หวหนาโครงการ วราภรณ แสงทอง

ผรวมโครงการ ประวตร พทธานนท

สภกตร ปญญา

งานวจยเสรจส�นสมบรณ

30 / 7 / 2555

คานยม

ขอขอบพระคณสานกวจย และสงเสรมวชาการการเกษตร มหาวทยาลยแมโจท�ใหทนวจย

แกคณะผวจยในการทาการวจยในปงบประมาณ 2554 และกรมการขาวท�มอบเมลดพนธขาวเพ�อ

นามาใชในโครงการวจย จนโครงการวจยน�ประสบผลสาเรจอยางดย�ง

ก

สารบญ

หนา

สารบญตาราง ข

สารบญภาพ ค

บทคดยอ 1

ABSTRACT 2

คานา 3

วตถประสงค 5

การตรวจเอกสาร 6

อปกรณ และวธการ 13

ผลการวจย 19

สรปผลการวจย 22

เอกสารอางอง 23

ข

สารบญตาราง

หนา

ตารางท� 1 แสดงระยะเวลาท�ใชในการปรบปรงพนธขาวเหนยวของประเทศไทย 4

ตารางท� 2 แสดงจานวนตาแหนงของ background marker 20

ค

สารบญภาพ

หนา

ภาพท� 1 ภาพถายเจลภายใตแสง UV ของลกษณะของแถบดเอนเอท�เกดข�นจากการใช

เคร�องหมายโมเลกล Glu-23 ตรวจสอบยโนไทปของตนขาว (M) คอแถบดเอนเอ

มาตรฐาน 100 bp ladder (1) ตนขาวเหนยวพนธ กข 6 ท�มยโนไทปเปน wxwx

(2) ตนขาว F1 ท�มยโนไทปเปน Wxwx และ (3) ตนขาวเจาพนธขาวดอกมะล

105 ท�มยโนไทปเปน WxWx

7

ภาพท� 2 ลกษณะเมลดขาวสารของพนธขาวในโครงการปรบปรงพนธขาวเจาพนธ ขาว

ดอกมะล 105 ใหเปนขาวเหนยวดวยวธผสมกลบโดยใชเคร�องหมายโมเลกล

ชวยในการคดเลอก (a) ขาวเจาพนธ ขาวดอกมะล 105 และ (b) ขาวเหนยวพนธ

กข 6 ท�ใชในการปรบปรงพนธ สวน (c) สายพนธขาวเจา (WxWx) และ (d)

สายพนธขาวเหนยว (wxwx) ท�ไดจากการปรบปรงพนธ

7

ภาพท� 3 แสดงขนาดแถบดเอนเอภายใตแสง UV เพ�อเปรยบเทยบแถบดเอนเอจาก

ผลผลต PCR เม�อใช ESP, IFAP, INSP และ EAPA ซ�งเปนเคร�องหมายโมเลกล

ยนหอมของขาว (fragrance gene) (Bradbury et al., 2005) เปนไพรเมอร และม

ดเอนเอแมพมพ คอ ดเอนเอของขาวพนธตางๆ ถาขาวพนธใดมอลลลหอม (fgr)

จะมแถบดเอนเอขนาด 257 bp แตถาขาวท�ไมมอลลล หอม (Fgr) จะไมมแถบด

เอนเอขนาด 257 bp โดยท� M คอแถบดเอนเอมาตรฐาน 100 bp ladder พบวา

เลนท� 1 คอแถบดเอนเอของขาวเหนยวพนธ กข 6, เลนท� 3 ขาวสายพนธ

BC3F1-51-501-6211, เลนท� 4 ขาวสายพนธ BC4F1-51-501-6211-2320, เลนท� 5

ขาวสายพนธ BC5F1-51-501-6211-2320-414, เลนท� 6 สายพนธ BC3F3-51-501-

6211-1955 (hd1hd1), เลนท� 7 ขาวสายพนธ BC3F3-51-501-6211-2008, เลนท�

8 ขาวสายพนธ BC3F1-84-448-7237 และเลนท� 11 ขาวเจาหอมพนธปทมธาน 1

มอลลลหอม (fgr) เพราะมแถบดเอนเอขนาด 257 bp แตเลนท� 2 คอขาวพนธ

Taichung 65 เลนท� 9 ขาวเหนยวพนธ กข 10 และเลนท� 10 ขาวเหนยวพนธสน

ปาตอง 1 ไมมอลลล หอม (fgr) จงไมมแถบดเอนเอขนาด 257 bp

9

การปรบปรงพนธขาวเหนยวหอมจากขาวเจาดวยวธผสมกลบโดยใชเคร�องหมายโมเลกล

ชวยในการคดเลอก

Improvement of Aromatic Glutinous Rice from Non-glutinous Rice

by Using Marker-assisted Backcrossing

วราภรณ แสงทอง1 ประวตร พทธานนท2 และสภกตร ปญญา2

Varaporn Sangtong1, Prawit Puddhanon2,and Supak Phanya2

1คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยแมโจ จ. เชยงใหม 50290

2ภาควชาพชไร คณะผลตกรรมการเกษตร มหาวทยาลยแมโจ จ. เชยงใหม 50290

1Faculty of Science, Maejo University, Chiang Mai 50290

2Agronomy Department, Faculty of Agricultural Production, Maejo University, Chiang Mai 50290

-----------------------------------------

บทคดยอ

ประเทศไทยมพ�นท�ปลกขาวท�งหมด 57 ลานไร เปนพ�นท�ปลกขาวเหนยว 18 ลานไรซ�งคด

เปน 31 % ของพ�นท�ปลกขาวท�งหมด. พนธขาวเหนยวไมไวตอชวงแสงตนเต� ยท�ชาวนานยมปลกม

เพยง 3 พนธ ไดแก ขาวเหนยวพนธ สนปาตอง 1 กข 10 และแพร 1, ในขณะท�ขาวเจาพนธดม

มากมาย. ดงน�นโครงการน� มวตถประสงคเพ�อนาขาวเจาพนธดจานวน 2 พนธ คอ ขาวเจาพนธ

ชยนาท 80 และ สพรรณบร 1ซ�งมผลผลตสง ตนเต�ย ไมไวตอชวงแสง ตานทานตอโรคและแมลงท�

สาคญของขาว มาเปนพนธรบ เพ�อปรบปรงพนธใหเปนขาวเหนยวหอมดวยวธผสมกลบโดยใช

เคร� องหมายโมเลกลชวยในการคดเลอกซ�งเปนการคดเลอกในระดบยโนไทปหรอยนทาใหการ

คดเลอกมความถกตอง แมนยา และชวยลดระยะเวลาในการปรบปรงพนธใหส�นลง. การทดลองเร�ม

จากในฤดแรกผลตเมลด F1 โดยผสมขาวเจาพนธสพรรณบร 1 และชยนาท 80 ซ�งใชเปนพนธรบ

กบขาวเหนยวพนธ กข 6 ซ�งใชเปนพนธรบ. ผลการทดลองพบวาผลตเมลด F1 ของคผสมระหวาง

ชยนาท 80 กบ กข6 ไดจานวน 19 เมลด สวนคผสมระหวาง สพรรณบร 1 กบ กข6 ไดจานวน 82

เมลด. ในฤดท� 2 ผลตเมลด BC1F1 ของคผสมขาวเจาชยนาท 80 กบขาวเหนยวพนธ กข6 ไดจานวน

57 เมลด และผลตเมลด BC1F1 ของคผสมขาวเจาพนธสพรรณบร 1 กบขาวเหนยวพนธ กข6 ได

จานวน 147 เมลด. นอกจากน� พบวา background markers จานวน 8 ตาแหนงท�สามารถแยกความ

2

แตกตางทางพนธกรรมระหวางขาวเจาพนธชยนาท 80 กบขาวเหนยวพนธ กข6 ได และ

background markers จานวน 7 ตาแหนงท�สามารถแสดงความแตกตางทางพนธกรรมระหวางขาว

เจาพนธสพรรณบร 1 กบขาวเหนยวพนธ กข6 ได

คาสาคญ : ขาวเหนยว, ขาวเจา, ผสมกลบ และเคร�องหมายโมเลกล

ABSTRACT

Thailand has about 57 million rais of land grown to rice, 18 million of which have been

planted to glutinous rice, comprising about 31% of the total area. There have only been about 3

rice varieties which farmers preferred to cultivate: Sanpatong 1, RD6 and Phrae 1 among the

many good varieties of non-glutinous rice varieties, This project aimed to use two good glutinous

rice varieties (Chainat 80 and Suphanburi 1) which are high yielding, dwarf, non-photoperiod

sensitive and high resistance to disease and pests which are considered important characteristics

of the rice plant as receiver plant in order to improve the rice varieties to become sweet glutinous

by molecular marker-assisted backcrossing to select genotypes or genes that would lead to proper

selection of recurrent parents and at the same time, reduce the time period of improvement. The

experiment was started initially with the production of F1 seeds by crossing Suphanburi 1 and

Chainat 80 which were used as donor parents with glutinous RD6 as recurrent parents. Results

showed that 19 F1 seeds were produced by the cross between Chainat 80 and RD 6 while 82 seeds

resulted from the cross between Suphanburi 1 and RD6. In the second planting season, 57 BC1F1

seeds resulted from the cross between non-glutinous Chainat 80 and glutinous RD6 while 147

seeds were produced from the cross between non-glutinous Suphanburi 1 and glutinous RD6.

Aside from these, results also showed that 8 background markers were located in loci positions

which could separate the genetic differences between non-glutinous Chainat 80 and glutinous

RD6 and 7 background markers which were able to show the genetic difference between non-

glutinous Suphanburi 1 and RD6.

Key words: glutinous rice, non-glutinous rice and molecular markers0

3

คานา (Introduction)

ประเทศไทยมพ�นท�ปลกขาวท�งหมด 57 ลานไร เปนพ�นท�ปลกขาวเจา 39 ลานไร คดเปน

69 % และเปนพ�นท�ปลกขาวเหนยว 18 ลานไร คดเปน 31 % ของพ�นท�ปลกขาวท�งหมด พนธขาว

เจาท�มพ�นท�ปลกมากท�สด คอ พนธขาวดอกมะล 105 เปนขาวไวแสงมพ�นท�ปลก 18 ลานไรคดเปน

31 % ของพ�นท�ปลกขาวท�งหมด นอกจากน� ยงมพนธขาวเจาพนธดจานวนมากท�มผลผลตสง ไมไว

ตอชวงแสงจงปลกไดท�งนาปและนาปรง มความตานทานตอโรค และแมลงศตรขาว เชน ขาวเจา

พนธ สพรรณบร 1, สพรรณบร 2, สพรรณบร 3, สพรรณบร 60, สพรรณบร 90, ปทมธาน 1,

ปทมธาน 60, ชยนาท 1, ชยนาท 80 และ กข 39 ฯ ซ�งพนธขาวเจาเหลาน� ไดรบการปรบปรงพนธ

และผานการทดสอบสายพนธตามหลกวชาการจากกรมการขาวมาเปนอยางด จงทาใหชาวนาท�

ปลกขาวเจามโอกาสท�จะเลอกพนธขาวเจาท�จะปลกใหเหมาะสมกบสภาพพ�นท�ของตนได สวน

พนธขาวเหนยวท�มพ�นท�ปลกมากท�สด คอ ขาวเหนยวพนธ กข 6 เปนขาวไวแสงมพ�นท�ปลก 15

ลานไร คดเปน 83 % ของพ�นท�ปลกขาวเหนยวท�งหมด และคดเปน 26 % ของพ�นท�ปลกขาว

ท�งหมดของประเทศ ขาวเหนยวท�มพ�นท�ปลกรองจากพนธ กข 6 คอ กข 10 เปนขาวเหนยวไมไว

แสงมพ�นท�ปลก 2 ลานไรซ�งคดเปน 11 % ของพ�นท�ปลกขาวเหนยวท�งหมด สวนขาวเหนยวพนธ

อ�นๆ มพ�นท�ปลกเพยงรอยละ 6 ของพ�นท�ปลกขาวเหนยวท�งหมด พนธขาวเหนยวอ�นๆ ไดแก ขาว

เหนยวสนปาตองเปนขาวไวแสง กข 8 เปนขาวไวแสง สวนขาวเหนยวแพร 1 และสนปาตอง 1

เปนพนธไมไวตอชวงแสง และพนธพ�นเมองเปนขาวไวตอชวงแสง (กรมวชาการเกษตร, 2546)

ชาวนาสวนใหญในเขตภาคเหนอ และภาคตะวนออกเฉยงเหนอจะปลกขาวเหนยวพนธ

กข 6 ไวเพ�อบรโภค เน�องจากเปนพนธขาวเหนยวท�ขาวสกออนนม และมกล�นหอม แตขาวเหนยว

พนธ กข 6 เปนขาวท�ไวตอชวงแสงจงปลกไดเฉพาะฤดนาปเทาน�นไมสามารถปลกในฤดนาปรงได

นอกจากน�ขาวเหนยวพนธ กข 6 ไมตานตอโรค และแมลงสวนใหญของขาว พนธขาวเหนยวท�ไม

ไวตอชวงแสงท�ชาวนานยมปลกไวขายมเพยง 3 พนธ ไดแก ขาวเหนยวพนธ สนปาตอง 1, กข 10

และแพร 1 ดงน�นชาวนาท�ปลกขาวเหนยวจงขาดแคลนพนธขาวเหนยวท�มผลผลตสง ไมไวตอชวง

แสง ตนเต�ย และมความตานทานตอโรคและแมลงของขาว

ในอดตมการปรบปรงพนธขาวเหนยวทาโดยการฉายรงส เชน นาเมลดขาวเจาพนธ ขาว

ดอกมะล 105 และ กข 1 มาฉายรงสเพ�อชกนาใหเกดการกลายพนธ และปลกคดเลอกจนไดขาว

เหนยวพนธด คอ กข 6 และ กข 10 ตามลาดบ ใชระยะเวลาในการปรบปรงพนธขาวเหนยวเหลาน�

พนธละ 12 ป จงจะไดขาวเหนยวพนธดออกมาสเกษตรกร สวนการปรบปรงพนธขาวเหนยวพนธ

4

แพร 1 และ สนปาตอง 1 ใชการปรบปรงแบบด�งเดม ใชเวลาปรบปรงพนธนานถง 19 และ 16 ป

ตามลาดบ ดงน�นการปรบปรงพนธขาวเหนยวแตละพนธใชเวลาเฉล�ย 15 ป (ตารางท� 1)

ตารางท� 1 แสดงระยะเวลาท�ใชในการปรบปรงพนธขาวเหนยวของประเทศไทย

ขาวเหนยวพนธ พ.ศ. ท�เร�มปรบปรง พ.ศ.ท�รบรองพนธ ร ะ ย ะ เ ว ล า ท� ใ ช ใ น ก า ร

ปรบปรงพนธ (ป)

กข 6 2508 2520 12

กข 10 2512 2524 12

แพร 1 2518 2537 19

สนปาตอง 1 2527 2543 16

เฉล�ย - - 15

แหลงท�มา กรมการขาว 2552

เน�องจากในปจบนการปรบปรงพนธขาวสามารถใชความรทางพนธศาสตรโมเลกล เชน

เคร�องหมายโมเลกล (molecular marker) มาชวยในการคดเลอก เปนการคดเลอกในระดบยโนไทป

หรอยน ไมใชคดเลอกฟโนไทปท�มผลจากสภาพแวดลอมเขามาเก�ยวของเหมอนการปรบปรงพนธ

อยางด�งเดม การใชเคร�องหมายโมเลกลมาชวยในการคดเลอกยโนไทปทาใหการคดเลอกมความ

แมนยา และถกตองมากย�งข�น รวมท�งยงเปนการชวยลดระยะเวลาในการปรบปรงพนธใหส�นลง

โครงการวจยน� “การปรบปรงขาวพนธเหนยวหอมจากขาวเจาดวยวธผสมกลบโดยใช

เคร�องหมายโมเลกลชวยในการคดเลอก” เลอกจะนาขาวเจาพนธดจานวน 2 พนธ คอ ขาวเจาพนธ

สพรรณบร 1 และชยนาท 80 มาปรบปรงพนธใหเปนขาวเหนยวหอมดวยวธผสมกลบโดยใช

เคร�องหมายโมเลกลมาชวยในการคดเลอก สาเหตท�เลอกขาวเจาพนธ สพรรณบร 1 และ ชยนาท 80

มาเปนพนธรบ เพ�อปรบปรงใหเปนขาวเหนยว เพราะขาวเจาท�ง 2 พนธมผลผลตสง ตนเต� ย ไมไว

ตอชวงแสง และมลกษณะท�สาคญอกอยางหน�ง คอ ตานทานตอโรคและแมลงท�สาคญของขาว ซ�ง

ลกษณะตานทานตอโรค และแมลงน� มความสาคญมาก เพราะการปรบปรงพนธในลกษณะน�ทาได

ยากตองใชระยะเวลานาน และในอนาคตปญหาโรคแมลงของขาวกจะกลายเปนปญหาสาคญของ

การปลกขาว นอกจากน�ขาวเจาพนธ ชยนาท 80 เปนขาวท�มอายส�นเพยง 99 วนเม�อปลกในฤดนา

ปรง ซ�งจะทาใหไดพนธขาวเหนยวท�มอายส�น ซ�งจะทาใหเกษตรกรสามารถปลกขาว หรอพชอ�น

ในนาไดมากคร� งย�งข�น เม�อพนธขาว สพรรณบร 1 และ ชยนาท 80 ถกปรบปรงพนธดวยวธผสม

5

กลบโดยใชเคร�องหมายโมเลกลชวยคดเลอก กจะยงคงลกษณะอ�นๆ ของพนธเดมไว ยกเวนเปล�ยน

จากขาวเจาไมหอม เปน ขาวเหนยวหอม

สาเหตท� เลอกวธปรบปรงพนธขาวเจาใหเปนขาวเหนยวหอมดวยวธผสมกลบ โดยใช

เคร�องหมายโมเลกลชวยในการคดเลอก เพราะวธน� จะทาใหไดสายพนธขาวเหนยวท�มพนธกรรม

ท�งหมดเหมอนกบพนธขาวเจาพนธเดม (สพรรณบร 1 และ ชยนาท 80) แสดงวายงคงรกษา

ลกษณะผลผลตสง ตานทานตอโรคและแมลงไว ยกเวนเปล�ยนเฉพาะยโนไทป WxWx FgrFgr ท�

มฟโนไทปเปนขาวเจาไมหอม กลายเปนขาวเหนยวหอมท�มยโนไทปเปน wxwx fgrfgr นอกจากน�

การใชเคร�องหมายโมเลกลชวยในการคดเลอกชวยยนระยะเวลาในการปรบปรงพนธขาวไดถง 3-7

ป ซ�งถาโครงการน�ประสบผลสาเรจจะเปนแนวทางใหมท�สามารถใชปรบปรงพนธขาวเหนยวพนธ

ดซ�งจะเปนประโยชนอยางมากตอชาวนาท�ปลกขาวเหนยว

วตถประสงคของโครงการวจย

1. สรางสายพนธขาวเหนยวหอมจานวน 2 สายพนธจากขาวเจาพนธด คอ พนธสพรรณบร

1 และชยนาท 80 ดวยวธผสมกลบโดยใชเคร�องหมายโมเลกลชวยคดเลอก

ขอบเขตของโครงการวจย

ขอบเขตการปรบปรงพนธขาวเจาพนธสพรรณบร 1 และชยนาท 80 ใหเปนขาวเหนยว

หอมดวยวธผสมกลบโดยใชเคร�องหมายโมเลกลชวยคดเลอก ทาโดยใชขาวเจาพนธสพรรณบร 1

และชยนาท 80 เปนพนธรบ (recurrent parent) และมพนธขาวเหนยวพนธ กข 6 เปนพนธให

(donor parent) อลลลดอย wx ท�ควบคมใหขาวเปนขาวเหนยว และ อลลลดอย fgr ท�ควบคมใหขาว

หอม target gene คอ อลลลดอย wx และอลลลดอย fgr เคร�องหมายโมเลกลท�ใชคดเลอก Wx/wx คอ

ไพรเมอร Glu-23 (Wanchana et al., 2003) เคร�องหมายโมเลกลท�ใชคดเลอก Fgr/fgr คอไพรเมอร

ESP, IFAP, INSP และ EAPA (Bradbury et. al., 2005) ซ�งไพรเมอรท�ง 2 ตาแหนงมเรยบรอยแลว

แตยงตองหา flanking marker 1 และ 2 ท�ขนาบอยท� ง 2 ขางของยน Wx/wx และ Fgr/fgr เพ�อ

ปองกนไมใหยนอ�นๆ ท�ไมตองการตดมากบ target gene และหา background marker เปนชนด

SSR marker อกประมาณ 60 ตาแหนง เฉล�ย 5 ตาแหนง/โครโมโซม เพ�อใชคดเลอกหาตน BCnFn ท�

มพนธกรรมเหมอนพนธรบมากท�สด ข�นตอนโดยยอเร�มจากการผลตเมลด F1 ระหวางขาวเจาพนธ

สพรรณบร 1 กบขาวเหนยวพนธ กข 6 และขาวเจาพนธชยนาท 1 กบขาวเหนยวพนธ กข 6 การ

คดเลอกตน F1 ผลตเมลด BC1F1 คดเลอกตน BC1F1 ดวยเคร�องหมายโมเลกล ผลตเมลด BC2F1

6

คดเลอกตน BC2F1 ดวยเคร�องหมายโมเลกล และ ผลตเมลด BC3F1 ซ�งในโครงการน� จะหยดลงใน

ข�นตอนน� และจะขอโครงตอจนทาสาเรจ

ทฤษฎ สมมตฐาน และกรอบแนวความคดของโครงการวจย

ลกษณะความเปนขาวเจา และขาวเหนยวถกควบคมดวย waxy gene (Wx/wx) ซ�งอยบน

โครโมโซมท� 6 อลลลเดน Wx ควบคมความเปนขาวเจา และอลลลดอย wx ควบคมความเปนขาว

เหนยว เน�องจากมความแตกตางกนระหวางอลลลเดน Wx กบ อลลลดอย wx คอ ในอลลลดอย

พบมการเพ�มข�นของเบสจานวน 23 bp อก 1 ชดใน เอกซอนท� 2 แตไมพบการเพ�มน� ในอลลลเดน

จงมการออกแบบไพรเมอร Glu-23 ใหเฉพาะกบ 23-bp duplication น� ซ�งสามารถใชไพรเมอรน�

แยกความแตกตางของอลลลดอย wx ของขาวเหนยว จากอลลลเดน Wx ของขาวเจาได

(glutinous/non-glutinous alleles) (Wanchana et al., 2003)

เจตศรณย และคณะ (2549) ซ�งเปนนกศกษาระดบปรญญาโทของคณะผวจย ศกษาการ

ถายทอดทางพนธกรรมของลกษณะความเปนขาวเจา และขาวเหนยว โดยศกษาอตราสวนฟโน

ไทป และยโนไทปในขาวรน F2 ซ� งเกดจากการผสมกน ระหวางขาวเหนยว กบขาวเจา ไดแก

คผสมระหวางขาวเหนยวพนธ กข6 x ขาวเจาพนธ Taichung 65, ขาวเจาพนธ ขาวดอกมะล 105 x

ขาวเหนยวพนธ กข6, ขาวเจาพนธ ชยนาท 1 x ขาวเหนยวพนธ กข6 และ ขาวเจาพนธ ปทมธาน 1

x ขาวเหนยว พนธ กข6 พบวาอตราสวนฟโนไทปของเมลดขาวรน F2 เทากบ 3/4 ขาวเจา:1/4 ขาว

เหนยว และเม�อศกษาอตราสวนยโนไทปของตนขาวรน F2 ของคผสมขาวเหนยวพนธ กข 6 x ขาว

เจาพนธ Taichung 65 ดวยไพรเมอร Glu-23 ซ� งเปนเคร� องหมายโมเลกลท�สามารถแยกความ

แตกตางของอลลลเดน Wx จากอลลลดอย wx พบวาอตราสวนยโนไทปของตนขาวรน F2 เทากบ

1/4 WxWx : 2/4 Wxwx : 1/4 wxwx นอกจากน� เม�อนาตน F2 จากคผสมขาวเหนยวพนธ กข 6 x

ขาวเจาพนธ Taichung 65 ท�มยโนไทปเปน WxWx ผสมตวเองไดเมลด F3 เปนขาวเจาทกเมลด เม�อ

ผสมตวเองตน F2 มยโนไทปเปน wxwx ไดเมลด F3 เปนขาวเหนยวทกเมลด และเม�อผสมตวเอง

ตน F2 ท�มยโนไทปเปน Wxwx ไดเมลด F3 มอตราสวนฟโนไทปเทากบ 3/4 ขาวเจา : 1/4 ขาว

เหนยว ดงน�นอลลลเดน Wx ขม อลลลดอย wx อยางสมบรณ สรปวาการถายทอดทางพนธกรรม

ของลกษณะความเปนขาวเจา และขาวเหนยวเปนไปตามกฎขอท� 1 ของเมนเดล ดงน�นลกษณะ

ความเปนขาวเจา และขาวเหนยวถกควบคมดวยยนเพยง 1 ตาแหนง

ตอมา เจตศรณย (2550) ทาการปรบปรงพนธขาวเจาพนธ ขาวดอกมะล 105 ใหเปนขาว

เหนยวดวยวธผสมกลบโดยใชเคร�องหมายโมเลกลชวยคดเลอก โดยใชไพรเมอร Glu-23 ชวยใน

การคดเลอก (ภาพท� 1) ไดขาวเหนยวสายพนธ (wxwx) ท�มพนธกรรมเหมอนขาวเจาพนธ ขาวดอก

7

มะล 105 ยกเวนเปล�ยนจากขาวเจา (WxWx) มาเปนขาวเหนยว (wxwx) (ภาพท� 2) และพบวา

ผลผลต และองคประกอบผลผลตของขาวเจาพนธ ขาวดอกมะล 105 เดม กบ สายพนธขาวเหนยว

(wxwx) ท�ไดจากการปรบปรงพนธไมแตกตางกน

ดงน�นวธการน� จงสามารถนาไปประยกตใชในการปรบปรงพนธขาวเจาพนธดท�มอยอยาง

มากมายของไทยใหเปนขาวเหนยวพนธใหมได

ภาพท� 1 ภาพถายเจลภายใตแสง UV ของลกษณะของแถบดเอนเอท�เกดข�นจากการใชเคร�องหมาย

โมเลกล Glu-23 ตรวจสอบยโนไทปของตนขาว (M) คอแถบดเอนเอมาตรฐาน 100 bp ladder (1)

ตนขาวเหนยวพนธ กข 6 ท�มยโนไทปเปน wxwx (2) ตนขาว F1 ท�มยโนไทปเปน Wxwx และ (3)

ตนขาวเจาพนธขาวดอกมะล 105 ท�มยโนไทปเปน WxWx

ภาพท� 2 ลกษณะเมลดขาวสารของพนธขาวในโครงการปรบปรงพนธขาวเจาพนธ ขาวดอกมะล

105 ใหเปนขาวเหนยวดวยวธผสมกลบโดยใชเคร�องหมายโมเลกลชวยในการคดเลอก (a) ขาวเจา

8

พนธ ขาวดอกมะล 105 และ (b) ขาวเหนยวพนธ กข 6 ท�ใชในการปรบปรงพนธ สวน (c) สายพนธ

ขาวเจา (WxWx) และ (d) สายพนธขาวเหนยว (wxwx) ท�ไดจากการปรบปรงพนธ

เน�องจากขาวหอมเปนท�นยมบรโภคกนอยางกวางขวาง เชนขาวเจาพนธ ขาวดอกมะล

105 และขาวเหนยวพนธ กข6 ดงน�นคณะผวจยจงตองการปรบปรงใหพนธขาวเหนยวท�จะไดจาก

โครงการวจยน�มความหอมอยดวย จากการตรวจเอกสารพบวายนหอม (fragrance gene, fgr) เปน

รหสพนธกรรมของเอนไซม aldehyde dehydrogenase 2 (BAD2) และยนน� ต�งอยบนโครโมโซมท�

8 ยนน� ทาใหเกดความหอมในขาว Jasmine และ Basmati พบวาพนธขาวไมหอม (non-fragrant

rice varieties) ม อลลลท�เปนรหสพนธกรรมของ BAD2 ท�ทางานไดปกต (functional allele) แต

พนธขาวหอม (fragrant varieties) มอลลลท� เปนรหสพนธกรรมของ BAD2 ท�ไมทางาน (non

functional allele) เพราะเกดการขาดหายของเบสจานวน 8 bp (eight base pair deletion) และ เกด

SNPs จานวน 3 ตาแหนงในเอกซอนท� 7 ของอลลลดงกลาว (three SNPs in exon 7) เปนสาเหตให

เกด premature stop codon จงทาใหเอนไซม BAD2 ไมทางาน มการออกแบบไพรเมอร ESP,

IFAP, INSP และ EAPA ท�สามารถแยกความแตกตางระหวางอลลลเดน Fgr ท�ทาใหขาวไมหอม

จาก อลลลดอย fgr ท�ทาใหขาวหอม (Bradbury et al., 2005)

คณะผวจยไดใชไพรเมอร ESP, IFAP, INSP และ EAPA ในการทา PCR เพ�อเปน

เคร�องหมายโมเลกลในการตรวจสอบสายพนธขาวท�ไดจากโครงการปรบปรงพนธ กข 6 ใหไมไว

ตอชวงแสง และมดเอนเอแมพมพ คอ ดเอนเอของขาวพนธตางๆ ผลการทดลอง พบอลลลหอม

(fgr) ในขาวสายพนธ BC3F1-51-501-6211 (เลนท� 3), BC4F1-51-501-6211-2320 (เลนท� 4),

BC5F1-51-501-6211-2320-414 (เลนท� 5), BC3F3-51-501-6211-1955 (hd1hd1) (เลนท� 6), BC3F3-

51-501-6211-2008 (เลนท� 7) และ BC3F1-84-448-7237 (เลนท� 8) เชนเดยวกบขาวเหนยวพนธ กข

6 (เลนท� 1) และขาวเจาหอมพนธปทมธาน 1 (เลนท� 11) กมยนหอม เพราะมแถบดเอนเอขนาด 257

bp แตขาวเจาพนธ Taichung 65 (เลนท� 2), ขาวเหนยวพนธ กข 10 (เลนท� 9) และสนปาตอง 1

(เลนท� 10) ไมพบอลลลหอม นอกจากน� เม�อนาเอาเมลดขาวกลองของขาวสายพนธ BC3F3-51-501-

6211-1955 (hd1hd1) (เลนท� 6), BC3F3-51-501-6211-2008 (เลนท� 7) ไปวเคราะหหาปรมาณสาร

หอม (2-acetyl-1-pyrroline, 2AP) โดยวธ gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS) ท�

ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม พบสารหอมในขาว กข 6 ไมไวตอชวงแสง

ท�ง 2 สายพนธ ดงน�นเคร�องหมายโมเลกลน�สามารถใหคดเลอกตนขาวท�มอลลลหอม (fgr) ได

9

ภาพท� 3 แสดงขนาดแถบดเอนเอภายใตแสง UV เพ�อเปรยบเทยบแถบดเอนเอจากผลผลต PCR

เม�อใช ESP, IFAP, INSP และ EAPA ซ�งเปนเคร�องหมายโมเลกลยนหอมของขาว (fragrance

gene) (Bradbury et al., 2005) เปนไพรเมอร และมดเอนเอแมพมพ คอ ดเอนเอของขาวพนธตางๆ

ถาขาวพนธใดมอลลลหอม (fgr) จะมแถบดเอนเอขนาด 257 bp แตถาขาวท�ไมมอลลล หอม (Fgr)

จะไมมแถบดเอนเอขนาด 257 bp โดยท� M คอแถบดเอนเอมาตรฐาน 100 bp ladder พบวาเลนท� 1

คอแถบดเอนเอของขาวเหนยวพนธ กข 6, เลนท� 3 ขาวสายพนธ BC3F1-51-501-6211, เลนท� 4 ขาว

สายพนธ BC4F1-51-501-6211-2320, เลนท� 5 ขาวสายพนธ BC5F1-51-501-6211-2320-414, เลนท�

6 สายพนธ BC3F3-51-501-6211-1955 (hd1hd1), เลนท� 7 ขาวสายพนธ BC3F3-51-501-6211-2008,

เลนท� 8 ขาวสายพนธ BC3F1-84-448-7237 และเลนท� 11 ขาวเจาหอมพนธปทมธาน 1 มอลลลหอม

(fgr) เพราะมแถบดเอนเอขนาด 257 bp แตเลนท� 2 คอขาวพนธ Taichung 65 เลนท� 9 ขาวเหนยว

พนธ กข 10 และเลนท� 10 ขาวเหนยวพนธสนปาตอง 1 ไมมอลลล หอม (fgr) จงไมมแถบดเอนเอ

ขนาด 257 bp

ดงน�นการปรบปรงพนธใหขาวเจาพนธสพรรณบร 1 และชยนาท 80 ใหเปนขาวเหนยว

หอมดวยวธผสมกลบโดยใชเคร� องหมายโมเลกลในการคดเลอกจงจะทาใหสาเรจโดยใช

เคร�องหมายโมเลกลเหลาน�

การทบทวนวรรณกรรม/สารสนเทศ (information) ท�เก�ยวของ

การปรบปรงพนธโดยใชเคร�องหมายโมเลกลชวยในการคดเลอก

การปรบปรงพนธพชแบบด�งเดม (conventional plant breeding) เนนการคดเลอกฟโนไทป

ท�ดท�สดในประชากรท�มการกระจายตวท�ไดมาจากการผสมพนธ ซ�งประสบปญหาวาเกดปฏกรยา

สมพนธระหวางพนธกรรมและสภาพแวดลอม (genotype x environment interaction ; G x E)

10

ประกอบกบการคดเลอก และการทดสอบฟโนไทปตองใชเงนจานวนมาก และใชเวลานาน การ

ปรบปรงพนธโดยใชเคร�องหมายโมเลกลมาชวยคดเลอก (marker-assisted selection; MAS) เนน

การคดเลอกท� ยนไมใชฟโนไทป ดงน� นการคดเลอกดวยเคร� องหมายโมเลกลไม ข� นกบ

สภาพแวดลอม และสามารถคดไดในทกชวงอายของพช เน�องจากการม molecular marker และ

genetic map เกดข� นจงทาใหการใช MAS มความเปนไปไดท� งลกษณะท�เปนท�เชงคณภาพ

(qualitative trait) และลกษณะเชงปรมาณ (quantitative trait loci) (Francia et al., 2005)

วธการปรบปรงพนธพชแบบผสมกลบแบบด�งเดม(conventional backcrossing) เปนการ

ถายทอดยนท�ตองการจากพนธให (donor parent) ซ�งสวนใหญเปนพนธท�มลกษณะการเกษตรไมด

ไปสพนธรบ (recipient parent) ซ�งเปนพนธด (elite variety) เร�มโดยผสมพนธรบกบพนธใหเพ�อ

ผลต F1 ตอจากน�นนา F1 ผสมกลบไปหาพนธรบ ตองทาการผสมกลบไปหาพนธรบถง 6 คร� ง จง

จะไดเปอรเซนตจโนมของพนธรบ เทากบ 99.2 จงจะอยในระดบท�ยอมรบได พนธท�ไดจากการ

ปรบปรงพนธแบบผสมกลบจะมพนธกรรมเหมอนกบพนธรบยกเวนยนในตาแหนงท�ตองการ

(target gene) ท�ไดมาจากพนธให (Allard, 1969)

สาหรบวธการผสมกลบโดยใชเคร�องหมายโมเลกลชวยในการคดเลอก (marker-assisted

backcrossing; MAB) (Frisch et al., 1999a) เม�อเปรยบเทยบ MAB กบวธการผสมกลบแบบด�งเดม

พบวา การใช marker มาชวยในการคดเลอกจะชวยเพ�มประสทธภาพของวธผสมกลบแบบด�งเดม

ได 3 ประการ (1) บางลกษณะการคดเลอกดวยฟโนไทปทาไดยาก การใช marker ท�ลงคของ target

gene ชวยเพ�มประสทธภาพ และความแมนยาของการคดเลอก (2) marker ชวยคดเลอกตน BC ท�ม

ปรมาณจโนมของพนธรบสง และ marker ชวยคดเลอกตนท�ม linkage drag ท�มขนาดส�นๆ และ (3)

ในการถายทอดยนดอย (recessive gene) ถาใชวธผสมกลบแบบด�งเดมตองทาการผสมตวเองเพ�ม

อกหน�งช�วหลงจากการผสมกลบในแตละช�ว แตเม�อใช marker ชวยในการคดเลอกไมตองทาการ

ผสมตวเองในแตละช�วของการผสมกลบอก (Francia et al., 2005) วธการผสมกลบโดยใช

เคร� องหมายโมเลกลชวยในการคดเลอกน�น การคดเลอกตน BCnF1 ท�ตองการดวย marker ม 3

ข�นตอนคอ ข�นตอนแรก ใช target marker คดเลอกตนท�มยนท�ตองการ (target gene) โดยคดเลอก

ตนท�มยโนไทปเปน heterozygous สาหรบอลลลของพนธรบ และอลลลของพนธให ข�นตอนท� 2

ทาการลดจานวนของยนท�ไมตองการท�ตดมาจากพนธให (linkage drag) โดยใช flanking marker

จานวน 2 ตาแหนงซ� งขนาบอยท� งสองขางของยนท�ตองการ โดยคดเลอกให marker ท� งสอง

ตาแหนงเปน homozygous สาหรบอลลลของพนธรบ ข�นตอนท� 3 ใช background marker ซ� ง

กระจายอยในตาแหนงตางๆ (non target loci) ในจโนมเพ�อคดเลอกตนท�มยโนไทปเปน

homozygous สาหรบอลลลของพนธรบ ซ�งจะทาใหไดตนท�มยโนไทปเหมอนพนธรบมากท�สดได

11

เรวข�น (Newbury, 2003) Frisch et al. (1999b) รายงานวาเม�อ MAB ในกรณท�ม target gene เพยง

หน�งตาแหนงจะสามารถลดจานวนคร� งของการผสมกลบลงถง 2-4 ช�ว

การปรบปรงพนธขาว

ประเทศ (2526) รายงานข�นตอนการวจยใหไดขาวพนธดมดงน�

-การอนรกษพนธขาว (rice conservation) เพ�อเกบรกษาขาวพนธด และขาวพนธพ�นเมอง

รวมท�งพนธขาวท�นามาจากประเทศอ�นๆ เกบรกษาไว เพ�อใชเปนเช�อพนธกรรมสาหรบในการ

ปรบปรงพนธขาวตอไป

-การผสมพนธ (hybridization) การชกนาใหเกดการเปล�ยนแปลงกรรมพนธ (inducing

mutation) และการคดเลอก (selection)การผสมพนธ เปนการผสมระหวางขาว 2 พนธหรอมากกวา

เพ�อรวมเอาลกษณะท�ตองการเอามาไวในตนเดยวกน เม�อผสมพนธแลวจะไดเมลดช�วแรก (F1)

นาไปปลกเม�อ F1 ผสมตวเองไดเมลด F2 ตอจากน�นปลกเมลด F2 แลวทาการคดเลอก แบบ bulk

selection หรอ pedigree selection จะใชแบบใดข�นกบลกษณะท�ตองการคดเลอก การคดเลอกทา

ต�งแต F2-F6 ซ�งลกษณะท�ตองคดเลอกในช�ว F6 คอ รปแบบของทรงตน อาย ความตานทานตอโรค

แมลง และลกษณะเมลด

-การชกนาใหเกดการเปล�ยนแปลงกรรมพนธทาใหพนธขาวท�ดอยแลวมลกษณะท�ตองการ

เพ�มข�น โดยใชรงสหรอ สารเคม การคดเลอกทาคลายกบการคดเลอกขาวลกผสม

-การศกษาพนธข �นตน (observation) พนธขาว F6 ท�คดเลอกไว นาไปปลกสายพนธละ 1-4

แถว และตองปลกพนธมาตรฐานเปนพนธเปรยบเทยบ ลกษณะตางๆ ท�ศกษาคอ รปแบบ ทรงตน

ความตานทานโรคและแมลง อาย และลกษณะเมลด คดเลอกสายพนธท� ดไว ทาการปลกและ

คดเลอกอก 2 คร� งใน F7 และ F8

-การเปรยบเทยบผลผลตภายในสถาน (intra-station trial) นาสายพนธท�ไดจากการ

คดเลอกข�นตนมาจดเปนกลมตามอายและความสง นามาทาการปลกเปรยบเทยบผลผลตในสถาน

โดยการทดลองหน� งๆ มสายพนธขาวประมาณ 15-25 สายพนธและตองมพนธมาตรฐานดวย

ทาการศกษาถงผลผลต ขนาด คณภาพของเมลด คณภาพหงตมและรบประทาน

-การเปรยบเทยบผลผลตระหวางสถาน (inter-station trial) สายพนธท�ไดจากการคดเลอก

จากการเปรยบเทยบผลผลตภายในสถาน นามาจดเปนกลมตามอายและความสง แลวนาไปปลก

เปรยบเทยบผลผลตตามสถานตางๆ พรอมกน ซ�งไดขอมลการปรบตวของสายพนธขาวเหลาน� ใน

สภาพแวดลอมท�แตกตางกน วธทดสอบทาเหมอนการเปรยบเทยบผลผลตภายในสถาน

12

-การเปรยบเทยบผลผลตทองถ�น (regional trial) สายพนธท�ไดจากการคดเลอกจากการ

เปรยบเทยบผลผลตระหวางสถาน นามาจดเปนกลมตามอายและความสง แลวนาไปปลก

เปรยบเทยบผลผลตในแปลงนาของเกษตรกรตามทองถ�นตางๆ ซ�งพนธท�ปลกทดสอบในข�นน� คาด

วาจะเปนพนธใหม ซ�งไดขอมลการปรบตวของสายพนธขาวเหลาน� ในสภาพแวดลอมท�แตกตาง

กนวธทดสอบทาเหมอนการเปรยบเทยบผลผลตภายในสถานสายพนธขาวท�มผลผลตสงและม

ลกษณะท�ด ซ�งไดจากการเปรยบเทยบผลผลตระดบทองถ�น จะเสนอใหคณะกรรมการพจารณา

พนธของกรมวชาการเกษตรพจารณาวาสมควรจะสงเสรมใหเกษตรกรปลกหรอไม

13

วธการดาเนนการวจย และสถานท�ทาการทดลอง/เกบขอมล

พนธรบ

โครงการวจยน� เลอกขาวเจาพนธดจานวน 2 พนธ คอ ขาวเจาพนธสพรรณบร 1 และชยนาท

80 เปนพนธรบในการปรบปรงพนธ เพราะขาวท�งสองพนธมลกษณะท�ดดงตอไปน� คอ

ขาวพนธ สพรรณบร 1 ลกษณะประจาพนธ เปนขาวเจาสงประมาณ 125 เซนตเมตร ไมไว

ตอชวงแสง อายเกบเก�ยว ประมาณ 120 วน เมลดขาวเปลอกสฟาง ระยะพกตวของเมลดประมาณ

22 วน เมลดขาวกลอง กวาง x ยาว x หนา = 22 x 7.3 x 1.8 มลลเมตร ปรมาณอมโลส 29 % คณภาพ

ขาวสก รวน แขง ผลผลตประมาณ 806 กโลกรมตอไร ลกษณะเดน มผลผลตสง ตอบสนองตอการ

ใชปย ตานทานโรคไหม โรคขอบใบแหง และตานทานโรคใบหงก และโรคใบสสม ในสภาพ

ธรรมชาต ตานทานเพล�ยกระโดดสน� าตาล และเพล�ยกระโดดหลงขาว (กรมการขาว, 2552)

ขาวพนธ ชยนาท 80 (กข 29) ลกษณะประจาพนธ เปนขาวเจาไมไวตอชวงแสง อายเกบ

เก�ยว 103 วน ในฤดนาป และ 99 วนในฤดนาปรงเม�อปลกโดยวธหวานน� าตม สงเฉล�ย 104

เซนตเมตร ขาวกลอง สขาว เปนทองไขนอย รปรางเรยว ยาว 7.34 มลลเมตร กวาง 2.23 มลลเมตร

หนา 1.80 มลลเมตร มปรมาณ อมโลสสง (26.6-29.4%) ผลผลตเฉล�ย 876 กโลกรม / ไร ลกษณะ

เดน อายส�น ผลผลตสง เฉล�ย 876 กโลกรมตอไร คอนขางตานทานตอเพล�ยกระโดดสน� าตาลใน

ภาคเหนอตอนลาง และโรคขอบใบแหง มปรมาณธาตเหลกในขาวกลอง 15.7 มลลกรม ตอ 1

กโลกรม ในขาวสาร 6.7 มลลกรมตอ 1 กโลกรม ขอควรระวง ไมควรปลกในชวงกลางเดอน

กนยายนถงปลายเดอนพฤศจกายน ซ� งมอากาศเยน ทาใหเมลดลบมาก ผลผลตต�า ชยนาท 80

ออนแอตอเพล�ยกระโดดสน� าตาล ในเขตจงหวดนครปฐม ปทมธาน ราชบร และฉะเชงเทรา (ศนย

เมลดพนธขาวชลบร, 2552)

พนธให

ในโครงการวจยน� เลอกพนธให คอ ขาวเหนยวพนธ กข 6 เปนขาวเหนยวหอมท�มคณภาพ

หงตมเปนท�ตองการของผบรโภค จงทาใหขาวเหนยวพนธ กข 6 มพ�นท�ปลกถง 15 ลานไร ขาว

เหนยวพนธ กข 6 ใหอลลลดอย wx ซ�งควบคมใหขาวเปนขาวเหนยว และนอกจากน� ใหอลลลดอย

fgr ซ�งควบคมใหขาวหอม รายละเอยดของพนธขาว กข 6 มดงน�

ขาวเหนยวพนธ กข6 ไดจากการปรบปรงพนธ โดยนาขาวขาวดอกมะล 105 อาบรงส

แกมมาชกนาใหเกดการกลายพนธ ไดขาวเหนยวพนธ กข 6 มความสงประมาณ 154 เซนตเมตร ไว

ตอชวงแสง อายเกบเก�ยวประมาณ 21 พฤศจกายน เมลดขาวกลอง กวาง x ยาว x หนา = 2.2 x 7.2 x

14

1.7 มลลเมตร คณภาพขาวสก เหนยวนม มกล�นหอม ผลผลตประมาณ 666 กโลกรมตอไร ลกษณะ

เดนมคณภาพการหงตมด มกล�นหอม ตานทานโรคใบจดสน� าตาล ขอควรระวงไมตานทานโรคขอบ

ใบแหง และโรคใบไหม ไมตานทานเพล�ยกระโดดสน� าตาลและแมลงบ�ว(กรมการขาว, 2552)

ข�นตอนการปรบปรงพนธขาวเจาพนธสพรรณบร 1 และชยนาท 80 ใหเปนขาวเหนยวหอม

ดวยวธผสมกลบโดยใชเคร�องหมายโมเลกลชวยคดเลอก ทาโดยใชขาวเจาพนธสพรรณบร 1 และ

ชยนาท 80 เปนพนธรบ (recurrent parent) และมพนธขาวเหนยวพนธ กข 6 เปนพนธให (donor

parent) อลลลดอย wx ท�ควบคมใหขาวเปนขาวเหนยว และ อลลลดอย fgr ท�ควบคมใหขาวหอม

target gene คอ อลลลดอย wx และ อลลลดอย fgr โดยท� Wx/wx อยบนโครโมโซมท� 6 อลลลเดน

Wx ควบคมใหเปนขาวเจา และอลลลดอย wx ควบคมใหเปนขาวเหนยว เคร�องหมายโมเลกลท�ใช

คดเลอก Wx/wx คอไพรเมอร Glu-23 (Wanchana et al., 2003) ซ�งจะเรยกวา waxy marker สวน Fgr/

fgr อยบนโครโมโซมท� 8 อลลลเดน Fgr ควบคมใหขาวไมหอม และอลลลดอย fgr ควบคมใหขาว

หอม เคร� องหมายโมเลกลท�ใชคดเลอก Fgr/fgr คอไพรเมอร ESP, IFAP, INSP และ EAPA

(Bradbury et. al., 2005) ซ�งจะเรยกวา fragrance marker นอกจากน� ม flanking marker 1 และ 2 ท�

ขนาบอยท�ง 2 ขางของยน Wx/wx และ Fgr/fgr เพ�อปองกนไมใหยนอ�นๆ ท�ไมตองการตดมากบ

target gene นอกจากน�ม background marker เปนชนด SSR marker อกประมาณ 60 ตาแหนง เฉล�ย

5 ตาแหนง/โครโมโซม เพ�อใชคดเลอกหาตน BCnFn ท�มพนธกรรมเหมอนพนธรบมากท�สด

ข�นตอนโดยยอเร�มจากการผลตเมลด F1 ระหวางขาวเจาพนธสพรรณบร 1 กบขาวเหนยว

พนธ กข 6 และขาวเจาพนธชยนาท 1 กบขาวเหนยวพนธ กข 6 ตอจากน�นผสมกลบไปหาพนธรบ

ของแตละคผสมจานวน 5 คร� ง แตละคร� งของการผสมกลบจะปลกตน BCnF1 และคดเลอกดวย wx

marker เลอกตนท�มยโนไทปเปน Wxwx และนามาคดเลอกตอดวย fragrance marker โดยเลอกตนท�

มยโนไทปเปน Fgrfgr ตอจากน�นจงคดเลอกดวย flanking marker 1 และ 2 ของ Wx/wx ในช�ว

BC1F1 และ BC2F1 ตามลาดบ และคดเลอกดวย flanking marker 1 และ 2 ของ Fgr/fgr ในช�ว BC3F1

และ BC4F1 ตามลาดบ สาเหตท�ตองคดเลอกแตละ flanking maker ในช�วของการผสมกลบตางกน

เพราะจานวนตนท�ตองใชในการคดเลอกจะไมมมากเกนไป ถาใชตนจานวนมากจะส�นเปลอง

คาใชจายอยางมาก สวน background marker จะใชคดเลอกในช�ว BC5F1 เพราะจะมประสทธภาพ

สงสด เพราะตนขาวสวนใหญมพนธกรรมเหมอนพนธรบแลว ตอจากน�นผสมตวเองตน BC5F1

เพ�อผลตเมลด BC5F2 แลวปลก ตน BC5F2 คดเลอกดวยเคร�องหมายโมเลกล เพ�อหาตนท�มยโนไทป

ท�งหมดเหมอนพนธรบ ยกเวนท�ตาแหนง Wx/wx มยโนไทปเปน wxwx ซ�งเปนขาวเหนยว และท�

ตาแหนง Fgr/fgr มยโนไทปเปน fgrfgr ซ�งเปนขาวหอม ตอจากน�นจงทาการศกษาพนธ 2 และ 4

15

แถว เพ�อคดเลอกขาวสายพนธท�ด แลวจงนาไปทดสอบใน และระหวางสถานทดลอง รวมท�งปลก

ทดสอบในนาเกษตรกรตอไป รายละเอยดของโครงการท�งหมดมดงตอไปน�

ฤดท� 1 การผลตเมลด F1 และ การหาเคร�องหมายโมเลกลชนดตางๆ

การผลตเมลด F1

การผลตเมลด F1 จานวน 2 คผสม คผสมแรก คอ ขาวเจาพนธ สพรรณบร 1 x ขาวเหนยว

พนธ กข 6 คผสมท� 2 คอ ขาวเจาพนธชยนาท 80 x ขาวเหนยวพนธ กข 6

การหา target marker

เน�องจากตองการปรบปรงขาวเจาใหเปนขาวเหนยว และมกล�นหอมดวย ดงน�นจงตองม

target marker จานวน 2 ตาแหนง

ตาแหนงท� 1 คอ waxy gene (Wx/wx) อยบนโครโมโซมท� 6 โดยท�อลลลเดน Wx ควบคม

ความเปนขาวเจา สวนอลลลดอย wx ควบคมความเปนขาวเหนยว ใชไพรเมอรช�อ Glu-23

(Wanchana et al., 2003) เปน waxy marker เพ�อคดเลอกหาตนขาวท�มอลลลดอย wx ของขาวเหนยว

ตาแหนงท� 2 คอ fragrance gene (Fgr/fgr) อยบนโครโมโซมท� 8 โดยท�อลลลเดน Fgr

ควบคมใหขาวไมหอม สวนอลลลดอย wx ควบคมใหขาวหอม ใชไพรเมอร ESP, IFAP, INSP และ

EAPA (Bradbury et al., 2005) เปน fragrance marker เพ�อคดเลอกหาตนขาวท�มอลลลดอย fgr ท�ทา

ใหขาวหอม

ซ�งในขณะน�คณะผวจยมท�ง waxy และ fragrance marker อยเรยบรอยแลว

การหา flanking marker 1 และ 2

การหา flanking marker ทาโดยเขาไปใน http://www.gramene.org/ เลอกเคร�องหมาย

โมเลกลชนด SSR ท�ขนาบอยท� ง 2 ขางของยน Wx/wx และยน Fgr/fgr ส�งสงเคราะหไพรเมอร

นามาทา PCR โดยมดเอนเอของขาวพนธสพรรณบร 1, ชยนาท 80 และ กข 6 เปนแมพมพ คดเลอก

เคร� องหมายโมเลกลท�สามารถแยกความแตกตางระหวางขาวพนธสพรณบร 60 กบ กข 6 และ

ระหวาง ชยนาท 80 กบ กข 6

การหา background marker

การหา background marker ทาโดย คดเลอกเคร�องหมายโมเลกลชนด SSR จานวน 200-300

ตาแหนงท�กระจายอยบนโครโมโซมท�ง 12 คของขาว ส�งสงเคราะหไพรเมอร นามาทา PCR โดยม

16

ดเอนเอของขาวพนธสพรรณบร 1, ชยนาท 80 และ กข 6 เปนแมพมพ คดเลอกเคร�องหมายโมเลกล

ท�สามารถแยกความแตกตางระหวางขาวพนธสพรรณบร 1 กบ กข 6 และระหวาง ชยนาท 80 กบ

กข 6 เน�องจากขาวท�ง 3 พนธเปนขาวอนดกา ดงน�นจงตองใชเคร�องหมายโมเลกลชนด SSR จานวน

มากถง 20-25 ตาแหนง/โครโมโซม จงได SSR ท�ใหความแตกตางระหวางพนธขาวอนดกา 2 พนธ

ประมาณ 4-6 ตาแหนง/โครโมโซม

ฤดท� 2 การคดเลอกตน F1 และการผลตเมลด BC1F1

ปลกตน F1 ของคผสมท�ง 2 ค คอ สพรรณบร 1 กบ กข 6 และ ระหวาง ชยนาท 80 กบ กข 6

แลวคดเลอกดวย target marker เพ�อใหแนใจวาเปนตน F1 จรง ตอจากน�นนาตน F1 ผสมกลบไปหา

ขาวพนธรบ เพ�อผลตเมลด BC1F1

ฤดท� 3 การคดเลอกตน BC1F1 ดวยเคร�องหมายโมเลกล และ การผลตเมลด BC2F1

ปลกตน BC1F1 คดเลอกดวย waxy marker เลอกตนท�มยโนไทปเปน Wxwx

(heterozygous) แลวจงนาตนเหลาน�มาคดเลอกตอดวย fragrance marker เลอกตนท�มยโนไทปเปน

Fgrfgr (heterozygous) ตอจากน�นจงนาตนดงกลาวมาคดเลอกตอ ดวย flanking marker 1 ของ waxy

gene เพ�อคดเลอกหาตนท�มยโนไทปเปน homozygous ของอลลลพนธรบ นาตนท�คดเลอกไดผสม

กลบไปหาพนธรบ เพ�อผลตเมลด BC2F1

ฤดท� 4 การคดเลอกตน BC2F1 ดวยเคร�องหมายโมเลกล และ การผลตเมลด BC3F1

ปลกตน BC2F1 คดเลอกดวย waxy marker เลอกตนท�มยโนไทปเปน Wxwx แลวจงนาตน

เหลาน� มาคดเลอกตอดวย fragrance marker เลอกตนท�มยโนไทปเปน Fgrfgr ตอจากน�นจงนาตน

ดงกลาวมาคดเลอกตอ ดวย flanking marker 2 ของ waxy gene เพ�อคดเลอกหาตนท�มยโนไทปเปน

homozygous ของอลลลพนธรบ นาตนท�คดเลอกไดผสมกลบไปหาพนธรบเพ�อผลตเมลด BC3F1

ฤดท� 5 การคดเลอกตน BC3F1 ดวยเคร�องหมายโมเลกล และ การผลตเมลด BC4F1

ปลกตน BC3F1 คดเลอกดวย waxy marker เลอกตนท�มยโนไทปเปน Wxwx แลวจงนาตน

เหลาน� มาคดเลอกตอดวย fragrance marker เลอกตนท�มยโนไทปเปน Fgrfgr ตอจากน�นจงนาตน

ดงกลาวมาคดเลอกตอ ดวย flanking marker 1 ของ fragrance gene เพ�อคดเลอกหาตนท�มยโนไทป

เปน homozygous ของอลลลพนธรบ นาตนท�คดเลอกไดผสมกลบไปหาพนธรบ เพ�อผลตเมลด

BC4F1

17

ฤดท� 6 การคดเลอกตน BC4F1 ดวยเคร�องหมายโมเลกล และ การผลตเมลด BC5F1

ปลกตน BC4F1 คดเลอกดวย waxy marker เลอกตนท�มยโนไทปเปน Wxwx แลวจงนาตน

เหลาน� มาคดเลอกตอดวย fragrance marker เลอกตนท�มยโนไทปเปน Fgrfgr ตอจากน�นจงนาตน

ดงกลาว มาคดเลอกตอ ดวย flanking marker 2 ของ fragrance gene เพ�อคดเลอกหาตนท�มยโนไทป

เปน homozygous ของอลลลพนธรบ นาตนท�คดเลอกไดผสมกลบไปหาพนธรบ เพ�อผลตเมลด

BC5F1

ฤดท� 7 การคดเลอกตน BC5F1 ดวยเคร�องหมายโมเลกล และการผลตเมลด BC5F2

ปลกตน BC5F1 คดเลอกดวย waxy marker เลอกตนท�มยโนไทปเปน Wxwx แลวจงนาตน

เหลาน� มาคดเลอกตอดวย fragrance marker เลอกตนท�มยโนไทปเปน Fgrfgr ตอจากน�นจงนาตน

ดงกลาวมาคดเลอกตอ ดวย flanking marker 1 และ 2 ของท�ง waxy marker และ fragrance gene

เพ�อคดเลอกหาตนท�มยโนไทปเปน homozygous ของอลลลพนธรบ ตอจากน�นนาตนท�คดเลอกได

ไปคดเลอกตอดวย background marker เพ�อคดเลอกหาตนท�มยโนไทปเปน homozygous ของอลลล

พนธรบทกตาแหนง ตอจากน�นทาการผสมตวเองเพ�อผลตเมลด BC5F2

ฤดท� 8 การคดเลอกตน BC5F2 ดวยเคร�องหมายโมเลกล และ การผลตเมลด BC5F3

ปลกตน BC5F2 คดเลอกดวยเคร�องหมายโมเลกล waxy marker และ fragrance marker โดย

คดเลอกตนท�มยโนไทปเปน wxwx และ frgfrg ผสมตวเองตนท�คดเลอกไดเพ�อผลตเมลด BC5F3 ซ�ง

จะไดสายพนธขาวเหนยวท�มพนธกรรมเหมอนกบพนธรบ คอ สพรรณบร 1 และชยนาท 80 ยกเวน

เปนขาวเหนยว และมกล�นหอมเพราะมยโนไทปเปน wxwx และ frgfrg

ฤดท� 9 การศกษาพนธ 2 แถว (2 - Row Observation) ตน BC5F3 ทาการคดเลอก และผลต

เมลด BC5F4

ฤดท� 10 การศกษาพนธ 4 แถว (4 - Row Observation) ตน BC5F4 ทาการคดเลอก และผลต

เมลด BC5F5

ฤดท� 11-12 การเปรยบเทยบผลผลตภายในสถาน (Intra-station Yield Trials) จานวน 2 ฤด

และศกษาคณภาพหงตม

18

ฤดท� 13-18 รวมมอกบกรมการขาวเพ�อการเปรยบเทยบผลผลตระหวางสถาน (Inter-station

Yield Trials) และการทดสอบผลผลตในนาเกษตรกร (Farmer Yield Trials or On-Farm Trials)

ประมาณ 3-5 ป

รวมเวลาปรบปรงพนธขาวเหนยวหอมจากขาวเจาพนธดโดยใชเคร�องหมายโมเลกลชวยใน

วธผสมกลบใชเวลาท�งหมดประมาณ 8-10 ป

หมายเหต โครงการน�จะขอทนวจยในระยะเวลา 2 ปกอน คอ จากฤดท� 1-4 ตอจากน�นจง

ขอทนวจยตอ คาดวาจะใชเวลาปรบปรงพนธท�งหมด 8-10 ปนาจะไดพนธใหมท�จะสงเสรมให

ชาวนาปลกได เม�อเปรยบเทยบกบการปรบปรงพนธขาวเหนยวพนธท�เกษตรกรนยมปลกอยใน

ปจจบน เชน กข 6, กข 10, แพร 1 และ สนปาตอง 1 ใชเวลาปรบปรงพนธเฉล�ยถง 15 ป (ตารางท� 1)

ซ�งถาโครงการปรบปรงพนธขาวเหนยวหอมจากขาวเจาพนธดดวยวธผสมกลบโดยใชเคร�องหมาย

โมเลกลชวยในการคดเลอก ประสบผลสาเรจกสามารถเปนแนวทางใหมท�จะใชปรบปรงพนธขาว

เหนยว ซ�งจะลดระยะเวลาการปรบปรงพนธไดประมาณ 3-7 ป

ระยะเวลาทาการวจย และแผนการดาเนนงานตลอดโครงการวจย

การวจยน� จะเร�มในวนท� 1 ตลาคม 2553 ถงวนท� 30 กนยายน 2555 ซ�งมแผนดาเนนการ

วจยดงน�

แผนงาน

พ.ศ.2

553 พ.ศ. 2554 พ.ศ. 2555

10-12 1-3 4-6 7-9 10-

12

1-3 4-6 7-

9

5.1 การผลตเมลด F1

และการหาเคร�องหมายโมเลกลชนดตางๆ

xxx xxx

5.2 การคดเลอกตน F1 และการผลตเมลด BC1F1 xxx xxx

5.3 การคดเลอกตน BC1F1 ดวยเคร� องหมาย

โมเลกล และ การผลตเมลด BC2F1

xxx xxx

5.4 การคดเลอกตน BC2F1 ดวยเคร� องหมาย

โมเลกล และการ ผลตเมลด BC3F1

xxx xx

สรปผลการทดลอง x

19

สถานท�ทาการทดลอง/เกบขอมล

ผลตเมลด F1 และ BC1F1 ท�เรอนกระจกของศนยเทคโนโลยชวภาพของ มหาวทยาลยแมโจ

จงหวดเชยงใหม

การคดเลอกโดยเคร� องหมายโมเลกล และงานทางชวโมเลกลทาท�หองปฏบตการทาง

โมเลกลของภาควชาชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยแมโจ จงหวดเชยงใหม

ผลการทดลอง

1. ผลตเมลด F1 และการหาเคร�องหมายโมเลกลชนดตางๆ

การผลตเมลดพนธ F1 (ชยนาท 80 x กข6 และสพรรณบร 1 x กข6)

การปลกขาวเพ�อผลตเมลดพนธ F1 ไดเร�มกระทาต�งแตเดอน ตลาคม 2553 ส�นสดเม�อเดอน

มนาคม 2554 เปนเวลา 6 เดอน โดยทาการปลกขาวพนธ ชยนาท 80 และสพรรณบร 1 ซ�งใชเปนตน

แม และพนธ กข 6 เปนตนพอ ทาการผสมพนธระหวางพนธ และพนธสพรรณบร 1 กบพนธ กข6

โดยการทา emasculation คอ การกาจดเกสรตวผของตนแม ซ�งมวธการ คอ นารวงขาวท�ยงตดอยกบ

ตนมาแชในน� าอนอณหภมประมาณ 42 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท แลวจะพบวาดอกขาวม

เกสรตวผโผลออกมาจากดอก ทาการตดแตงชอดอก โดยตดดอกท�ไมมเกสรตวผโผลออกมาท�ง

ท�งหมด ใหเหลอเฉพาะดอกท�มเกสรตวผโผลออกมาจากดอก ประมาณ 15-20 ดอก จากน�นทาการ

คบเกสรตวผออกใหหมด แลวนาถงกระดาษมาคลมชอดอกไว ซ�งบนถงกระดาษจะตองบนทก วน/

เดอน / ป ท�ทาการ emasculation, เวลา และช�อพนธขาว จากน�นเม�อตนพอมเกสรตวผบานจงทาการ

ผสมพนธขาว โดยคบเกสรตวผจากตนพอมาใสในดอกตวเมยท�ทาการ emasculation จนครบทก

ดอก แลวใชถงกระดาษคลมไวเหมอนเดม แลวบนทก ช�อพนธขาวท�ใชเปนพอพนธ และเวลาท�ทา

การผสมพนธ จากน�นยายตนขาวไปวางไวในท�ท�มความช�นสงๆ เม�อครบ 7 วนแลวจงตรวจดวาผสม

ตดหรอไม ถาผสมตดจะทาการเกบเก�ยวไดหลงจากผสมตดไปแลว 25-30 วน ซ�งในฤดท� 1 ไดเมลด

ของคผสมระหวาง ชยนาท 80 x กข6 จานวน 19 เมลด และสพรรณบร 1 x กข6 จานวน 82 เมลด ซ�ง

เมลดของคผสมท�งสองคน� คอ เมลด F1 ซ�งจะปลกเปนตนพอ แลวนาไปผสมกลบกบพนธชยนาท 80

และสพรรณบร 1 เพ�อผลตเมลด BC1F1 ในฤดตอไป

20

2. การหา background marker

ตารางท� 2 แสดงจานวนตาแหนงของ background marker

ลาดบ ช�อ marker Chromosome Position (cM) ชยนาท 80

x กข 6

สพรรณบร 1

x กข 6

1 RM588 6 1,611,442 - 1,611,468 / /

2 RM16626 4 12,778,457 - 12,778,480 / -

3 RM589 6 1,380,931 - 1,380,978 / /

4 RM6836 6 9,320,821 - 9,320,862 - /

5 RM8225 6 9,320,821 - 9,320,862 / -

6 RM19405 6 2,839,645 - 2,839,665 / /

7 RM25526 10 16,496,356 - 16,496,376 - /

8 RM20342 6 23,347,950 - 23,347,970 - /

9 RM20348 6 23,506,887 - 23,506,907 / -

10 RM7434 6 23,552,227 - 23,552,266 / -

11 RM19414 6 2,941,468 - 2,941,491 / -

3. การคดเลอกตน F1 และการผลตเมลด BC1F1

การปลกขาวเพ�อคดเลอกตน F1 และการผลตเมลด BC1F1 ไดเร�มกระทาต�งแตเดอน เมษายน

2554 ส�นสดเม�อเดอน กนยายน 2554 เปนเวลา 6 เดอน มข�นตอนดงน�

1. ปลกเมลด F1 ท�ผลตไดในฤดท�แลวในขวด หลงจากขาวมอาย 2 – 4 สปดาห ทาการสกด

ดเอนเอใบขาวโดยใชชดสกดดเอนเอสาเรจรป ของบรษท Fermentas

2. จากน�นเพ�มปรมาณช�นสวนดเอนเอท�ตองการดวยปฏกรยาพซอาร (polymerase chain

reaction ; PCR) โดยใช primer ท�จาเพาะเจาะจงกบ Wx gene

4. ทาวเคราะหการเพ�มปรมาณช�นสวนดเอนเอท�ตองการดวยวธอเลกโตรโฟรซส

(electrophoresis) โดยอาศยการเคล�อนท�ผานวนอะกาโรส (agarose) ในสารละลาย TBE buffer

ความเขมขน 1 เทา และยอมช�นสวนช�นสวนดเอนเอดวยสารละลาย เอทเดยมโบรมายด (ethidium

bromide) เปนเวลา 10 นาท ลางสยอมสวนท�เกนออกดวยน� ากล�นเปนเวลา 5 นาท บนทกภาพดวย

เคร�อง Gel Doc 2000 (บรษท BIO-RAD Laboratory) โดยใชซอฟทแวร Quantity One (บรษท BIO-

RAD Laboratory)

21

5. คดเลอกตนท�มยโนไทปเปน heterozygous ทกตาแหนงไปปลกในกระถาง โดยสามารถ

คดเลอกคผสมระหวางชยนาท 80 x กข6 จานวน 6 ตน และสพรรณบร 1 x กข6 จานวน 8 ตน

6. นาตนท�คดเลอกไดในขอท� 5 ไปใชเปนตนพอ โดยนาตน F1(ชยนาท 80 x กข6) ผสม

กลบไปหาขาวพนธชยนาท 80 และนาตน F1(สพรรณบร 1 x กข6) ผสมกลบไปหาขาวพนธ

สพรรณบร 1 เพ�อผลตเมลด BC1F1 โดยมข�นตอนการผสมพนธเหมอนกบการผลตเมลด F1

7. ในฤดท� 2 น� สามารถผลตเมลด BC1F1 ของคผสม ชยนาท 80 x กข6 จานวน57 เมลด

และสพรรณบร 1 x กข6 จานวน 147 เมลด

22

สรปผลการทดลอง

การปรบปรงพนธขาวเหนยวหอมจากขาวเจาดวยวธผสมกลบโดยใชเคร�องหมายโมเลกล

ชวยในการคดเลอกโดยมขาวเจาพนธสพรรณบร 1 และชยนาท 80 เปนพนธรบ และขาวเหนยวสาย

พนธ กข6 ตนเต�ยไมไวตอชวงแสงเปนพนธให ทาการผสมพนธเพ�อผลตเมลด F1 และคดเลอกดวย

เคร�องหมายโมเลกล จากน�นทาการผสมกลบไปหาพนธรบท�ง 2 พนธ จากผลการทดลองพบวา

สามารถผลตเมลด F1 ของคผสมระหวาง ชยนาท 80 x กข6 จานวน 19 เมลด และสพรรณบร 1 x กข

6 จานวน 82 เมลด และเมลด BC1F1 ของคผสม ชยนาท 80 x กข6 จานวน57 เมลด และสพรรณบร 1

x กข6 จานวน 147 เมลด จากการหา background marker ท�งหมด 11 ตาแหนงพบวา เคร�องหมาย

โมเลกล RM588, RM16626, RM589, RM8225, RM19405, RM20348, RM7434 และ RM19414 ท�

อยบนโครโมโซมท� 6 สามารถแสดงความแตกตางทางพนธกรรมระหวางขาวเจาพนธชยนาท 80

กบ ขาวเหนยวพนธ กข6 ได และเคร� องหมายโมเลกล RM588, RM589, RM6836, RM19405,

RM20342, RM20348 ท�อยบนโครโมโซมท� 6 เคร�องหมายโมเลกล RM25526 ท�อยบนโครโมโซมท�

10 สามารถแสดงความแตกตางทางพนธกรรมระหวางขาวเจาพนธสพรรณบร 1 กบ ขาวเหนยว

พนธ กข6 ได

23

เอกสารอางอง (Reference of Literature cited)

กรมวชาการเกษตร. 2551. [ระบบออนไลน]. แหลงท�มา :http://www.doa .go.th/ germplasm

/rice9.htm (25 เมษายน 2551)

กรมวชาการเกษตร. 2546. สถตการเกษตรของประเทศไทยปเพาะปลก 2544/45 เอกสารวชาการ

ขาวและธญพชเมองหนาวพนธด.

เจตศรณย สวรรณธาน ณฐดนย ทรพยสมบรณ วราภรณ แสงทอง ประวตร พทธานนท และ

ประทป พณตานนท. 2549. การถายทอดพนธกรรมของลกษณะความเปนขาวเจาและขาว

เหนยวโดยการใชเคร�องหมายโมเลกล. เอกสารประกอบการประชมทางวชาการคร� งท� 7

วนท� 25-26 พฤษภาคม 2549. ณ ศนยการศกษาและฝกอบรมนานาชาต มหาวทยาลยแมโจ

เชยงใหม. หนา 35-42.

เจตศรณย สวรรณธาน. 2550. การศกษาผลของยน Wx และ wx ตอผลผลตของขาว. ปรญญาวทยา

ศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาพชไร มหาวทยาลยแมโจ. 131 หนา.

ศนยเมลดพนธขาวชลบร. 2552. http://cbr-rsc.ricethailand.go.th/Chai% 20Nat%2080 .htm. (20

กรกฎาคม 2552)

ประเทศ สทธยศ. 2526. ข�นตอนการวจยเพ�อใหไดขาวพนธด. ว. วทย. กษ. 16 (5):423-427.

Allard RW. 1960. Principles of plant breeding. Wiley, New York. 485 p.

Bradbury LMT, Henry RJ, Jin Q, Reinke RF, Waters DLE. 2005. A perfect marker for fragrance

genotyping in rice. Molecular Breeding 16: 279–283.

Francia E, Tacconi G, Crosatti C, Barabaschi D, Bulgarelli D, Dall’Aglio E and G Vale. 2005.

Marker assisted selection in crop plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 82: 317–

342.

Frisch M, Bohn M and AE Melchinger. 1999a. Minimum sample size and optimum positioning of

flanking markers in marker-assisted backcrossing for transfer of a target gene. Crop Sci

39:967-975.

Frisch M, Bohn M and AE Melchinger. 1999b. Comparison of selection strategies for marker-

assisted backcrossing of a gene. Crop Sci 39:1295-1301.

Newbury HJ. 2003. Marker-assisted breeding. Plant Molecular Breeding. 320 p.

24

Wanchana S, Toojinda T, Tragoonrung S, Vanavichit A. 2003. Duplicated coding sequence in the

waxy allele of tropical glutinuous rice (Oryza sativa L.). Plant Science 165: 1193–1199.