ชื่อหนังสือ คู่มือทางห้อง...
TRANSCRIPT
ชอหนงสอ คมอทางหองปฏบตการตรวจวนจฉยธาลสซเมย และฮโมโกลบนผดปกต
จดทำโดย คณะกรรมการจดทำคมอปฏบตงานการตรวจวนจฉยโรคธาลสซเมย และฮโมโกลบนผดปกตทางหองปฏบตการ
จดพมพ ศนยวจยทางคลนก กรมวทยาศาสตรการแพทยกระทรวงสาธารณสข ถ.ตวานนทอ.เมองจ.นนทบร11000 โทร.029510000ตอ99394 โทรสาร.029510000ตอ99394
พมพครงท1 มนาคม 2552 1,000เลม
พมพท:บรษทหมดเดดจำกด 1213/84ซอยลาดพราว94ถนนลาดพราว แขวงวงทองหลางเขตวงทองหลางกรงเทพฯ10310 โทร02-559-3298-9 www.knockoutblow.com
ขอมลทางบรรณานกรมของหอสมดแหงชาตคณะกรรมการจดทำคมอปฏบตงานการตรวจวนจฉยโรคธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตทางหองปฏบตการ.
คมอทางหองปฏบตการตรวจวนจฉยธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกต.--นนทบร:ศนยวจยทางคลนกกรมวทยาศาสตรการแพทย,2552.
42หนา.
1.ธาลสสเมย–การวนจฉย.2.ฮโมโกลบน.3.การวนจฉยโรคทางหองปฏบตการ.I.ชอเรอง.
616.152075
ISBN:978-611-11-0023-5
III
คำนยม
ดฉนมความยนดเปนอยางยงทกรมวทยาศาสตรการแพทย ไดจดพมพคมอปฏบตงานดาน
การตรวจวนจฉยโรคธาลสซเมยททนสมยกาวหนาและมคณภาพเพอใชในการฝกอบรมและบรการ
ตรวจโรคโลหตจางธาลสซเมยใหถกตองแมนยำรวดเรวทวประเทศจะทำใหแผนการควบคมปองกน
และรกษาโรคนเปนไปไดอยางมประสทธภาพยง
ดฉนขอขอบคณทานคณาจารย ผเชยวชาญจากสถาบนตางๆ ซงรวมมอกนสรางคมอนขนมา
ซงจะเปนคณานประโยชนอยางยงตอผปวยโรคโลหตจางธาลสซเมยและครอบครว อนเปนปญหา
สำคญทางสาธารณสขของประเทศ
ศ.พญ.คณหญงสดสาครตจนดา
ประธานมลนธโรคโลหตจางธาลสซเมยแหงประเทศไทยฯ
คำนำ ธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตเปนโรคโลหตจางเรอรงทางพนธกรรมทเปนปญหาสำคญ
ทางสาธารณสขของประเทศไทยหองปฏบตการทางการแพทยเปนหนวยงานหนงทมบทบาทสำคญใน
การควบคมและปองกนโรคผลการตรวจทนาเชอถอและรวดเรวนบเปนประโยชนทงในดานการรกษา
และพฒนาคณภาพชวตของผปวยตลอดจนการปองกนไมใหมผปวยใหมเพมมากขน
การใหบรการทางหองปฏบตการเพอตรวจวนจฉยธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตถงแมจะ
ดำเนนการมาแลวเปนเวลานานแตยงคงขาดแนวทางปฏบตทเปนมาตรฐานเดยวกนทำใหเกดความ
แตกตางในทางปฏบต หากบคลากรทเกยวของมความเขาใจทไมถกตอง จะสงผลกระทบโดยตรงตอ
ความสำเรจในการควบคมและปองกนโรคธาลสซเมยของประเทศได
กรมวทยาศาสตรการแพทยในฐานะทมภารกจหลกทางหองปฏบตการ เพอสนบสนนการแกไข
ปญหาสาธารณสขของประเทศ จงไดเรยนเชญคณะผเชยวชาญจากมลนธโรคโลหตจางธาลสซเมยแหง
ประเทศไทยกระทรวงสาธารณสขและมหาวทยาลยตางๆรวมกนจดทำคมอทางหองปฏบตการ
ตรวจวนจฉยโรคธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตเพอเผยแพรใหทกหนวยงานทเกยวของถอปฏบต
ใหเปนมาตรฐานเดยวกน
กรมวทยาศาสตรการแพทยขอขอบคณคณะผเชยวชาญทกทานทใหเกยรตเปนคณะกรรมการ
จดทำคมอฉบบน ขอขอบคณสำนกงานหลกประกนสขภาพแหงชาตทสนบสนนงบประมาณดำเนนการ
และหวงเปนอยางยงวาองคความรอนมคณคาทงหมดจะเปนประโยชนในการพฒนาศกยภาพเครอขาย
หองปฏบตการของประเทศ ใหรายงานผลการตรวจวเคราะหธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตได
อยางมคณภาพ อยบนมาตรฐานเดยวกน สามารถสนบสนนการควบคมและปองกนโรคไดอยางม
ประสทธภาพ
(นายแพทยมานตยธระตนตกานนท)
อธบดกรมวทยาศาสตรการแพทย
มนาคม2552
V
นพ.มานตธระตนตกานนท
กรมวทยาศาสตรการแพทย
กระทรวงสาธารณสข
โทร.02-5899862ตอ99001-2
คณะผจดทำ
VI
ศ.เกยรตคณพญ.คณหญงสดสาครตจนดา
มลนธโรคโลหตจางธาลสซเมย
แหงประเทศไทย
โทร.02-4198329
ศ.เกยรตคณพญ.วรวรรณตนไพจตร
ภาควชากมารเวชศาสตร
โรงพยาบาลศรราช
โทร.02-4198329
นพ.สวรรณชยวฒนายงเจรญชย
กรมวทยาศาสตรการแพทย
กระทรวงสาธารณสข
โทร.02-9511429ตอ99008-9
รศ.พนเอกนพ.กตตตอจรส
หนวยโลหตวทยา
กองกมารเวชศาสตร
โรงพยาบาลพระมงกฎเกลา
โทร.02-3547660ตอ93808
ดร.ปราณฟเจรญ
สถาบนวจยและพฒนาวทยาศาสตร
และเทคโนโลย
มหาวทยาลยมหดล
โทร.02-8892557-8
นพ.สมชายแสงกจพร
ศนยวจยทางคลนก
กรมวทยาศาสตรการแพทย
กระทรวงสาธารณสข
โทร.02-9510000ตอ98456
นพ.ชนนทรลมวงศ
ภาควชาอายรศาสตร
โครงการพฒนาระบบสขภาพ
สำหรบธาลสซเมยโรงพยาบาลศรราช
โทร.02-4199488
รศ.ดร.สพรรณฟเจรญ
ศนยวจยและพฒนาการตรวจวนจฉย
ทางหองปฏบตการทางการแพทย
คณะเทคนคการแพทย
มหาวทยาลยขอนแกน
โทร.043-202083
รศ.กลนภาฟเจรญ
ศนยวจยและพฒนาการตรวจวนจฉย
ทางหองปฏบตการทางการแพทย
คณะเทคนคการแพทย
มหาวทยาลยขอนแกน
โทร.043-202083
VII
รศ.พญ.พมพลกษณเจรญขวญ
ภาควชากมารเวชศาสตรคณะแพทยศาสตร
มหาวทยาลยเชยงใหม
โทร.053-945412-5
ผศ.ดร.จำนงคนพรตน
ภาควชาพยาธวทยาคณะแพทยศาสตร
มหาวทยาลยสงขลานครนทร
โทร.074-451567
ผศ.ดร.ณฐยาแซอง
ภาควชาจลทรรศนคลนก
คณะเทคนคการแพทย
มหาวทยาลยขอนแกน
โทร.043-202087
อาจารยชวดนพรตน
ภาควชาพยาธวทยา
คณะแพทยศาสตร
มหาวทยาลยสงขลานครนทร
โทร.074-451562
รศ.ดร.ธนศกดตาต
ศนยวจยโลหตวทยาและเทคโนโลยสขภาพ
คณะเทคนคการแพทย
มหาวทยาลยเชยงใหม
โทร.053-949288
รศ.ดร.กนกวรรณแสนไชยสรยา
ภาควชาจลทรรศนคลนก
คณะเทคนคการแพทย
มหาวทยาลยขอนแกน
โทร.043-202087
นางสรภากรแสงกจพร
ศนยวจยทางคลนก
กรมวทยาศาสตรการแพทย
กระทรวงสาธารณสข
โทร.02-9510000ตอ99394
สทศนยวมลเศรษฐ
ศนยวทยาศาสตรการแพทยขอนแกน
กรมวทยาศาสตรการแพทย
กระทรวงสาธารณสข
โทร.043-240800
นางภทราภรณบญขนท
งานโลหตวทยาโรงพยาบาลราชวถ
กรมการแพทยกระทรวงสาธารณสข
โทร.02-3548108ตอ3620-1
นางนษฐชลหรโอตปปะ
ศนยอนามยท1กรมอนามย
กระทรวงสาธารณสข
โทร. 02-5216550-2 ตอ 105
VIII
นางบญนภาสวรรณกาล
ศนยวทยาศาสตรการแพทยอดรธาน
กรมวทยาศาสตรการแพทย
กระทรวงสาธารณสข
โทร.042-207364-6ตอ110,106
แนวทางการตรวจวนจฉยธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตทางหองปฏบตการ 1
การตรวจคดกรอง
-การตรวจคดกรองธาลสซเมยดวยการทดสอบความเปราะของเมดเลอดแดง 3
-การตรวจคดกรองฮโมโกลบนอ(HbE)ดวยนำยาDCIP 4
-การตรวจคดกรองธาลสซเมยดวยคาดชนเมดเลอดแดง 6
การตรวจวเคราะหชนดและปรมาณฮโมโกลบน(HbTyping&Quantitation) 9
การตรวจวเคราะหความผดปกตของยนทเปนสาเหตของ -thalassemia1 17
การตรวจวเคราะหความผดปกตของยนทเปนสาเหตของ -thalassemia 19
สรปแนวทางการดำเนนงานทางหองปฏบตการ 23
บรรณานกรม 25
ภาคผนวก 27
สารบญ
IX
�
แนวทางการตรวจวนจฉยธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตทางหองปฏบตการ
ธาลสซเมยเปนโรคโลหตจางเรอรงทถายทอดทางพนธกรรม เกดจากความผดปกตของยนท สงเคราะหฮโมโกลบนของเมดเลอดแดงนำไปสการเกดพยาธสภาพกบแทบทกอวยวะในรางกาย ผ ทมยนธาลสซเมยมทงผทเปนโรค และไมเปนโรคหรอพาหะ ผทเปนโรคมอาการแตกตางกน ตงแตมโลหตจางเลกนอยโลหตจางมากเรอรงไปจนถงอาการรนแรงมากจนเสยชวตตงแตอยในครรภมารดาหรอหลงคลอดไมนานสวนผทเปนพาหะมสขภาพปกตเหมอนคนทวไป แตสามารถถายทอดยนทผดปกตไปสลกหลานได อบตการณในประเทศไทยพบวา ประชากรทเปนพาหะมประมาณรอยละ30-40หรอประมาณ18-24 ลานคน มผท เปนโรคประมาณรอยละ 1หรอประมาณ6แสนคนในแตละปจากหญงตงครรภประมาณ 1 ลานคน มหญงตงครรภทเสยงตอการมบตรเปนโรคธาลสซเมยประมาณ5หมนคนและมเดกเกดใหมปวยเปนโรคเพมขนประมาณ 12,000คน ธาลสซเมยจงเปนปญหาสำคญทางการแพทยและสาธารณสข ซงไมเพยงแตมผลตอผปวยและครอบครวเทานน หากยงสงผลกระทบตอเศรษฐกจและสงคมของประเทศอกดวย การแกไขปญหาโรคธาลสซเมยจำเปนตองอาศยความรวมมอของหนวยงานตางๆ ในการดำเนนการควบคมและปองกน แผนการดำเนนการควบคมและปองกนโรค ประกอบดวยการใหความรแกประชาชนและบคลากรทางสาธารณสขการตรวจหาผ ปวยและพาหะ การใหคำปรกษาแนะนำทางพนธกรรมและการตรวจวนจฉยทารกในครรภ ห องปฏบ ต การทางการแพทยน บเป นหนวยงานทมบทบาทสำคญทงในดานการตรวจหาผ ป วยและพาหะ ตลอดจนการตรวจว น จฉ ยทารกในครรภซ งใหขอมลสำคญนำไปใชในการใหคำแนะนำทางพนธกรรมและชวยในการตดสนใจสำหรบสามภรรยาคเสยงทมโอกาสใหกำเนดบตรเปนโรคธาลสซเมยชนดรนแรง3โรคตามนโยบายของ
กระทรวงสาธารณสข ไดแก homozygous -tha-lassemia1(HbBart’shydropsfetalis),homozygousβ-thalassemiaและβ-thalassemia/HbE เนองจากชนดของธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตในประชากรไทยมความหลากหลาย จงไมมการทดสอบใดการทดสอบหนงทางหองปฏบตการทสามารถใหการวนจฉยไดครอบคลมความผดปกตไดทกชนด โดยทวไปการตรวจทางหองปฏบตการเพอการวนจฉยธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตในหญงตงครรภและคสมรสม3ระดบดงน ระดบท 1 การตรวจคดกรอง (screeningtests) เปนขนตอนแรกทมเปาหมายหลกในการคดกรองเอาคนปกตหรอคนทมความผดปกตชนดทไมรนแรงออกไป เพอจะไดไมตองตรวจเลอดตอและเปนการประหยดคาใชจาย คงเหลอแตผทนาจะมความผดปกตของธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตทเขาสกระบวนการตรวจวเคราะหในขนตอนตอไป ระดบท 2 การตรวจวเคราะหชนดและปรมาณฮโมโกลบนในเลอด(Hbtyping)สามารถตรวจวนจฉยธาลสซเมยทไมซบซอนไดเกอบทกชนดทพบบอยในประชากรไทยยกเวนพาหะ -thalassemia ระดบท 3การตรวจวเคราะหระดบดเอนเอ(DNAanalysis)ใชในกรณทผลการตรวจHbtypingในระดบท2ไมสามารถใหการวนจฉยไดชดเจนหรอกรณตองการทราบชนดของมวเตชนของธาลสซเมยทวนจฉยไดในระดบท 2 และกรณการตรวจวนจฉยทารกในครรภทมความเสยงตอการเปนโรคธาลส-ซเมยชนดรนแรง การดำเนนงานทางหองปฏบตการทกขนตอนลวนมความสำคญทงสนบคลากรทเกยวของควรพจารณาใหเหมาะสมตามหลกวชาการและสอดคลองกบขอกำหนดดานคณภาพเพ อใหผลการตรวจวเคราะหมความนาเชอถอ สามารถสนบสนนการควบคมและปองกนโรคธาลสซเมยชนดรนแรงไดอยางมประสทธภาพ
�
�
การตรวจคดกรองเปนการทดสอบอยางงาย
มขนตอนไมยงยากไมตองใชอปกรณราคาแพงและ
บคลากรทมความชำนาญมากนก สามารถทำไดใน
โรงพยาบาลทกระดบคลนกและสถานอนามยตางๆ
การตรวจคดกรองมเปาหมายหลกในการคดกรอง
เอาคนปกต หรอมความผดปกตชนดทไมรนแรง
ออกไป เพอจะไดไมตองตรวจเลอดตอและเปน
การประหยดคาใชจาย ดงนนผลการตรวจคดกรอง
จะตองมความไวสงอาจมผลบวกปลอมไดบางราย
ทผลการตรวจคดกรองเปนลบไมจำเปนตองนำไป
ตรวจยนยนตอการตรวจคดกรองจงชวยลดภาระงาน
และคาใชจายในการตรวจทางหองปฏบตการลงได
มาก โดยเฉพาะอยางยงเมอตองดำเนนงานในกลม
ประชากรขนาดใหญในระดบประเทศ
ในประเทศไทยการตรวจคดกรองทเก ยว
ของในการควบคมและปองกนโรคธาลสซเมยชนด
รนแรงตามนโยบายของกระทรวงสาธารณสข ม 3
การทดสอบคอ
1.การตรวจOF
2.การตรวจDCIP
3.การตรวจหาคาดชนเมดเลอดแดง
แนวทางท 1ประกอบดวยการตรวจosmotic
fragility(OF)รวมกบการตรวจdichlorophenolindo-
phenol(DCIP)precipitation
การตรวจคดกรองธาลสซเมยและฮโมโกลบน
ผดปกตในประชากรไทยสามารถเลอกทำไดจาก 2
แนวทางดงน
แนวทางท 2 ประกอบดวยการตรวจดชน
เมดเลอดแดง(MCV,MCH)รวมกบการตรวจdichlo-
rophenolindophenol(DCIP)precipitation
การตรวจ OF และ MCV/ MCH ใชใน
การตรวจคดกรองความผดปกตท มสาเหตจาก
-thalassemia และ β-thalassemia สวน DCIP
ใชในการตรวจHbE
การตรวจคดกรอง
�
การตรวจคดกรองธาลสซเมยดวยการทดสอบความเปราะของเมดเลอดแดง (osmotic fragility test: OF test)
หลกการ
เม ดเล อดแดงปกตเม ออย ในนำเกลอ
ความเขมขน รอยละ 0.85 จะคงสภาพปกตไวได
แตเมอลดความเขมขนของนำเกลอลงเรอยๆนำจะ
แพรเขาสเซลลเมดเลอดแดงทำใหเซลลบวมขนจน
ถงความเขมขนของเกลอระดบหนงเมดเลอดแดงจะ
แตกการทเมดเลอดแดงแตกงาย(increasedosmotic
fragility)หรอแตกยาก(decreasedosmoticfragility)
ขนอยกบอตราสวนของพนทผนงเซลลตอความเขมขน
ของสารภายในเซลลซ งสวนใหญคอ ฮโมโกลบน
เมดเลอดแดงทมอตราสวนนสงเชนtargetcellและ
hypochromiccellจะแตกยากในขณะทspherocyte
จะแตกงายดงนนในการทดสอบความเปราะของเมด
เลอดแดงเมดเลอดแดงปกตจะแตกไดหมดแตเมด
เลอดแดงของผปวยธาลสซเมยและพาหะธาลสซเมย
ทม target cell และ hypochromic cell จะไมแตก
อยางไรกตามภาวะอนททำใหเมดเลอดแดงมลกษณะ
เปนhypochromiccellเชนภาวะโลหตจางจากการ
ขาดเหลกหรอเปนtargetcellเชนในผปวยโรคตบ
สามารถใหผลบวกปลอมได
สารเคมและนำยา
ปจจบนมนำยาสำเรจรปหลายชนดจำหนาย
การเลอกใชควรพจารณาใหรอบคอบตามขอกำหนด
ดานคณภาพและขอมลอางองทางวชาการ
วธการ
-เปนไปตามมาตรฐานของนำยาทกำหนด
การรายงานผล
-เมอไดผลลบรายงานผล“Negative”
-เมอไดผลบวกรายงานผล“Positive”
การแปลผล
Negative:ไมเปนธาลสซเมยหรออาจเปน
ธาลสซเมยชนดทไมรนแรง เชน -thalassemia 2,
HbConstantSpring,HbPaksè
Positive : อาจเปน -thalassemia หรอ
-thalassemia โดย -thalassemia มโอกาส
เปนไดทงชนด -thalassemia 1 และบางรายของ
-thalassemia2สวน -thalassemiaกอาจเปนไดทง0-หรอ +-thalassemiaเมอผลการตรวจเปนpositive
ตองสงตวอยางเลอดตรวจHbtypingและดเอนเอ
ตอไป
ขอจำกดของการทดสอบ
1.การทดสอบOFเปนการตรวจคดกรองท
มวตถประสงคในการคดกรองα-thalassemia1และ
β-thalassemiaเปนหลกเทานนไมสามารถใชในการ
วนจฉยชนดของความผดปกตได
2.ผทเปนพาหะHbEบางรายอาจใหผลบวก
บางรายอาจใหผลลบกบการทดสอบน
3. อาจพบผลบวกลวงในภาวะโลหตจาง
จากการขาดเหลกและจากความผดปกตอนๆทพบ
targetcellเชนโรคตบ
�
หากไมสามารถทำการทดสอบไดท นท
หลงไดรบเลอด ควรเกบไวในตเยน 4ºC ไมควร
เกบไวนานเกน 48 ชวโมง ถาไมมตเยนตองเกบใน
กระตกทมนำแขง และทำการทดสอบภายใน 24
ชวโมง เนองจากเลอดเกาเมดเลอดแดงบางสวนม
การเสอมสภาพทำใหแตกงายเกดผลลบปลอมได
3.การควบคมคณภาพวธการทดสอบ
- นำยาทเกบในตเยน ควรนำออกมาวาง
ทอณหภมหองไมนอยกวา 15 นาท และเขยากอน
นำมาใชงาน
-ปเปตทพ(pipettetip)ควรใชของใหมเนอง
จากปเปตทพทนำมาลางเพอใชใหมอาจมสารตกคาง
และไมแหงสนท ทำใหเมดเลอดแดงแตก เกดผล
ลบปลอมได
- ไมควรใชเครองผสมสารละลาย (vortex
mixer)ผสมเลอดกบนำยาเพราะจะทำใหเมดเลอด
แดงแตกจากแรงเหวยงทำใหเกดผลลบปลอมได
- ระยะเวลาในการทำปฏกรยากอนอานผล
จะตองปฏบตตามรายละเอยดในเอกสารกำกบนำยา
อยางเครงครด เพอใหเมดเลอดแดงปกตแตกอยาง
สมบรณ
4.การอานผลไมควรนำมาอานผลทละหลอด
ควรใสrackยกขนอานทละแถวประมาณ10-12หลอด
จะไดมผลการทดสอบทงบวก และลบเปรยบเทยบไป
พรอมกน โดยมโคมไฟใหแสงพอด (ไมจาเกนไป)
สองจากดานบนลงมาทหลอด ตวอยางทใหผลขน
ไมชดเจน(weaklypositiveหรอsuspicious)มกเปน
ตวอยางเลอดของผทเปนพาหะHb Eบางราย และ
พาหะ -thalassemia 2 สำหรบในกรณทเปนพาหะ
Hb E ถาทำการตรวจคดกรองDCIP ดวย ตวอยาง
เหลานนกจะใหผลบวกชดเจนกบDCIP
การควบคมคณภาพ
1. ควรทำการตรวจสอบคณภาพของนำยา
กอนนำมาใชในงานบรการ โดยทำการทดสอบกบ
เลอดควบคมคณภาพ ซงมแนวทางในการเลอกตว
อยางเลอดควบคมคณภาพจากเลอดผใหญในงาน
ประจำวนดงน
ตวอยางควบคมผลลบ (Negative control)
MCV>85fL,MCH>28pgและHb>13.0g/dL
(ผชาย)หรอHb>12.0g/dL(ผหญง)
ตวอยางควบคมผลบวก (Positive control)
MCV<75fL,MCH<25pgและHb>11.0g/dL
(ผชาย)หรอHb>10.0g/dL(ผหญง)
เม อน ำยาผ านกระบวนการตรวจสอบ
คณภาพกอนใชงานแลวจงนำไปใชใหบรการ โดย
ในการทำงานประจำใหแบงเกบตวอยางเลอดทให
ผลการตรวจคดกรองเปนบวกและลบอยางละ1-2
ตวอยางไวในตเยน4ºCสำหรบใชเปนเลอดควบคม
คณภาพนำยาสำหรบการทดสอบในวนตอไป และ
เกบใหมวนตอวนไปเรอยๆ
2.การเกบตวอยางเลอดทไมเหมาะสมอาจ
ทำใหผลการตรวจผดพลาดไดเชนปรมาณเลอดกบ
EDTAมสดสวนทไมเหมาะสมถาปรมาณเลอดนอย
EDTAเหลอมากจะทำใหนำแพรออกจากเซลลเมด
เลอดแดงทำใหเมดเลอดแดงเหยว(crenatedRBC)
จะใหผลบวกปลอมตอการทดสอบไดในทำนองตรง
ขามถาเจาะเลอดมากเกนหรอผสมเลอดกบสารกน
เลอดแขงไมด เลอดบางสวนแขงตว (partial clot)
ทำใหผลการตรวจไมถกตอง
�
การตรวจคดกรอง ฮโมโกลบน อ (Hb E) ดวยนำยา DCIPdichlorophenolindophenol precipitation test
HbE(2 2
26Glu-Lys)เปนฮโมโกลบนผดปกต
ท กรดอะมโนตำแหนงท 26 ของสาย -globin
เปลยนจากกรดกลตามก(glutamic:Glu)เปนไลซน
(lysine:Lys)ทำใหโครงสรางทจดสมผสระหวางสาย
โกลบน1 1
ไมแขงแรงเมออยในสารละลายDCIP
จะถกออกซไดซใหกลายเปนโกลบนสายเดยวทม
ซลฟไฮดรลอสระจงตกตะกอนไดงาย และเรวกวา
ฮโมโกลบนปกต โดยปรมาณความขนของตะกอน
ทเกดขนจากตวอยางเลอดของHbEhomozygote
จะมากกวาของพาหะHbE
หลกการ
สารเคมและนำยา ป จจ บ นม น ำยาสำเร จร ปหลายชน ด
จำหนาย การเลอกใชควรพจารณาใหรอบคอบตาม
ขอกำหนดดานคณภาพและขอมลอางองทางวชาการ
วธการ
-เปนไปตามมาตรฐานของนำยาทกำหนด
การรายงานผล
-เมอไดผลลบรายงานผล“Negative”
-เมอไดผลบวกรายงานผล“Positive”
การแปลผล
Negative:ไมมHbE
Positive:อาจเปนผทมHbEซงพบไดทง
ทเปนพาหะHbE,HbEhomozygoteหรอ -tha-
ขอจำกดของการทดสอบ
-HbHซงเปนฮโมโกลบนทไมเสถยรถาม
ปรมาณมากจะถกออกซไดซตกตะกอนเกดผลบวกได
-ไมควรใชกบheparinizedbloodเนอง
จากheparinรบกวนการตรวจวดและกอใหเกดผล
บวกปลอมได
การควบคมคณภาพ
1. ควรทำการตรวจสอบคณภาพของนำยา
กอนนำมาใชในงานบรการ โดยทำการทดสอบกบ
เลอดควบคมคณภาพ ซงมแนวทางในการเลอกตว
อยางเลอดควบคมคณภาพจากเลอดผใหญในงาน
ประจำวนดงน
ตวอยางควบคมผลลบ (Negative control)
เปนตวอยางเลอดทมชนดของHbเปนA2A
ตวอยางควบคมผลบวก (Positive control)
เปนตวอยางเลอดทมชนดของHbเปนEA
ไมควรใช EE เพราะใหผลบวกแรงเกนไป
หองปฏบตการสามารถเกบตวอยางเลอด
ดงกลาวไวในตเยน4ºCสำหรบใชเปนเลอดควบคม
คณภาพตอไปได1สปดาห
ในกรณท ไม สามารถหาตวอยางเล อด
ดงกลาวไดผปฏบตสามารถใชตวอยางเลอดทเหลอ
lassemiaและหรอ -thalassemiaทมHbEรวมดวย
ตองสงตวอยางเลอดตรวจHbtypingตอไป
�
จากการตรวจคดกรองทใหผลการตรวจเปนบวกและ
ลบอยางละ1-2รายเกบไวในตเยน2-8ºCเพอใช
ควบคมคณภาพสำหรบการทดสอบครงตอไป และ
เกบเลอดใหมทกครงททำการทดสอบไปเรอยๆ
2. ตวอยางเลอดทนำมาทดสอบควรเปน
เลอดทเจาะใหมในวนนน หากไมสามารถทำการ
ทดสอบไดทนท ควรเกบเลอดไวในต เยน 4ºC
และไมควรเกบไวนานเกน1สปดาหแตถาไมมตเยน
เกบควรทำการทดสอบภายใน48ชวโมงเนองจาก
เลอดท เกาฮโมโกลบนบางสวนจะถกออกซไดซ
ไปแลวสงเกตไดจากเลอดมการเปลยนแปลงเปน
ส แดงคลำไม ใช แดงสดเหมอนเล อดเจาะใหม
เมอนำไปทำปฏกรยากบDCIPจะตกตะกอนไดงาย
ขนจนเกดผลบวกปลอมได
3. อณหภมท ทำปฏกรยาจะตองเทากบ
37±1ºC และเวลาท ใหทำปฏกร ยาจะตองตรง
ตามทระบในเอกสารกำกบนำยา ดงนนอางนำหรอ
บลอกควบคมอณหภม(heatblock)จะตองมระบบ
ตรวจสอบความถกตองของอณหภมเปนประจำ
เพราะถาอณหภมตำกวา 36ºC จะใหผลลบปลอม
แตถ ามากกวา 38ºC กจะใหผลบวกปลอมได
ขอควรระวง
นำยา DCIP เปนนำยาสนำเงนเขม มความไวตอแสง อากาศ และอณหภมทสงจงตองเกบนำยาในภาชนะทมฝาปดสนทบรรจในกลองเพอไมใหโดนแสงเกบในตเยน4ºC
หากทำการทดสอบแลวมผลลบหรอบวกทกตวอยาง
ใหตรวจสอบเร องอณหภม ท ทำปฏก ร ยาเปน
อนดบแรก สำหรบประเดนในเรองเวลาทำปฏกรยา
จะพบความผดพลาดไดมากกวา ถาผปฏบตทำการ
ทดสอบคร งละหลายตวอยาง (เชนมากกวา 10
ตวอยางตอครง) โดยเฉพาะถาทำการทดสอบใน
หองทไมไดปรบอากาศ และมอณหภมหองสงกวา
30ºC ตวอยางรายแรกๆ ทเตมเลอดลงไปในนำยา
ระหว างท รอเต มต วอย างเล อดรายตอๆ ไป
จนครบรายสดทายไดเกดปฏกร ยาไปบางสวน
แลว เมอนำไปอนตออก 15 นาท อาจทำใหเกด
ผลบวกปลอมได
4. การควบคมคณภาพการอานผลทำ
เชนเดยวกบการอานผลOF
�
การตรวจคดกรองธาลสซเมยดวยคาดชนเมดเลอดแดง
ในการตรวจหาคาดชนเมดเลอดแดง (red
bloodcellindices)คาทนยมใชในการตรวจคดกรอง
ธาลสซเมยคอคาMCVและMCHโดยเมดเลอด
แดงของผทเปนธาลสซเมยจะมคาMCVและMCH
ตำกวาเมดเลอดแดงคนปกต โดยใชตามเกณฑของ
WeatherallDJและCleggJBคอMCV<80fL
และ/หรอMCH<27pgซงมความไวสงพอในการ
คดกรองพาหะ -thalassemia1และ -thalassemia
วธการและการรายงานผล รายงานคาตามทวเคราะหได
การแปลผล MCV < 80 fL และ/หรอ MCH < 27 pg :อาจเปน -thalassemiaและหรอ -thalassemiaและหรอ Hb E โดย -thalassemia มโอกาสเปนไดทงชนด -thalassemia1และ -thalassemia2สวน-thalassemiaกมโอกาสเปนไดทง 0-thalassemiaและ +-thalassemia MCV > 80 fL และ MCH > 27 pg :ไมเปนธาลสซเมย หรออาจเปนธาลสซเมยชนดไมรนแรงเชน -thalassemia2,HbConstantSpring,HbPaksèหรออาจมHbE
ขอจำกดของการทดสอบ 1. การคดกรองดวยคาดชนเมดเลอดแดง
จำเปนตองทำการทดสอบกบเมดเลอดทเจาะใหม
หรอทเกบรกษาไวในตเยน 4ºC ไมเกน 24 ชวโมง
เนองจากเมดเลอดแดงเปนเซลลทมชวต มการใช
พลงงานในกระบวนการเมตาบอลซมเพอคงสภาพ
เซลลไวตลอดเวลาเมอพลงงานลดลงเซลลเมดเลอด
แดงกจะเปลยนแปลงรปรางและแตกในทสด
2.ประมาณรอยละ20-40ของพาหะHb
EมคาMCVและMCHมากกวา80fLและ27
pg ตามลำดบ จงจำเปนตองตรวจดวยวธ DCIP
รวมดวย
การควบคมคณภาพ
หองปฏบตการตองมแนวทางการปฏบตงานเพอคงมาตรฐานเครองมอตามเกณฑมาตรฐานทกำหนด รวมทงมการควบคมคณภาพภายในหองปฏบตการ(internalqualitycontrol)ดวยวสดควบคมคณภาพทไดมาตรฐานและเขารวมเปนสมาชกexternalqualityassuranceหรอproficiencytestingprogramและม การบำร งร กษาเคร องม อเป นประจำสมำเสมอ
�
การตรวจวเคราะหชนดและปรมาณฮโมโกลบน (Hb typing & quantitation)
ปจจบนการตรวจวเคราะหชนดและปรมาณ
ฮโมโกลบน เพอวนจฉยธาลสซเมยและฮโมโกลบน
ผดปกตทางหองปฏบตการนยมใชเครองมออตโนมต
เนองจากมขอดหลายประการอาทเชนความสะดวก
รวดเรวในการปฏบตงาน เครองสามารถตรวจไดทง
ชนดและปรมาณของฮโมโกลบนไดอยางตอเนอง
ในขนตอนเดยวกน จงไมยงยากและไมตองอาศยผ
ทมความชำนาญสงอกทงยงมความถกตองแมนยำ
และเปนทยอมรบในระดบสากล ปจจบนเครองมอ
อตโนมตสำหรบวเคราะหชนดและปรมาณฮโมโกล
บนทมใชในประเทศไทยม2หลกการคอ
1. หลกการโครมาโตกราฟอดแรงดน มทง
ประเภทแรงดนสง(highpressureliquidchromato
graphy:HPLC)และแรงดนตำ(lowpressureliquid
chromatography : LPLC) โดยมหลกการเดยวกน
คอ เปนคอลมนโครมาโตกราฟแบบแลกเปลยน
อออนชนดบวก (cation exchange column chro-
matography) สวนคอลมนบรรจอนภาคขนาดเลก
(spherical silica gel) เคลอบดวยสารคารบอกซล
(carboxyl) ซงมประจลบ ทำหนาทเปน stationary
phase จบกบประจบวกของฮโมโกลบนทผานเขา
ไปในคอลมนทางระบบสงสารตวอยาง (sample
injector)จากนนฮโมโกลบนแตละชนดจะถกชะลาง
(elute) ออกจากคอลมนดวยบฟเฟอร (mobile
phase)ทมความแรงของประจ (ionicstrength)สง
กวาความแรงของประจของฮโมโกลบนทจบอยกบ
stationary phase แตเนองจากในตวอยางเลอดม
ฮโมโกลบนปนกนหลายชนด แตละชนดม ionic
strength ไมเทากน เครองอตโนมตเหลานจงตองม
โปรแกรมควบคมการผสมบฟเฟอร2ชนดทมionic
strengthตางกนเพอใหมการเปลยนแปลงของionic
strength ทเหมาะสมสำหรบฮโมโกลบนแตละชนด
ระยะเวลาทฮโมโกลบนแตละชนดคงอยในคอลมน
เรยกวาretentiontime(RT)ซงเปนคณสมบตเฉพาะ
ของแตละฮโมโกลบนจากนนฮโมโกลบนทถกชะออก
มาจะถกสงผานไปยงเครองตรวจวดคาการดดกลน
แสง(spectrophotometerdetector)ทความยาวคลน
ท เหมาะสม แลวสงขอมลไปยงสวนประมวลผล
เพอวเคราะหฮโมโกลบนชนดตางๆอางองตามRT
ของฮโมโกลบนมาตรฐาน และรายงานผลเปน 2
ลกษณะ คอ รายงานโครมาโตแกรม แสดงการดด
กลนแสงของฮโมโกลบนทถกชะลางผานคอลมน
ออกมาในเวลาตางๆ (หรอนยมเรยกกนวา peak)
และรายงานปรมาณฮโมโกลบนแตละชนดตามพน
ทใตกราฟในชวงเวลาทกำหนด
2.หลกการแยกดวยกระแสไฟฟาความตาง
ศกยสงในหลอดแกวนำไฟฟาขนาดเลก (capillary
electrophoresis)อาศยการแยกชนดฮโมโกลบน
ดวยกระแสไฟฟาความตางศกยสง (10,000-30,000
volts) ผานตวกลาง คอหลอดแกวนำไฟฟาขนาด
เลกมาก (silica capillary) ท มเสนผาศนยกลาง
25-100 ไมโครเมตร (high voltage capillary elec-
trophoresis) โดยปลายทงสองขางของหลอดแกว
จมอยในบฟเฟอรทเปนดาง (alkali buffer pH 9.4)
เมอปลอยกระแสไฟฟา เขาไปจะเกดการเคลอนท
ของฮโมโกลบนชนดตางๆ ทมประจสทธแตกตาง
กนไปตามแรงขบเคลอนไฟฟา (electro osmotic
flow) โดยตวอยางจะถกปลอยเขาไปในหลอด
แกวทางดานข วบวก เคล อนท ไปยงข วลบผาน
เครองตรวจวดการดดกลนแสงความยาวคลน 415
นาโนเมตร (detector) และระบบแปลงสญญาณ
แลวรายงานผลออกมา เรยกวา electrophore-
�0
gram (เทยบไดกบ chromatogram จากเคร อง
HPLC หรอ LPLC) โดยกอนการตรวจวเคราะหใน
ตวอยางเลอดจะมการปรบมาตรฐานตำแหนงของ
ฮโมโกลบนใหHbAอยตรงกลางของหนาตางelec-
trophoregram จากตวอยางควบคมคณภาพกอน
โดยฮโมโกลบนชนดตางๆทมในตวอยางเลอดจะถก
กำหนดเปนโซนเรยกวา โซน 1- โซน 15 ใน elec-
trophoregram ท ปรากฏโดยอางองจาก Hb A
และหรอHbA2ของตวอยางนนในกรณทตวอยาง
เลอดทตรวจวเคราะหไมม Hb A และหรอ Hb A2
เคร องจะอางองชนดฮโมโกลบนจากตวอยางท
วเคราะหกอนหนาน และจะไมปรากฏแถบโซนใน
electrophoregram
วสดอปกรณ นำยา และวธการ
เคร องมอของแตละบรษทมรายละเอยดแตกตางกนออกไป ผปฏบตควรไดรบการฝกอบรมทงในดานการเตรยมตวอยางเลอด การใชและบำรงรกษาเครองมอ ตลอดจนการอาน และการวเคราะหผลจากผเชยวชาญของบรษทและผทรงคณวฒในสาขาทเกยวของกอนการใหบรการทางหองปฏบตการ
การรายงานผล
รายงานชนดฮโมโกลบนจากโครมาโตแกรม
ทปรากฏออกมาจากสวนแสดงผลพรอมทงรายงาน
ปรมาณHbA2/EและHbFทเครองคำนวณใหโดย
การรายงานชนดฮโมโกลบนทพบบอยในประเทศไทย
คอHbConstantSpring,HbA2/E,HbF,HbA,
HbBart’sและHbH
เครองวเคราะหฮโมโกลบนอตโนมต หลกการ Capillary Electrophoresis รายงานชนดฮโมโกลบนตามลกษณะelectro-
phoregramทปรากฎและปรมาณฮโมโกลบนชนดตางๆ
ทเครองวเคราะหใหเหมอนกบ การตรวจวเคราะห
การแปลผลการวเคราะหฮโมโกลบน (Hb Typing) ทพบบอยในประชากรไทย
1.ในกรณทผลการวเคราะหHbtypingเปนA2A
และปรมาณHbA2นอยกวา4.0%พบไดในหลายกรณ
ดงน
1.1คนปกตทไมเปนธาลสซเมยหรออาจเปน
ธาลสซเมยชนดไมรนแรง กลมนผลการตรวจทาง
โลหตวทยาพบวาMCV,MCHและBloodSmear
ปกต
1.2 ผ ท เป นพาหะ -thalassemia 2
และผทเปนhomozygous -thalassemia2กลมน
โดยทวไปจะไมมอาการซดHbมากกวา10g/dLคา
MCVมคาตงแต70fLจนถงมากกวา80fL
1.3ผทเปนพาหะ -thalassemia1กลมน
โดยทวไปจะไมมอาการซด Hb มากกวา 10 g/dL
(ถาไมมภาวะอนแทรกซอน) blood smear พบเมด
เลอดแดงผดปกตเลกนอยและสวนใหญมคาMCV
นอยกวา80fLและMCHนอยกวา27pg
เนองจากผลการตรวจHbtypingไมสามารถ
แยกผทเปนพาหะ -thalassemia1พาหะ -tha-
lassemia 2 และ homozygous -thalassemia 2
ออกจากคนปกตทไมเปนธาลสซเมยหรอผทเปน
เครองวเคราะหฮโมโกลบนอตโนมต ระบบคอลมนโครมาโตกราฟ (HPLC และ LPLC)
ดวยระบบอนๆ แตเนองจากเครอง high voltage
capillary electrophoresis มศกยภาพในการแยก
HbA2กบHbEออกจากกนไดในขณะทเครองอน
ทอาศยหลกการคอลมนโครมาโตกราฟ ไมสามารถ
แยกออกจากกนไดคาอางองของHbA2และHbE
ในผทเปนธาลสซเมยชนดตางๆทมHbEจงแตกตาง
จากเครองอนๆซงปรมาณHbEทวดไดจะมปรมาณ
HbA2รวมอยดวยหากตองการใชคาอางองตามท
ยอมรบกนในปจจบน โดยเฉพาะอยางยงพาหะHbE
ทสงสยวาจะมยนแฝง -thalassemia1ซงใชคาcutoff
ทHbE<25%สามารถทำไดโดยการรวมปรมาณ
HbA2กบHbEเขาดวยกนได
��
ขอควรระวง
5.ในกรณทผลการวเคราะหHbtypingเปนEE
โดยมปรมาณHbE>80%และHbF<5%แปลผลเปน
homozygousHbEwithorwithout -thalassemia
เนองจากผทเปน homozygous Hb E ทงทมและ
ไมมยนแฝง -thalassemiaรวมมผลการตรวจHb
typingทคลายคลงกนตองตรวจวเคราะหDNAเทา
นนจงจะใหการวนจฉยการมยนแฝง -thalassemia
ไดโดยทวไปhomozygousHbEมคาHbมากกวา
10 g/dLMCV ประมาณ 60-70 fL ผลการตรวจ
blood smear พบเมดเลอดแดงมการเปลยนแปลง
ทงขนาดและรปราง พบ target cell จำนวนมาก
หากทำการตรวจคดกรองดวยDCIPจะใหผลบวก
6.ในกรณทไมแนใจวาผลการวเคราะหHb
typing เปน EEหรอ EF เนองจากปรมาณHb F
เพมขนจากทระบในขอ5ทำใหสบสนในการรายงาน
ผลวาเปน EE หรอ EF ดงนนจงอาจรายงานเปน
EE/EFและแปลผลเปน“suspectedhomozygous
HbEor -thalassemia/HbEwithorwithout
-thalassemiaกรณาดclinicalหรอทำfamilystudy
ประกอบการแปลผล” เนองจากความผดปกต 2
ชนดนมจโนไทปทตางกนและมความรนแรงตางกน
การวนจฉยแยกชนดตองพจารณาผลการตรวจอนๆ
ประกอบดวยหากเปนEEคอhomozygousHbE
จะไมเปนโรคธาลสซเมยทรนแรงดงรายละเอยดในขอ
5แตถาเปนEFกจะเปนโรค -thalassemia/HbE
ซงผลการตรวจทางโลหตวทยาจะพบความรนแรง
มากกวาดงรายละเอยดในขอ12
7.ในกรณทผลการวเคราะหHbtypingเปน
CSA2AแปลผลเปนsuspectedHbConstantSpring
อยางไรกดฮโมโกลบนผดปกตนอาจเปนHbPakse
ไดเนองจากฮโมโกบนผดปกต2ชนดนมจำนวนกรด
อะมโนของสาย -globinมากกวาปกต31ตวเทากน
และถงแมจะมกรดอะมโนตำแหนงท 142 ตางกน
โดยทHbConstantSpringเปนกลตามน(Glutamine:
Glu) สวน Hb Pakse เปนไทโรซน (Tyrosine:Tyr)
แตประจสทธไมตางกน จงตรวจพบในตำแหนง
เดยวกนทงการแยกดวยกระแสไฟฟาและการตรวจ
ธาลสซเมยชนดไมรนแรงได หากผลการตรวจพบHb
typingA2AโดยHbA
2นอยกวา4.0%หองปฏบตการ
สามารถแปลผลเปนnormalHbtyping,notruleout
-thalassemia
2.ในกรณท ผลการวเคราะหHbtyping
เปนA2AและปรมาณHbA
2>4.0%แปลผลเปน
-thalassemiatraitwithorwithout -thalassemia
สวนใหญมปรมาณHbA2ประมาณ4-7.5%MCV
ประมาณ60-75fLผลการตรวจbloodsmearพบ
เมดเลอดแดงผดปกตเลกนอย หากทำการตรวจ
คดกรองดวย OF และ DCIP จะใหผลบวกกบ
การทดสอบ OF test แตใหผลลบกบการทดสอบ
DCIP
- ในพาหะ -thalassemia ทม -thalas
semia1รวมดวย(doubleheterozygote)ปรมาณ
HbA2อาจตำลงบางรายอาจตำกวา 4%และคา
MCVอาจจะสงขนเปน78-80fLทำใหการวนจฉย
ผดพลาดได
-ในบางภมภาค +-thalassemiaบางชนด
อาจมคาMCVเลกและมปรมาณHbA2อยในชวง
3.5-4% ได หากคสมรสเปนพาหะ -thalassemia
ควรพจารณาสงตรวจหาชนดของmutationตอไป
3.ในกรณทผลการวเคราะหHbtypingเปน
EAและปรมาณHbE25–35%แปลผลเปนHbEtrait
โดยทวไปผทเปนพาหะHbEจะมคาMCVประมาณ
75-85fLหากทำการตรวจคดกรองดวยOFสามารถ
ใหผลไดทงบวกและลบแตผลการตรวจคดกรองดวย
DCIPจะใหผลบวก
4. ในกรณทผลการวเคราะห Hb typing
เปน EA และปรมาณHb E < 25% แปลผลเปน
Hb E trait with or without -thalassemia
โดยทวไปผทเปนพาหะ Hb E รวมกบพาหะ -
thalassemia1พบHbEประมาณ19-21%MCV
ประมาณ 60-75 fL ผลการตรวจคดกรองดวย OF
และDCIPเปนบวกทงค
��
ดวยเครองวเคราะหฮโมโกลบนอตโนมต HPLC
หรอLPLCแตจะรายงานผลจากการตรวจวเคราะห
ฮโมโกลบนเปนHbConstantSpringเนองจากHb
ConstantSpringมความชกในการตรวจพบมากกวา
Hb Pakse โดยทวไปผทเปนพาหะจะไมซด และม
ขอมลทางโลหตวทยาอนๆอยในเกณฑปกต
8.ในกรณทผลการวเคราะหHbtypingเปน
CSA2ABart’sแปลผลเปนsuspectedhomozygous
Hb Constant Spring ซงผปวยมกมภาวะซดคลาย
ผทเปนโรคHbHอยางไรกตามอาจตรวจไมพบHb
Bart’sไดเนองจากสาย -globinมปรมาณนอย
9. ในกรณทผลการวเคราะห Hb typing
เปน A2A H หรอ A
2A Bart’s H ปรมาณHb A
2
คอนขางตำกวาปกต แปลผลเปน Hb H disease
( -thalassemia 1/ -thalassemia 2) เนองจาก
การตรวจพบ Hb H (4) หรอ Hb Bart’s (
4)
แสดงวาสาย -globinจะตองมปรมาณนอยลงมาก
จงทำใหสาย -globinและสาย -globinเหลออยมาก
จงจบกนเอง4สายกลายเปนHbHและHbBart’s
ในผปวยบางรายอาจไมพบHbBart’sเนองจากสาย
-globinมปรมาณนอยผลการตรวจbloodsmear
ในผ ปวยกล มน พบลกษณะเมดเลอดแดงแบบ
ธาลสซเมย แตมลกษณะผดปกตประมาณ 1+ ถง
2+ ลกษณะจำเพาะทใชวนจฉยโรค Hb H ไดด
คอการตรวจพบเมดเลอดแดงทม inclusion body
โดยอาจตรวจพบเมดเลอดแดงเชนนไดถง 30-90%
ของเมดเลอดแดงทงหมด
10.ในกรณทผลการวเคราะหHbtyping
เปนCSA2AHหรอCSA
2ABart’sHแปลผล
เปน Hb H-CS disease ( -thalassemia 1/
Hb CS หรอ -thalassemia 1/ Hb Pakse )
อาการตางๆ จะคลายผทเปนโรค Hb H disease
( -thalassemia 1/ -thalassemia 2) ในขอท 9
แตอาการมกจะรนแรงกวาเนองจากมความไมเสถยร
ของHbHรวมกบHbCSหรอHbPakse และขอ
ควรระวงสำหรบหองปฏบตการคอ ความไมเสถยร
รวมกบมปรมาณนอยของHbHและHbCSหรอ
HbPakse หากเกบเลอดไวนานเกนไปอาจตรวจไม
พบทำใหการแปลผลผดพลาดได
11. ในกรณทผลการวเคราะห Hb typing
เปน A2F ในเดกอายมากกวา 1 ป รวมกบการม
อาการของโรคธาลสซเมยชดเจน ซด ตบมามโต
แปลผลเปนhomozygous o-thalassemiawithor
without -thalassemia จากการทตรวจไมพบHbA
แสดงวาผปวยสงเคราะหสาย -globin ไมไดเลย
จงมการสงเคราะหสาย -globin ขนมาทดแทน
ทำใหตรวจพบHbFมปรมาณสงมากสวนปรมาณ
Hb A2 อาจสงขนเลกนอยหรออยในเกณฑปกต
ผลการตรวจbloodsmearพบเมดเลอดแดงมลกษณะ
ผดปกตมากกวาในโรคHbHไมพบHbHinclusion
body ในเมดเลอดแดง แตผปวยทตดมามแลวอาจ
จะพบตะกอนของฮโมโกลบนในเมดเลอดแดงได
ข อควรระว งหากพบผลการว เคราะห
ฮ โมโกลบนเปน A2F คอ ตองตรวจสอบอาย
ของผ ปวยใหด ถาเปนเดกทารกท อายยงไมถง
1 ป จะไมสามารถวนจฉยจโนไทปท แนนอนได
เนองจากปรมาณHbFยงคงสงอยตองรอใหHbF
คอยๆลดลงจนอายมากกวา1ปจงสามารถแปลผล
การตรวจHbtypingได
12.ในกรณทผลการวเคราะหHbtyping
เปน EF โดยมปรมาณ Hb E ประมาณ 40-80%
Hb F ประมาณ 20-60% ไมพบ Hb A พบได
ในหลายกรณดงน
12.1กรณทเปนผปวย 0-thalassemia/Hb
Ewith orwithout -thalassemia ผปวยมอาการ
ของโรคธาลสซเมยชดเจน ซด ตบมามโต คลาย
homozygous 0-thalassemia หรออาจนอยกวา
โดยทวไปผปวยกลมนมปรมาณHb4-10g/dL
MCVประมาณ55-75fLผลการตรวจbloodsmear
พบเมดเลอดแดงทมการเปลยนแปลงทงขนาดและ
รปราง อาจพบเมดเลอดแดงตวออน (nucleated
red cell) ในกรณทผ ปวยไดรบการรกษาโดยการ
ใหเลอดมาแลวอาจพบHbAจากdonor blood
ทำใหปรมาณ Hb E และ Hb F เปลยนแปลงไป
��
ถาไมทราบประวตการรบเลอดมากอนจะทำใหการ
วนจฉยผดพลาดได
12.2กรณทผปวยมdeletionalHPFHรวมกบ
HbEโดยทวไปผปวยกลมนจะไมซดมปรมาณHb>
10g/dLผลการตรวจbloodsmearพบลกษณะเมด
เลอดแดงคอนขางปกตรายงานผลเปนsuspected
HPFH/HbE
เนองจากผลการตรวจHbtypingไมสามารถ
แยกผทเปน 0-thalassemia/HbEและHPFH/Hb
E ออกจากกนได หากผลการตรวจพบ Hb typing
EF โดยมปรมาณHbEประมาณ40-80%HbF
ประมาณ 20-60% ไมพบ Hb A หองปฏบตการ
สามารถแปลผลเปนsuspected 0-thalassemia/Hb
EorHPFH/HbEwithorwithout -thalassemia
13.ในกรณทผลการวเคราะหHbtypingเปน
A2FAโดยปรมาณHbF10–30%พบไดในหลายกรณ
ดงน
13.1 ในกรณทผปวยมภาวะซดไมมประวต
การรบเลอดภายใน3เดอนกอนทำการตรวจเลอด
ควรแปลผลเปน suspected 0-thalassemia/ +-
thalassemiaหรอ +-thalassemia/ +-thalassemia
13.2 ถาไมมอาการของโรคธาลสซเมย
เลยกอาจเปนไปไดวาตวอยางเลอดรายนนเปน
พาหะHPFHหรอพาหะ( )o-thalassemiaซงเปน
ภาวะทยน -globinสรางสาย -globinไดในปรมาณ
สงโดยไมแสดงอาการผดปกตใดๆ ควรแปลผลเปน
suspectedHPFHtraitor( )o-thalassemiatrait
เนองจากผลการตรวจHbtypingไมสามารถ
แยกผทเปน 0-thalassemia/ +-thalassemia, +-tha-
lassemia/ +-thalassemia,พาหะHPFHและพาหะ
( )o-thalassemiaออกจากกนไดหากผลการตรวจพบ
HbtypingA2FAโดยปรมาณHbF10–30%
หองปฏบตการสามารถแปลผลเปนsuspected0-thalassemia/ +-thalassemiaor +-thalassemia/
β+-thalassemiaorHPFHtraitor( )o-thalassemiatrait
withorwithout -thalassemiaอยางไรกตามการ
ตรวจพบ Hb F ในตวอยางเลอดผปวย กอนทจะ
ทำการวนจฉยใดๆตองตรวจสอบอายของผปวยกอน
เสมอหากอายยงไมครบ1ปจะยงไมสามารถใหการ
วนจฉยท ถ กตองได นอกจากน นควรพจารณา
อาการทางคลนกประกอบ หากไมมอาการของโรค
ธาลสซเมยเลยกอาจเปนไปไดวาผปวยมภาวะHPFH
��
ขอจำกด
1. เคร องวเคราะหฮโมโกลบนอตโนมต
แสดงผลในลกษณะโครมาโตแกรมหรอโซนตางๆ
ทปรากฎรวมกบปรมาณของฮโมโกลบนแตละชนด
โดยไมไดสรปผล Hb typing ใหผปฏบตงานจงตอง
มความร และประสบการณสงในการรายงานผล
และแปลผล
2.อนพนธของฮโมโกลบน(hemoglobin
derivatives)เชนglycosylatedHb,acetylated
HbFและฮโมโกลบนท โมเลกลสลายบางสวน
หรอ( )o-thalassemiaหรอภาวะทมstresseryth-
ropoiesisจากสาเหตอนๆททำใหมภาวะเลอดจาง
เชน การต งครรภ ภาวะเลอดจางเร อรง มะเรง
เมดเลอดขาว แตการเพมขนของปรมาณ Hb F
ในภาวะทม stress erythropoiesis นมกจะเพมขน
ไมเกนรอยละ 10 ดงนนการทตรวจพบปรมาณ
Hb F สงขน แลวจะสรปวาเปนโรค -thalassemia
จงตองพจารณาใหรอบคอบ โดยเฉพาะอยางยง
ตองทราบประวต และอาการของคนไข หากมผล
การตรวจเลอดของครอบครวประกอบดวยจะชวย
ใหวนจฉยไดถกตองมากยงขน
14.ในกรณทผลการวเคราะหHbtypingเปน
EFA ผปวยมภาวะซดไมมประวตการรบเลอดภายใน3
เดอนกอนทำการตรวจเลอดควรแปลผลเปน +-tha-
lassemia/HbEwithorwithout -thalassemia
15. ในกรณทผลการวเคราะห Hb typing
เปนEABart’s,EEBart’s,EFABart’s,EFBart’s,
CSEABart’s,CSEEBart’s,CSEFABart’sและ
CS EF Bart’s ทงหมดนเปนกลมโรคธาลสซเมย
ทมฟโนไทปและจโนไทปซบซอน ซงมภาวะรวม
ระหวาง -thalassemia, -thalassemiaและHbE
ภาวะเหลานเกดเนองจากสาย -globin มปรมาณ
นอยลงและสาย -globinชอบจบกบสาย -globin
ปกตมากกวาสาย E-globinในกรณทเปนHbEtrait
จงตรวจพบปรมาณของHbEลดลงดวยเสมอเมอ
เทยบกบปรมาณHbAโดยจะพบปรมาณนอยกวา
รอยละ 20 แตการจะสรปจโนไทปใหถกตองจรงๆ
ควรจะตองทำการตรวจวเคราะหDNAท งยน
-thalassemiaและ -thalassemiaดวยจงจะสามารถ
สรปเพ อใหคำปรกษาเก ยวกบการถายทอดทาง
กรรมพนธของครอบครวผปวยไดอยางถกตอง
16. ในกรณพบฮโมโกลบนผดปกตทนอก
เหนอจาก Hb E และ Hb CS จดเปนฮโมโกลบน
ผดปกตท พบไมบอย(rareabnormalHb)เชน
HbJBangkok,HbHope,HbQ-Thailand,HbC,HbO
และอ นๆควรรายงานตำแหนงของฮโมโกลบน
ผดปกตทพบบนโครมาโตแกรมหรอelectrophoregram
และแปลผลเปนsuspectedabnormalHbไมควรระบ
ชนดของฮโมโกลบนผดปกตถงแมวาเครองจะรายงาน
Window ของฮโมโกลบนเหลานนกตาม เนองจาก
ฮโมโกลบนผดปกตหลายชนดมคณสมบตใกลเคยงกน
ไมสามารถวนจฉยแยกจากกนโดยการตรวจHbtyping
ไมวาจะโดยเครอง HPLC, LPLC หรอ CE เชน
การพบฮโมโกลบนผดปกตท S window ในระบบ
คอลมนโครมาโตกราฟ เมอนำไปตรวจวเคราะห
DNAพบวาเปนไดท งHbTak,HbDPunjab,
HbQueens,HbSiamและHbSหากตองการทราบ
ชนดของความผดปกตจะตองตรวจยนยนโดยการ
ตรวจวเคราะห DNA หรอตรวจหาลำดบการเรยง
ตวของกรดอะมโนตอไป
ทกลาวมาทงหมดเปนแนวทางในการแปล
ผลการตรวจวเคราะหฮโมโกลบนเพอการวนจฉย
ธาลสซเมยทพบบอยในประเทศไทยซงตองอาศย
ขอมลหลายอยางประกอบตงแตผลการตรวจคดกรอง
คาดชนเมดเลอดแดงผลHbtypingปรมาณHbA2
ปรมาณHbFนอกจากนประวตผปวยและครอบครว
ตลอดจนผลการตรวจเลอดของครอบครวกมสวนชวย
ใหการวนจฉยมความถกตองแมนยำมากยงขน
��
(degradation)เนองจากเลอดเกาอาจทำใหเกดปญหา
การเคลอนของคา retention time และสบสนในการ
อานผลได
3. ในกรณทพบปรมาณHb F สงกวาปกต
ถาไมใชเลอดเดกแรกเกดควรยอม FCell ประกอบ
การรายงานผลดวย เน องจากม abnormal Hb
บางชนดปรากฎในตำแหนงเดยวกบHbF
4.ในกรณทไมแนใจวาเปนHbHหรอไม
การยอมHbHinclusionbodiesจะชวยยนยนการ
รายงานผลได
5. ในกรณทสงสยวามฮโมโกลบนผดปกต
การตรวจเลอดบคคลอนๆ ในครอบครว และการ
ตรวจแยกชนดฮโมโกลบนดวยระบบอนดวยอาจจะ
ชวยยนยนผลในเบองตนไดวามฮโมโกลบนผดปกต
หรอไมอยางไรกตามยงไมสามารถรายงานชนดของ
ฮโมโกลบนผดปกตได จนกวาจะไดตรวจวเคราะห
DNAหรอลำดบกรดอะมโน
1.ควรใหความสำคญในการดแลบำรงรกษาและสอบเทยบครภณฑเปนประจำสมำเสมอ 2. ควรมการควบคมคณภาพภายในหองปฏบตการ (internal quality control) โดยใชวสดควบคมคณภาพท ม มาตรฐานทกคร งท ทำการวเคราะหตวอยางสงตรวจ 3.ควรเขารวมกจกรรมควบคมคณภาพโดยหนวยงานภายนอก(externalqualityassuranceหรอproficiencytestingprogram)เปนประจำ 4.การรายงานผลแต ละต วอย างควรตรวจสอบความสมพนธกบผลการตรวจคดกรองเบองตนทมดวยเสมอ 5. ผ ปฏบตงานควรไดร บการฝกอบรมและตรวจประเมนประสทธภาพดานองคความรในการวเคราะหและประมวลผลการตรวจทางหองปฏบตการเปนประจำ
การควบคมคณภาพการตรวจวเคราะห ฮโมโกลบนดวยเครองอตโนมต
��
��
PCRProduct โดยการทำagarosegel electrophore-sis อาศยการสราง primer ใหครอมบรเวณ DNAท ขาดหายไปเมอนำไปทำ PCR จะสามารถเพมจำนวนชนสวนของ DNA ได เนองจากการขาดหายไปของ DNA ทำให primer ดงกลาวถกเลอนเขามาใกลกน สวน DNA คนปกต (normalDNA)primerทงสองทใชอยหางกนมากกวา17.5kb(SEAdeletion)และมากกวา38kb(THAIdeletion)ซ งเป นขนาดท ใหญเก นกวาจะเพ มจำนวนไดในการทำ PCR ทวๆ ไป จงไมม PCR productเกดข น และเพอใหสามารถวนจฉยแยกระหวางhomozygous -thalassemia1และพาหะ -tha-lassemia1จงมการเพมprimerสำหรบเพมปรมาณnormal DNA ลงไปในการทำปฏกรยา PCR ดวยจากนนจงตดตามการเกดPCRproductsโดยการทำagarosegelelectrophoresisและเปรยบเทยบขนาดDNAทเกดขนทำใหทราบวาบคคลนนมความผดปกตของยนทเปนสาเหตของ -thalassemia1ชนดSEAdeletionหรอชนดTHAIdeletionหรอไม
Relative Quantitative PCR
เทคนค Relat ive Quantitat ive PCR
อาศยการออกแบบprimerและprobe3ชดสำหรบ
เพมปรมาณDNAและตรวจหาความผดปกตของยน
ท เปนสาเหตของ -thalassemia1ชนดSEA
deletion และชนด THAI deletion เปรยบเทยบกบ
ยน -globinทปกตโดยprobeทง3ชนดไดรบ
การออกแบบใหตดฉลากดวยสfluorescenceท
แตกตางกนจงสามารถตดตามความผดปกตของยน
-thalassemia1ทง2ชนดได
ตวอยางทไมพบความผดปกตของ -tha-
lassemia1ทงชนดSEAและชนดไทยจะพบเฉพาะ
การตรวจวเคราะหความผดปกต ของยนทเปนสาเหตของ -thalassemia 1
ความผดปกตของยนทเปนสาเหตของ -tha-
lassemia1ในประชากรไทยมสาเหตมาจากการขาด
หายไปของยน -globin ทงสองยนบนโครโมโซม
เดยวกน จงไมสามารถสงเคราะหสาย -globin
ไดเลย สาม-ภรรยาทมความผดปกตของ -tha-
lassemia1ทงคมโอกาสถายทอดความผดปกตรวม
กนไปสลกทำใหลกเปนhomozygous -thalassemia
1(HbBart’shydropsfetalis)ซงเปนโรคธาลสซเมย
ทมอาการรนแรงทสด ทารกจะเสยชวตตงแตอย
ในครรภ ตายคลอด หรอไมก ช วโมงหลงคลอด
ในขณะท มารดาจะเกดภาวะแทรกซอนของการ
ต งครรภ มอาการครรภเปนพษ มการคลอดผด
ปกต ตกเลอดหลงคลอด หากอาการรนแรงมาก
อาจเสยชวตได หากหองปฏบตการมศกยภาพใน
การตรวจหาความผดปกตของยน -thalassemia1
ไดอยางมประสทธภาพถกตองและรวดเรว จะชวย
ปองกนอนตรายทจะเกดขนกบมารดาทตงครรภบตร
เปนHbBart’shydropsfetalisไดอยางทนทวงท
ความผดปกตของยนทเปนสาเหตของ -tha-
lassemia 1 ทมรายงานในประชากรไทยม 2 ชนด
คอชนด SEA deletion และชนด THAI deletion
สวนใหญทพบเปนชนดSEAdeletionชนดTHAI
deletionถงแมจะพบในอตราสวนทนอยกวาแตถาพบ
ความผดปกตรวมกบชนดSEAdeletionกสงผลใหเกด
HbBart’shydropsfetalisไดเชนเดยวกน
ความผดปกตของยนทเปนสาเหตของ -thalassemia1สามารถตรวจหาไดโดยเทคนคPCRสวนใหญนยมใชวธGapPCRรวมกบการวเคราะห
หลกการ Gap PCR/ Agarose Gel Electrophoresis
��
วธการ สวนใหญแตละหนวยงานจะพฒนาวธการตรวจวเคราะหขนใชเอง หลกการวเคราะหจงอาจแตกตางกนขนกบปรมาณตวอยางสงตรวจตลอดจนความพรอมของบคลากรและเครองมอ สงทสำคญคอจะตองมการตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะห (method validation) กอนเปดบรการเพอใหสอดคลองตามขอกำหนดในมาตรฐานสากลและมความม นใจในประสทธภาพของการตรวจวเคราะห
การรายงานผลในกรณตรวจวนจฉย ในบคคลทวไปทไมใชการตรวจวนจฉย ทารกในครรภมารดา
การควบคมคณภาพ 1. ควรมการควบคมคณภาพภายในหองปฏบตการ(internalqualitycontrol)โดยใชตวอยางDNA ควบคมคณภาพทผานการตรวจยนยนแลวใหครบทง3ชนดคอDNAควบคมคณภาพชนดSEAdeletion,DNAควบคมคณภาพชนดTHAIdeletionและ DNA ควบคมคณภาพทไมพบความผดปกตของทงSEAและTHAIdeletion(negativecontrol)ทกครงททำการวเคราะหตวอยางสงตรวจ 2. ควรเข าร วมโครงการทดสอบความชำนาญทางหองปฏบตการเพอเปรยบเทยบผลการตรวจวเคราะหกบหนวยงานอน 3. ควรใหความสำคญในการดแลบำรงรกษาและสอบเทยบครภณฑทมผลกระทบตอความนาเชอถอของการตรวจวเคราะห เชน เครอง PCRไปเปตอตโนมตตเยนและตแชสำหรบเกบตวอยางและนำยาทใชในการตรวจวเคราะห 4. บคลากรทปฏบตหนาทควรไดรบการฝกอบรมเปนประจำอยางตอเนอง
การเรองแสงของสfluorescenceของnormalprobe
สวนตวอยางทพบความผดปกตของ -thalassemia 1
(SEA)heterozygoteจะพบการเรองแสงของสfluores-
cenceของnormalprobeและSEAprobeและตว
อยางทพบความผดปกตของ -thalassemia1 (THAI)
heterozygote จะพบการเรองแสงของส fluorescence
ของnormalprobeและTHAIprobe
รายงานNegativefor -thalassemia1(SEA
andTHAIdeletions)ในกรณทตรวจไมพบความผดปกต
ของยนα-thalassemia1ชนดSEAและชนดTHAI
รายงานPositivefor -thalassemia1(SEA
deletion) ในกรณทตรวจพบความผดปกตของยน
-thalassemia1ชนดSEA
รายงานPositivefor -thalassemia1(THAI
deletion) ในกรณทตรวจพบความผดปกตของยน
-thalassemia1ชนดTHAI
��
polymeraseชนดทไมมฤทธของ3’-5’exonucleaseภายใตสภาวะในการทำ PCR ทเหมาะสม primerจำเพาะแตละชนดจะทำใหเกดการเพ มจำนวน -globingeneจากAlleleใดAlleleหนงทจำเพาะเทานนจงสามารถแยก -globin gene ปกต และ -tha-lassemia ออกจากกนไดโดยตรวจดชนสวน DNAทเพมจำนวนขนมาไดโดยการแยกดวยกระแสไฟฟา(agarosegelelectrophoresis) ในการทำ ASPCR ตวอยางท ใหผลลบจะไมปรากฏแถบ DNA ใดๆ ใหเหนบนแผนเจลท แยกดวยกระแสไฟฟา ดงน นนอกเหนอจากตวอยางควบคมทใหผลบวก (positive control)และใหผลลบ(negativecontrol)แลวจะตองมการควบคมคณภาพปฏกรยา PCR ในหลอดทดลอง(internal control) ของการทำ PCR ดวย โดยเปนการเพมจำนวนของยนอนทไมใช -globin geneและมขนาดชนสวน DNA ทแตกตางจากยนทเปนสาเหตของ -thalassemiaทกำลงจะตรวจ วธASPCRนบเปนวธทรวดเรวและสะดวกในการตรวจหาความผดปกตของยน เน องจากขนตอนทตองทำการวเคราะหภายหลงขนตอนPCR(postPCR)มเพยงการตรวจหาDNAทเพมจำนวนไดโดยการแยกดวยกระแสไฟฟาเทานน
เทคนค Reverse Dot Blot Hybridization (RDB)
เทคนค Reverse Dot Blot Hybridization
(RDB) อาศยการออกแบบและสงเคราะห Allele
Specific Oligonucleotide (ASO) Probe หลายๆ
ชนดทมปลายขางหนงเปนหมอะมโน(NH2)นำมา
ยดตดบนแผนไนลอนเมมเบรน(nylonmembrane)
ทเปนประจลบแลวนำDNAของผปวยทไดทำPCR
โดยใหนวคลโอไทดบนสายDNAตดฉลากดวยBiotin
การตรวจวเคราะหความผดปกตของยนทเปนสาเหตของ -thalassemia
ความผดปกตของยนทเปนสาเหตของ -tha-
lassemiaในประชากรไทยสวนใหญเปนชนดpoint
mutationซงเกดจากการมเบสเปลยนแปลงไป(basesub-
stitution)หรอเบสจำนวนนอยๆขาดหายไปหรอเกนมา
(small deletion หรอ insertion) ทำใหเกดmutation
ทเรยกวาframeshiftmutationความรนแรงของ
-thalassemia ขนกบชนดของmutation ทเกดขน
วาสามารถสรางmRNAหรอสาย -globinไดหรอไม
หากไมสามารถสรางสาย -globinไดเลยเรยก 0-
thalassemiaแตถาสามารถสรางสาย -globinไดบาง
เรยก +-thalassemia ความผดปกตของยนทเปน
สาเหตของ -thalassemiaในประชากรไทยมความ
หลากหลายมากปจจบนมรายงานมากกวา30ชนด
โดยแตละภมภาคแตละชมชนกมความแตกตางกน
การตรวจหาความผดปกตของยนท เปน
สาเหตของ -thalassemiaในปจจบนนยมใชเทคนค
allelespecificPCR(ASPCR),เทคนคreversedot
blothybridization(RDB)และการตรวจหาลำดบการ
เรยงตวของสารพนธกรรม(DNAsequencing)
เทคนคallelespecificPCR(ASPCR)อาศยการออกแบบและสงเคราะห primer ใหมความจำเพาะตอmutationชนดใดชนดหนงชนดละ2 primer, primer ท 1 จำเพาะตอ Allele ปกตและ primer ท 2 จำเพาะตอmutation ชนดนนๆโดยออกแบบใหมเบสจำเพาะท ปลายดาน 3’จากนนนำ primer ทงสองชนดนไปทำ PCR คกบprimer ปกตอกชนดหนง ซงเปน common primerโดยอาศยเอนไซมTaqDNApolymeraseหรอDNA
หลกการ
เทคนค Allele Specific PCR (ASPCR)
�0
การตรวจหาลำดบการเรยงตวของสารพนธกรรม (DNA sequencing)
ว ธ ตรวจหาลำดบการเร ยงต วของสาร
พนธกรรม (DNA sequencing)ทนยมใชในปจจบน
คอวธchain terminationของSangerซงสามารถ
พฒนาใชรวมกบเคร องอตโนมต ทำใหการอาน
และการวเคราะหผลทำไดสะดวกมากขนอาศยการ
เพ มปร มาณDNAท ต องการตรวจหาลำด บ
การเรยงตวของสารพนธกรรมดวยเทคนคPCR
โดย DNA สายใหมท สรางข นจะถกจำกดความ
ยาวดวย dideoxy nucleotide ตวใดตวหนงใน 4
ตว คอ ddATP, ddGTP, ddCTP และ ddTTP
ท ต ดฉลากดวยสฟลออเรสเซนตท แตกตางกน
เม อนำปฏกรยาทไดไปทำ polyacrylamide gel
electrophoresis จะสามารถแยกชนสวนของ DNA
ทมความยาวตางกน1เบสไดการทำelectrophore-
sis โดยใชเครองอตโนมต ซงมอปกรณการอาน
และการแปลผลขอมล จะชวยอำนวยความสะดวก
ในการตรวจวเคราะหไดเปนอยางด
วธการ
สวนใหญแตละหนวยงานจะพฒนาวธการตรวจวเคราะหขนใชเอง หลกการวเคราะหจงอาจแตกตางกนขนกบปรมาณตวอยางสงตรวจตลอดจนความพรอมของบคลากรและเครองมอ สงทสำคญคอจะตองมการตรวจสอบ ความถกตองของวธวเคราะห(methodvalidation)กอนเปดบรการเพอใหสอดคลองตามขอกำหนดในมาตรฐานสากลและมความมนใจในประสทธภาพของการตรวจวเคราะห
การรายงานผล
รายงานผล Negative ในกรณตรวจไมพบ
ความผดปกตของยน -thalassemia ทตรวจสอบ
เชนNegativefor -thalassemiacodons41/42
(-TTCT),codon17(A-T)andIVSI-5(G-C)
รายงานผลPositivefor -thalassemiaและ
ระบความผดปกตของยน -thalassemiaทตรวจพบ
เชน Positive for -thalassemia [Codons 41/42
(-TTCT)]
รายงานPositiveforcompoundheterozygous
-thalassemiaและระบชนดของยนท ผ ดปกต
ในกรณทตรวจพบความผดปกตของยน2ชนดรวมกน
เชนPositiveforcompoundheterozygous -tha-
lassemia [Codons 41/42 (-TTCT) and IVS I-5
(G-C)]
มาhybridizeกบASOProbeบนแผนเมมเบรนดงกลาว
แลวตรวจสอบปฏกรยาhybridizationระหวางASO
ProbeกบDNAผปวยโดยการทำcolordetection
วธการดงกลาวสามารถตรวจหาความผดปกตของยน
-thalassemiaไดหลายชนดจากการทำhybridization
เพยงครงเดยวนบเปนวธทสะดวกรวดเรว
��
ชนดการผาเหลา -thalassemia ในคนไทย
��
เทคนค Reverse Dot Blot Hybridization (RDB)
1. กรณทเปน compound heterozygote
ของmutation ทมตำแหนงใกลกน เชน IVS 1 nt
1 และ IVS 1 nt 5หรอ codon 17 และ codon
19จะไมพบการเกดสบนnormalprobeเนองจาก
ตำแหนงทผดปกตใกลกนทำใหnormalprobeทง2
ชนดไมสามารถhybridizeกบDNAtemplateได
2.เปนวธทคอนขางยากและมหลายขนตอน
จงตองอาศยผเชยวชาญและมประสบการณสง
การตรวจหาลำดบการเรยงตวของสารพนธกรรม (DNA sequencing)
การควบคมคณภาพ 1. ควรทำ positive control และ negativecontrol โดยใชตวอยางDNA ทผานการตรวจยนยนแลวทำปฏกรยาควบคไปกบตวอยางสงตรวจทกครง 2. ควรเขารวมโครงการทดสอบความชำนาญทางหองปฏบตการเพอเปรยบเทยบผลการตรวจวเคราะหกบหนวยงานอนหากไมมโครงการดงกลาวอาจเปรยบเทยบผลการวเคราะหกบหนวยงานอนทนาเชอถอ(inter-laboratorycomparison)เปนระยะๆตามความเหมาะสม 3.ควรใหความสำคญในการดแลบำรงรกษาและสอบเทยบครภณฑทมผลกระทบตอความนาเชอถอของการตรวจวเคราะห 4. บคลากรทปฏบตหนาทควรไดรบการฝกอบรมเปนประจำอยางตอเนอง
เทคนค Allele Specific PCR (ASPCR)
1. การตรวจยน -thalassemia ดวยวธmultiplexASPCRเม อพบผลบวกกบmutationชนดใดชนดหนงจะสรปจโนไทปยงไมไดจะตองทำPCRอกหลอดดวยprimerปกต(N)ท codonทมmutationนนถาตรวจพบแถบDNAทจำเพาะเมอใชprimerNดวยกแสดงวาเปนheterozygoteแตถาไมพบกแสดงวาเปนhomozygoteการตรวจดวย primer N น จะใชในกรณท ทำการตรวจวนจฉยตวอยางทารกท พอและแมม mutationชนดเดยวกนแตถาพอและแมมmutationตางชนดกนเชนพอม -thalassemiacodon17[A-T]แมมHb E ตวอยาง DNA ของทารกกจะตรวจดวยprimerMของcodon17[A-T]และHbEเทานน
ขอจำกด
1.เปนวธทคอนขางยากและมหลายขนตอน
จงตองอาศยผเชยวชาญและมประสบการณสง
2. เปนวธทตองใชเครองมอทมราคาแพง
จงเหมาะกบหองปฏบตการอางองทใหบรการตรวจ
หาลำดบการเรยงตวของสารพนธกรรมในดานอน
ทนอกเหนอจากการตรวจหาความผดปกตของยน
ธาลสซเมย
สวนการตรวจหาmutation ของยน -thalassemiaในหญงตงครรภ และหรอคสมรสทมผลการตรวจคดกรองเปนบวกและผลวเคราะหฮโมโกลบนทวนจฉยไดแลววาเปนพาหะ -thalassemia (Hb typingA
2A
wihhighHbA2)เมอใหผลบวกกบmutationใดแลวก
ไมจำเปนตองตรวจกบprimerNตอ 2. จำเปนตองใช primer หลายชนดในการตรวจแตถาเลอกศกษาในกลมประชากรเปาหมายแลวจะมmutationทตองตรวจไมมากนก
��
ภาพสรปแนวทางการดำเนนงานทางหองปฏบตการ
��
��
1.กลนภาฟเจรญ.การตรวจทางหองปฏบตการ
เพอการตรวจวนจยธาลสซเมย และฮโมโกลบน
ผดปกตทพบบอยในประเทศไทย. พมพครงท 1.
ขอนแกน:ศนยวจยและพฒนาการตรวจวนจฉยทาง
หองปฏบตการทางการแพทยคณะเทคนคการแพทย
มหาวทยาลยขอนแกน,2549.
2. กลนภา ฟ เจรญ. การตรวจทางหอง
ปฏบตการ เพอการตรวจวนจยธาลสซเมย และ
ฮโมโกลบนผดปกตท พบบอยในประเทศไทย.
พมพคร งท 2. ขอนแกน: ศนยวจยและพฒนา
การตรวจวนจฉยทางหองปฏบตการทางการแพทย
คณะเทคนคการแพทยมหาวทยาลยขอนแกน,2551.
3. กลนภา ฟ เจรญ, สพรรณ ฟ เจรญ.
การตรวจคดกรองธาลสซเมยในประเทศไทย.วารสาร
เทคนคการแพทย และกายภาพบำบด 2551; 20:
165-176.
4.จว เชาวถาวร,สทศนฟเจรญ,จนตนา
พฒนพงศธร.ธาลสซเมยคมอการวนจฉยและแนะนำ
ปรกษา.พมพครงท1กรงเทพฯ:ชมนมสหกรณการ
เกษตรแหงประเทศไทย,2542.
5.ปราณ(วนจจะกล)ฟเจรญและสทศนฟเจรญ
(บรรณาธการ).ธาลสซเมยการตรวจวเคราะหยนดวย
เทคนคPCRพมพครงท1โครงการวจยธาลสซเมย
สถาบนวจย และพฒนาวทยาศาสตรและเทคโนโลย
มหาวทยาลยมหดล,2541
6.ปราณ(วนจจะกล)ฟเจรญ.Laboratory
diagnosisofthalassemiaandhemoglobinopathies.
การประชมเชงปฏบตการ(Workshop)Thalassemia:
from molecular biology to clinical medicine.
สถาบนวจยและพฒนาวทยาศาสตรและเทคโนโลย
มหาวทยาลยมหดล,9-20มนาคม2541
7.วชยเหลาสมบต.ธาลสซเมย.กรงเทพ:
โอเอสพรนตงเฮาส,2541:71-124.
8.สาครวนทอง,กลนภาฟเจรญ,เชยวชาญ
สระคพนธ, กนกวรรณ แสนไชยสรยา, ณฐยา
แซอง, สพรรณ ฟเจรญ. การจดตงระบบควบคม
คณภาพเพอเพมประสทธภาพการตรวจคดกรอง
ธาลสซเมยทโรงพยาบาลเมองสรวงจงหวดรอยเอด.
วารสารเทคนคการแพทยและกายภาพบำบด2550;
19:148-166.
9.สรภากรแสงกจพร,สมชายแสงกจพร.
การตรวจวนจฉยทางหองปฏบตการเพอสนบสนนการ
ควบคมและปองกนโรคทางพนธกรรม พมพครงท 1
นนทบร:กรมวทยาศาสตรการแพทย,2548.
10. สพรรณ ฟเจรญ, กลนภา ฟเจรญ.
การตรวจทางหองปฏบตการเพอการวนจฉยธาลสซเมย
ตามแผนงานการควบคมและปองกนโรคของประเทศ
ไทย.สงขลานครนทรเวชสาร2545;20:43-55.
11.FucharoenG,SanchaisuriyaK,Sae-
ungN,DangwibulS,FucharoenS.Asimplified
screeningstrategy for thalassemiaandhaemo-
globinEinruralcommunitiesinsouth-eastAsia.
BullWorldHealthOrgan2004;82:364-372.
12. Sanchaisuriya K, Fucharoen S,
Fucharoen G, Ratanasiri T, Sanchaisuriya P,
ChangtrakulY,etal.Areliablescreeningproto-
col for thalassemia and hemoglobinopathies in
pregnancy;analternativeapproachtoelectronic
bloodcellcounting.AmJClinPathol2005;123:
113-118.
13.WeatherallDJ,CleggJB.Thelabora-
torydiagnosisofthethalassemias.In:Thethalas-
saemiasyndromes.4rded.BlackwellScientific
Publication,Oxford,2001:690.
บรรณานกรม
��
��
ASO allelespecificoligonucleotide
ASPCR allelespecificpolymerasechainreaction
CE capillaryelectrophoresis
CS constantspring
DCIP dichlorophenolindophenol
Hb hemoglobin
Hct hematocrit
HPFH hereditarypersistanceoffetalhemoglobin
HPLC highpressureliquidchromatography
LPLC lowpressureliquidchromatography
MCH meancorpuscularhemoglobin
MCV meancorpuscularvolume
OF osmoticfragility
PCR polymerasechainreaction
RDB reversedotblot
SEA Southeastasia
Taq Thermusaquaticus
Thal thalassemia
คำยอ
��
/2551 ( )
( )
1. 2. . 3. 4. . 5. . 6. 7. 8.
1.
2. -
3.
. . 2551
( ) 9 ( )
��
/2552
………………………….
-
13
1.
2.
3.
4.
5.
6.
/2...
�0
- 2 -
7. .
8.
9. .
10.
11.
12. .
13. .
14.
15.
16.
1
17.
18.
/3...
��
- 3 -
1.
2.
3.
. . 2552
��
กรมวทยาศาสตรการแพทยขอขอบคณคณะผเชยวชาญทกทานทใหเกยรตเปนคณะกรรมการ
จดทำคมอทางหองปฏบตการตรวจวนจฉยธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตฉบบน