/ . Embryo!, exp. Morph. Vol. 31,1, pp. 27-35,1974 2 7

Printed in Great Britain

A propos (Tun effet paradoxal de la cycloheximidesur Foeuf d'Anemia salina

Par J. FAUTREZ1 ET N. FAUTREZ-FIRLEFYN1

Universite de Gand - Laboratoire d'Anatomie de la Faculte de Medecine

SUMMARY

Cycloheximide, an inhibitor of protein synthesis at the 'translation' level, has a very strongantimitotic activity upon the egg of Artemia salina, during segmentation. At extremely lowconcentrations, on the contrary, it enables eggs, extracted from the uterus just after fertiliza-tion, to enter into segmentation, while the controls remain undivided. From these results itis argued that synthesis of a protein in the immature egg could have an inhibitory influenceupon too early cell division. The synthesis of this factor could be extremely sensitive to cyclo-heximide action.

INTRODUCTION

La cycloheximide inhibe la synthese des proteines au niveau des ribosomes.Elle empecherait la liaison initiate de m-RNA aux ribosomes en une structuredu type polysome, et le glissement du messager contre les ribosomes (Colombo,Felicetti & Baglioni, 1965). Sur Pceuf & Artemia salina, en segmentation, elle serevele etre un antimitotique puissant, agissant jusqu'a de tres fortes dilutions(1 x 10~6

M a % x 10~6 M). NOUS reviendrons ailleurs sur les particularity de cette

action, mais voudrions tirer l'attention, ici, sur une activite apparemmentparadoxale observee fortuitement. II s'est revele en effet que des concentrationsplus faibles encore (1 x 10~7 M a £ x 10~6 M) peuvent induire la division cellu-laire de jeunes ceufs indivis, fraichement fecondes, dans des lots, ou les temoinsne se divisent pas in vitro.

MATERIEL ET TECHNIQUE

Les ceufs d'Artemia salina sont preleves dans l'ovisac et recueillis dans dessalieres contenant soit un liquide salin (temoins) (Fautrez-Firlefyn & Van Dyck,1961), soit ce merae liquide auquel de la cycloheximide fut ajoutee (oeufsexperimentes).

Dans le present travail nous ne nous interessons qu'a certains lots d'ceufsindivis, preleves rapidement apres leur descente dans l'uterus et leur fecondation(Fig. 1), toujours avant le soulevement de la membrane vitelline. Ces oeufs sereconnaissent aisement, sous la loupe binoculaire, des oeufs ayant souleve leur

1 Adresse des auteurs: Laboratoire d'Anatomie de la Faculte de Medecine, Universite deGand, B-9000 Gent, Ledeganckstraat 35, Belgium.

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membrane. Les premiers sont en effet legerement aplatis et mats; les secondssont spheriques et brillants.

Alors que dans nos conditions de culture, les oeufs indivis ou aux premiers stadesde la segmentation se developpent jusqu'au debut de la gastrulation, il arrivecependant que des lots d'oeufs indivis 'mats' ne se divisent pas. Ayant fortuite-ment constate que dans ces cas, la cycloheximide a de faibles concentrationspouvait permettre a la segmentation de se realiser, nous avons repris 10 foiscette experience, en utilisant differentes concentrations allant de 1 x 10~7 M a1 x 10-6

M.

Les germes sont examines vivants, et apres 6 a 7 heures il sont fixes pourexamen microscopique. Le fixateur utilise est l'alcool-formol-acetique. Lacoloration des oeufs coupes en serie se fait au bleu de toluidine ou a la reactionde Feulgen.

RESULTATS PERSONNELS(a) Les temoins

La plupart des oeufs soulevent leur membrane de fecondation, environ quatreheures apres leur descente dans l'uterus. Us ne presentent aucun signe, visible ala loupe, de division cellulaire. Quelques rares germes cependant restent mats etcollent plus ou moins fortement au fond du recipient. Ces derniers presententplusieurs ondes de division. Dans ces oeufs aplatis, les blastomeres sont anor-malement disposes, pratiquement tous dans un seul plan.

A l'examen microscopique des temoins, qui sont restes indivis et qui ontsouleve leur membrane vitelline, on observe des figures pluricentriques, quioccupent le centre de l'oeuf. Les centres sont des spheres peu colorees, relieespar des images fibrillaires, constituant des fuseaux anarchiques dans lesquelsdes chromosomes se retrouvent deci-dela en plaques equatoriales ou en amas

FIGURES 1 A 6

(Eufs temoins, cultives dans un liquide physiologique. Toutes les coupes sontcolorees au bleu de toluidine. L'echelle au bas de la page se rapporte a toutes lesfigures.Fig. 1. Coupe d'un ceuf, au debut de l'experience. II est preleve de l'ovisac apresfecondation, au moment ou l'axe de la metaphase de la premiere division de matura-tion (en haut) est encore parallele a la surface du germe.Fig. 2 et 3. Deux exemples typiques d'oeufs jeunes cultives dans le liquide physio-logique: figures polycentriques a centres clairs. Les chromosomes sont dispersesdans les fuseaux polycentriques.

Fig. 4. Cas plus exceptionnel: on trouve un seul noyau interphasique pres d'un desasters pluricentriques.Fig. 5 et 6. (Eufs n'ayant pas souleve leur membrane vitelline. Division en VIIIblastomeres, dont les rapports sont atypiques: etales dans un seul plan. Pour le resteles images mitotiques semblent normales et remarquablement synchrones. Fig. 5.Tous les noyaux sont en prophase. Fig. 6. Tous les noyaux sont en metaphase.

Cycloheximide sur /Vw/VArtemia 29

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Cycloheximide sur V'ceuf d'Artemia 31

plus irreguliers (Fig. 2, 3). Plus rarement on trouve un seul noyau en inter-cinese, pres d'un des poles de la figure pluricentrique (Fig. 4). Dans 6 series detemoins, nous ne trouvons pratiquement que des oeufs presentant cet aspectparticulier. Dans les 4 autres series, de rares germes ont atteint le stade des deuxpronuclei, apparemment normal, auquel ils sont figes.

Sporadiquement on observe des oeufs, qui ne soulevent pas leur membranevitelline; ils restent flasques et se divisent. A l'examen microscopique, on trouvedes blastomeres etales en un plan. II est remarquable que, meme dans cesconditions, les cycles cellulaires restent absolument synchrones. La Fig. 5montre un de ces oeufs, ou tous les noyaux sont en prophase; dans l'oeufrepresents sur la Fig. 6, ils sont tous en metaphase.

(b) CEufs soumis a faction de la cycloheximide

1. La solution \ x 10~7 M n'a aucune action decelable sur les germes, qui ontle meme aspect que les temoins.

2. La solution \ x 10~7 M est a la limite de l'activite. Sur 7 lots d'oeufs, unseul presente des germes, qui sont tous semblables aux temoins. Dans les autreslots on obtient un melange. De tres nombreux oeufs sont arrives, au moment dela fixation, aux stades a II (Fig. 7) ou IV blastomeres. Dans un lot de nom-breux germes avaient atteint le stade VIII (Fig. 8). Tres souvent, au stade aII blastomeres, la cloison separant les deux cellules ne se developpe que d'unseul cote (Fig. 9,10). Dans la plupart des lots, on rencontre en outre des germesbloques au stade des 2 pronuclei (Fig. 11), ou a diverses phases de la premieredivision de segmentation. Mais a l'exception des germes a cloisonnementincomplet, tous ces elements ne sont pas differenciables, morphologiquement degermes normaux, fixes a des moments correspondants du developpement. Dansla moitie des echantillons environ, on rencontre une faible quantite d'oeufssemblables aux temoins. Exceptionnellement, on peut trouver un germe indivisa plusieurs noyaux intercinetiques dans un complex pluricentrique (Fig. 12).

3. La solution 1 x 10~7 M a une action plus prononcee que la precedentsJamais plus nous y avons rencontre des germes semblables aux temoins. Sur

FIGURES 7 A 12

CEufs cultives dans une solution de cycloheximide \ x 10~7 M dans le liquidephysiologique. Toutes les coupes sont colorees au bleu de toluidine. L'echelle aubas de la page se rapporte a toutes les figures.Fig. 7. OEuf divise en II blastomeres.Fig. 8. GEuf divise en VIII blastomeres.Fig. 9. OEuf au stade II avec cytodierese incomplete.Fig. 10. Le sillon entre les II blastomeres ne s'esquisse que d'un cote (vers la droite:fleche).Fig. 11. CEuf fige au stade des 2 pronuclei.Fig. 12. Les noyaux se sont divises au centre d'une figure polycentrique. Absence detoute cytodierese.

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7 lots examines, 1 seul etait compose essentiellement de germes au stade a IVblastomeres. Dans 5 autres nous avons trouve le plus grand nombre d'oeufs aII blastomeres. Dans 1 seul, les elements etaient figes au stade des 2 pronuclei.Dans quatre des cinq lots ou les oeufs au stade II predominaient, on decouvritquelques germes presentant encore les 2 pronuclei, et d'autres arretes au coursde la premiere mitose de segmentation.

4. La solution a \ x 70~6 M ne fut utilisee que pour deux lots. Dans un deslots, certains oeufs avaient atteint le stade a II blastomeres; d'autres restaientfiges a celui des 2 pronuclei. Dans l'autre lot, on observe divers stades, d'aspectnormal, de la premiere division de segmentation.

5. La solution a 1 x 10~6 M bloque tous les oeufs au stade des 2 pronucleisitues au centre du germe, soit encore a sa peripherie. II s'agit du blocage de lasegmentation au meme moment ou la cycloheximide arrete, aussi a des con-centrations plus elevees des oeufs immerges au stade indivis jeune, aussi dans desexperiences dans lesquelles les temoins se divisent anormalement.

DISCUSSION

L'effet de la cycloheximide permettant du moins l'initiation d'une segmenta-tion apparemment normale d'ceufs indivis, venant de descendre dans l'ovisac,alors que les temoins restent indivis, se manifeste dans des limites de concentra-tion tres etroites. D'une part la concentration | x 10~7 M n'a aucune actionvisible. D'autre part la concentration 1 x 10~6 M bloque les oeufs au stade desdeux pronuclei, c'est-a-dire au stade ou des oeufs mats, dont les temoins sontcapables de se segmenter, sont arretes par Faction antimitotique du produit,utilise a cette meme concentration ou a des concentrations plus elevees. Entreces deux extremes on voit que la concentration a -| x 10~7 M presente l'effetfavorisant, mais que toutefois un certain nombre d'oeufs reste encore semblableaux temoins. Par contre, les solutions a 1 x 10~7 M et a | x 10~6 M permettent ladivision cellulaire, mais on constate deja, pour un certain nombre de germes, leblocage au stade des pronuclei.

II n'est pas simple de s'imaginer le mecanisme de cette influence, qui regu-larise et favorise la division cellulaire. Si Ton se souvient que la cycloheximideest connue comme un inhibiteur de la synthese des proteines, l'hypothese laplus vraisemblable nous semble etre l'inhibition par l'antibiotique d'uneproteine inhibitrice de la division cellulaire. La synthese de cette proteineinhibitrice serait particulierement sensible a la cycloheximide, et le serait encorea des doses ou la synthese des proteines necessaires a la division n'est plusinfluencee.

Insistons sur le fait qu'il ne peut s'agir ici, que d'une simple hypothese,basee sur des deductions indirectes. La synthese de proteines, pas plus quel'inhibition de celle de certaines parmi elles sous l'effet de la cycloheximide,n'a pu etre mise en evidence jusqu'ici sur notre materiel par des tests et des

Cycloheximide sur I'oeuf d'Artemia 33

mesures directs, faute de technique appropriee. Ce n'est que par analogie avec ceque Ton sait sur l'action du produit utilise sur d'autres materiaux (Wettstein,Noll & Penman, 1964; Colombo et al. 1965), que nous estimons pareilleassertion plausible, tout en nous rendant compte que Interpretation de l'effetd'un inhibiteur reste toujours delicate et qu'il pourrait sans doute agir sur lemetabolisme cellulaire par des mecanismes differents.

La cycloheximide, a des doses plus fortes que celle que nous avons utiliseesici, se revele sur l'oeuf & Artemia en segmentation comme un antimitotiquepuissant (resultats inedits). Son eflfet antimitotique est en grandes lignes sem-blable a celui de la puromycine (resultats inedits), agent qui s'est egalementrevele etre un inhibiteur de la synthese proteique au niveau de la traduction(Colombo et al. 1965), et a celui de l'actinomycine D (Fautrez-Firlefyn &Fautrez, 1966) et de la proflavine (Fautrez & Fautrez-Firlefyn, sous presse)dont l'action sur la transcription est generalement admise (Hurwitz, Furth,Malamy & Alexander, 1962). II nous semble done assez logique d'admettre queles 4 agents, reputes comme des inhibiteurs de la synthese des proteines, pro-duisant un effet antimitotique semblable sur notre materiel, le feraient par lemecanisme qui leur est commun.

II nous semble en outre indispensable de rapprocher ces observations desresultats anterieurs (Fautrez & Fautrez-Firlefyn, 1961), ou nous avons montreque des ceufs vierges etaient actives, et pouvaient presenter des divisionsabortives, a condition de quitter l'oviducte. Cette reaction pouvait etre obtenuede deux manieres differentes. Les oeufs peuvent etre extraits de l'oviducte etrecueillis dans un milieu physiologique. On pouvait encore les laisser descendredans l'ovisac chez des femelles separees de males: ils n'y etaient done pas fecon-des comme normalement. Dans ces conditions, nous avons cru pouvoir con-clure a la presence, dans l'oviducte, d'un facteur empechant des divisionscellulaires d'eeufs immatures.

Nos presentes experiences permettent, nous semble-t-il, de faire un pas deplus. Le facteur frenateur de l'oviducte agit par l'intermediaire de metabolitessynthetises par le germe lui-meme, puisque la cycloheximide agissant sur lesoeufs recueillis in vitro, leve l'inhibition en frenant cette synthese.

Mais il y a plus: les oeufs dont-il s'agit dans ces nouvelles experiences sontfecondes. En effet, la fecondation a lieu des la descente dans l'ovisac de lafemelle, non separee des males, qui est un veritable receptacle de spermatozoides.De plus quelques rares oeufs-temoins, et d'assez nombreux germes traites ala cycloheximide sont arretes au stade des deux pronuclei. D'autres oeufssoumis a la cycloheximide parcourent les premiers stades d'une segmentationnormale. Tous ces phenomenes sont le fait d'oeufs fecondes.

Si les oeufs descendus dans l'ovisac avaient ete laisses en place, ils auraientconnu un developpement normal. Dans des centaines de ces femelles, observeesau cours de 25 ans de recherches, nous n'avons jamais trouve un arret dudeveloppement semblable a celui de nos germes-temoins.

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L'interpretation la plus plausible de nos resultats nous semble done etrequ'apres un court sejour dans l'ovisac, l'ceuf, qui vient d'etre feconde est capabled'entrer en segmentation, parce qu'un facteur, contenu dans le sue de l'ovisac,inhibe la synthese d'inhibiteurs de la division. II faut un certain temps d'actionde ce facteur de l'ovisac pour permettre la segmentation normale. Si l'ceuf luiest soustrait trop tot, on obtient le resultat qu'illustrent nos temoins. Maisl'action de la cycloheximide, a tres faible dose, peut mimer Peffet desinhibiteurdu facteur present dans le sue de l'ovisac.

Cette hypothese peut rendre compte de tous les effets observes. Les oeufsextraits de l'ovisac apres un sejour suffisant vont se developper in vitro, jusqu'audebut de la gastrulation. Extraits rapidement apres la fecondation, encore enmetaphase de la 1° division de maturation, ils sont encore sous l'effet desproteines inhibitrices de la division. Celles-ci permettent dans les oeufs extraitsdeja la division des centres, mais pas encore celle des noyaux, ni surtout lacytodierese, et Ton obtient l'image habituelle, observee dans nos temoins. Sipour une raison, qui nous echappe encore, la membrane vitelline n'est passoulevee, on peut supposer, que par une plus grande permeabilite la proteineinhibitrice se perd dans le milieu; les mitoses de segmentation sont normales etmeme remarquablement synchrones, comme dans la segmentation normale.Seuls les rapports entre les blastomeres sont anormaux dans les germes flasqueset aplatis. Apres soulevement de la membrane vitelline les proteines inhibitricesquittent moins le germe ou restent concentrees dans le liquide perivitellin.

La cycloheximide, inhibitrice des syntheses proteiques, pourrait, a tresfaible dose mimer Faction d'un facteur contenu dans le liquide de l'ovisac,apres extraction precoce. Elle va rendre possible la division nucleaire et enfinla cytodierese, qui souvent reste encore troublee et partielle. Elle inhibe lesfacteurs proteiques, qui empechent la division d'oeufs encore immatures. Dansles meilleurs cas on arrive, dans les delais de l'experience a des stades VIII,apparemment normaux. Si la dose frole l'effet antimitotique de l'antibiotique,on arrive a un arret au stade des deux pronuclei, qui est typique pour Factionde la cycloheximide a des concentrations plus elevees, dans des experiences oudes temoins sont deja capables de se segmenter.

Ces experiences semblent done montrer l'existence d'un equilibre delicatentre des facteurs, peut-etre de nature proteique, qui rendent possible lasegmentation normale d'un oeuf feconde, et ceux qui inhibent des divisionsinadequates d'un germe encore immature. L'intervention d'un facteur secretepar l'oviducte serait responsable de l'arret a la metaphase de la premieredivision de maturation. II agirait par l'intermediaire de proteines synthetiseespar le germe lui-meme. Cette synthese serait moins importante dans les germeseleves in vitro, et rapidement inhibee par un facteur present dans le sue del'ovisac.

Cycloheximide sur Vosuf d'Aittmia, 35

RESUME

A de tres faibles concentrations, la cycloheximide permet l'entree en segmentation d'oeufsd'Artemia, qui viennent d'etre fecondes, alors que les temoins restent indivis.

L'hypothese est emise qu'a des doses minimes, la cycloheximide pourrait inhiber dans lesoeufs la synthese de proteines, activee par un facteur present dans l'oviducte, et tendant aempecher des divisions d'oeufs immatures. Elle pourrait mimer Faction d'un facteur contenudans le sue de l'ovisac et rendant possible la segmentation normale d'un oeuf feconde.

TRAVAUX CITES

COLOMBO, B., FELICETTI, L. & BAGLIONI, C. (1965). Inhibition of protein synthesis by cyclo-heximide in rabbit reticulocytes. Biochem. biophys. Res. Commun. 18, 391-395.

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FAUTREZ, J. & FAUTREZ-FIRLEFYN, N. Effets de la proflavine sur l'oeuf d'Artemia salina L.Archs. BioL, Liege (sous presse).

FAUTREZ-FIRLEFYN, N. & FAUTREZ, J. (1966). Effet de Pactinomycine D sur les divisions dematuration et de segmentation de l'oeuf d'Artemia salina. Archs. BioL, Liege 11, 425-440.

FAUTREZ-FIRLEFYN, N. & VAN DYCK, F. (1961). La culture 'in vitro' de l'oeuf d'Artemiasalina. Archs. Zool. exp. gen. 100, 37-41.

HURWITZ, J., FURTH, J. J., MALAMY, M. & ALEXANDER, M. (1962). The role of deoxyribo-nucleic acid in ribonucleic acid synthesis. III. The inhibition of the enzymatic synthesis ofribonucleic acid and deoxyribonucleic acid by actinomycin and proflavin. Proc. natn. Acad.Sci. U.S.A., 48, 1222-1230.

WETTSTEIN, F. O., NOLL, H. & PENMAN, S. (1964). Effect on cycloheximide on ribosomalaggregates engaged in protein synthesis in vitro. Biochim. biophys. Acta 87, 525-527.

(Regu le 3 avril 1973)

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