UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE „GR. T. POPA” IASI FACULTATEA DE FARMACIE CERCETĂRI PRIVIND PREZENŢA ACRILAMIDEI ÎN ALIMENTELE PRELUCRATE TERMIC REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT Conducător ştiinţific, PROF. UNIV. DR. RODICA CUCIUREANU Doctorand, FARM. ANCA-IRINA BURLACU PRISĂCARU − IAŞI 2009 −CUPRINS INTRODUCERE…………………………………………………...1 Motivaţia cercetării…………………………………..….....2 Obiectivele tezei de doctorat…………………………….....3 PARTE GENERALĂ…………………………………..………......4 PARTE PERSONALĂ………………………………………….…6 CAPITOLUL VII. ANALIZA CANTITATIVĂ A ACRILAMIDEI ÎN PRODUSELE ALIMENTARE. VALIDAREA METODEI GAZ CROMATOGRAFICE….......6 VII.1 Instrumente analitice şi condiţii cromatografice…..6VII.2 Validarea metodei…………………….……………...6 VII.3 Concluzii……………………………………………...7 CAPITOLUL VIII. ANALIZA CANTITATIVĂ A ACRILAMIDEI ÎN PRODUSELE ALIMENTARE. APLICAŢII…………………………………………………………8 VIII.1 Prelucrarea probelor……………………………….8 VIII.2 Analiza cantitativă a acrilamidei în probele de chips-uri……………………………………………………………..8 VIII.3 Analiza cantitativă a acrilamidei în probele de cartofi prăjiţi………………………………………………………..9 VIII.4 Analiza gaz cromatografică a acrilamidei în probele de pâine prăjită……………………………………………9VIII.5 Analiza gaz cromatografică a acrilamidei în probele de biscuiţi………………………………………………….9 VIII.6 Analiza gaz cromatografică a probelor de popcorn………………………………………………………………...10 VIII.7 Concluzii…..……………………………………….10 CAPITOLUL IX. CORELAŢIA DINTRE CONŢINUTUL ÎN ZAHĂR SOLUBIL ŞI NIVELUL DE ACRILAMIDĂ………16 IX.1 Determinarea concentraţiei de zahăr direct reducător şi zahăr total solubil prin metoda Luff-Schoorl……..16 IX.2 Determinarea concentraţiei de acrilamidă din produsele alimentare……………………………………………...17 IX.3 Concluzii……………………………………………..19 CAPITOLUL X. INFLUENŢA PROCESULUI CULINAR ASUPRA CONŢINUTULUI ÎN ACRILAMIDĂ. STUDIU

COMPARATIV…………………………………………………...20 X.1 Implicaţiile intervalului de prelucrare culinară şi a temperaturii procesului culinar în procesul de formare al acrilamidei…………………………………………………………20 X.2 Influenţa modului de prelucrare culinară asupra conţinutului în acrilamidă……………………………………..…21 X.3 Concluzii……………………………………………...22 CAPITOLUL XI. STUDIUL MODIFICĂRILOR BIOCHIMICE, HEMATOLOGICE ŞI HISTOPATOLOGICE ÎN INTOXICAŢA CRONICĂ CU ACRILAMIDĂ………………23 XI.1 Modelul experimental ………………………………23 XI.2 Interpretarea statistică……………………………...24 XI.3 Investigaţia biochimică……………………………..24 XI.4 Investigarea hematologică…………………………..29 XI.5 Investigaţia histopatologică ………………………...30 XI.6 Concluzii……………………………………………..32 CAPITOLUL XII. EVALUAREA POTENŢIALULUI PROTECTOR AL ACIDULUI ASCORBIC ÎN INTOXICAŢIA SUBACUTĂ CU ACRILAMIDĂ LA ANIMALELE DE LABORATOR……………………………...32 XII.1 Model experimental………………………………..32 XII.2 Investigaţia biochimică…………………………….33 XII.3 Concluzii…………………………………………….38 CAPITOLUL XIII. POTENŢIALUL PROTECTOR AL FTALIDELOR DIN APIUM GRAVEOLENS ÎN INTOXICAŢIA CU ACRILAMIDĂ…………………………….39XIII.1 Modelul experimental……………………………..39 XIII.2 Investigaţia biochimică……………………………39 XIII.3 Concluzii…………………………………………...46 CAPITOLUL XIV. CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE CERCETARE…………….48 XIV.1 Concluzii generale…………………………………48 XIV.2 Contribuţii originale………………………………50 XIV.3 Perspective privind noi direcţii de cercetare a problematicii acrilamidei…………………………………………51 Bibliografie……………………………………………………...…52 1INTRODUCERE Acrilamida, compus sintetizat pentru prima dată de către Moureu, în Germania, prin adiţia apei la acrilonitril, este utilizată în procesul de tratare al apei în scop potabil, în tratarea apelor reziduale, în obţinerea gelurilor pentru electroforeză, prelucrarea hârtiei şi celulozei, prelucrarea minereurilor, fabricarea maselor plastice şi a unor ambalaje pentru produsele alimentare, în industria cosmetică, în tratamentul solului, în industria textilă, în obţinerea agenţilor de etanşare utilizaţi în construcţii ş.a. (1, 2). Acrilamida prezintă o structură chimică posesoare a doi centri

de nesaturare: dubla legătură şi gruparea amidică, ceea ce îi conferăun grad înalt de reactivitate şi stă la originea mecanismului toxicologic. Toxicitatea acrilamidei este cunoscută încă din primii ani de producţie şi utilizare. Agenţia Internaţională pentru Cercetare a Cancerului a clasificat acrilamida în categoria 2 de carcinogenitate şi mutagenicitate, respectiv categoria 3 de toxicitate asupra reproducerii şi dezvoltării. De asemenea, amida acrilică este incriminată pentru potenţialul neurotoxic. Efectele asupra sistemului nervos central apar după câteva ore până la câteva zile de la intoxicaţie şi presupun: confuzie, probleme de memorie şi concentrare, oboseală, vorbire incoerentă, halucinaţii. Neuropatiile periferice se dezvoltă în urma unei perioade de latenţă care poate dura de la câteva zile până la câteva săptămâni: parestezii, amorţeală, slăbiciune musculară, reflexe scăzute ale tendonului. Tremorul şi tulburările de mers se pot dezvolta ca urmare a afecţiunilor la nivelul cerebelului si creierului mijlociu (3, 4, 5, 6). Prezenţa acrilamidei în alimentele bogate în amidon şi prelucrate termic prin prăjire sau coacere a fost decelată în anul 2002 de către cercetătorii suedezi (2). Astfel, acrilamida devine preocuparea principală a cercetărilor analitice şi toxicologice din punct de vedere al mecanismului de formare în alimentele prelucrate termic prin prăjire sau coacere, al dezvoltării unor metode de analizăsensibile, al evaluării conţinutului în acrilamidă al alimentelor, al estimării aportului de acrilamidă prin consum de alimente, precum şi al mecanismului responsabil de inducerea genotoxicităţii, 2carcinogenităţii şi a toxicităţii asupra aparatului de reproducere (7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15). Motivaţia cercetării În România, problematica acrilamidei nu s-a bucurat de aceeaşi atenţie din partea autorităţilor în domeniu sau a industriei alimentare. Până în prezent, cercetările privind evaluarea aportului de acrilamidă prin consum de alimente în România sunt reduse, atât sub aspect analitic cât şi toxicologic (16). Prin urmare, necesitatea abordării problematicii acrilamidei în context naţional devine evidentă, atât din punct de vedere analitic, cât şi prin prisma expunerii populaţiei la toxicitatea acrilamidei prin consumul de alimente cu un conţinut bogat în această noxă alimentară. Mai mult, incidenţa crescută a acrilamidei în produse alimentare şi riscul expunerii organismului uman la impactul cu doze zilnice de acrilamidă impun necesitatea acţionării pe variate direcţii de cercetare, cum ar fi: • găsirea unor căi de prevenire a expunerii la dozele de toxic, prin educaţia conduitei alimentare, prevalent la tineret, categorie atrasă de gustul alimentelor cu un conţinut ridicat de acrilamidă; • preîntâmpinarea procesului de formare al acrilamidei

în produsele alimentare prin controlul reacţiilor sintetizatoare de amidă acrilică în cursul prelucrării termice; • reducerea toxicităţii acrilamidei prin metode fitoterapeutice, chemopreventive sau de inducţie enzimatică, metode care să accelereze excretarea metaboliţilor toxici ai acrilamidei sau săpreîntâmpine formarea de aducţi chimici, precursori ai leziunii biochimice. Prin urmare, modelele experimentale pe animale de laborator, realizate în cadul acestei teze de doctorat, ce şi-au propus evaluarea potenţialelor antitoxice şi protectoare ale acidului ascorbic şi a ftalidelor din uleiul volatil, respectiv soluţiile extractive de Apii folium, Apii radix şi Apii semen îşi justifică necesitatea cercetării. 3Obiectivele tezei de doctorat Cercetările din cadrul tezei de doctorat au fost orientate spre următoarele obiective: • validarea unei metode gaz cromatografice de determinare cantitativă a acrilamidei în alimente; • evaluarea conţinutului în acrilamidă al unor produse alimentare disponibile pe piaţa comercială din România; • influenţa procesului culinar asupra concentraţiei de acrilamidă în produse pe bază de cereale (pâine feliată prăjită şi neprăjită) şi produse pe bază de cartofi (cartofi prăjiţi, cartofi copţi, cartofi prăjiţi sub abur); • estimarea corelaţiei existente între conţinutul în zahăr direct reducător şi concentraţia în acrilamidă în produsele alimentare pe bază de cartofi (cartofi prăjiţi) şi cereale (pop-corn); • evidenţierea modificărilor biochimice, hematologice şi histopatologice pe animale de laborator expuse aportului cronic de acrilamidă prin consum de cartofi prăjiţi, pâine prăjită, respectiv soluţie apoasă de acrilamidă 0,1 μg/L timp de 90 de zile; • aprecierea modificărilor biochimice în intoxicaţia subacută cu acrilamidă şi evaluarea unei posibile acţiuni antitoxice a acidului ascorbic; • determinarea modificărilor biochimice în intoxicaţia cronică cu acrilamidă survenită prin administrarea unei doze de 25 μg/kg timp de 11 săptămâni şi estimarea efectului protector al preparatelor de Apium graveolens (Apii aetheroleum, Apii folium, Apii radix, Apii semen).*** Teza de doctorat este structurată pe 14 capitole, cuprinde 295 de pagini (parte generală – 83 pagini), 175 de figuri şi 86 de tabele. 4PARTE GENERALĂSTADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII Stadiul actual al cunoaşterii problematicii acrilamidei este structurat pe 6 capitole. Capitolul I prezintă aspecte generale privind caracteristicile

fizico-chimice ale amidei acrilice, obţinerea monomerului pe cale sintetică şi utilizările sale în industrie (1, 2, 17, 18). Capitolul II al tezei expune cercetările realizate până în prezent pe plan internaţional privind elucidarea mecanismului de formare al acrilamidei în alimente. O primă ipoteză susţine căprecursorii toxicului rezultat în urma prelucrării termice a alimentului sunt diferiţi aminoacizi (alanina, glutamina, asparagina, metionina) (19). A doua ipoteză consideră acroleina ca fiind implicată în mecanismul de formare al acrilamidei (17, 19). O a treia posibilitate de exprimare a procesului de formare al acrilamidei în alimente vizează acidul acrilic, compus rezultat din acroleină sau acizi policarboxilici (19). A patra ipoteză, considerată a sta la baza mecanismului principal de formare al amidei acrilice în alimente, consideră compuşii Maillard ca fiind veritabilii precursori ai toxicului alimentar (7, 20, 21, 22). Capitolul III prezintă o imagine sintetică a metodelor de analiză cantitativă a acrilamidei în alimente. Metodele de evidenţiere şi cuantificare ale amidei acrilice sunt variate, fiecare adaptându-se tipului de produs analizat şi caracteristicilor acestuia, caracteristici ce se referă la consistenţă, conţinutul în grăsimi, aminoacizi, proteine etc. Stadiile procesului analitic sunt comune tuturor metodelor de dozare a acrilamidei şi constau în: omogenizarea produsului alimentar şi adaosul standardului intern, extracţia analitului fie în apă, fie în solvenţi organici, purificarea extractului, etape urmate fie de analiza directă a amidei toxice (prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă în tandem cu spectrometria de masă sau prin gaz cromatografie cuplată cu detecţia spectrometrică), fie de un pas suplimentar ce constă în derivatizarea acrilamidei prin brominare, etapă ce conduce la creşterea sensibilităţii metodei (23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31; 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38). 5Capitolul IV abordează sistematic şi gradual factorii care influenţează procesul de formare al acrilamidei în alimente şi modalităţile de reducere ale concentraţiei noxei alimentare în produsele alimentare pe bază de cereale şi cartofi. Conţinutul în acrilamidă al produselor alimentare este influenţat de o serie de parametri, parametri dependenţi de materia primă (tipul de sol, amplasamentul culturilor, tratamentul cu fertilizatori organici, momentul recoltării, conţinutul în precursori al materiei prime, prezenţa aminoacizilor şi proteinelor, conţinutul în umiditate al materiei prime, condiţii de depozitare) (21, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45) şi parametri dependenţi de procesul culinar (blanşizare, pre-prăjire, condimente având caracter antioxidant, utilizarea carbonatului de amoniu în obţinerea produselor de panificaţie, utilizarea îndulcitorilor, timp şi temperatură de prelucrare culinară) (46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57). Capitolul V al tezei de doctorat prezintă căile de expunere

ale populaţiei la agresivitatea acrilamidei, precum şi modalităţi de estimare ale aportului de acrilamidă prin consum de alimente cu un conţinut bogat în această noxă alimentară (3, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68). Capitolul VI reprezintă o trecere în revistă a datelor din literatura de specialitate privind toxicocinetica şi toxicitatea acrilamidei la animalele de laborator şi la om. Acrilamida este incriminată a avea acţiune cancerigenă, genotoxică, mutagenă, neurotoxică şi toxică asupra reproducerii. Cu toate acestea, concluzii certe privind potenţialul carcinogen al acrilamidei în urma consumului îndelungat de alimente cu un conţinut bogat în acest compus nu pot fi susţinute de studiile epidemiologice efectuate. Efectele genotoxice şi cancerigene ale acrilamidei au fost demonstrate doar pe culturile de celule embrionare de hamster sirian şi la animalele de laborator (4, 5, 70, 71, 72, 73). 6PARTE PERSONALĂCAPITOLUL VII ANALIZA CANTITATIVĂ A ACRILAMIDEI ÎN PRODUSELE ALIMENTARE - VALIDAREA METODEI GAZ CROMATOGRAFICE Prezentul capitol îşi propune elaborarea şi validarea unei metode simple de determinare cantitativă a acrilamidei, bazată pe tehnica cromatografiei gazoase cu detecţie de ionizare în flacără, urmărind parametrii: liniaritate, precizie, acurateţe, stabilitate, randament de recuperare, limită de detecţie, limită de cuantificare. VII.1 Instrumente analitice şi condiţii cromatograficeExperimentele au fost efectuate pe un gaz cromatograf Agilent Technologies (6890N, Network GC System – US10337042 – USA), cu detector de ionizare în flacără, folosind ca gaz purtător azotul, cu debit de 2,0 ml/min. VII.2 Validarea metodei Metoda de validare şi procedura de analiză a probelor s-a realizat în conformitate cu normele de validare pentru metodele analitice ale FDA (75). Validarea metodei a fost realizată prin stabilirea următorilor parametri: liniaritate, precizie, acurateţe, stabilitate, randament de recuperare, limită de detecţie, limită de cuantificare. a) Determinarea domeniului de liniaritate Răspunsul acrilamidei este liniar peste un interval de concentraţie de 0,5 – 5,0 mg/L, având un coeficient de determinare (R2) de 0,9999 . b) Determinarea preciziei Determinarea repetabilităţii Pentru repetabilitate, câte cinci determinări pentru trei soluţii standard (0,5 mg/L, 1,0 mg/L şi 5,0 mg/L) au fost realizate în aceeaşi

zi, de către acelaşi analist, cu aceeaşi aparatură, şi cu aceiaşi reactivi, în aceleaşi condiţii experimentale. Rezultatele demonstrează o bunărepetabilitate a metodei. 7Determinarea preciziei intermediare Precizia intermediară a fost verificată prin realizarea a câte 5 injecţii pe zi, în trei zile diferite, pentru cele trei soluţii standard (0,5 mg/L, 1,0 mg/L şi 5,0 mg/L). Rezultatele evidenţiază o bună precizie intermediară a metodei. În concluzie, pe baza rezultatelor obţinute, se poate aprecia faptul că metoda este precisă. c) Determinarea exactităţii Exactitatea metodei a fost determinată prin analiza a trei puncte din curba de calibrare şi compararea valorii măsurate cu valoarea „reală”. Rezultatele demonstrează faptul că metoda prezentată este exactă. d) Evaluarea stabilităţii Stabilitatea a fost verificată pe trei soluţii standard (0,5 mg/L, 1,0 mg/L, 5,0 mg/L) după o lună, respectiv 2 luni de la preparare. În acest timp, soluţiile au fost păstrate la întuneric, în tuburi de hemoliză, la temperatura de 4ºC, fiind scoase doar în perioada injectărilor. După o lună de la preparare, în urma analizei gaz cromatografice a celor trei soluţii standard, nu s-au observat modificări în ceea ce priveşte structura cromatogramei sau aria picului pentru acrilamidă. După două luni de la prepararea celor trei soluţii standard, intervin modificări atât în structura cromatogramei, prin apariţia unor picuri noi, dar şi în ceea ce priveşte aria picului pentru acrilamidă, observându-se o scădere a acesteia. e) Determinarea randamentului de recuperare Randamentul de recuperare se caracterizează prin obţinerea unor valori optime în cazul tuturor categoriilor de produse analizate (cartofi prăjiţi, chips-uri, pâine prăjită, biscuiţi, pop-corn). VII.3 Concluzii Metoda de determinare cantitativă a acrilamidei prezentată în acest capitol este o metodă gaz cromatografică cu detecţie de ionizare în flacără, care se caracterizează prin precizie, exactitate, stabilitate şi un randament de recuperare corespunzător. Această metodă prezintăca avantaje simplitatea şi rapiditatea protocolului de prelucrare a probelor, precum şi un cost redus de achiziţionare a echipamentului analitic în comparaţie cu alte metode de analiză cantitativă a acrilamidei. 8CAPITOLUL VIII ANALIZA CANTITATIVĂ A ACRILAMIDEI ÎN PRODUSELE ALIMENTARE - APLICAŢII Obiectivul prezentului capitol constă în evaluarea conţinutului în acrilamidă al produselor alimentare disponibile pe piaţa comercială din România (chips-uri, cartofi prăjiţi, pâine, pâine

prăjită, biscuiţi, pop-corn), utilizând metoda gaz cromatografică a cărei validare este prezentată în capitolul VII. VIII.1 Prelucrarea probelor Probele de chips-uri, cartofi prăjiţi, pâine prăjită au fost mărunţite prin mojarare şi cântărite la balanţa analitică (în jur de 3 g pentru fiecare probă) în flacoane Erlenmeyer cu dop rodat. S-au adăugat câte 10 ml metanol HPLC şi 100 μL soluţie dimetilftalat 1,014 g/L (standard intern) în fiecare probă. În continuare, probele au fost menţinute la 60°C, pe plita magnetică, 3000 rpm, timp de 20 minute. Supernatantele au fost recuperate în eprubete de centrifugă, menţinute la temperatură scăzută (4ºC) pentru 2 ore, supuse centrifugării 20 minute la 3500 rpm şi concentrate la aproximativ 1 mL. În final, s-au injectat în gaz cromatograf câte 0,2 μL. Celelalte probe au fost supuse aceloraşi etape de prelucrare, cu excepţia faptului că în cazul probelor de pop-corn şi biscuiţi s-au utilizat pentru extracţie 50 mL metanol, respectiv 20 mL metanol. VIII.2 Analiza cantitativă a acrilamidei în probele de chips-uri În scopul evaluării conţinutului în acrilamidă al probelor de chips-uri, s-au analizat 56 de probe diferite, fiecare rezultat reprezentând media a 4 determinări. Domeniul valorilor medii ale concentraţiilor se întinde de la o valoare aflată sub limita de detecţie a metodei şi până la 4,94 mg/kg (fig. VIII.1). În unele cazuri, pentru probe de chips-uri provenite din şarje diferite, s-au obţinut variaţii considerabile în ceea ce priveşte conţinutul în acrilamidă. Aceste variaţii ale concentraţiilor de acrilamidă pentru aceeaşi probă se pot explica prin faptul că, 9provenind din şarje diferite, materiile prime utilizate pot varia din punct de vedere al nivelurilor de precursori (asparagină şi zaharuri reducătoare) şi al prezenţei aminoacizilor şi proteinelor (76, 77). De asemenea, parametrii procesului culinar pot fi diferiţi (temperatură şi timp de prăjire, tipul de ulei folosit la prăjire şi gradul de peroxidare, cantitatea de condimente ce pot interveni prin caracterul antioxidant, prezenţa clorurii de sodiu şi a sărurilor de calciu) (78, 79). VIII.3 Analiza cantitativă a acrilamidei în probele de cartofi prăjiţi Pentru a evalua conţinutul în acrilamidă al probelor de cartofi prăjiţi s-au analizat 16 probe procurate din diverse puncte de distribuţie din oraşele Iaşi, Bucureşti, Cluj, Galaţi, Timişoara. Probele de cartofi prăjiţi prezintă valori uşor superioare probelor de chips-uri în ceea ce priveşte conţinutul în acrilamidă, cuprinse în intervalul 1,5 – 5,03 mg/kg (fig. VIII.2). VIII.4 Analiza gaz cromatografică a acrilamidei în probele de pâine prăjităRezultatele privind concentraţia de acrilamidă în probele de pâine prăjită procurate din reţeaua comercială din România sunt

redate în figura VIII.3 şi reprezintă media a 3 determinări. Valorile sunt inferioare probelor de cartofi prăjiţi şi chips-uri, fapt explicabil printr-o concentraţie mai scăzută a aminoacidului precursor (asparagina) în cereale faţă de cartofi. Aproximativ jumătate din probele de pâine prăjită analizate în acest experiment (47,62%) conţin acrilamidă în cantităţi situate sub limita de cuantificare a metodei. Concentraţia maximă în cadrul probelor analizate este de 1,60 mg/kg. VIII.5 Analiza gaz cromatografică a acrilamidei în probele de biscuiţi Probele analizate în vederea determinării cantitative a acrilamidei sunt reprezentate de 39 de probe de biscuiţi procurate din diverse puncte comerciale de pe teritoriul României. Rezultatele privind concentraţia acrilamidei în probele de biscuiţi sunt prezentate în figura VIII.4 şi reprezintă media a 3 determinări. Valorile sunt asemănătoare rezultatelor obţinute pentru probele de pâine prăjită, excepţie făcând probele 4, 27 şi 28, cu un conţinut în acrilamidă de 3,40 mg/kg, 3,89 mg/kg, respectiv 3,95 10mg/kg. Un procent de 33,33% dintre probele analizate conţin acrilamidă în cantităţi aflate sub limita de cuantificare a metodei gaz cromatografice. Rezultatele se caracterizează printr-o valoare a deviaţiei standard de 2,149523, respectiv a deviaţiei standard relative 1,523099 şi reprezintă consecinţa unui întreg ansamblu de factori. Astfel, conţinutul în acrilamidă al biscuiţilor este influenţat nu numai de caracteristicile materiei prime (gradul de extracţie al făinii, soiul de cereale utilizat, provenienţa culturilor de cereale), dar şi de ingredientele folosite pe parcursul procesului industrial de preparare a biscuiţilor (80). VIII.6 Analiza gaz cromatografică a probelor de pop-corn Rezultatele privind concentraţia acrilamidei în probele de pop-corn analizate sunt ilustrate în figura VIII.5 şi reprezintă media a 3 determinări. Rezultatele prezintă o bună distribuţie a valorilor (SD = 0,8818, RSD = 0,8768). Două dintre cele 14 probe analizate conţin acrilamidă în concentraţii aflate sub limita de cuantificare (proba 12), respectiv de detecţie (proba 9) a metodei gaz cromatografice. Restul probelor prezintă valori ale concentraţiei de acrilamidă cuprinse în intervalul 0,12 – 3,40 mg/kg. Spre deosebire de celelalte probe, în cazul probelor de popcorn, pe lângă factorul de variabilitate al materiei prime, intervine ca factor limitant procesul de prelucrare culinară prin intermediul microundelor. Cercetările în domeniu confirmă formarea acrilamidei atât în produsele alimentare cât şi în modelele experimentale în care sunt implicate microundele. VIII.7 Concluzii Analizând valorile măsurate pe categorie de produs, cele mai mari concentraţii de acrilamidă se găsesc în probele de cartofi prăjiţi

(media = 6,0058 mg/kg), fiind urmate de probele de chips-uri (media = 1,5578 mg/kg), biscuiţi (media = 1,4113 mg/kg), pop-corn (media = 1,0057 mg/kg) şi pâine (media = 0,5112 mg/kg). 110,450,911,80,710,420,761,170 0 04,224,944,341,91,580,32,131,330,770,31,260,970,722,071,330,752,184,851,3702,050,4201,153,2303,532,213,610 0 04,90,321,451,280,74

4,063,850123456P1 P 4 P 5 P 6 P 7 P 9 P10P11P13P14P15P16P17P20P21P22P23P24P25P27P28P29P30P31P

32P33P34P35P36P37P38P39P40P41P42P43P44P45P46P47P48P49P50P51P52P53P54P

55P56Probe chips-uriConcentraţia acrilamidei (mg/kg)Fig VIII.1. Concentraţia acrilamidei în probele de chips-uri (rezultatele sunt media a 4 determinări) 123,564,272,03 1,99 25,031,52,392,652,032,553,02 33,532,550123456Concentraţia în acrilamidă(mg/kg)Proba1Proba3Proba5Proba7Proba9Proba11Proba13Proba15Probe cartofi prăjiţi

Fig. VIII.2. Conţinutul în acrilamidă al probelor de cartofi prăjiţi 13Concentraţiile de acrilamidă în probele de pâine prăjită01,61,23100 0 0001,151,471,310000,990000,560,631,200010,9200,60,760000,71,120,990,90,910,650,90,8800,20,40,60,811,21,41,61,8Proba 1Proba 3Proba 5Proba 7Proba 9

Proba 11Proba 13Proba 15Proba 17Proba 19Proba 21Proba 23Proba 25Proba 27Proba 29Proba 31Proba 33Proba 35Proba 37Proba 39Proba 41Probe pâine prăjităConcentraţia în acrilamidă (mg/kg)Fig. VIII.3. Concentraţia de acrilamidă în probele de pâine prăjită 1400,7401,33000 00,6702,051,330 01,90,650,720,9922,51,050,483,893,957,9710,510 00,85 0,81,030,700,730

1,59 1,58 1,633,4024681012Proba 1Proba 2Proba 3Proba 4Proba 5Proba 6Proba 7Proba 8Proba 9Proba 1Proba 11Proba 12Proba 13Proba 14Proba 15Proba 16Proba 17Proba 18Proba 19Proba 20Proba 21Proba 22Proba 23Proba 24Proba 25Proba 26Proba 27Proba 28Proba 29Proba 30Proba 31Proba 32Proba 33Proba 34Proba 35Proba 36Proba 37

Proba 38Proba 39Probe biscuiţi Concentraţia în acrilamidă (mg/kgFig. VIII.4. Concentraţiile de acrilamidă în probele de biscuiţi 150,911,551,060,861,841,320,1700,770,12 00,673,241,5700,511,522,533,50 2 4 6 8 10 12 14 16Probe pop-cornConcentraţia de acrilamidă (mg/kg)Fig. VIII.5. Concentraţia de acrilamidă în probele de pop - corn Diferenţa de valori pe categorie de produs se explică atât prin conţinutului superior în asparagină şi zaharuri reducătoare al probelor de cartofi în comparaţie cu cerealele, dar şi prin parametrii procesului culinar specific obţinerii fiecărui produs alimentar (prăjire în ulei, în cazul chips-urilor şi al cartofilor prăjiţi; prăjire în cazul pâinii prăjite şi al biscuiţilor; microunde în cazul probelor de pop-corn) (80). Concentraţiile superioare de acrilamidă determinate în probele de cartofi comparativ cu probele de chips-uri se pot explica fie prin diferenţa dintre materiile prime privind conţinutul în precursori ai acrilamidei, fie prin tratarea probelor de chips-uri înaintea procesului de prelucrare termică, cu condimente având proprietăţi antioxidante, cu un rezultat inhibitor asupra procesului de formare al acrilamidei (57, 79, 80). Variaţia concentraţiilor de acrilamidă în cazul produselor pe bază de cereale (pâine prăjită, biscuiţi, pop-corn) poate avea drept

cauză, pe lângă variaţia precursorilor în materiile prime, diferenţele din cadrul procesului culinar aplicat: umiditate, timp şi temperaturăde prăjire, intervenţia microundelor, utilizarea îndulcitorilor sau a altor ingrediente cu conţinut bogat în zaharuri, utilizarea aditivilor precum acidul citric, acidul ascorbic, sărurile de sodiu şi potasiu (80). 16CAPITOLUL IX CORELAŢIA DINTRE CONŢINUTUL ÎN ZAHĂR SOLUBIL ŞI NIVELUL DE ACRILAMIDĂCapitolul prezent îşi propune corelarea concentraţiei acrilamidei din preparate culinare precum cartofi prăjiţi şi pop-corn cu nivelurile de zahăr direct reducător şi zahăr total solubil din materia primă neprelucrată termic (cartofi, porumb). IX.1 Determinarea concentraţiei de zahăr direct reducător şi zahăr total solubil prin metoda Luff-Schoorl Probele analizate în vederea evaluării conţinutului în zahăr direct reducător, respectiv zahăr total solubil prin metoda LuffSchoorl sunt reprezentate de probe de cartofi şi porumb pentru popcorn, procurate din reţeaua comercială a judeţului Iaşi. Rezultatele evidenţiază faptul că probele de cartofi conţin cantităţi superioare de zahăr direct reducător (valoare medie pentru zahăr direct reducător de 1,2310 mg % glucoză), în comparaţie cu probele de porumb pentru pop-corn (0,1345 mg % glucoză), fapt susţinut experimental de cercetările de specialitate (81, 82) (fig. IX.1). Media valorilor determinate experimental pentru conţinutul în zahăr total solubil urmează aceeaşi variaţie, cu diferenţe mai subtile însă (2,6981 mg % glucoză pentru probele de porumb şi 3,4958 mg % glucoză pentru probele de cartofi) (fig. IX.2). 0,3761,37571,53440,15170,07130,162700,20,40,60,811,21,41,6Conţinutul în ZDR (m g glucoză)Cartofi Porumb pop-cornProba 1 Proba 2 Proba 3Fig. IX.1. Conţinutul în zahăr direct reducător al probelor de cartofi

şi porumb 172,69534,22473,56754,0070,67783,4096012345Conţinutul în ZTS (mg glucoză)Cartofi Porumb pop-cornProba 1 Proba 2 Proba 3Fig. IX.2. Conţinutul în zahăr total solubil al probelor de cartofi şi porumb IX.2 Determinarea concentraţiei de acrilamidă din produsele alimentareProbele analizate prin metoda gaz cromatografică în vederea decelării acrilamidei sunt reprezentate de probe de cartofi prăjiţi şi pop-corn, obţinute prin prelucrarea culinară a probelor de cartofi şi porumb pentru pop-corn, al căror conţinut în zahăr direct reducător şi zahăr total solubil a fost analizat anterior.Experimentele au fost efectuate pe un gaz cromatograf Agilent Technologies cu detector de ionizare în flacără, folosind condiţiile cromatografice prezentate în capitolul VII. În urma analizei comparative a concentraţiilor de acrilamidădin cele două categorii de alimente, putem observa că cele mai ridicate concentraţii de toxic se găsesc în probele de cartofi prăjiţi (concentraţie medie de 10,5078 mg acrilamidă/kg probă cartofi prăjiţi), fiind urmate de probele de pop-corn (2,6981 mg acrilamidă/kg probă pop-corn) (fig. IX.3). Putem observa, de asemenea, existenţa corelaţiei între conţinutul de zahăr direct reducător, respectiv de zahăr total solubil din probele de cartofi şi concentraţia de acrilamidă din probele de cartofi prăjiţi, obţinute prin prelucrarea termică a cartofilor analizaţi (fig. IX.4). 186,5112,0812,940,880,581

02468101214Conţinutul în acrilamidă (mg/kg)Cartofi Porumb pop-cornProba 1 Proba 2 Proba 3Fig. IX.3. Conţinutul în acrilamidă al probelor de cartofi prăjiţi şi pop-corn Astfel, pentru proba 1, având conţinutul cel mai redus în zahăr direct reducător (0,376 mg % glucoză), se obţine cea mai scăzută concentraţie de acrilamidă (6,51 mg/kg produs). Un nivel mai ridicat al zahărului direct reducător pentru proba 2 (1,3757 mg % glucoză) conduce, de asemenea, la concentraţii superioare de acrilamidă (12,08 mg/kg produs). Pentru proba 3, ce deţine valoarea maximă privind conţinutul în zahăr direct reducător (1,5344 mg % glucoză), se obţine concentraţia maximă de acrilamidă (12,94 mg/kg produs). Se observă şi în cazul probelor de porumb pentru pop-corn, dependenţa concentraţiei de acrilamidă de conţinutul în zahăr direct reducător şi zahăr total solubil (fig. IX.5). 1,53446,5112,940,3761,375712,080246810121416Proba 1 Proba 2 Proba 3Conţinutul în zahăr direct reducător (mg glucoză)Concentraţia de acrilamidă (mg/kg)ZDR ACRFig. IX.4. Evoluţia concentraţiei de acrilamidă în probele de cartofi

prăjiţi în funcţie de conţinutul în ZDR al materiei prime 190,16270,880,07130,15170,58100,20,40,60,811,2Proba 1 Proba 2 Proba 3Conţinut în zahăr direct reducător (mg glucoză)Concentraţia de acrilamidă (mg/kg produs)ZDR ACRFig. IX.5. Evoluţia concentraţiei de acrilamidă în probele de popcorn în funcţie conţinutul în ZDR al materiei prime IX.3 Concluzii Se observă variaţia nivelurilor de zahăr direct reducător şi zahăr total solubil în cadrul materiilor prime analizate (cartofi, porumb pentru pop-corn), pentru aceeaşi probă, dependent de şarja de provenienţă. Variaţia nivelurilor de zahăr direct reducător şi zahăr total solubil se regăseşte şi în cadrul aceluiaşi produs, pentru probe diferite. Se observă dependenţa concentraţiei de acrilamidă de conţinutul în zahăr direct reducător şi zahăr total solubil, pentru toate cele trei probe analizate. În urma analizei comparative a concentraţiilor de acrilamidădin cele două categorii de alimente, putem observa că cele mai ridicate concentraţii de toxic se găsesc în probele de cartofi prăjiţi, fiind urmate de probele de pop-corn. 20CAPITOLUL X INFLUENŢA PROCESULUI CULINAR ASUPRA CONŢINUTULUI ÎN ACRILAMIDĂ - STUDIU COMPARATIV Capitolul X al tezei de doctorat îşi propune: • evaluarea influenţei timpului, respectiv a temperaturii de prelucrare culinară asupra concentraţiei de acrilamidă formată în probe de pâine feliată supuse procesului de prelucrare termică prin prăjire. • studiul experimental privind influenţa soiurilor de cartofi şi implicaţiile modului de prelucrare culinară asupra conţinutului în

acrilamidă. X.1 Implicaţiile intervalului de prelucrare culinară şi a temperaturii procesului culinar în procesul de formare al acrilamidei Probele analizate prin metoda gaz cromatografică prezentatăîn capitolul VII în vederea decelării amidei toxice sunt reprezentate de trei probe de pâine feliată: o probă de pâine feliată albă (1), o probă de pâine integrală (2) şi o probă de pâine feliată Graham (3). Pentru fiecare tip de pâine feliată, s-au luat în lucru câte trei probe (1a, 1b, 1c; 2a, 2b, 2c; 3a, 3b, 3c), rezultând, în final, nouă probe. Astfel, rezultatele vor reprezenta media a trei determinări. Probele au fost procurate din reţeaua comercială a judeţului Iaşi. Fiecare din cele nouă probe au fost prelucrate termic prin prăjire astfel: 0 - pâine feliată neprăjită, 1’- pâine feliată prăjită 1 minut, 3’- pâine feliatăprăjită 3 minute, 5’- pâine feliată prăjită 5 minute. Rezultatele denotă faptul că nivelul acrilamidei în toate cele 3 probe de pâine feliată neprăjită sunt semnificativ scăzute, fiind situate sub limita de cuantificare a metodei. De asemenea, rezultatele pun în evidenţă o creştere a nivelului de acrilamidă în probele de pâine prăjită dependent de timpul de prelucrare termică şi, implicit, de temperatura procesului de prăjire, dependenţă ilustrată în figura X.1. 210 00,39100,2520,3290,4610,2780,5670,3790,570,47400,10,20,30,40,50,61234Probe pâine feliată prăjite pentru intervale diferite de timp: 1. pâine feliatăneprăjită; 2. pâine feliată prăjită 1 minut; 3. pâine feliată prăjită 3 minute; 4. pâine feliată prăjită 5 minute.Concentraţia în acrilamidă (mg/kgFig.X.1. Concentraţia în acrilamidă a probelor de pâine feliată prăjite

Valorile maxime privind concentraţia de acrilamidă în probele de pâine feliată prăjită s-au obţinut în cazul probei 3 (0,379 mg/kg), pâine Graham, ce conţine în compoziţia sa tărâţe de grâu. Experimental, a fost demonstrat faptul că utilizarea făinii cu grad mic de extracţie, prin conţinutul scăzut de asparagină, conduce la obţinerea unor produse de panificaţie cu un conţinut redus de acrilamidă. Spre deosebire de aceasta, tărâţele conţin concentraţia cea mai ridicată de asparagină şi, prin urmare, va conduce, în urma procesului de prelucrare termică, la un conţinut maxim al amidei toxice (81). X.2 Influenţa modului de prelucrare culinară asupra conţinutului în acrilamidăProbele analizate prin metoda gaz cromatografică în vederea determinării cantitative a acrilamidei sunt reprezentate de trei soiuri diferite de cartofi timpurii (Solanum tuberosum Ostara, Solanum tuberosum Desiree, Solanum tuberosum Sante). Experimentele au fost efectuate pe un gaz cromatograf Agilent Technologies cu detector de ionizare în flacără, folosind condiţiile cromatografice prezentate în capitolul VII. 22Rezultatele demonstrează faptul că nivelul acrilamidei în produsele alimentare pe bază de cartofi variază dependent de soiul de cartof utilizat în procesul de prelucrare culinară, datele obţinute fiind în concordanţă cu datele din literatură (83, 84). Astfel, se observă căvaloarea cea mai ridicată privind concentraţia în acrilamidă s-a obţinut pentru proba 3 - Solanum tuberosum Sante, urmată de proba 2 - Solanum tuberosum Desiree, concentraţiile cele mai reduse obţinându-se pentru proba 1 - Solanum tuberosum Ostara.Rezultatele demonstrează, de asemenea, variaţia conţinutului în acrilamidă funcţie de procedeul culinar aplicat. Astfel, valorile cele mai ridicate pentru acrilamidă s-au obţinut pentru cartofii prăjiţi în ulei (30,95 mg acrilamidă/kg pentru Solanum tuberosum Ostara, 31,40 mg acrilamidă/kg pentru Solanum tuberosum Desiree, 31,76 mg acrilamidă/kg pentru Solanum tuberosum Sante). Valori mai scăzute s-au obţinut în cazul cartofilor copţi la cuptorul clasic (30,10 mg acrilamidă/kg pentru Solanum tuberosum Ostara, 31,40 mg acrilamidă/kg pentru Solanum tuberosum Desiree, 31,76 mg acrilamidă/kg pentru Solanum tuberosum Sante). Valorile cele mai reduse au fost determinate în cazul cartofilor prelucraţi termic prin prăjire în abur (24,15 mg acrilamidă/kg pentru Solanum tuberosum Ostara, 27,12 mg acrilamidă/kg pentru Solanum tuberosum Desiree şi 27,15 mg acrilamidă/kg pentru Solanum tuberosum Sante). X.3 Concluzii Nivelul acrilamidei în toate cele 3 probe de pâine feliatăneprăjită sunt semnificativ reduse, fiind situate sub limita de cuantificare a metodei. Rezultatele evidenţiază o creştere a concentraţiei de

acrilamidă în probele de pâine prăjită dependentă de timpul de prelucrare termică şi, implicit, de temperatura procesului de prăjire. Valorile maxime privind concentraţia de amidă toxică în probele de pâine feliată prăjită s-au obţinut în cazul probei 3, pâine Graham, ce conţine în compoziţia sa tărâţe de grâu. Rezultatele demonstrează faptul că nivelul acrilamidei în produsele alimentare pe bază de cartofi variază dependent de soiul de cartof utilizat în procesul de prelucrare culinară. Rezultatele relevă variaţia conţinutului în acrilamidă funcţie de procedeul culinar aplicat. Astfel, valorile cele mai ridicate pentru 23acrilamidă s-au obţinut pentru cartofii prăjiţi în ulei, valori mai scăzute s-au obţinut în cazul cartofilor copţi la cuptorul clasic, iar valorile cele mai reduse au fost determinate în cazul cartofilor prelucraţi termic prin prăjire în abur. CAPITOLUL XI STUDIUL MODIFICĂRILOR BIOCHIMICE, HEMATOLOGICE ŞI HISTOPATOLOGICE ÎN INTOXICAŢA CRONICĂ CU ACRILAMIDĂPrezentul capitol îşi propune ca obiectiv monitorizarea modificărilor biochimice, hematologice şi histopatologice ulterior aportului de acrilamidă prin consum de alimente prelucrate termic (cartofi prăjiţi şi pâine prăjită) la animalele de laborator, respectiv prin consumul ad libitum al unei soluţii de acrilamidă 0,1 µg/L (limita maximă admisibilă privind prezenţa acrilamidei în apa potabilă, conform legislaţiei Uniunii Europene). XI.1 Modelul experimental Toate procedeele experimentale realizate în acest studiu au fost în strictă concordanţă cu reglementările etice internaţionale şi au primit aprobarea Comisiei de Etică a Universităţii de Medicină şi Farmacie “Gr.T. Popa“, Iaşi. Experimentul s-a desfăşurat pe 4 loturi de şobolani (6 şobolani pe lot), linia Wistar, cu mase ponderale cuprinse între 180 – 220 g, după modelul experimental din tabelul XI.1 Experimentul s-a derulat pe perioada a 90 de zile. La finalul experimentului, animalele de experienţă au fost anesteziate cu ketamină (i.p., 75mg/kg). La constatarea absenţei semnelor vitale (mişcări respiratorii, bătăile cordului, reflexe), s-au recoltat probe de sânge din plexul retroorbitar în scopul efectuării analizelor biochimice şi hematologice. Ulterior, animalele au fost sacrificate pentru recoltarea fragmentelor de organe: creier, ficat, rinichi, pancreas, splină, considerate posibile organe-ţintă. 24Tabel XI.1. Modelul experimental referitor la aportul de alimente bogate in acrilamidăLoturi Denumire Acrilamidăsoluţie 0,1μg/l Cartofi

prăjiţi Pâine prăjităLot 1 Lot de referinţă - - - Lot 2 Lot de control Ad libitum - - Lot 3 Lot CP - Ad libitum - Lot 4 Lot PP - - Ad libitumXI.2 Interpretarea statisticăÎn interpretarea statistică a datelor au fost utilizate o serie de metode statistice de analiză a factorilor de variabilitate în experimentul biologic (ANOVA). Datele statistice au fost prelucrate de programul StatsDirect versiunea 2.7.2 (2008). Rezultatele au fost exprimate ca medie ± deviaţie standard. A fost consideratăsemnificativă valoarea p<0,05. XI.3 Investigaţia biochimicăDeterminările biochimice s-au efectuat sub forma unei baterii de teste care urmează cinci direcţii principale: a) Testarea integrităţii celulare în sensul decelării modificării patologice a permeabilităţii membranei hepatocitului; b) Controlul capacităţii de sinteză a ficatului în sensul depistării insuficienţei funcţiei proteosintetice; c) Depistarea unei eventuale inducţii enzimatice sau a unui virtual fenomen de oncogeneză; d) Evaluarea stresului oxidativ;e) Evaluarea funcţiei de detoxifiere a ficatului. Determinările cantitative ale parametrilor biochimici vizaţi de experimentul în curs s-au efectuat pe analizorul semiautomat EOS 880 PLUS în sistem deschis. a) Testarea integrităţii celulare Determinarea aspartat aminotransferazei Evoluţia AST evidenţiază creşteri semnificative ale activităţii sale în serul animalelor ce au fost tratate cu soluţie de acrilamidă, cartofi prăjiţi şi pâine prăjită, ceea ce sugerează apariţia unor leziuni la nivelul membranei hepatocitului; activitatea cea mai crescută a 25enzimei se înregistrează în serul animalelor hrănite cu cartofi prăjiţi (fig. XI.1). Determinarea alanil aminotransferazei Activitatea ALT înregistreză o ascensiune semnificativăpentru lotul ce a consumat acrilamidă în apa de băut, pentru loturile hrănite cu pâine prăjită, respectiv cartofi prăjiţi, valoarea cea mai crescută fiind atinsă de lotul hrănit cu cartofi prăjiţi (fig. XI.2). 35,52669,90854,28484,0263,47

49,9865,19 65,3233,1675,612 80,6341,163,2831 6,2557 7,7026 5,66860,0895 0,1019 0,0924 0,10440102030405060708090Lot ref Lot control Lot CP Lot PPLoturi experimentaleActivitatea aspartat aminotransferazeiMinima Media Maxima SD* RSD**Fig. XI.1. Activitatea aspartat aminotransferazei Determinarea lactat dehidrogenazei Activitatea lactat dehidrogenazei diminuează spectaculos pentru loturile hrănite cu cartofi prăjiţi şi pâine prăjită, necorelânduse cu ceilalţi doi indicatori de citoliză hepatică (fig. XI.3). b) Controlul capacităţii de sinteză a ficatului Determinarea proteinelor totale Studiul proteinemiei totale pentru loturile din experiment evidenţiază o scădere semnificativă pentru lotul de control şi pentru lotul hrănit cu pâine prăjită, scădere ce se poate asocia cu o deprimare a proteosintezei hepatice la aceste loturi (fig. XI.4). Determinarea albuminelor Variaţia albuminemiei loturilor din experiment deşi pare neconcludentă pentru evaluarea funcţiei proteosintetice a ficatului, poate fi corelată cu existenţa unui sindrom nefrotic. 2623,740,3427,98646,27660,906 60,59235,5173,8954,77 59,63 6348,21

4,70806 3,7842 8,1433 8,38310,1682 0,1337 0,1384 0,0818 01020304050607080Lot ref Lot control Lot CP Lot PPLoturi experimentaleActivitatea alanin aminotransferazeiMinima Media Maxima SD* RSD**Fig. XI.2. Evoluţia alanil aminotransferazei 5,5 5,223,39 3,636,6926,24,412 4,4387,997,195,32 5,611,0976 0,9215 0,6903 0,73360,164 0,14860,1565 0,1653 0123456789Lot ref Lot control Lot CP Lot PPActivitatea lactat dehidrogenazeiMinima Media Maxima SD* RSD**Fig. XI.3. Activitatea lactat dehidrogenazei Determinarea colinesterazei Evoluţia colinesterazei surprinde prin apariţia de valori crescute la animalele tratate cu acrilamidă, fie sub formă de soluţie apoasă fie sub formă de alimente tratate termic, creştere ce nu poate fi corelată cu deprimarea funcţiei proteosintetice a ficatului, dar care se corelează cu existenţa unui sindrom nefrotic, fenomen semnalat în

cazul intoxicaţiei cu acrilamidă. 27c) Depistarea unei eventuale inducţii enzimatice sau a unui virtual fenomen de oncogeneză Determinarea activităţii γ-glutamil transferazei Activitatea gamma-glutamil transpeptidazei înregistrează o creştere pentru lotul de control, ceea ce se corelează cu evoluţia indicatorilor de citoliză hepatică la acest lot. Activitatea enzimei atinge apogeul valoric în serul animalelor hrănite cu cartofi prăjiţi, această accentuare a activităţii enzimei fiind caracteristică leziunilor cronice ale hepatocitului de etiologie toxică (fig. XI.5). 8,74127,76028,6377,9254 7,6138,5037,3228,616 8,0198,7038,0668,8980,1089 0,2781 0,0873 0,17490,0125 0,03584 0,0101 0,0221012345678910Lot ref Lot control Lot CP Lot PPLoturi experimentaleValoarea proteinemieiMinima Media Maxima SD* RSD**Fig. XI.4. Concentraţiile serice de proteine totale (g/dL) d) Evaluarea stresului oxidativ Determinarea activităţii catalazei serice Variaţiile observate în analiza stresului oxidativ prin prisma catalazei, deşi nesemnificative din punct de vedere statistic, denotăimplicarea sa în inhibarea speciilor reactive ale oxigenului prin reducerea concentraţiei sale plasmatice pentru loturile expuse aportului cronic de acrilamidă, fie prin consumul soluţiei apoase de toxic, fie prin consumul de alimente cu un conţinut bogat în amida

acrilică (fig. XI.6). 288,3 8,8510,839,6611,666 12,06610,86 10,76214,2412,19,7814,861,39692,5141,85271,0540,1446 0,2155 0,15350,09790246810121416Lot ref Lot control Lot CP Lot PPActivitatea gama glutamil transpeptidazeiMinima Media Maxima SD* RSD**Fig. XI.5. Activitatea γ-glutamil transpeptidazei Determinarea superoxid dismutazei Cel de al doilea parametru evaluator al stresului oxidativ, superoxid dismutaza, metaloenzimă ce foloseşte ca substrat radicalul supeoxid (O2 .-), înregistrează modificări valorice revelatoare pentru implicaţiile sale în eradicarea stresului oxidativ cu până la 27-30 unităţi pentru toate loturile experimentale (fig. XI.7). 531,625496,2 495,64 509,24593,6493,9 483,01 478 498,16522 521 513,510,799 14,9315 8,5492 46,77110,0218 0,0301 0,0168 0,0880100200

300400500600700Lot ref Lot control Lot CP Lot PPLoturi experimentaleActivitatea catalazei (U/L)Minima Media Maxima SD* RSD**Fig. XI.6. Activitatea catalazei (U/L)29362,18 353,2 349,7415,63388,61 388,84 383,12409,5 421 420409 421,728,010,0120247 0,050479376 0,0626156384,9979 19,617 24,34730,073110962 050100150200250300350400450Lot ref Lot control Lot CP Lot PPActivitatea superoxid dismutazei (U/mL)Minima Media Maxima SD* RSD**Fig. XI.7. Activitatea superoxid dismutazei (U/L) Determinarea grupărilor sulfhidrice libere Analiza valorilor grupărilor sulfhidrice libere susţin experimental dublul rol al glutationului (cel de antioxidant şi detoxifiant), prin reducerea marcantă a valorilor plasmatice, în special pentru lotul expus aportului cronic de acrilamidă prin consumul soluţiei apoase de toxic alimentar (fig. XI.8). 210282,78212,02299 295,7263,5224195254,23 254,78

29522532,6870,052834808 0,09798706 0,12829342324,9116 11,2019 11,10650 0,03927671650100150200250300350Lot ref Lot control Lot CP Lot PPLoturi experimentaleGrupari sulfhidrice libereMinima Media Maxima SD* RSD**Fig. XI.8. Nivelul plasmatic al grupărilor sulfhidrice libere XI.4 Investigarea hematologică Determinările hematologice au urmărit modificările apărute la nivelul următorilor parametri: numărul de eritrocite, hematocritul, 30hemoglobina, concentraţia medie de hemoglobină, hemoglobina eritrocitară medie, volumul eritrocitar mediu, lărgimea distribuţiei eritrocitare, numărul de trombocite, volumul trombocitar mediu, limfocite, monocite, numărul de leucocite, neutrofile. În comparaţie cu valorile lotului de referinţă, celelalte 3 loturi experimentale au prezentat o scădere semnificativă din punct de vedere statistic a numărului de eritrocite, a hemoglobinei şi a hematocritului. Modificările valorilor volumului mediu eritrocitar sunt semnificative statistic doar pentru loturile expuse aportului de acrilamidă prin consum de cartofi prăjiţi şi pâine prăjită. Creşterea gradului de anizocitoză pentru loturile expuse aportului de acrilamidă este semnificativ din punct de vedere statistic (p<0,05) şi este in corelaţie cu valoarea volumului eritrocitar mediu, întărind posibilitatea existenţei unei anemii microcitare. În ceea ce priveşte numărul de trombocite, singurul lot care prezintă o scădere semnificativă din punct de vedere statistic este lotul de control, căruia i s-a administrat ad libitum soluţia de acrilamidă 0,1 μg/L. Valori superioare ale numărului de leucocite în comparaţie cu lotul de referinţă s-au obţinut pentru lotul de control (p<0,05). XI.5 Investigaţia histopatologicăExamenul histopatologic a urmărit evidenţierea unor modificări morfologice consecutive administrării unei diete cu un conţinut bogat în acrilamidă, respectiv consecutive administrării unei

soluţii apoase de acrilamidă 0,1μg/L la nivelul creierului, ficatului, rinichiului, pancreasului şi splinei. Rezultatele examenului histopatologic la nivelul creierului (fig. XI.9, fig. XI.10), ficatului (fig. XI.11, fig. XI.12), rinichiului (fig. XI.13, fig. XI.14) şi pancreasului (fig. XI.15, fig. XI.16) evidenţiază toxicitatea acrilamidei administrate sub forma soluţiei apoase 0,1 μg/L timp de 90 de zile, excepţie făcând splina, la nivelul căreia micrografiile nu relevă modificări morfologice. Aportul de acrilamidă în urma consumului alimentelor cu un conţinut bogat în această noxă alimentară (cartofi prăjiţi şi pâine prăjită) nu este atât de semnificativ încât să producă modificări histopatologice la nivelul organelor examinate. 31Fig. XI.9. Creier – lot ref (HEx10) Fig. XI.10. Creier – lot control (HEx10) Fig. XI.11. Ficat - lot ref (HEx10) Fig. XI.12. Ficat – lot control (HEx10) Fig.XI.13. Rinichi - lot ref (HEx10) Fig. XI.14. Rinichi – lot control(HEx10) Fig. XI.15. Pancreas - lot ref (HEx10) Fig. XI.16. Pancreas – lot control (HEx10) 32 XI.6 Concluzii Acţiunea hepatotoxică a acrilamidei este susţinută de rezultatele investigaţiei biochimice prin creşterea lizei celulelor hepatice şi scădere funcţiei proteosintetice a ficatului, dar şi de modificările histopatologice observate la nivelul acestui organ ţintă. Existenţa unui posibil sindrom nefrotic este sugerată atăt de variaţiile albuminemiei, dar şi de rezultatele histopatologice la nivelul rinichiului. Evaluarea stresului oxidativ prin prisma catalazei, superoxid dismutazei şi grupărilor tiolice libere denotă implicarea acrilamidei, posibil în special prin intermediul metabolitului său epoxidic, glicidamida, în creşterea speciilor reactive ale oxigenului. În ceea ce priveşte parametrii hematologici, intoxicaţia cronică cu acrilamidă conduce la scăderea numărului de eritrocite, a valorilor hemoglobinei, hematocritului şi trombocitelor, precum şi creşterea formulei leucocitare. CAPITOLUL XII EVALUAREA POTENŢIALULUI PROTECTOR AL ACIDULUI ASCORBIC ÎN INTOXICAŢIA SUBACUTĂ CU ACRILAMIDĂ LA ANIMALELE DE LABORATOR Capitolul XII îşi propune ca obiective: • evaluarea modificărilor biochimice survenite în intoxicaţia provocată de administrarea unei doze de 50 mg/kg masă corporală, respectiv 100 mg/kg masă corporală de acrilamidă la fiecare douăzile la animalele de laborator; • aprecierea posibilului efect protector al vitaminei C pe fundalul intoxicaţiei subacute cu acrilamidă la cele două doze. XII.1 Model experimental Toate procedeele experimentale realizate în acest studiu au fost în strictă concordanţă cu reglementările etice internaţionale şi au primit aprobarea Comisiei de Etică a Universităţii de Medicină şi

Farmacie “Gr.T. Popa“, Iaşi. 33Experimentul a fost realizat pe 5 loturi de şobolani masculi (5 animale pe lot), linia Wistar, cu mase corporale cuprinse între 240 g şi 390 g (tabel XII.1). Experimentul a fost derulat pe perioada a două săptămâni pentru loturile 4 şi 5 şi pentru trei săptămâni pentru loturile 1, 2 şi 3. Pe toată perioada experimentului s-au urmărit evoluţia greutăţii corporale a animalelor şi alterările comportamentului animal. La sfârşitul experimentului, s-a recurs la anestezia şobolanilor cu ketamină (75mg/kg i.p.). În urma constatării absenţei semnelor vitale (mişcări respiratorii, bătăile cordului, reflexe) s-au recoltat probe de sânge din plexul retroorbitar în scopul efectuării analizelor biochimice. XII.2 Investigaţia biochimicăDeterminările biochimice s-au efectuat sub forma unei baterii de teste care urmează cinci direcţii principale: a) Testarea integrităţii celulare în sensul decelării modificării patologice a permeabilităţii membranei hepatocitului: - activitatea aspartat-aminotransferazei (AST sau GOT); - activitatea alanin-aminotransferazei (ALT sau GPT); - activitatea lactat-dehidrogenazei (LDH); - testul de Ritis (AST /GPT sau GOT /ALT). Tabel XII.1. Model experimental Loturi Denumire ACR (50 mg/kg) ACR (100 mg/kg)Acid ascorbic (100 mg/kg) Lot 1 Lot ref - - - Lot 2 Lot ACR 50 + - - Lot 3 Lot ACR 50/C 100 + - + Lot 4 Lot ACR 100 - + Lot 5 Lot ACR 100/C 100 - + + Legendă: Lot ref = lot de referinţă; ACR = acrilamidă; ACR 50 = acrilamidă în doză per 48 ore de 50 mg/kg (gavaj gastric soluţie apoasă acrilamidă 12,5 g/L); ACR 100 = acrilamidă în doză per 48 ore de 100 mg/kg (gavaj gastric soluţie apoasă acrilamidă 12,5 g/L); C 100 = acid ascorbic în doză per 48 ore de 100 mg/kg (gavaj gastric soluţie apoasă 25 g/L cu 15 minute înainte de intoxicaţia cu acrilamidă). 34b) Controlul capacităţii de sinteză a ficatului în sensul depistării insuficienţei funcţiei proteosintetice: - determinarea cantitativă a azotului ureic; - determinarea activităţii colinesterazei serice; c) Depistarea unei eventuale inducţii enzimatice sau a unui virtual

fenomen de oncogeneză: - determinarea activităţii γ-glutamil transferazei (GGT); - determinarea calitativă a albuminei Bence-Jones; d) Evaluarea stresului oxidativ: - determinarea activităţii catalazei serice (CAT); - determinarea activităţii superoxid dismutazei serice (SOD);e) Evaluarea funcţiei de detoxifiere a ficatului: - determinarea cantitativă a grupărilor sulfhidril libere - dozarea acidului ascorbic din sânge. Determinările cantitative ale parametrilor biochimici vizaţi în prezentul capitol s-au efectuat pe analizorul semiautomat EOS 880 PLUS în sistem deschis, după principiile enunţate în capitolul XI. a) Testarea integrităţii celulare Determinarea aspartat-aminotransferazei Variaţia activităţii AST evidenţiază accentuări semnificative pentru loturile de animale care au fost tratate cu 50 mg/kg şi 100mg/kg acrilamidă; aceste hiperenzinemii constituie dovada lezării membranei hepatocitului şi migrarea enzimei în spaţiul intercelular. Analiza valorică a activităţii acestei enzime pentru loturile care au fost protejate cu acid ascorbic evidenţiază o atenuare semnificativă a impactului dintre forma agresiv/toxică a acrilamidei şi membrana hepatocitului, atenuare care devine deosebit de evidentă pentru lotul tratat cu doza de 100 mg/kg acrilamidă (fig. XII.1). Determinarea alanil aminotransferazei Evoluţia ALT înregistreză un traseu asemănător celui obţinut în cazul aspartat aminotransferazei, cu o exacerbare a activităţii enzimei pentru loturile intoxicate cu acrilamidă, mai ales pentru lotul tratat cu 100 mg/kg acrilamidă, lot la care dimensiunea supradenivelării faţă de lotul martor depăşeşte 11 unităţi. Valori semnificativ crescute faţă de cele ale lotului de referinţă şi uşor scăzute faţă de ale loturilor tratate exclusiv cu acrilamidă sugerează35o palidă acţiune protectoare a acidului ascorbic prin prisma alanil aminotransferazei (fig. XII.2). 42,25 44,1657,6551,996 48,43461,21 59,7645,1958,1653,382 55,2962,98651,8368,5560,178,04320,1507 0,1098 0,0731 0,061

5,7104 4,6042 2,9523 2,24640,039 01020304050607080Lot ref Lot ACR 50 Lot ACR 50/C100 Lot ACR 100 Lot ACR 100/C100 Loturi experimentaleActivitatea aspartat aminotransferazei (UI)Minima Media Maxima SD* RSD**Fig. XII.1. Evoluţia activităţii aspartat aminotransferazei Determinarea lactat dehidrogenazei Variaţia lactat dehidrogenazei evidenţiază acţiunea toxic/membranară a acrilamidei, atât la doza de 50 mg/kg masăcorporală cât şi la doza dublă. Cercetând evoluţia LDH pentru loturile beneficiare ale tratamentului cu acid ascorbic, se poate sublinia intervenţia antitoxică a vitaminei pentru lotul intoxicat cu doza de 50 mg/kg, dar nu şi pentru lotul tratat cu doză dublă de acrilamidă (fig. XII.3). 43,72455,19 51,852 53,66279,1239,6649,1960,6645,09 49,6668,5348,6358,61 55,14 59,580,0775 0,123 0,04 0,1134 0,06723,3869 6,7872 2,0754 7,7685 3,60770102030405060

708090Lot ref Lot ACR 50 Lot ACR 50/C100 Lot ACR 100 Lot ACR 100/C100 Loturi experimentaleActivitatea alanin aminotransferazei (UI)Minima Media Maxima SD* RSD**Fig. XII.2. Activitatea alanil aminotransferazei 36 b) Controlul capacităţii de sinteză a ficatului Determinarea cantitativă a azotului ureic Cuantificarea azotului ureic din sângele animalelor nu furnizează informaţii despre capacitatea funcţională a ficatului şi nici despre potenţialul antitoxic al acidului ascorbic, dar evidenţiazăcreşteri semnificative ale azotemiei loturilor tratate cu doză dublatăde amidă acrilică ce se pot asocia cu intensificări ale catabolismului proteic sau cu afectări ale excreţiei ureei, fenomene ce implicătoxicodinamia acrilamidei. Determinarea colinesterazei Studiul valorilor activităţii colinesterazei evidenţiază oscilaţii care, deşi nu au un grad de semnificaţie ridicat, sunt deosebit de concludente în ansamblul experimentului ce vizează rolul pozitiv al acidului ascorbic în intoxicaţia cu acrilamidă. Scăderea semnificativăa activităţii colinesterazei din serul animalelor tratate cu doza de 100 mg/kg corp poate fi interpretată ca fiind imaginea unei afectări semnificative a funcţiei sintetizatoare a hepatocitului. 20,6942329,3516,6818,68 20,19 19,5 19,0123,70820,756 22,564 23,33625,012325,72,3907 2,33384,37590,1155 0,1034 0,076 0,0889 0,18461,5778 2,07520510

1520253035Lot ref Lot ACR 50 Lot ACR50/C 100 Lot ACR 100 Lot ACR100/C 100 Loturi experimentaleActivitatea lactat dehidrogenazei (μmol/ml)Minima Media Maxima SD* RSD**Fig. XII.3. Evoluţia lactat dehidrogenazei c) Depistarea unei eventuale inducţii enzimatice sau a unui virtual fenomen de oncogeneză37Determinarea gamma-glutamil transpeptidazei Oscilaţia valorică a GGT pentru loturile protejate prin aport de vitamina C scoate în evidenţă atenuări semnificative ale activităţii enzimei, aceste diminuări ale GGT ilustrând existenţa unei certe acţiuni antitoxice ale acestei vitamine hidrosolubile, cu implicaţii majore în fenomenul de detoxifiere al organismului (fig. XII.4). d) Evaluarea stresului oxidativ Determinarea activităţii catalazei serice Variaţia catalazei denotă certa sa implicare în reacţiile de neutralizare a speciilor reactive ale oxigenului, răspunzătoare de apariţia stresului oxidativ; această implicare este susţinută de scăderea activităţii sale în serul loturilor intoxicate cu acrilamidă şi de ameliorarea activităţii sale pentru loturile ce au beneficiat de protecţia acidului ascorbic (fig. XII.5). Determinarea superoxid dismutazei Variaţia activităţii superoxid dismutazei pentru loturile din experiment confirmă acţiunea antitoxică/antioxidantă a acidului ascorbic împotriva atacului speciilor reactive ale oxigenului, specii chimice generatoare ale stresului oxidativ. 8,78211,4849,516,910,0111,235,697,79 7,0313,0187,6228,48

12,2110,01 9,911,5036 2,24120,1331 0,1033 0,1973 0,1722 0,09731,1286 0,9076 1,1178024681012141618Lot ref Lot ACR 50 Lot ACR 50/C100 Lot ACR 100 Lot ACR 100/C100 Loturi experimentaleActivitatea gama-glutamil transpeptidazei (UI)Minima Media Maxima SD* RSD**Fig. XII.4. Activitatea γ-glutamil transpeptidazei e) Evaluarea funcţiei de detoxifiere a ficatului Determinarea cantitativă a grupărilor sulfhidril libere Analiza comparativă a concentraţiilor plasmatice de funcţii sulfhidrice libere pentru loturile tratate exclusiv cu acrilamidă38conduce la scăderi deosebit de semnificative, scăderi ce susţin ipoteza epuizării grupărilor tiolice libere în urma atacului radicalilor epoxidici ai acrilamidei. 605,58568,07433,14585,47504,34595,7543,15411579,65495,1621,12 601,1451,8595,55190,046 0,042

10,143 26,095 18,088 6,427 9,0680,017 0,011 0,018 0100200300400500600700Lot ref Lot ACR 50mg/kg Lot ACR 100mg/kgLot ACR 50/C100 Lot ACR100/C100Loturi experimentaleActivitatea catalazei serice (U/L)Minima Media Maxima SD* RSD**Fig. XII.5. Activitatea catalazei serice Concentraţiile plasmatice ale tiolilor liberi în cazul loturilor protejate prin pretratament cu acid ascorbic ating valori ce se apropie de valorile lotului de referinţă, ceea ce ilustrează o ameliorare a potenţialului detoxifiant al ficatului ce a beneficiat de efectul antitoxic/antitoxidant al vitaminei C. XII.3 Concluzii În consecinţă, activitatea hepatotoxică a acrilamidei este susţinută nu doar de variaţiile enzimelor de citoliză hepatică dar şi de variaţia colinesterazei, ceea ce sugerează şi o deprimare a funcţiei proteosintetice. Intervenţia protectoare a acidului ascorbic se manifestă evident asupra aspartat aminotransferazei, evoluţia celorlalte enzime edificatoare pentru afectarea hepatică fiind mai puţin influenţată de acţiunea vitaminei. De asemena, evaluarea stresului oxidativ denotă implicarea amidei toxice în creşterea concentraţiei speciilor reactive ale oxigenului, cel mai probabil prin intermediul metabolitului său cu structură epoxidică, glicidamida. Acţiunea benefică a acidului ascorbic se traduce prin ameliorarea marcantă a stresului oxidativ. 39CAPITOLUL XIII POTENŢIALUL PROTECTOR AL FTALIDELOR DIN APIUM GRAVEOLENS ÎN INTOXICAŢIA CU ACRILAMIDĂPrezentul capitol îşi propune următoarele obiective: • aprecierea toxicităţii acrilamidei prin determinarea modificărilor biochimice survenite la loturile de şobolani în urma administrării cronice de amidă toxică; • evaluarea potenţialului antitoxic al ftalidelor prezente în uleiul volatil de Apium graveolens, precum şi în soluţiile extractive de Apii folium, Apii semen şi Apii radix în intoxicaţia cronică cu acrilamidă.

XIII.1 Modelul experimental Modelul experimental (tabel XIII.1) descris în acest capitol a fost astfel conceput încât să confirme sau să infirme existenţa unei potenţiale acţiuni antitoxice a ftalidelor din uleiul volatil de ţelină(Apii aetheroleum) în intoxicaţia cu acrilamidă. Totodată, experimentul încearcă să evalueze potenţialele antitoxice ale unor soluţii extractive obţinute din Apii folium, Apii radix şi Apii semen. Experimentul derulat pe o perioadă de 11 săptămâni s-a finalizat cu recoltarea sângelui pentru explorarea biochimică. XIII.2 Investigaţia biochimicăInvestigarea biochimică s-a desfăşurat sub forma unor baterii de teste ce sunt redate în tabelul XIII.2. a) Evaluarea indicatorilor de citoliză hepaticăDeterminarea aspartat aminotransferazei Evoluţia AST în serul animalelor din experiment evidenţiazăo creştere semnificativă pentru lotul tratat exclusiv cu acrilamidă, ceea ce sugerează apariţia lizei membranare. Variaţia activităţii aspartat aminotransferazei pentru loturile ce au beneficiat de protecţie reliefează existenţa unui bun efect antitoxic al ftalidelor din Apii radix şi un efect antitoxic moderat pentru principiile active din uleiul volatil, frunzele şi seminţele de Apii graveolens (fig. XIII.1, tabel XIII.3). În ceea ce priveşte ameliorarea agresării hepatocitului de către amida acrilică, s-ar putea ierarhiza potenţialul protector al fitopreparatelor testate astfel: soluţie extractivă Apii radix > Apii 40aetheroleum > soluţie extractivă Apii semen ≥ soluţie extractivă Apii folium. Tabel XIII.1. Modelul experimental pentru evaluarea acţiunii antitoxice a ftalidelor din Apium graveolens Loturi Denumire ACR (μg/kg)* Apii aeth (μg/kg)** Apii foliumApii radixApii semen Lot 1 Referinţă - - - - - Lot 2 Control 25 - - - - Lot 3 Lot aeth 25 10 - - - Lot 4 Lot folium 25 - Ad libitum - - Lot 5 Lot radix 25 - - Ad

libitum - Lot 6 Lot semen 25 - - - Ad libitumACR = acrilamidă; * - administrare prin gavaj; **- administrare prin gavaj, încorporat în lactozăTabel XIII.2. Schema investigaţiei biochimice BATERIE TESTE PARAMETRII TESTAŢI Aspartat aminotransferaza (ASAT sau AST) 1 Indicatori de citoliză hepaticăAlanil aminotransferaza (ALAT sau ALT) Lactat dehidrogenaza (LDH) Colinesteraza (ChE) 2 Indicatori de proteosinteză Proteine totale serice (PT) Albumine serice (ALB) 3 Markeri de inducţie enzimaticăγ- glutamil transpeptidaza (GGT) Catalaza (CAT) 4 Indicatori ai stresului oxidativ Superoxid dismutaza (SOD) Glutation peroxidaza (GSH-Px) 41Determinarea alanil aminotransferazei Studiul evoluţiei ALT atrage atenţia prin creşterea activităţii enzimei pentru lotul tratat exclusiv cu acrilamidă, confirmând astfel existenţa unei certe leziuni la nivelul hepatocitului (fig. XIII.2, tabel XIII.3). Pentru loturile protejate cu Apii aetheroleum şi soluţii extractive de Apii semen, Apii radix şi Apii folium se obţin valori apropiate de cele ale lotului de referinţă (28,390 UI ± 3,143, 25,951 ±3,161, 30,319 ± 3,160, respectiv 30,011 ± 1,467), ceea ce constituie un argument favorabil în ceea ce priveşte protecţia hepatocitului în faţa agresiunii amidei acrilice. Încercarea de ierarhizare a potenţialului antitoxic al fitopreparatelor pe bază de Apii graveolensîn intoxicaţia cu acrilamidă prin prisma acestui indicator de citolizăhepatică s-ar putea schematiza astfel: soluţie extractivă de Apii semen > soluţie extractivă de Apii folium ≥ Apii aetheroleum > soluţie extractivă de Apii radix. 34,62045,01338,161 39,15041,02030,34032,55023,90133,90630,990 31,99635,312

31,29239,53735,89733,53235,89638,1122,881 4,222 2,285 3,455 4,357 4,2440,136 0,107 0,065 0,096 0,130 0,080 05101520253035404550Lot ref Lot control Lot aeth Lot folium Lot radix Lot semenLoturi experimentaleActivitatea aspartat aminotransferazei (UI)Minima Media Maxima SD* RSD**Fig. XIII.1. Activitatea aspartat aminotransferazei Determinarea lactat dehidrogenazei Oscilaţia activităţii LDH profilează o exacerbare a activităţii enzimei pentru lotul căruia i s-a administrat doza cronică de acrilamidă, ceea ce sugerează agresivitatea acrilamidei nu numai la nivel hepatic ci şi la alte nivele (organe ce găzduiesc intracelular LDH). Variaţia activităţii LDH pentru loturile protejate cu 42fitopreparatele pe bază de Apium graveolens este aproape liniară, valorile activităţii enzimei oscilând în jurul valorii lotului de referinţă(fig. XIII.3, tabel XIII.3). Rezultatele confirmă intervenţia pozitivă a ftalidelor din ţelină care acţionează antitoxic, acţiunea antitoxică a acestora putând fi gradualizată astfel: soluţie extractivă de Apii folium > soluţie extractivă de Apii semen > soluţie extractivă de Apii radix > Apii aetheroleum. 28,56339,56131,15133,54129,55422,33129,95222,54925,405 27,99123,164

24,970 25,95130,011 30,31928,39034,860 31,6023,160 3,161 1,467 3,143 4,097 2,6880,108 0,118 0,111 0,049 0,104 0,122 051015202530354045Lot ref Lot control Lot aeth Lot folium Lot radix Lot semenLoturi experimentaleActivitatea alanil aminotransferazei (UI)Minima Media Maxima SD* RSD**Fig. XIII.2. Variaţia alanil aminotransferazei 6,66715,9996,559 6,510 6,4586,021 5,941 5,755 6,12915,7515,997 6,3587,7256,911 6,9717,12116,3237,0520,378 0,833 0,416 0,207 0,489 0,3510,062 0,013 0,075 0,055 0,128 0,059 024681012141618Lot ref Lot control Lot aeth Lot folium Lot radix Lot semenLoturi experimentaleActivitatea lactat dehidrogenazei (μmol/ml)

Minima Media Maxima SD* RSD**Fig. XIII.3. Variaţia valorilor lactat dehidrogenazei 43b) Investigarea indicatorilor de proteosintezăDeterminarea colinesterazei Variaţia colinesterazei prezintă o curbă aleatorie nesemnificativă pentru controlul capacităţii proteosintetice a ficatului, dar care se corelează cu existenţa unui sindrom nefrotic (tabel XIII.3). Determinarea proteinelor totale serice Proteinemia manifestă variaţii ce scot în evidenţă deprimarea funcţiei proteosintetice a ficatului de către acrilamidă şi evidenţiazăintervenţia benefică a ftalidelor din produsele vegetale, prevalent din Apii semen (fig. XIII.4, tabel XIII.3). Determinarea albuminelor Controlul albuminemiei confirmă efectul antitoxic al ftalidelor din Apii semen şi sugerează o posibilă corelare a hiperalbuminemiei lotului intoxicat cu acrilamidă cu existenţa unui sindrom nefrotic (tabel XIII.3). c) Evaluarea markerilor de inducţie enzimaticăDeterminarea γ-glutamil transpeptidazei Studiul dinamicii GGT reliefează o creştere semnificativăpentru lotul tratat cu doza cronică de acrilamidă, creştere ce se poate corela fie cu existenţa unei grave afectări hepatice, fie cu existenţa unui fenomen de inducţie enzimatică. Valoarea diminuată a activităţii γ-glutamil transpeptidazei pentru loturile beneficiare a aportului exogen de ftalide reliefează efectul protector al acestora (fig. XIII.5, tabel XIII.4). d) Evaluarea stresului oxidativ Determinarea catalazei Evoluţia activităţii CAT dezvăluie o supraproducţie de radicali liberi pentru lotul de control, căruia i s-a administrat doar acrilamidă, şi o ameliorare a stresului oxidativ în urma administrării de fitopreparate bogate în ftalide, între acestea impunându-se printrun bun efect antitoxidant Apii semen (fig. XIII.6, tabel XIII.4). Determinarea superoxid dismutazei Variaţia activităţii SOD confirmă producerea stresului oxidativ atât pentru lotul intoxicat cu acrilamidă, cât şi pentru loturile tratate cu fitopreparate de Apium graveolens, nesusţinând 44efectul antitoxic al acestora, ca in cazul altor parametri (fig. XIII.7, tabel XIII.4). Determinarea glutation peroxidazei Studiul dinamicii glutation peroxidazei surprinde prin creşterea activităţii enzimei pentru lotul intoxicat, creştere ce s-ar putea justifica prin implicarea enzimei într-un proces de inducţie enzimatică, fenomen semnalat în pulmonii şi rinichii fumătorilor (fig. XIII.8, tabel XIII.4).

8,0548,913 8,652 8,659 8,5177,5076,9197,4587,011 7,0236,0288,18368,07327,7044 7,7514 7,89127,21768,6690,4985 0,759 0,706 0,5939 0,7395 0,41210 0,0609 0,1052 0,0895 0,0766 0,096 0,05112345678910Lot ref Lot control Lot aeth Lot folium Lot radix Lot semenLoturi experimentaleConcentraţiile serice de proteine totale (g/dL)Minima Media Maxima SD* RSD**Fig. XIII.4. Concentraţia proteinelor totale serice 6,8438,0348,555 8,303 8,125 8,1235,0555,579 5,45 5,832 5,551 5,6537,52487,0256 6,9348 6,8598 6,93169,4351,39850,97631,2115 1,6784 1,40190,95010,2018 0,1388 0,2231 0,14231,21151,40190

12345678910Lot ref Lot control Lot aeth Lot folium Lot radix Lot semenLoturi experimentaleActivitatea γ-glutamil transpeptidazei (UI)Minima Media Maxima SD* RSD**Fig. XIII.5. Activitatea γ-glutamil transpeptidazei 45625,9512,1 502,3615,1 599,1639,9591,9427,9533,7417,9 411,8549,2593,84495,1570,05464,6 468,258591,7633,31279,325433,627638,8164 38,8094 37,70140,0656 0,0835 0,0805 0,059 0,1602 0,0561 0100200300400500600700Lot ref Lot control Lot aeth Lot folium Lot radix Lot semenLoturi experimentaleActivitatea catalazei serice (U/L)Minima Media Maxima DS DSR

Fig.XIII.6. Activitatea catalazei 355335367,8 360,91442,7400,262459,9411,8461 466398,9430 418,432 420,252 424,444383,9421,16 449,538,947139,6451 38,4667 30,9087 37,90519,48420,0214 0,099 0,1002 0,0728 0,0906 0,0927 050100150200250300350400450500Lot ref Lot control Lot aeth Lot folium Lot radix Lot semenLoturi experimentaleActivitatea SOD (U/mL)Minima Media Maxima SD* RSD**Fig. XIII.7. Evoluţia superoxid dismutazei 4663,50075,15066,50058,12066,15060,97091,90099,17088,909 88,902 90,166 88,70084,67078,59269,49277,019 79,330 83,9916,928 7,779

12,010 9,768 8,091 11,8420,143 0,115 0,103 0,170 0,098 0,090 020406080100120Lot ref Lot control Lot aeth Lot folium Lot radix Lot semenLoturi experimentaleActivitatea peroxidazei (U/L)Minima Media Maxima SD* RSD**Fig. XIII.8. Activitatea glutation peroxidazei XIII.3 Concluzii Rezultatele analizei biochimice evidenţiază acţiunea toxic hepatică a acrilamidei prin creşterea lizei membranare şi deprimarea funcţiei proteosintetice a ficatului, dar în acelaşi timp invocă ipoteza unei posibile afectări renale. De asemenea, rezultatele demonstreazăimplicarea acrilamidei în inducerea stresului oxidativ. Valorile biochimice obţinute în cazul loturilor tratate cu preparate obţinute din ţelină (Apii folium, Apii radix, Apii semen, Apii aetheroleum) reflectăîmbunătăţirea funcţiei hepatice şi scăderea stresului oxidativ comparativ cu loturile intoxicate cu acrilamidă, evidenţiind existenţa unei posibile acţiuni antitoxice. 47Tabel XIII.3. Rezultatele investigaţiei biochimice privitoare la acţiunea antitoxică a ftalidelor din Apium graveolens prin prisma indicatorilor de citoliză hepatică şi de proteosintezăIndicatori de citoliză ( x ± SD) Indicatori de proteosinteză ( x ± SD) ⎯ ⎯Loturi AST (UI) ALT (UI) LDH ChE PT ALB Lot 1 31,291±4,244 24,969±2,687 6,666±0,415 232,2±45,350 8,183±0,377 2,511±0,377 Lot 2 39,536±4,222 34,859±4,097 15,998±0,207 267,2±55,143 7,217±0,758 3,705±0,385 Lot 3 35,311±2,284 28,39±3,143 6,559±0,488 264,7±38,382 7,891±0,705 3,184±0,405 Lot 4 35,897±3,455 30,010±1,466 6,358±0,351 276,88±70,528 7,751±0,593 3,039±0,150 Lot 5 33,532±4,357 30,318±3,159 6,509±0,832 251,932±43,009 7,704±0,739 3,039±0,785 Lot 6 35,8958±2,8812 25,951±3,160 6,458±0,378 220,32±18,021 8,073±0,412 2,55±0,512 Tabel XIII.4. Rezultatele investigaţiei biochimice privitoare la acţiunea antitoxică a ftalidelor din Apium graveolens prin prisma markerilor de inducţie enzimatică şi stres oxidativ Markeri inducţie enzimatică (oncogeneză) ( x ± sd) ⎯Indicatori stres oxidativ ( x ± sd) ⎯Loturi GGT CAT SOD GSH-Px

Lot 1 6,843±0,950 591,76±38,816 442,700±9,4842 83,991±12,009 Lot 2 7,524±1,678 464,6±38,809 400,262±39,6451 84,670±9,768 Lot 3 7,025±1,401 468,258±37,701 383,900±38,4667 78,591±8,091 Lot 4 6,934±1,211 570,05±33,627 424,444±30,9087 69,492±11,841 Lot 5 6,859±0,976 495,1±79,325 418,432±37,9051 79,329±7,778 Lot 6 6,931±1,398 593,84±33,312 420,252±38,9471 77,019±6,927 48CAPITOLUL XIV CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE CERCETARE XIV.1 Concluzii generale 1. Metoda de determinare cantitativă a acrilamidei a fost validată urmărind parametrii: domeniu de concentraţie/liniaritate, precizie, acurateţe, stabilitate, randament de recuperare, limită de detecţie, limită de cuantificare. 2. Rezultatele evidenţiază un domeniu de liniaritate cuprins între 0,5 şi 5,0 mg/L, cu un coeficient de corelaţie (R2) de 0,9999. 3. Metoda se caracterizează prin precizie, exactitate, stabilitate şi un randament optim de recuperare. 4. Analiza cantitativă a acrilamidei în unele produse alimentare disponibile pe piaţa comercială din România dezvăluie faptul că cele mai mari concentraţii de acrilamidă se găsesc în probele de cartofi prăjiţi, fiind urmate de probele de chips-uri, biscuiţi, pop-corn şi pâine. 5. Variaţiile concentraţiilor de acrilamidă în produsele alimentare analizate se datorează atât conţinutului diferit în precursori al materiilor prime, dar şi condiţiilor de prelucrare culinară, ce intervin prin următorii parametri: blanşizare, condimente utilizate, timp şi temperatură de prăjire, tipul şi calitatea uleiului utilizat la prăjire, modalitatea de prelucrare culinară (pre-prăjire, prăjire în ulei, prăjire în abur, coacere, microunde). 6. Rezultatele obţinute în cadrul prezentei teze de doctorat evidenţiază corelaţia existentă între conţinutul în zahăr direct reducător, respectiv zahăr total solubil din probele de cartofi şi porumb pentru pop-corn şi concentraţia finală de acrilamidă din probele de cartofi prăjiţi şi pop-corn. 7. Analiza probelor de pâine feliată evidenţiază valori aflate sub limita de cuantificare a metodei pentru pâinea feliatăneprăjită şi relevă creşterea concentraţiei de acrilamidă în probele de pâine prăjită dependent de timpul şi temperatura procesului de prelucrare termică. De asemenea, valorile determinărilor analitice demonstrează dependenţa conţinutului în acrilamidă de gradul de 49extracţie al făinii, valorile cele mai mari obţinându-se pentru pâinea Graham, care conţine în compoziţia sa tărâţe de grâu. 8. Nivelul acrilamidei în produsele alimentare pe bază de cartofi variază dependent de soiul de cartof utilizat în procesul de

prelucrare culinară, valoarea cea mai ridicată regăsindu-se pentru soiul Sante, urmat de Desiree, concentraţiile cele mai reduse obţinându-se pentru soiul Ostara. Rezultatele demonstrează, de asemenea, variaţia conţinutului în acrilamidă dependent de procedeul culinar aplicat. Astfel, valorile cele mai ridicate pentru acrilamidă sau obţinut pentru cartofii prăjiţi în ulei, valori mai scăzute s-au obţinut în cazul cartofilor copţi la cuptorul clasic, în timp ce valorile cele mai reduse au fost determinate în cazul cartofilor prelucraţi termic prin prăjire în abur. 9. În experimentul ce a vizat evaluarea modificărilor biochimice, hematologice şi histopatologice ulterior aportului cronic de acrilamidă prin consumul de cartofi prăjiţi, pâine prăjită, respectiv soluţie apoasă de acrilamidă, acţiunea hepatotoxică a amidei acrilice este susţinută de rezultatele investigaţiei biochimice prin creşterea lizei celulelor hepatice şi scăderea funcţiei proteosintetice a ficatului, dar şi de modificările histopatologice observate la nivelul acestui organ ţintă. Existenţa unui posibil sindrom nefrotic la loturile din cadrul aceluiaşi experiment este sugerată atât de variaţiile albuminemiei, dar şi de rezultatele histopatologice la nivelul rinichiului. Evaluarea stresului oxidativ la animalele de laborator expuse aportului cronic de acrilamidă prin consum de cartofi prăjiţi, pâine prăjită, respectiv soluţie apoasă de acrilamidă 0,1 μg/L denotăimplicarea noxei alimentare, posibil în special prin intermediul metabolitului său epoxidic, glicidamida, în creşterea concentraţiei speciilor reactive ale oxigenului. În ceea ce priveşte parametrii hematologici, intoxicaţia cronică cu acrilamidă conduce la scăderea numărului de eritrocite, a valorilor hemoglobinei, hematocritului şi trombocitelor, precum şi creşterea formulei leucocitare. 10. În experimentul ce evaluează potenţialul protector al acidului ascorbic în intoxicaţia subacută cu acrilamidă, activitatea hepatotoxică a amidei este susţinută nu doar de variaţiile enzimelor de citoliză hepatică dar şi de variaţia colinesterazei, ceea ce sugerează şi o deprimare a funcţiei proteosintetice. Intervenţia 50protectoare a acidului ascorbic se manifestă evident asupra aspartat aminotransferazei, evoluţia celorlalte enzime edificatoare pentru afectarea hepatică fiind mai puţin influenţată de acţiunea vitaminei. De asemena, evaluarea stresului oxidativ denotă implicarea amidei toxice în creşterea concentraţiei speciilor reactive ale oxigenului, cel mai probabil prin intermediul metabolitului său cu structurăepoxidică, glicidamida. Acţiunea benefică a acidului ascorbic se traduce prin ameliorarea marcantă a stresului oxidativ. 11. În experimentul ce estimează potenţialul protector al preparatelor din ţelină, rezultatele analizei biochimice evidenţiazăacţiunea toxic hepatică a acrilamidei prin creşterea lizei membranare şi deprimarea funcţiei proteosintetice a ficatului, dar în acelaşi timp invocă ipoteza unei posibile afectări renale. De asemenea, rezultatele

demonstrează implicarea acrilamidei în inducerea stresului oxidativ. Valorile biochimice obţinute în cazul loturilor tratate cu preparate obţinute din ţelină (Apii folium, Apii radix, Apii semen, Apii aetheroleum) reflectă îmbunătăţirea funcţiei hepatice şi scăderea stresului oxidativ comparativ cu loturile intoxicate cu acrilamidă, evidenţiind existenţa unei posibile acţiuni antitoxice. XIV.2 Contribuţii originale Rezultatele cercetărilor experimentale efectuate în cadrul prezentei teze de doctorat includ o serie de contribuţii cu caracter de originalitate: - validarea unei metode gaz cromatografice de analizăcantitativă a acrilamidei în produsele alimentare, metodă ce se distinge nu numai prin precizie, acurateţe, randament de recuperare optim, stabilitate, ci mai ales prin simplitatea şi uşurinţa metodologiei de lucru, precum şi un cost redus privind achiziţionarea aparaturii şi instrumentelor de laborator comparativ cu metodele gaz cromatografice sau lichid cromatografice utilizate; - cuantificarea conţinutului în acrilamidă al unor produse alimentare disponibile pe piaţa comercială din România (chips-uri, cartofi prăjiţi, pâine prăjită, biscuiţi, pop-corn); - realizarea unui model experimental pe animale de laborator care a avut ca obiectiv major simularea aportului cronic de acrilamidă prin consum de alimente cu un conţinut bogat în această51noxă alimentară şi repercusiunile la nivel biochimic, hematologic şi histopatologic; - cercetarea unor posibile căi de diminuare a toxicităţii amidei acrilice prin utilizarea de substanţe cu acţiune chemopreventivă(substanţe cu potenţial antiradicalar, antitoxic); - evidenţierea unui potenţial antitoxic parţial al acidului Lascorbic în intoxicaţia subacută cu acrilamidă la animalele de laborator - stabilirea unei acţiuni protectoare parţiale a unor fitopreparate din Apium graveolens (Apii aetheroleum, Apii folium, Apii radix, Apii semen)în intoxicaţia cronică cu acrilamidă. XIV.3 Perspective privind noi direcţii de cercetare a problematicii acrilamidei Rezultatele obţinute în cadrul prezentei teze de doctorat oferăposibilitatea orientării către noi direcţii de cercetare: - continuarea determinării cantitative a acrilamidei în alte categorii de produse alimentare din România: cereale pentru micul dejun, cafea şi substituitori pentru cafea, ciocolată şi produse pe bazăde ciocolată, produse de cofetărie, alimente pentru diabetici, hranăpentru copii etc.; - extinderea cercetării conţinutului în acrilamidă asupra produselor cosmetice şi evaluarea aportului de acrilamidă prin absorbţia cutanată ulterior utilizării acestor produse;

- evaluarea aportului de acrilamidă prin consum de alimente printr-un model experimental realizat pe subiecţi umani, utilizând fie metoda chestionarului, fie metoda biomarkerilor ce determină cantitativ aducţii acrilamidei cu hemoglobina; - implicarea industriei alimentare în obţinerea unor alimente cu un conţinut redus în acrilamidă, prin alegerea unor soiuri de cartofi cu un conţinut scăzut în zahăr direct reducător, prin păstrarea unor condiţii optime de depozitare şi alegerea unor parametri culinari corespunzători; - revizuirea legislaţiei privind securitatea şi siguranţa alimentară, prin introducerea unor limite maxime admisibile vizând prezenţa acrilamidei în apă, respectiv în ambalajele pentru produsele alimentare; 52- stabilirea şi recomandarea unei diete sănătoase prin: consumul alimentelor cu un conţinut redus în acrilamidă, prin respectarea unor reguli privind controlul parametrilor din cadrul procesului culinar casnic, prin abordarea unei diete cu un conţinut bogat în vitamina C (fructe şi legume în stare proaspătă), respectiv ftalide (ţelină, leuştean). Bibliografie selectivă1. *** - NICNAS, Acrylamide. Priority Existing Chemical. Assessment Report No. 23 (2002). 2. Eriksson, E., Acrylamide in food products: Identification, formation and analytical methodology. Doctoral Thesis, Stockholm University, 2005: 9-19 3. Dybing, E., Farmer, P. B., Andersen, M., Fennell, T. R., Lalljie, S. P. D., Muller, D. J. G., Olin, S., Petersen, B. J., Schlatter, J., Scholz, G., Scimeca, J. A., Slimani, N., Tornqvist, M., Tuijtelaars, S., Verger, P. (2005). Human exposure and internal dose assessments of acrylamide in food. Food and Chemical Toxicology, 43: 365–410. 4. Fennell, T. R., Sumner, S. C., Snyder, R. W., Burgess, J., Friedman, M. A. (2006). Kinetics of elimination of urinary metabolites of acrylamide in humans. Toxicological Sciences, 93 (2): 256-267. 5. Fuhr, U., Boettcher, M. I, Kinzig-Schippers, M., Weyer, A., Jetter, A., Lazar, A., Taubert, D., Tomalik-Scharte, D., Pournara, P., Jakob, V., Harlfinger, S., Klaassen, T., Berkessel, A., Angerer, J., Sörgel, F., Schömig, E. (2006). Toxicokinetics of Acrylamide in Humans after Ingestion of a Defined Dose in a Test Meal to Improve Risk Assessment for Acrylamide Carcinogenicity. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention, 15: 266-271. 6. Doerge, D. R., Twaddle, N. C., Boettcher, M. I., McDaniel, L. P., Angerer J. (2007). Urinary excretion of acrylamide and metabolites in Fischer 344 rats and B6C3F1 mice administered a single dose of acrylamide. Toxicology Letters. 169(1): 34-42. 7. Stadler, R., Blank, I., Varga, N., Robert, F., Hau, J., Guy, P., Robert, M., Riediker, S. (2002). Acrylamide from Maillard reaction products. Nature, 419: 449 – 450. 8. Stadler, R., Scholz, G. (2004). Acrylamide: an update on current

knowledge in analysis, levels in food, mechanisms of formation, and potential strategies of control. Nutrition reviews, 62: 449-467. 9. Landersdorfer, C. (2002). Acrylamide: increased concentrations in homemade food and first evidence of its variable absorption from food, variable metabolism and placental and breast milk transfer in humans. Chemotherapy,48(6): 267-274. 10. Schettegen, T., Broding, H.C., Angerer, J., Drexler, H. (2002). Hemoglobin adducts of ethylene oxide, propylene oxide, acrylonitrile and 53acrylamide-biomarkers in occupational and environmental medicine. Toxicol Lett, 134(1-3): 65-70. 11. Schettgen, T., Drexler, H., Angerer, J. (2002). Acrylamide in the general population - A daily intake estimation. Umweltmedizin in Forschung und Praxis, 7: 331-336. 12. Schettgen, T., Weiss, T., Drexler, H., Angerer, J. (2003). A first approach to estimate the internal exposure to acrylamide in smoking and non-smoking adults from Germany. International Journal of Hygiene and Environmental Health, 206: 9–14. 13. Pedreschi, F., Bustos, O., Mery, D. (2007). Colour kinetics and acrylamide formation in NaCl soaked potato chips. Journal of Food Engineering, 79: 989–997. 14. Petersson, E., Rosen, J., Turner, C., Danielsson, R., Hellenas, K. (2006). Critical factors and pitfalls affecting the extraction of acrylamide from foods: An optimisation study. Analytica Chimica Acta, 557: 287-295. 15. Park, J., Kamendulis, L. M., Friedman, M. A., Klaunig, J. (2002). Acrylamide-Induced Cellular Transformation. Toxicological Science, 65: 177-183. 16. Mancaş, D., Oiţă, T., Mancaş, G. (2005). Analiza acrilamidei cancerigene din alimente prin cromatografie în fază gazoasă. Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., 109 (4), [suppl. 1]: 262-265 17. Friedman, M. (2003). Chemistry, Biochemistry, and Safety of Acrylmide. A Review. J. Agric. Food. Chem., 51: 4504-4526. 18. *** - Nexant Chem Systems, PERP Program – New Report Alert, Acrylamide (01/02S10), www.chemsystems.com/newsletters/perp/Dec02-N01S10.cfm (2002). 19. Lindsay, R., Generalized Potential Origins of Acrylamide in Foods, Workshop on FRI Acrylamide Project, Chicago, 2002. 20. Mottram, D. S, Wedzicha, B. L., Dodson, A. T. (2002). Acrylamide is formed in the Maillard reaction. Nature, 419: 448-9. 21. Chuda, Y., Ono, H., Yada, H., Ohara-Takada, A., Matsuura-Endo, C., Mori, M. (2003). Effects o Physiological Changes in Potato Tubers (Solanum tuberosum L.) after Low Temperature Storage on the Level of Acrylamide Formed in Poatato Chips. Biosci. Biotechnol. Biochem., 67 (5): 1188-1190. 22. Zyzak, D., Sanders, R., Stojanovic, M., Tallmadge, D., Eberhart, L. B., Ewald, D. K., Gruber, D. C., Morsch, T. R., Strothers, M. A., Rizzi, G. P., Villagran, M. D. (2003). Acrylamide Formation Mechanism in Heated Foods. J. Agric. Food. Chem., 51: 4782-4787. 23. Cavalli, S., Maurer, R., Höfler, F. (2003). Fast Determination of

Acrylamide in Food Samples Using Accelerated Solvent Extraction Followed by Ion Chromatography with UV or MS Detection. The Application Book Dionex Corp. 24. Robarge, T., Phillips, E., Conoley, M. Analysis of Acrylamide in Food by GC–MS. (2003). The Applications Book of Thermo Electron Corporation Chromatography and Mass Spectrometry. 5425. Pittet, A., Périsset, A., Oberson, J-M. (2004). Trace level determination of acrylamide in cereal-based foods by gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1035: 123–130. 26. Ötles, S., Ötles, S. (2004). Acrylamide in Food (Chemical Structure of Acrylamide). Electron. J. Environ. Agric. Food Chem. 3 (5): 723-730. 27. Hoenicke, K., Gatermann, R., Harder, W., Hartig, L. (2004). Analysis of Acrylamide in different Foodstuffs using Liquid Chromatography-tandem mass spectrometry and gas chromatography-tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 520: 207-215. 28. Stadler, R., Scholz, G. (2004). Acrylamide: an update on current knowledge in analysis, levels in food, mechanisms of formation, and potential strategies of control. Nutrition reviews, 62: 449-467. 29. Şenyuva, H. Z., Gökmen, V. (2005). Study of acrylamide in coffee using an improved liquid chromatography mass spectrometry method: Investigation of colour changes and acrylamide formation in coffee during roasting. Food Additives and Contaminants, 22(3): 214–220. 30. Pabst, K., Mathar, W., Palavinskas, R., Meisel, H., Blüthgen, A., Klaffke H. (2005). Acrylamide–occurrence in mixed concentrate feed for dairy cows and carry-over into milk. Food Additives and Contaminants, 22(3): 210–213. 31. Corradini, M. G., Peleg, M. (2006). Linear and Non-Linear Kinetics in the Synthesis and Degradation of Acrylamide in Foods and Model Systems. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 46:489–517. 32. Koh, B-K. (2006). Determination of acrylamide content of food products in Korea. Journal of the Science of Food and Agriculture, 86: 2587–2591. 33. Chuang, W. H., Chiu, C. P., Chen, B. H. (2006). Analysis and Formation of Acrylamide in French Fries and Chicken Legs during Frying. Journal of Food Biochemistry, 30: 497–507. 34. Wenzl, T., Karasek, L., Rosen, J., Hellenaes, K-E., Crews, C., Castle, L., Anklam, E. (2006). Collaborative trial validation study of two methods, one based on high performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry and on gas chromatography–mass spectrometry for the determination of acrylamide in bakery and potato products. Journal of Chromatography A, 1132: 211–218. 35. Aguas, P. C., Fitzhenry, M. J., Giannikopoulos, G., Varelis, P. Analysis of acrylamide in coffee and cocoa by isotope dilution liquid chromatography–tandem mass spectrometry. (2006). Anal Bioanal Chem, 385: 1526–1531. 36. Dabrio, M., Sejeroe-Olsen, B., Musser, S., Emteborg, H., Ulberth, F. (2006). Certification Report. Certification of Acrylamide in Toasted Bread. Certified Reference Materials ERM®-BD273. European Commission, Joint Research Centre. Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM), Geel (BE).

37. Fernandes, J. O., Soares, C. (2007). Application of matrix solid-phase dispersion in the determination of acrylamide in potato chips. Journal of Chromatography A, 1175: 1–6. 5538. Geng, Z., Jiang, R., Chen, M. (2008). Determination of acrylamide in starch-based foods by ion-exclusion liquid chromatography. Journal of Food Composition and Analysis, 21 (2): 178-182. 39. Matsuura-Endo, C., Ohara-Takada, A., Chuda, Y., Ono, H., Yada, H., Yoshida, M., Kobayashi, A., Tsuda, S., Takigawa, S., Noda, T., Yamauchi, H., Mori, M. (2006). Effects of Storage Temperature on the Contents of Sugars and Free Amino Acids in Tubers from Different Potato Cultivars and Acrylamide in Chips. Biosci. Biotchnol. Biochem., 70 (5): 1173-1180. 40. Matthäus, B., Haase, N. U. (2003b). Acrylamides. What are the possibilities of their minimisation in food? Original language title: Acrylamid - Welche Moglichkeiten zur Minimierung. Lebensmittel gibt est Muhle, 140: 142-144. 41. Leufven, A., Lingnert, H. (2003). Factors influencing acrylamide formation food procesing – Introductory model experiments performed at SIK. Public report of the Swedish Institute for Food and Biotechnology. 42. Olsson, K., Svensson, R., Roslund, C. (2004). Tuber components affecting acrylamide formation and colour in fried potato: Variation by variety, year, storage temperature and storage time. Journal of the Science of Food and Agriculture, 84: 447-458. 43. Biedermann, M., Noti, A., Biedermann-Brem, S., Mozzetti, V., Grob, K. (2002c). Experiments on acrylamide formation and possibilities to decrease the potential of acrylamide formation in potatoes. Mitt Lebensm Hyg, 93: 668–687. 44. Biedermann, M., Biedermann-Brem, S., Noti, A., Grob K. (2002b). Methods for Determining the potential of Acrylamide Formation and Its Elimination in Raw Materials for Food Preparation, Such as Potatoes. Mitt Lebensm Hyg, 93: 653–667. 45. Noti, A., Biedermann, B., Biedermann, M., Grob, K., Albisser, P., Realini, P. (2003). Storage of potatoes at low temperature should be avoided to prevent increased acrylamide formation during frying or roasting. Mitteilungen aus Lebensmitteluntersuchung und Hygiene, 94: 167-180. 46. Kita, A., Brathen, E., Knutsen, S. H., Wicklund, T. (2004). Effective ways of decreasing acrylamide content in potato crisps during processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55 (23): 5011-5016. 47. Grob, K., Biedermann, M., Biedermann, B., Noti, A., Imhof, D., Amrein, T., Pfefferle, A., Bazzocco, D. (2003a). French fries with less than 100 μg/kg acrylamide. A collaboration between cooks and analysts. European Food Research and Technology, 217: 185-194. 48. Gertz, C., Klostermann, S., Kochhar, P. (2003). Deep frying: the role of water from food being fried and acrylamide formation. Oléagineux Corps Gras Lipides, 10 (4): 297- 303. 49. Gertz, C., Klostermann, S. (2002). Analysis of acrylamide and mechanisms of its formation in deep-fried products. Eur J Lipid Sci Technol, 104: 762–771. 56

50. Gertz, C. Optimising the frying and baking process using oil improving agents. 4th International Symposium Deep-Frying, Hagen, 2004. 51. Fernandez, S., Kurppa, L., Hyvönen, L. (2003). Content of acrylamide decreased in potato chips with addition of a proprietary flovonoid spice mix (Flavomare®) in frying. Inn. In Food Technol., 18: 24-26. 52. Brathen, E., Knutsen, S. H. (2005). Effect of temperature and time on the formation of acrylamide in starch-based and cereal model systems, flat breads and bread. Food Chemistry, 92: 693-700. 53. Ishihara, K., Matsunaga, A., Nakamura, K., Sakuma, K., Koga, H. (2006). Examination of Conditions Inhibiting the Formation of Acrylamide in the Model System of Fried Potato. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (7): 1616-1621. 54. Morales, F., Capuano, E., Fogliano, V. (2008). Mitigation Strategies to Reduce Acrylamide Formation in Fried Potato Products. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1126: 89–100. 55. Ötles, S., Ötles, S. (2004). Acrylamide in Food (Chemical Structure of Acrylamide). Electron. J. Environ. Agric. Food Chem. 3 (5): 723-730. 56. Levine, R. A., Smith, R. E. (2005). Sources of variability of acrylamide levels in a cracker model. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53: 4410–4416. 57. Low, M.Y., Koutsidis, G., Parker, J.K. (2006). Effect of citric acid and glycine addition on acrylamide and flavor in a potatomodel system. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54: 5976–5983. 58. DiNovi, M., Howard, D. The Updated Exposure Assessment for Acrylamide, FDA/CFSAN, Acrylamide in Food: Update –Scientific Issues, Uncertainties, and Research Strategies, April 13, 2004. http://www.jifsan.umd.edu/presentations/acry2004/acry_2004_dinovihoward.pdf. 59. *** - CERHR, Monograph on the Potential Human Reproductive and Developmental Effects of Acrylamide (2005). 60. Bergmark, E. (1993). Determination of hemoglobin adducts in humans occupationally exposed to acrylamide. Toxicology and Applied Pharmacology, 120:45–54. 61. Bergmark, E. (1997). Hemoglobin adducts of acrylamide and acrylonitrile in laboratory workers, smokers and nonsmokers. Chemical Research in Toxicology, 10: 78–84. 62. Dybing, E., Sanner, T. (2003). FORUM: Risk Assessment of Acrylamide in Foods. Toxicological Sciences, 75: 7-15. 63. Konings, E. J. M., Baars, A. J., van Klaveren, J. D., Spanjer, M. C., Rensen, P. M., Hiemstra, M., van Kooij, J. A.,Peters, P. W. J. (2003). Acrylamide exposure from foods of the Dutch population and an assessment of the consequent risks. Food and Chemical Toxicology, 41: 1569-1579. 64. Leung, K. S., Lin, A., Tsang, C. K., Yeung, S. T. K. (2003). Acrylamide in Asian foods in Hong Kong, Food Additives and Contaminants, 20: 1105–1113. 5765. Maitani, T. (2004). Evaluation of exposure to chemical substances through foods - exposure to pesticides, heavy metals, dioxins, acrylamide and food additives in Japan. Journal of Health Science, 50(3): 205-209.

66. Matthys, C., Bilau, M., Govaert, Y., Moons, E., Henauw, S. D., Willems, J. L. (2005). Risk assessment of dietary acrylamide intake in Flemish adolescents. Food and Chemical Toxicology, 43(2): 271-278. 67. *** - Norwegian Food Control Authority. (2002). Risk assessment of acrylamide intake from foods with special emphasis on cancer risk . 68. Mucci, L. A., Dickman, P. W., Steineck, G., Adami, Augustsson, K. (2003). Dietary acrylamide and cancer of the large bowel, kidney, and bladder: Absence of an associatin in a population-based study in Sweden. British Journal of Cancer, 88: 84-89. 69. Sörgel, F., Weissenbacher, R., Kinzig-Schippers, M., Hofmann, A., Illauer, M., Skott, A., Landersdorfer, C. (2002). Acrylamide: increased concentrations in homemade food and first evidence of its variable absorption from food, variable metabolism and placental and breast milk transfer in humans. Chemotherapy, 48(6): 267-274. 70. Twaddle, N. C., Churchwell, M. I., McDaniel, L. P., Doerge, D. R. (2004). Autoclave sterilization produces acrylamide in rodent diets: Implications for toxicity testing. J. Agric. Food Chem. 5: 4344-4349. 71. Fennell, T. R., Sumner, S. C. J., Snyder, R. W., Burgess, J., Spicer, R. (2005). Metabolism and hemoglobin adduct formation of acrylamide in humans. Toxicological Sciences, 85 (1): 447-459. 72. Mc Hugh, Atkins, W. M., Racha, K.J., Kunze, K. I. (1996) – Biding of the toxin-glutation conjugate to mouse glutation-S-transferase A3-3 is saturate dat onlz one, Journal of Biological and Biochimistry, 27470-27474; 73. Park, J., Kamendulis, L. M., Friedman, M. A., Klaunig, J. (2002). Acrylamide-Induced Cellular Transformation. Toxicological Science, 65: 177-183. 74. Sumner, S., Williams, C. C., Snyder, R. W., Krol, W. L., Asgharian, B., Fennel, T. R. (2003). Acrylamide: A Comparison of Metabolism and Hemoglobin Adducts in Rodents following Dermal, Intraperitoneal, Oral, or Inhalation Exposure. Toxicological Science, 75: 260-270. 75. Roman, L., Bojiţă, M., Săndulescu, R. Validarea metodelor de analiză şi control. Bazele teoretice şi practice, Editura medicală, 1998: 75/129, ISBN 973-39-0362-0. 76. Kim, C. T., Hwang, E., Lee, H. Y. (2005). Reducing acrylamide in fried snack products by adding amino acids. Journal of Food Science, 70: 354–358. 77. Becalski, A., Lau, B., Lewis, D., Seaman, S., Hayward, S., Sahagian, M., Ramesh, M., Leclerc, Y. (2004). Acrylamide in French fries: influence of free amino acids and sugars. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52: 3801-3806. 78. Fiselier, K., Bazzocco, D., Gama-Baumgartner, F., Grob, K. (2006). Influence of the frying temperature on acrylamide formation in French fries. Eur Food Res Technol, 222: 414–419. 5879. Matthäus, B., Vosmann, K., Haase, N. U. (2003a). How can one reduce acrylamide during baking and frying? Original language title: Wie lasst sich Acrylamid beim Backen und Braten vermindern?. Forschungs-Report, 33-35. 80. *** - German Federation of Food Law and Food Science. Development of New Technologies to Minimize Acrylamide in Food, ISBN 3-925032-42-8 (2005).

81. Taeymans, D., Wood, J., Ashby, P., Blank I. (2004). A Review of Acrylamide: An Industry Perspective on Research, Analysis, Formation and Control, Critical Reviews. Food Science and Nutrition, 44: 323-347. 82. Soyka, S., Frohberg, C., Quanz, M., Essigmann, B. (2004). Process for reducing the acrylamide content of heat-treated foods. European PCT Patent Application, no: WO-2004-040999. 83. Ono, H., Chuda, Y., Ohnishi-Kameyama, M., Yada, H., Ishizaka, M., Kobayashi, H., Yoshida, M. (2003). Analysis of acrylamide by LC-MS/MS and GC-MS/MS in processed Japanese foods. Food Additives and Contaminants, 20 (3): 215 – 220. 84. Wenzl, T., Karasek, L., Rosen, J., Hellenaes, K-E., Crews, C., Castle, L., Anklam, E. (2006). Collaborative trial validation study of two methods, one based on high performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry and on gas chromatography–mass spectrometry for the determination of acrylamide in bakery and potato products. Journal of Chromatography A, 1132: 211–218. 59LUCRĂRI PUBLICATE IN EXTENSO DIN DOMENIUL TEZEI 1. Burlacu, A. I., Cuciureanu, R., Fitterman, P., Larroque, M. (2009). Optimisation of a Gas Chromatographic Method For Acrylamide Analysis. Applications. Environmental Engineering and Management Journal, 8(2): 315-320. 2. Burlacu, A. I., Fitterman, P., Cuciureanu, R. (2008). Acrylamide Formation in Aliments Depending on Potato Varieties and Culinary Processes. A Comparative Study. Farmacia, LVI (3): 319-325. 3. Burlacu, A. I., Cuciureanu, R., Larroque, M. (2007). Cercetări privind prezenţa acrilamidei în produsele alimentare. Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iaşi, 111 (2) [Supliment Nr. 2]: 475-478. 4. Burlacu, A. I., Fiterman, P., Cuciureanu, R. (2008). Evaluarea aportului de acrilamidă prin consum de alimente. Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iaşi. 112 (2) [Supliment Nr. 1]: 79 – 83. 5. Burlacu, A. I., Cuciureanu, R., Prisăcaru, C. (2007). Acrylamide – toxic compound formed during the thermical process of aliments. Lucrări Ştiinţifice, Secţia medicină Veterinară, 50 (9): 129 – 133. 6. Burlacu, A. I., Fiterman, P., Cuciureanu, R. (2008). Gas chromatographic determination of acrylamide in chips. Orvosi es Gzogzsyeresyeti Syemie, 54: 87-89. REZUMATE PUBLICATE ÎN REVISTE COTATE ISI 1. Burlacu, A. I., Căruntu, I. D., Cuciureanu, M., Prisăcaru, C., Cuciureanu, R. (2008). Evaluation of the protective potential of ascorbic acid in acrylamide intoxication, Elsevier Toxicology Letters, 180 [1]: 62.PARTICIPAREA LA CONFERINŢE NAŢIONALE 1. Prisăcaru, A. I., Larroque, M., Cuciureanu, R. Contributions to the Acrylamide Analysis in Potato Products by Gas Chromatography,

Poster, Al XIII-lea Congres Naţional de Farmacie Cluj-Napoca, 28-30 septembrie 2006. 602. Burlacu, A. I., Cuciureanu, R., Larroque, M. Cercetări privind prezenţa acrilamidei în produsele alimentare, Comunicare orală, Simpozionul naţional Medicamentul – de la concepere până la utilizare Iaşi, Ediţia I-a, 30 mai – 1 iunie 2007.3. Burlacu, A. I., Fiterman, P., Cuciureanu, R. Evaluarea aportului de acrilamidă prin consum de alimente. Comunicare orală, Conferinţa Naţională de Fitoterapie, Ediţia a IV-a, Iaşi, 14-16 mai 2008.PARTICIPAREA LA CONFERINŢE INTERNAŢIONALE 1. Burlacu, A. I., Larroque, M., Cuciureanu, R. Analysis of acrylamide in food by gas chromatography. Comunicare orală, 29thBalkan Medical Week, Golden Sands, Bulgaria, 28-30 septembrie 2006. 2. Burlacu, A. I., Cuciureanu, R., Prisăcaru, C. Acrylamide – toxic compound formed during the thermical process of aliments, Poster, Simpozionul Ştiinţific Internaţional „Progrese şi Perspective în Medicina Veterinară” Iaşi, 7 – 8 iunie 2007. 3. Burlacu, A. I., Căruntu, I. D., Cuciureanu, M., Prisăcaru, C., Cuciureanu, R. (2008). Evaluation of the protective potential of ascorbic acid in acrylamide intoxication, Poster, The 45th Congress of the European Societies of Toxicology EUROTOX 2008, Rhodes, Grecia, 5-8 octombrie 2008. GRANTURI 1. Grant CNCSIS tip TD, Titlu: Cercetări privind prezenţa acrilamidei în alimentele prelucrate termic, Perioada: 2007-2009 (director de proiect). 2. Grant CNCSIS tip A, Tema Nr.1138/2007, Titlu:Acrilamida - compus toxic format în cadrul prelucrării termice a alimentelor; Perioada: 2007-2008 (membru în echipa de cercetare).