A consensus Genome-scale Reconstruction of Chinese HamsterOvary (CHO) Cell Metabolism

Hooman Hefzi, Kok Siong Ang, Michael Hanscho, Aarash Bordbar, David Ruckerbauer, Meiyappan Lakshmann, Camila A. Orellana, Deniz Baycin-Hizal, Yingxiang Huang, Daniel Ley, Veronica S. Martinez, Sarantos

Kyriakopoulos, Natalia E. Jiménez, Daniel C. Zielinski, Lake-Ee Quek, Tune Wulff, Johnny Arnsdorf, ShangzhingLi, Jae Seong Lee, Giuseppe Paglia, Nicolas Loira, Philipp N. Spahn, Lasse E. Pedersen, Jahir M. Gutierrez,

Zachary A. King, Anne Mathilde Lund, Harish Nagarajan, Alex Thomas, Alyaa M. Abdel-Haleem, JuergenZanghellini, Helene F. Kildegaard, BjØrn G. Voldborg, Ziomara P. Gerdtzen, Michael J. Betenbaugh, Bernhard O.,

Palsson, Mikael R. Andersen, Lars K. Nielsen, Nicole Borth, Dong-Yup Lee, Nathan E. Lewis

~ Pregled članka ~Živa Rejc

Znana dejstva, izzivi, cilji in želje

CHO celice

Prevladujoče v produkciji bioterapevtskih proteinov (rekombinantniproteini) – 70 %

Prednosti: rast celic v suspenziji (bioreaktorji), primerne za genetsko modificiranje, posttranslacijske modifikacije, varnost produkta

Izziv: Razumeti celostno delovanje celice – odziv na stres, metabolizem, celični cikel, celična smrt,…

Cilj: Ustvariti celične linije, ki bodo proizvajale velike količine produkta in računalniške modele, ki bodo to predvideli.

Želja: ustvariti primerne računalniške modele, ki bodo na podlagi eksperimentalnih podatkov pravilno in natančno predvideli vzorce ekspresije genov.

Izražanje rekombinantnih

proteinovMetabolizem Izločanje

produkta

Izražanje rekombinantnih proteinov

Izločanje produkta

MetabolizemŽelimo čim večje količine željenega produkta in čim manj ostalih produktov celičnega metabolizma.

Optimizacija

Povečanje celične gostote,

rasti celic in donos produkta

Sistemska biologija

Prepisovanje genovRNA procesiranje

Prevajanje zapisa v protein

Procesiranje proteina

Pot proteina

Priložnost za analiziranje izvedbe bioprocesiranja in vodenje celičnega inženirstvaNadzor in razlaga velike baze podatkovIzboljšanje efektivnosti produkcije rekombinantnih proteinov, pomoč pri nadaljnjih analizah in raziskavah

Nepoznane metabolne poti in z njimi povezanih genovProdukcija biomase ni statična, model pa jo statistično preračuna, zato natančnost ni vedno najvišjaProces glikozilacije, sekretornih poti,… še ni dodelan, kar se kaže na nižji natančnosti modela

Prednosti in pomanjkljivosti računalniških modelov

Raziskave, ki pripomorejo k konstruiranju modelov za CHO celice

http://www.nature.com/nbt/journal/v31/n8/pdf/nbt.2624.pdf

Genomsko zaporedje pri Kitjaskem hrčku

Napredek v sistemski biologiji

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201400647/epdf

Pregled strokovnega članka

Rekonstrukcija metabolnihpoti v CHO celicah (povezava

z > 1700 geni v Cricetulusgriseus genoma)

Metabolni model genoma iCHO1766

termetabolni modeli specifičnih celičnih linij CHO-K1, CHO-S

in CHO-DG44

Modeli natančno predvidijo fenotipe- stopnjo rasti in

metabolne lastnosti CHO celic.

> 3x bolj efektivna uporaba metabolnih virov za rast CHO

celic oz. sintezo rekombinantnih proteinov (z bioprocesiranjem, po analizi

na modelu)

Naslednji izziv: ustvariti pot izločanja produkta iz CHO

celic

Rekonstrukcija metabolne mreže Cricetulus griseus na ravni genoma

Potek raziskave

Metabolni modeli, ki so pripomogli k končnemu modelu• UCSD• NUS/BTI• UK BOKU• Dtu AK podmreža

Reakcije biomase

Konstrukcija modelov specifičnih celičnih linij

• GiMME algoritm

Podatki o rekonstrukciji in vsebini modela-Excel

http://bigg.ucsd.edu/ in http://www.chogenome.org/

Primerjava izračunanih in izmerjenih vrednosti za stopnjo rasti

Študije na podlagi avksotrofij za razumevanje procesov

Celično inženirstvo vs. bioprocesiranje

Figure 1: A multi-step process was used to reconcile a fewexsisting unpublished models and to generate the finalcommunity reconstruction and models.

Različne raziskovalne skupine neodvisno

rekonstruirale metalne modele C. griseus

Modeli sistematično

združeni in usklajeni

Skupni model

GPR = genes, proteins and reactions

Dodane CHO-specifične reakcije

Rekonstrukcija metabolne mreže Cricetulus griseus na ravni genoma

Potek raziskave

Metabolni modeli, ki so pripomogli k končnemu modelu• UCSD• NUS/BTI• UK BOKU• Dtu AK podmreža

Reakcije biomase

Konstrukcija modelov specifičnih celičnih linij

• GiMME algoritm

Podatki o rekonstrukciji in vsebini modela-Excel

http://bigg.ucsd.edu/ in http://www.chogenome.org/

Primerjava izračunanih in izmerjenih vrednosti za stopnjo rasti

Študije na podlagi avksotrofij za razumevanje procesov

Celično inženirstvo vs. bioprocesiranje

Figure 2: Outcomes from the reconciliation process.

3434 dodatnih reakcij

> 1300 publikacij

3229 reakcij povezanih z

geni1766 genov MODEL na

osnovi genoma

MODELI celičnih linij

• Začetni osnutek: GIMMEp algoritem• Recon 1 (človeška metabolna mreža)• Homologne reakcije med CHO in človeškim genomom (primerjava

človeških RefSeq proteinov proti CHO zaporedju genoma) –Bidirectional BLAST metoda (Basic Local Alignment Search Tool)

• Definiran nabor metabolnih funkcij in vključen v model: sposobnost produciranja biomase, sposobnost produciranja glikoliziranegaproteina, sposobnost porabe in sekrecije poznanih metabolitovkarakterističnih za CHO-K1 celice.

UCSDmetabolni

model

http://msb.embopress.org/content/msb/8/1/558.full.pdf

http://www.pnas.org/content/104/6/1777.full.pdf

GiMMEp

Recon 1

http://www.nature.com/nbt/journal/v29/n8/pdf/nbt.1932.pdf

• Objektivna funkcija biomase je bila konstruirana za RNA, DNA, vsebovani proteini, proste AK, glikogen, proste MK, lipidi, fosfolipidi, trigliceridi, ATP – iz literature.

• Rekonstrukcija metabolnih reakcij, ki prevedejo EPO protein in dodadjo obvezne N- in O-glycane oz. tudi razpada proteina.

• Reakcije izmenjave pri porabi ali sekreciji znanih metablitov vključene• Ročno dopolnjen model: povezovanje genov, lokalizacije reakcij in

druge reakcije, ki niso bile tako homologne.

UCSDmetabolni

model

Genomsko zaporedje CHO-K1

•Recon 1 (človeška metabolna mreža)•Homologne reakcije med CHO in človeškim genomom (primerjava člevških

RefSeq proteinov proti CHO zaporedju genoma) – Bidirectional BLAST metoda

•Iskanje reakcij, ki zagotavljajo formacijo biomase in so bile izključene pri iskanju homologov

•Za natančnejše konstruiranje modela: informacije iz literature, KEGG pathway in BRENDA Enzyme Database

•Dopolnitev reakcijske mreže na podlagi LC-MS opravljenih eksperimentov

NUS/BTImetabolni

model

http://nar.oxfordjournals.org/content/28/1/27.full.pdf+html

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2686525/pdf/gkn820.pdf

KEGG pathway

BRENDA Enzyme Database

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bit.24445/epdf

•Recon 1 (človeška metabolna mreža)•Homologne reakcije med CHO in človeškim genomom (primerjava člevških

RefSeq proteinov proti CHO zaporedju genoma) – Bidirectional BLAST metoda

•Iskanje reakcij, ki zagotavljajo formacijo biomase in so bile izključene pri iskanju homologov

•Za natančnejše konstruiranje modela: informacije iz literature, KEGG pathway in BRENDA Enzyme Database

•Dopolnitev reakcijske mreže na podlagi LC-MS opravljenih eksperimentov

NUS/BTImetabolni

model

LC-MS opravljeni eksperimenti

• Recon 2 (nadradnja človeške metabolne mreže)• InParanoid v4.1 program: iskanje homolognih

genov• Pretvarjanje Recon 2 metabolne mreže v CHO

specifično mrežo začetna baza CHO-specifične mreže bazirane na Recon 2

UQ/BOKUmetabolni

model

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614002673

http://nar.oxfordjournals.org/content/38/suppl_1/D196.full.pdf+html

Recon 2

InParanoid v4.1 program

DTU AK podmreža• Genom miši in biokemijske poti (KEGG

database)• BLAST iskanje genov AK iz miši za

identifikacijo ortolognih genov (geni iz različnih vrst, s predvidoma istim prednikom)

• Končni seznam genov je bil ročno dodelan na podlagi literature

Rekonstrukcija metabolne mreže Cricetulus griseus na ravni genoma

Potek raziskave

Metabolni modeli, ki so pripomogli k končnemu modelu• UCSD• NUS/BTI• UK BOKU• Dtu AK podmreža

Reakcije biomase

Konstrukcija modelov specifičnih celičnih linij

• GiMME algoritm

Podatki o rekonstrukciji in vsebini modela-Excel

http://bigg.ucsd.edu/ in http://www.chogenome.org/

Primerjava izračunanih in izmerjenih vrednosti za stopnjo rasti

Študije na podlagi avksotrofij za razumevanje procesov

Celično inženirstvo vs. bioprocesiranje

Uporabljen model, ki simulira rast celic in produkcijo rekombinantnih proteinov

Opredelitev relativne količine vsakega metabolita, ki je potreben za sintezo celičnih komponent in rekombinantnih proteinov eritropoetina in IgG.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2912156/pdf/nihms214357.pdf

The Biomass Objective Function

Zaradi razlik med izračunanimi in izmerjenimi vrednostmi ustvarjeni dve reakciji biomase: ena za celično linijo, ki producira protein in druga za ne-producirajočo celično linijo potrebno identificirati koločinopotrebnih metabolitov za sintezo vseh celičnih komponent.

Rekonstrukcija metabolne mreže Cricetulus griseus na ravni genoma

Potek raziskave

Metabolni modeli, ki so pripomogli k končnemu modelu• UCSD• NUS/BTI• UK BOKU• Dtu AK podmreža

Reakcije biomase

Konstrukcija modelov specifičnih celičnih linij

• GiMME algoritm

Podatki o rekonstrukciji in vsebini modela-Excel

http://bigg.ucsd.edu/ in http://www.chogenome.org/

Primerjava izračunanih in izmerjenih vrednosti za stopnjo rasti

Študije na podlagi avksotrofij za razumevanje procesov

Celično inženirstvo vs. bioprocesiranje

Konstrukcija modelov specifičnih celičnih linij

Osnova: GiMME algoritem• CHO-S: podatki o transkriptomu in proteomu pridobljeni• CHO-K1 in –DG44: uporabljeni že obstoječi podatki• Blokirane reakcije so bile izločene iz modela• Vsi podatki o reakcijah so bili združene in služili kot baza za

vsak posamezen model celične linije

Dodane reakcije• GLYCt in SUCCt4_3 za sekrecijo glicerola in sukinata• HISD, URCN, IZPN, GluForTx, FTCD in DM_trp_L[c] za večjo

uporabo histidina in triptofana za rast in produkcijo proteina

Specifični modeli za celične linije CHO-K1, CHO-S in CHO-DG44

http://journals.plos.org/ploscompbiol/article/asset?id=10.1371/journal.pcbi.1000082.PDF

GiMME algoritm, ki je bil uporabljen pri konstrukciji modelov specifičnih celičnih linij

Podatki o rekonstrukciji in vsebini modela so zbrani v „Supplemental data S1“

Formula reakcije

• Citosol• Mitohondrij• Jedro• Endoplazm. retikulum

• Golgijev aparat• Lizosom• Peroksisom

• Medmembranskimitohondrijski prostor

• Zunajcelični matriks

Reakcije (n=3229)

9 komparmentov

Literatura

Podatki o rekonstrukciji in vsebini modela so zbrani v „Supplemental data S1“

http://www.chogenome.org/

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201400646/epdf

http://bigg.ucsd.edu/

http://nar.oxfordjournals.org/content/44/D1/D515.full.pdf+html

Rekonstrukcija metabolne mreže Cricetulus griseus na ravni genoma

Potek raziskave

Metabolni modeli, ki so pripomogli k končnemu modelu• UCSD• NUS/BTI• UK BOKU• Dtu AK podmreža

Reakcije biomase

Konstrukcija modelov specifičnih celičnih linij

• GiMME algoritm

Podatki o rekonstrukciji in vsebini modela-Excel

http://bigg.ucsd.edu/ in http://www.chogenome.org/

Primerjava izračunanih in izmerjenih vrednosti za stopnjo rasti

Študije na podlagi avksotrofij za razumevanje procesov

Celično inženirstvo vs. bioprocesiranje

Figure 3: The CHO cell-line models can compute growthrates for various IgG-producing cell lines.

HP = high producersLP = low producersNaBu =Prisotnost natrijevega butirata v medijuEarly/Late Exp. = zgodnja in pozna eksponentna fazaCold 1/2 = temperaturni premik

CHO-DG44

CHO-K1

Figure 4: The modelsprovide insight intothe molecular basis ofCHO-specific aminoacid auxotrophies: (A) Arginine, (B) Cysteine, (C) Proline, (D) Asparagine.

Celično inženirstvo poveča efektivnost porabe virov v primerjavi z bioprocesiranjem

Bioprocesiranje Celično inženirstvo

• Ni povsem jasno, kako dobro celica preusmeri vire nutrientov iz rasti v produkcijo proteina;

• Eksperimentalno ugotovljeno koliko produkta nastane pred in po spreminjanju medija;

• Rezlutati eksperimentov kažejo na bolj efektivno proizvajanje proteina po tarčnem inženirstvu.

Figure 5: Resourceutilizationefficiency in CHO cell lines is greaterafter cell line engineering.

Reference slik

• Produkcija rekombinantnih proteinov: http://www.abgenex.com/recombinant-protein-production

• Metabolizem: https://www.spandidos-publications.com/10.3892/ijo.2013.1985• Bioreactor: https://en.wikipedia.org/wiki/Bioreactor• Metabolne poti v celici:

https://en.wikipedia.org/wiki/Systems_biology#/media/File:Signal_transduction_pathways.svg

• Metabolna mreža (sistemska biologija): http://www.bioquicknews.com/node/384• Transkripcija, translacija: https://www.studyblue.com/notes/note/n/genetic-code-and-

transcription-second-exam/deck/6080268• Potovanje proteinov z ER ven iz celice: http://slideplayer.com/slide/6253319/• GA: https://www.pinterest.com/cellorganelles/golgi-apparatus/• Ortologni geni: http://www.nature.com/nrd/journal/v2/n8/box/nrd1152_BX2.html