1

A Biotechnológiai Tanszék oktatási anyagaaz alábbi internet címen érhető el:

http://biotech.szbk.u-szeged.hu

2

3

4

kémiaitudományok

ImmunológiaSejtbiológiaGenetika

Molekulárisbiotechnológia

Molekulárisbiológia

Mikro-biológia

Biokémia

Élelmiszerbiotechnnológia

genetikailag módosítottnövények, állatok,

fermentatív termékek

Farmakológia,drogok, vakcinák

DNS- ésimmundignosztika

génterápia

Iparilag hasznos termékekelőállítása,

aminosavak, peptidekfehérjék, metabolitok,

egyéb vegyületek

Környezetvédelem,bioremediáció,biodegradáció

5

A FEHÉRJÉK TÚLTERMELTETÉNEK ELŐNYEI Fő ok: Ha egy fehérjére nagy mennyiségben van szükség, és a természetben csak kis mennyiségben fordul elő, vagy az eredeti sejtvonal nehezen kezelhető, belõle fehérje csak körülményesen nyerhető.  KÖZVETLEN FELHASZNÁLÁS

IPARI,  proteázok, szénhidrátbontó enzimek, lipázok,polimerázok,bioaktív peptidek, fehérjék, hormonok, farmakológiai, gyógyászati felhasználásra

KUTATÁSI CÉLOKRA   biokémiai és biofizikai vizsgálati módszerek,3 dimenziós röntgenszerkezet,mutációs analízis,

FELTÉTEL:A felhasználás előtt igazolni kell, hogy az eredeti fehérje és a rekombináns megfelelője biológiailag ekvivalens

6

NUKLEINSAVAK

DNS

- genetikai információ hordozóaz élőlények összes biológiai sajátságához szükséges információgenomi könyvtárak, genom projektek: ezen információk megfejtése

módosítható genetikailag módosított élőlények (genetically modified organisms (gmo)) metabolikus utak befolyásolása rekombináns termékek előllítása

ELŐFORDULÁS

Prokarióták Eukarióták

kromoszóma, nincs sejtmag kromoszóma, sejtmagextrakromoszómális elemek, mitokondrium

plazmidok, kloroplaszt fágok egyéb extrakromoszómális

elemek, plazmidok vírusok

RNS

tRNS mRNS rRNStranszfer RNS messenger RNS riboszómális RNSaminosav szállítás

aktív transzkripció cDNS könyvtárak funkcionális genomika

7

DNA RNA

1

OH

OH

OH

OH

2

U

H

3

8

A DNS felépítése

9

DNS-olvadáspont

Streptococcus DNS olvadási görbéje.

Tm= az a hőmérséklet ahol a 50% DNS megolvadt.

10

A DNS G-C tartalma és olvadáspontja közötti összefüggés

11

Annealing vagy Hibridizáció

Lehet• DNS - DNS• DNS - RNS• RNS - RNS

12

“A” DNS “B” DNS “Z” DNS

DNS-struktúrák

13

A KÜLÖNBÖZŐ DNS FORMÁK TULAJDONSÁGAI

“A” “B” “Z”

rövid, széles hosszabb, vékony megnyúlt, karcsú jobbcsavar jobbcsavar balcsavar

tengely nagy árok bázis párokon át kis árok nagy árok szűk, mély széles, közepesen mély felületen kisimult kis árok nagyon széles szűk közepesen mély nagyon szűk és mély glikozidos kötés anti anti anti (C), szün (G)

előfordulás dehidratált természetes (Pu-Py)n, magas só, vagy metiláció esetén

Egyéb fomák: egyszálú, három szálú (Hoogsteen triplex), „D” és „E” forma (guaninok eltávolítva)

14

DNS tisztítása kromoszomális, plazmid

1. Sejtfeltárás- lúgos kezelés- fagyasztás – felmelegítés- lizozimos kezelés (baktériumok)- hő- nyomás, French- press- ultrahangos szonikálás

2. Egyéb sejtalkotók eltávolítása- lipidek, poliszaharidok: szelektív kicsapás a sejtfeltárás körülményei között szerves extrakció, fenol-kloroform elegyével a DNS szelektív kicsapása alkohollal

- fehérjék: fehérje bontó enzimek alkalmazása: proteináz K szerves folyadék-folyadék extrakció, fenol-kloroform elegyével

- RNS: szelektív kicsapás LiCl oldattal

RNáz enzimek alkalmazása,

15

DNS etanollal, izopropilalkohollal kicsapható

Kromoszómális DNS nagy, makroszkopikus molekula kiemelhető Minél nagyobb egy DNS, annál könnyebben törik. Kb. 20 kb – osnál nagyobb DNS erős fizikai behatásnak(vortexes kevertetés) nem tehető ki! 

hordozóN+

Egyéb tisztítási módszerek  kromatográfia,

- ioncserés DEAE (dietil-aminoetil)kötés alacsony, elúció magas sókoncentráció eseténA DNS savas ionos kölcsönhatás

- szilikagél alapú elválasztásmagas sókoncentráció mellett felkötődik a DNS, alacsony sókoncentrációnál eluálódik

16

- CsCl sűrűséggradiens centrifugálás

adott koncetrációjú CsCl oldat centrifugálás során grádienst képez,a DNS a saját sűrűségének megfelelő helyre vándorol és ott megáll.

különböző konformációjú DNS-k szétválaszthatóak, nagy tisztaságRNS tisztítása

RNS nagyon könnyen degradálódik, RNázok stabilaka tisztítás során RNáz mentesíteni kell mindent

DEPC: dietil pirokarbonát

O

O

O

O

O

17

sok eltérő protokol, ma univerzálisan használható rendszer a guanidium isotiocianát-fenol-kloroform oldattal történő extrakcióegy lépésben sejtfeltárás és szerves-vizes folyadék fázisú extrakció.A vizes fázis csak totál RNS-t tartalmaz ( és némi kromoszómális DNS szennyezést, DNázI kezeléssel eltávolítható

RNS tisztítása

NH2

NH

N+

N [S]

guanidin és izotiociánsav sója

18

mRNS tisztítás

eukarióták esetén stabil poliA farok

TTTTTTTTTT-

hordozó

AAAAAAAAA

mRNS

tRNS

rRNS

AAAAAAAAA

mRNS

TTTTTTTTTT-

hordozó

AAAAAAAAA

mRNS

magas só

alacsony só

19

DNS ELVÁLASZTÁSAELEKTROFORÉZIS

denaturáló nem-denaturáló

lúgos, (DNS, agaróz)

formaldehid, glioxál, DMSO(RNS, agaróz)

urea (DNS, akrilamid)

méret

> 50 kb

100bp-50 kb

< 1000 bp

Mátrix

agaróz

agaróz 0.5- 2%

poliakrilamid

technika

pulzáló gélelektroforézis

hagyományos gélelektroforézis

(5-20%) hagyományos

LÁTHATÓVÁ TÉTEL:etídium bromid, interkaláló festék nem-denturáló körülmények,

elsősorban duplaszálú DNS-t fest, de egyszálú nukleinsavakat is.A DNS 254 nm-en elnyel energia a festékre 590 nm-en emisszió, a festék maga 302 és 366 nm-en nyel elLehet gélbe rakni, utófesteni, illetve a mintához adni.Érzékenység kb 10 ng

.Egyéb festékek, fluoreszkáló anyagok: pl. fluoreszcein, minden körülmény közöttradioaktivitás: minden körülmény között, 35S, 33P, 32P beta sugárzók

Nincs roncsoló ágens

20

etidium bromid & DNS

Agaróz szerkezete

21

Horizontális gélelektroforézis

22

Géldokumentáció

23

24Poliakrilamid gél futtató berendezés

25

Vertikális gélelektroforézis(PAGE)

26

DNS IZOLÁLÁSA GÉLBŐL

- közös pont: először elektroforetikus úton elválasztjuk a DNS-t

- a megfelelő sávot kivágjuk steril pengével

AGARÓZ

- dialízis, dializáló hártyában, elektrodialízisa kapott DNS további tisztítása fenolos extrakcióval, alkoholoskicsapással, univerzális, széles mérettartomány

- - fagyasztásos módszer : a kivágott – DNS-t tartalmazó - agarózdarabot –80oC-on megfagyasztjuk az agarós szerkezete roncsolódik, ebből a DNS egy szűrőn keresztül centrifugálással kinyerhető további tisztítás szükséges, univerzális

- kromatográfiás módszerek 6M NaI mellett a DNS 55oC-on (az agaróz megolvad) szilikagél felületére kötődik,a mátrix mosása után innen o55 C-on alacsony só(víz, TE) eluálható, majdnem univerzális, elég széles mérettartomány

DEAE membránba futtatjuk a DNS-t, innen magassókoncentrációval (1.5M) magas hőmérsékleten eluálhatónagy tisztaság, szűk, alacsony mérettartomány < 1.5 – 2 kb eseténjó a kitermelés

POLIAKRILAMID (PAGE)

a kivágott darabot passzív módon vagy elektromos térben eluáljukmajd töményítjük, ioncserésen tisztítjuk

27

DNS/ RNS MÉRÉSEA különböző nukleotidoknak 260 nm körül erős abszorbanciájuk van.Egyszálú DNS esetén:

bázis (cm3/(µmol * cm)

dA 15.4dG 11.7dC 7.5dT 8.8

átlagosan = 10 (cm3/(µmol * cm)

Ez leginkább oligonukleotidok esetén használatos.

Nagyobb egyszálú, kétszálú DNS-k, RNS-k esetén a bázisok kölcsönhatásamiatt a számítás módosul

1 cm-es küvettában 260 nm-en 1.0 az abszorbanciája

50 µg/ml kettősszálú DNS-t33 µg/ml egyesszálú DNS-t 40 µg/ml egyesszálú RNS-ttartalmazó oldatnak

A fehérjék 280 nm-en nyelnek el. Az A260nm/A280nm arány a nukleinsav tisztaságára jellemző

Egyéb módszerek: fluoreszcein, kemilumineszcens festékekkel. Érzékenyebb, de fluorimétert igényel.

A260nm/A280nm 2 tiszta a preparátum

A260nm/A280nm 1 - 1,5 sok a fehérje szennyezés

28

A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁNHASZNÁLATOS ENZIMEK

RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK

Enzim Felismerôhely Felismerô-hasítóhely Forrás organizmus hossza

AluI 4 AG/CT Arthrobacter luteus

HphI 5 GGTGAN8/ Haemophilus parahaemolyticus

EcoRI 6 G/AATTC Escherichia coli

BamHI 6 G/GATCC Bacillus amyloliquefaciens H

Ragadós végeket adó hasítások (sticky end)

5' túlnyúló

SalI 6 5' G TCGAC 3' Streptomyces albis 3' CAGCT G 3'

3' túlnyúló

KpnI 6 5' GGTAC C 3' Klebsiela pneumonia 3' C CATGG 5'

Tompa végû hasítások (blunt end)

HaeIII 4 5' GG CC 3' Haemophilus aegyptus 3' CC GG 5'