9. predavanje pia 2011 2012 mutavdzic pavlovic
TRANSCRIPT
Dr. sc. Dragana Mutavdžić Pavlović, doc.
Zavod za analitičku kemiju
Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologije
Sveučilišta u Zagrebu
Ak. g. 2011./2012.
PROCESNA I
INSTRUMENTALNA
ANALIZA
Kromatografski sustav čine analizirani uzorak te pokretna i nepokretna faza
Kromatografija normalnih faza - nepokretna je faza polarna (silikagel,
aluminijev oksid), a pokretna nepolarna
Kromatografija obrnutih faza - nepokretna faza nepolarna (C18-modificirani
silikagel), a pokretna polarna
KROMATOGRAFSKI SUSTAV
kromatografsko razdvajanje normalnih faza
kromatografsko razdvajanje obrnutih faza
Redoslijed opadanja polarnosti komponenti
Žuta
Crvena
plava
nepokretna faza
nepokretna faza
pokretna faza
pokretna faza
Nepokretna faza je čvrsta tvar ili kapljevina na inertnom nosaču.
Obzirom na kemijsku strukturu i polarnost, sorbensi se dijele na:
polarne anorganske (hidrofilne) sorbense, čiji su predstavnici
silikagel, aluminijev oksid i magnezijev silikat
nepolarne anorganske sorbense, kao što su aktivni ugljen i grafit
polarne vezane faze, npr. aminopropil, cijanopropil, diol
nepolarne vezane faze poput alkana, C8 i C18 ugljikovodika i
polarne organske sorbense koje predstavljaju celuloza, hitin,
poliamid
Izbor nepokretne faze uvjetovan je prirodom ispitivanog spoja,
prirodom ravnoteže kromatografskog procesa i vrstom veze koja
nastaje između ispitivanog spoja i kromatografske podloge. Stoga
je izbor sorbensa jedan od najvažnijih čimbenika u
kromatografskom procesu.
NEPOKRETNA FAZA
silikagel je jedan od najviše upotrebljavanih nepokretnih faza
opća mu je formula SiO2·xH2O, a strukturno predstavlja nepravilnu
prostornu rešetku SiO4-tetraedra
Kemijski vezane faze dobivaju se uvođenjem pogodnih funkcionalnih skupina
na površinu polarnog silikagela, čime se može bitno utjecati na promjenu
njegovih adsorpcijskih svojstava. Svojstva kemijski vezanih faza ovise o:
vrsti i duljini vezanih lanaca ugljikovodika,
pokrivenosti površine vezanom skupinom,
vrsti intermolekularnih interakcija organskog otapala i funkcionalne skupine
na površini adsorbensa
Shematski prikaz modificiranih silikagelnih podloga
Površina silikagela modificira se djelomično zamjenom hidroksilnih skupina
polarnim funkcionalnim skupinama (cijanopropil, diol, aminopropil) ili
nepolarnim (C8-C
18).
Kemijskim vezanjem zamjenjuje se najviše do 50% silanolnih skupina.
Uvođenjem nepolarnih skupina smanjuje se broj aktivnih mjesta na površini
silikagela, čime se uvelike smanjuje njegova polarnost, a uvedene polarne
skupine i same postaju sorpcijski centri.
Fizikalno impregnirani slojevi
U tankoslojnoj se kromatografiji silikagelni sloj može impregnirati različitim
dodacima sa svrhom poboljšanja njegovih svojstava za željenu separaciju. To
se provodi prilikom priprave sloja, a može se obaviti i naknadno uranjanjem ili
prskanjem već pripremljenog sloja sredstvom za impregniranje.
Izbor sredstva ovisi o cilju kromatografskog razdvajanja i mora voditi
poboljšanju postojećeg kromatografskog sustava.
Dodaci koji utječu na kromatografski proces mogu se klasificirati na:
Tvari koje mijenjaju pH-vrijednost kromatografskog sustava
Tvari koje mijenjaju ravnotežno stanje kromatografskog sustava
Tvari koje pojačaju selektivnu adsorpciju
Specifični dodaci kromatografskoj podlozi
da bi se s obzirom na izbor nepokretne faze omogućio optimalan
kromatografski sustav za razdvajanje željene smjese treba izabrati pogodan
sustav otapala koji čini pokretnu fazu
priroda veze koja se ostvaruje između ispitivanog spoja te nepokretne i
pokretne faze važan je čimbenik realnog kromatografskog procesa
intermolekularne interakcije van der Waalsovim silama, veze dipol-inducirani
dipol, dipol-dipol te vodikova veza najčešće su u kromatografiji normalnih i
obratnih faza
izbor pogodnog otapala, odnosno smjese otapala, provodi se s obzirom na
sposobnost otapala da stvaraju vodikove veze (odjeljivanje hidrofilnih, odnosno
hidrofobnih spojeva)
otapala moraju biti kromatografski čista, što znači da ne sadržavaju nikakvu
nečistoću koja bi mogla smetati tijekom kromatografskog određivanja
POKRETNA FAZA
S obzirom na sposobnost tvorbe vodikove veze otapala su podijeljena
u pet skupina:
1. tekućine kojima su molekule međusobno povezane višestrukim
vodikovim vezama (voda, glicerin, aminoalkoholi, etilenglikol i sl.)
2. tekućine kojima su molekule povezane vodikovom vezom i koje
mogu tvoriti vodikovu vezu s molekulama ispitivanog spoja
(alkoholi, fenoli, amini)
3. tekućine kojima molekule sadrže atome kisika, koji mogu imati
udjela u vodikovoj vezi, ali ne sadrže atome vodika (ketoni, eteri,
esteri, aldehidi)
4. tekućine kojima molekule sadrže atom vodika, koji može tvoriti
vodikovu vezu, ali ne sadrže odgovarajuće atome koji bi mogli
imati udjela u vezi (kloroform, diklormetan)
5. ostale tekućine kojima molekule mogu tvoriti vodikovu vezu
Jakost otapala u kromatografiji normalnih faza povećava se s
porastom polarnosti pokretne faze, a u kromatografiji obrnutih faza se
smanjuje s njezinom polarnošću
1. alifatski eteri, trialkil amini, tetrametil gvanidin,
heksametil amidi fosforne kiseline
2. alifatski alkoholi
3. derivati piridina, tetrahidrofuran, amidi (osim
formamida), glikol eteri, sulfoksidi
4. glikoli, benzilalkohol, octena kiselina, formamid
5. metilen klorid, etilen klorid
6. (A) trikrezil fosfat, alifatski ketoni i esteri,
polieteri, dioksan,
(B) sulfoni, nitrili, propilen karbonat
7. aromatski ugljikovodici, halogen supstituirani
aromatski ugljikovodici, nitro spojevi, aromatski
eteri
8. fluoralkani, m-krezol, voda, kloroform
Snyderov trokut selektivnosti
Na temelju indeksa polarnosti, P, te parametara selektivnosti (Xe, Xd, Xn) otapala,
Snyder ih je podijelio u osam skupina što je grafički prikazao Snyderovim trokutom
selektivnosti.
Parametri selektivnosti ovise o proton-donorskim (Xd) , proton-akceptorskim (Xe) i
dipolnim (Xn) svojstvima molekula otapala.
najjednostavniji način odjeljivanja tekućinskom kromatografijom je
izokratno eluiranje – pri kojoj analit kroz kolonu nosi jedno otapalo
odnosno ne mijenja se sastav pokretne faze tijekom cijele analize
ipak često bolje razdvajanje se postiže (veća djelotvornost)
primjenom gradijentnog eluiranja uz upotrebu dvaju ili više sustava
otapala znatno različitih polarnosti
pri gradijentnoj eluciji sastav pokretne faze se mijenja tijekom analize
kontinuirano ili skokovito
primjer gradijentnog eluiranja
Pokretna faza: tekućina
Nepokretna faza: punila vrlo finih zrna
Tlak: nekoliko MPa (do 4 x 107 Pa = 400 bara)
Podjela HPLC (High Performance Liquid Chromatography):
(1) Razdjelna kromatografija
(2) Adsorpcijska kromatografija
(3) Ionsko-izmjenjivačka kromatografija
(4) Kromatografija isključenjem na osnovi veličine čestica
Doseg HPLC: najveći u separacijskim tehnikama,
proizvodnja > mld USD godišnje
Prednosti HPLC:
osjetljivost,
prilagodljivost,
analiza neisparljivih i termički osjetljivih spojeva,
široki spektar uzoraka (industrija, znanost: aminokiseline, nukleinske
kiseline, šećeri, lijekovi, pesticidi, organometalni spojevi, anorganske tvari i
dr.)
TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE DJELOTVORNOSTI
1. Unošenje (injektiranje) analita
unošenje uzorka u pokretnu fazu
2. Razdvajanje analita u koloni
sastojci iz analita razdvajaju se u koloni na temelju različite raspodjele
između dviju faza
3. Eluacija (ispiranje) komponenti iz kolone
različiti sastojci izlaze iz kolone u različitim vremenima
4. Detekcija
eluirane komponente obično se analiziraju mjerenjem neke od
fizikalnih svojstava komponente (indeks refrakcije, UV apsorpcija,
električna vodljivost …)
Kromatografska analiza:
osnovni dijelovi uloga
spremnik (jedan ili više) izvor protoka pokretne faze
crpke (pumpe) za pokretanje pokretne faze
injektor ili sustav za unošenje
uzorka
za precizno odmjeravanje i
unošenje uzorka u kolonu
kolona za razdvajanje komponenata
smjese
termostat za održavanje konstantne
temperature
detektor detektira komponente smjese istim
redoslijedom kako one napuštaju
kolonu
sustav za registriranje signala iz
detektora
za dobivanje trajnog dokumenta o
pojavljivanju svake komponenti iz
ispitivane smjese
stakleni ili čelični spremnik
često se u sklopu tog sustava nalazi i oprema za uklanjanje plinova i čvrstih čestica iz tekućine
otplinjavanje je postupak kojime se otopljeni plinovi uklanjaju iz otapala nošeni mjehurićima inertnog, netopljivog plina
plinovi, zbog stvorenih mjehurića, mogu prouzročiti širenje kromatografske zone
mjehurići i čestice mogu ometati rad detektora
SPREMNIK POKRETNE FAZE
pumpa je jedan od najvažnijih dijelova kromatografskog sustava tekućinske kromatografije visoke djelotvornosti
pumpa održava kontinuirano konstantan protok pokretne faze kroz HPLC injektor, kolonu i detektor
pumpe se može podijeliti na pumpe s konstantnim tlakom i pumpe s konstantnim protokom
pumpe s konstantnim tlakom se koriste kod punjenja kolona sorbensom, tj. punilima
pumpe s konstantnim protokom su kolone koje se uobičajeno koriste u HPLC sustavima
za primjenu u tekućinskoj kromatografiji pogodne su dvije vrste mehaničkih pumpi: pumpe s vijčanim pogonom i recipročna pumpa
pumpe s vijčanim pogonom imaju mali kapacitet ( 250 mL) i nepogodne su za promjenu otapala
recipročne pumpe puno se više upotrebljavaju jer su pogodne za rad s gradijentom i daju konstantne protoke. Nedostatak im je taj što su skupe
zahtjevi kojima moraju udovoljiti pumpe vrlo su strogi:
tlakovi do 40 MPa
izlaz bez pulsiranja tlaka
brzine protoka od 0,01 do 10 mL/min
reproducibilnost protoka od 99,5% ili bolja
otpornost na koroziju izazvanu različitim otapalima Miješanje otapala kod niskog
tlaka
A i B - otapala; SC-nadzorni
sustav; P - pumpa, SV – solenoidni
ventil
M - komora za miješanje otapala
Miješanje otapala kod visokog tlaka
A i B –otapala; SC-nadzorni sustav; PA i
PB- pumpa za otapala A i pumpa za
otapalo B,
M-komora za miješanje otapala
Shematski prikaz recipročne pumpe
a- motor; b- regulator brzine; c- brtva; d- klip;
e- ulaz otopine; f- ventili; g- izlaz otopine
PUMPE ILI CRPKE
Protok je vrlo bitan za kromatografski proces
Veći protok kroz kolonu uzrokuje
jače širenje kromatografskih zona
slabije (lošije) razdvajanje pojedinih sastojaka uzorka
kraće vrijeme analize
Manji protok kroz kolonu
manje širenje kromatografskih zona
bolje razdvajanje pojedinih sastojaka uzorka
dulje vrijeme analize
uzorak se najčešće unosi kroz elastičnu membranu, tzv. septum
taj način nije osobito reproducibilan pa je ograničen na tlakove niže od 10 MPa
pri unošenju uzorka uz zaustavljanje protoka makne se matica na početku
kolone, a uzorak se injekcijskom štrcaljkom unese na početak punila
najčešće se unosi putem plinskog ventila
u sustavu za unošenje uzorka nalazi se i više izmjenjivih petlji kojima se u
kolonu mogu unositi količine uzorka od 5 do 500 L
SUSTAV ZA UNOŠENJE UZORKA
Sustav za ručno (a) i automatsko unošenje uzorka Varian ProStar 410 (b)
te
shematski prikazi petlje kojima se unose uzorci u kolonu
a) b)
od nehrđajućeg čelika ili od stakla (samo za niske tlakove <4MPa) punjene
granulama nepokretne faze
punilo najčešće silikagel
povijesni razvoj povećanja separacijske učinkovitosti HPLC kolona
duljina kolone najčešće 5 – 25 cm (danas postoje na tržištu i one od 3-7,5 cm)
unutarnjeg promjera: 2; 4,6 mm
promjer zrna punila: 2; 4; 5; 10 m
KOLONE
HPLC detektori mogu se podijeliti u dvije kategorije:
nespecifični (ili univerzalni) – mjeri se refrakcijski indeks (RI) ili dielektrična konstanta uzorka
specifični – fizikalna ili kemijska svojstva se mjere pod idealnim uvjetima,
npr. UV apsorpcija, spektrometrija masa (MS)
HPLC detektori:
= Refrakcijski detektor (RI) za mjerenje refrakcijskog indeksa
= UV/Vid detektori: -s fiksnom valnom duljinom
-s promjenjivom valnom duljinom
-s nizom dioda (DAD)
= Fluorescentni detektor (FLD)
= Konduktometrijski detektor
= Spektrometar masa (MS).
Treba naglasiti neke bitne parametre koje mora zadovoljavati jedan detektor:
mali pomak i šum kod snimanja bazne linije (izuzetno bitno kod analize u tragovima)
visoka osjetljivost
brzi odziv
široko linearno dinamičko područje rada (jer to pojednostavljuje kvantifikaciju)
mali „mrtvi“ volumen (što znači minimalno širenje kromatografske krivulje)
dizajn protočnih ćelija detektora koje će sprječavati ponovno miješanje razdvojenih analita
neosjetljivost na promjenu vrste otapala, protoka i temperature
da se njima jednostavno i pouzdano rukuje
podesivi tako da se mogu optimirati za različite spojeve
nedestruktivni obzirom na uzorak
DETEKTORI
• univerzalni HPLC detektor, a princip mu se temelji na mjerenju refrakcijskih indeksa otopina
koje prolaze kroz ćeliju
• što je veća razlika refrakcijskog indeksa između pokretne faze i uzorka, tim je veća
osjetljivost detektora.
• problem nastaje kod vrlo složenih uzoraka jer se često dešava da neki od analita imaju isti
indeks refrakcije kao i pokretna faza, pa te komponente postaju nevidljive za detektor
• kod ovih detektora predstavlja veliki problem rad s gradijentom pokretne faze, jer svaka
promjena u sastavu pokretne faze zahtjeva ponovno uravnoteženje detektora
• danas postoje dvije vrste RI detektora, i obje vrste zahtijevaju dvostruke ćelije, gdje kroz
jednu prolazi uzorak, a kroz drugu konstantno za usporedbu prolazi pokretna faza bez
uzorka.
• jedna vrsta RI detektora se naziva deflekcijskim detektorima (slika a), kojima ne smetaju
nečistoće i zrak u uzorku i pokretnoj fazi i mogu pokriti cijelo refrakcijsko područje od 1.000
do 1.750 s jednom ćelijom, no imaju malu osjetljivost
• druga vrsta RI detektora (slika b) su reflektivni detektori koji se temelje na Frensel principu i
u pravilu su vrlo rijetko u uporabi iako imaju visoku osjetljivost i kod viših koncentracija
uzoraka, te dobro rade i kod vrlo malih protoka pokretne faze. Glavni nedostatak im je česta
promjena prizmi.
• općenito RI detektori osjetljivi su na promjene koncentracije od 1 ppm, a na pomak bazne
linije značajno utječe promjena sastava pokretne faze, nepravilno miješanje, kao i promjena
temperature i tlaka
• preporuča se termostatiranje detektora
Refrakcijski detektor (RI)
a) Deflekcijski RI detektor
b) Refleksijski Fresnelov RI detektor
a) b)
svojstva: univerzalnost, jednostavnost, selektivnost, osjetljivost
vrlo su rašireni
načelo: apsorpcija elektromagnetskog zračenja u UV-(170 - 400 nm) i
VIS-području (400 - 750 nm)
Lambert-Beerov zakon (za kvantitativnu primjenu):
A = Ɛ × b × c
tipični UV/VIS-detektor: volumen 1-10 μl, duljina 2-10 mm,
tlak < 40 bar (potrebni reduktori)
UV/VIS-apsorpcijski detektori
s fiksnom valnom duljinom s promjenjivom valnom duljinom
Detektori s filterima
Izvor zračenja: Hg-lučnica iz koje filtar izdvaja λ = 254 nm (odnosno
250, 313, 334 nm) - primjena ograničena
Izvor zračenja: deuterijeva (D2) ili volframova (W) lampa s više filtera
(rotirajući) - za serijske analize uzoraka poznata sastava
Detektori s monokromatorima
Prizme ili optičke rešetke razdvajaju polikromatsko svjetlo na
komponente određenih valnih duljina koje se potom djelovanjem
pukotine odaberu prema uzorku da bi se snimio cijeli kromatogram
Alternativa: za svaku komponentu uzorka (ako su dovoljne razlike tR)
odabire se najpogodnija λ, uz moguću kompjutorsku podršku
izvor D2-lučnica (190-800 nm), uz izdvajanje putem rešetke snopova
širokih 2-4 nm (starije naprave 20-40 nm)
Detektor s nizom dioda
Načelo: osvjetljivanje uzorka polikromatskim svjetlom (“bijelim”) D2-
lučnice, a potom disperzija optičkom rešetkom na snopove 2 nm koji
istodobno padaju na niz od cca 316 dioda
cijeli snimak (scan): 0,1 sekunda (u praksi nekoliko sekundi) uz odličnu
reproducibilnost
dobiva se i pohranjuje cijeli spektar svake komponente
Fluorescencijski detektori
fluorescencija – neke tvari apsorbiraju elektromagnetsko zračenje i pri
relaksaciji (prelazak iz pobuđenog u osnovno stanje) emitiraju zračenje
više valne duljine λ (često u vidljivom dijelu spektra, VIS)
ograničeno na fluorescirajuće spojeve (farmacija, prirodni i klinički
spojevi,naftni derivati); moguća je pretvorba nefluorescirajućih u
fluorescirajuće spojeve!
izvori elektromagnetskog zračenja:
(1) Hg-lučnica (emitirano svjetlo izolira se s filtera)
(2) Xe-izvor (monokromatori su optičke rešetke)
emitirana svjetlost širi se u svim smjerovima pa je fotoelektrični
detektor pod 900 prema λ upadne zrake
Elektrokemijski detektori
npr. polarografski- komponente koje se mogu oksidirati ili reducirati;
potencijal DME se dovodi na vrijednost granične id svih komponenata i
registrira se I=f(t)
konduktometrijski – komponente koje se analiziraju mijenjaju
električnu provodnost pokretne faze
• podjela prema načinu ionizacije uzorka:
• ionizacija elektroraspršenjem (ESI)1,
• kemijska ionizacija pri atmosferskom tlaku (APCI)2,
• fotoionizacija pri atmosferskom tlaku (APPI)3
• kod LC/MS sustava kao analizatori masa mogu se koristiti:
• kvadrupolni analizator koji se sastoji od četiri štapa pod elektromagnetskim poljem (Q)4,
• analizator koji “zarobi” ion u šupljini ili ionska klopka (IT) ili linearna ionska klopka (LIT) 5,
• analizatori koji mjere vrijeme preleta iona kroz cijev nakon pobude elektrostatskom silom (TOF)6
• analizatori gdje ioni ulaze u ciklotron te nakon elektromagnetske pobude ovisno o masi izlaze iz komore do detektora (FT-ICR)7
• te njihove kombinacije (hibridni sustavi – različiti analizatori masa vezani u seriju) koje se mogu vezati jedna na drugu (ESI-MS/MS, Q-TOF, TOF-MS, IT-MS/MS, LIT-FT-ICR)
• ioni nakon analizatora masa dolaze na detektor, a u LC/MS sustavu kao detektori se koriste elektronsko pojačalo i mikrokanalna ploča
1 engl. Electrospray Ionization (ESI)
2 engl. Atmospheric Pressure Chemical Ionizatio (APCI)
3 engl. Atmospheric Pressure PhotoIonization (APPI)
4 engl. Quadrupole (Q)
5 engl. Ion Trap (IT)
6 engl. Time-of-Flight (TOF)
7 engl. Fourier Transform-Ion Cyclotron Resonance (FT-ICR)
Detektori spektrometra masa
Vrste različitih LC/MS ionizacijskih tehnika i njihova primjena
LC/MS ionizacijska tehnika Primjena
ESI
-za određivanje molekularne mase
i strukture spojeva velikih ionskih
molekula kao što su proteini,
peptidi i oligonukleotidi, no može
se primjeniti i za manje molekule
-ionizacija može dati i pozitivne i
negativne ione [ESI(+) i (-)]
APCI
-za određivanje molekularne mase
i strukture molekula <2000,
spojevi mogu biti i polarni i
nepolarni
-ionizacija može dati i pozitivne i
negativne ione [APCI(+) i (-)]
APPI
-za određivanje molekularne mase
manje polarnih spojeva
-ionizacija može dati i pozitivne i
negativne ione [APPI(+) i (-)]
Maseni analizatori u LC/MS sustavima
Maseni analizatori Karakteristike analizatora
Q
-lagan za rukovanje
-niske cijene
-visoke osjetljivosti kod analize izabranog
iona (SIM mode)
-izvrstan za kvantifikaciju
-nedostatak mu je što se ne mogu dobiti
točne mase
-manje brzine skeniranja ili snimanja od
TOF
IT
-mogućnost brzog skeniranja
-dobra rezolucija
-dobro definirani putovi fragmentacije
iona uz detaljnu interpretaciju
-nema informaciju o točnoj masi
-veće osjetljivosti od QQQ, ali manje
fragmentacije od QQQ
TOF
-dobiva se točna informacija o masi iona
-visoke rezolucije
-brzo skeniranje i dobra osjetljivost
skeniranja
-nema mogućnosti vezanja u MS/MS
sustav bez uporabe CID moda
FT-ICR
-može se vezati u više stupnjeva kao
MS/MS bez dodatnog masenog
analizatora, kao i IT
-pokriva širok spektar masa uz izvrsnu
rezoluciju
-najskuplji je od svih masenih analizatora
Izbor LC detektora prema njihovim karakteristikama
Detektor Osjetljivost Selektivnost Prednosti Primjena
UV/Vid + -
Niski troškovi
univerzalan
Organske kiseline,
masnoće nakon
derivatizacije,
anorganski ioni
UV/DAD + +
Mogućnost određivanja
čistoće kromatografske
krivulje
Antioksidansi,
konzervansi, mirisi,
boje, antiparazitici,
lijekovi, mikotoksini,
pesticidi, vitamini,
amini nakon
derivatizacije
FLD ++ +
Visoka osjetljivost Umjetna sladila,
mikotoksini, vitamini,
karbamati, glifosati
Elektrokemijski ++ + Visoka osjetljivost Vitamini, anorganski
ioni
MS scan - ++ Određivanje strukture
spojeva
Karbamati, lipidi
MS SIM ++ ++ Visoka osjetljivost Pesticidi, proteini
RI - - Univerzalan Ugljikohidrati,
nearomatske kiseline
omogućuje kvalitativno i kvantitativno određivanje kationa i aniona
odnosno iona ili nabijenih molekula
primjenom različitih ionsko izmjenjivačkih smola i eluensa ioni se
različito raspoređuju na ionsko izmjenjivačkoj smoli, a separacijskom
elucijom dolazi do odvojenog eluiranja ispitivanih iona
separacija se uglavnom temelji na razlici u afinitetu sastojaka uzorka
prema ionskoj izmjeni
nepokretna faza ima ionske funkcionalne grupe koje reagiraju s ionima
iz analizirane smjese suprotnog naboja
na osnovu toga metoda se dijeli na:
kromatografiju kationske izmjene – nepokretna faza ima
negativno nabijene funkcionalne grupe
kromatografiju anionske izmjene – nepokretna faza ima
pozitivno nabijene funkcionalne grupe
najčešće konduktometrijskom detekcijom mjerena vodljivost
omogućuje i kvantifikaciju pojedinih eluiranih iona
IONSKA KROMATOGRAFIJA (IONO-IZMJENJIVAČKA KROMATOGRAFIJA
Anionski izmjenjivač Funkcionalna skupina
Dietilaminoetil (DEAE) -O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2
Kvaterni aminoetil (QAE) -O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CHOH-CH3
Kvaterni amonij (Q) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3
Kationski izmjenjivač
Karboksimetil (CM) -O-CH2-COO-
Sulfopropil (SP) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3-
Metilsulfonat (S) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2SO3-
Funkcionalne skupine u ionskoj kromatografiji
nepokretna faza neki ionski izmjenjivač (umreženi sintetski polimeri koji
mogu izmjenjivati ione)
sastojci smjese moraju također biti sposobni da izmjenjuju ione,
odvajaju se na temelju svog različitog afiniteta prema ionsko-
izmjenjivačkoj nepokretnoj fazi
za svaki ion, proces je karakteriziran odgovarajućom ionsko-
izmjenjivačkom ravnotežom, koja određuje raspodjelu između pokretne
i nepokretne faze
za npr. anion A-
E-nepok + A-
pok A-nepok + E-
pok
pokretna faza je puferska otopina kojoj se sastav može kontinuirano
mijenjati (gradijentna analiza)
prikladna za spojeve s ioniziranim grupama (aminokiseline, nukleinska
kiselina)
nepok
-E x pok
-A
pok
-E x nepok
-A
AK
kao nepokretna faza služi mikroporozni neionski prirodni ili sintetski
polimer
u njegove pore mogu potpuno ili djelomično ući samo molekule manje
od neke određene veličine dok se veće molekule ne zadržavaju
sastojci se redom eluiraju iz kolone već prema veličini svojih molekula
pokretna faza je umreženi polimer
primjena u čišćenju i izolaciji supstancija iz prirodnih tvari, određivanje
raspodjele relativnih molekulskih težina prirodnih i sintetskih polimera
izraz kromatografija isključenjem po veličini također se može koristiti
kada je odvajanje temeljeno na veličini molekula
izrazi gel-filtracijska i gel-propusna kromatografija (GPC) su korišteni
za opis procesa kada je nepokretna faza nabubreni gel
izraz kromatografija isključenjem molekula specifično se koristi za
odvajanje iona u vodenoj fazi
KROMATOGRAFIJA NA GELU ILI KROMATOGRAFIJA ISKLJUČENJEM
Tiselius – začetnik kolonske kromatografije 1952.
a) punjene kolone
materijal: čelik, staklo, teflon
duljina: 2-3 m, unutarnji promjer: 2-4 mm
punjenje: čvrsti nosač (obično dijatomejska zemlja) na kojem je
nanesen tanki sloj nepokretne (tekuće) faze
b) kapilarne kolone
materijal: danas uglavnom kvarcno staklo
duljina: 10-100 m, unutarnji promjer: 0.1 - 0.5 mm
punjenje: unutarnje stjenke prevučene samo slojem tekuće
nepokretne faze ili nosačem na kojem se nalazi adsorbirana
nepokretna faza
KOLONSKA KROMATOGRAFIJA
plošna kromatografska metoda
za njeno razvijanje zaslužni Martin i R.L.M. Synge
nepokretna faza list ili traka kromatografskog papira, a pokretna faza je tekućina
uzorak se stavlja na papir u blizini njegova ruba i taj se rub papira uroni u
tekućinu (pokretnu fazu)
prolaskom tekućine kroz papir putuju zbog kapilarnih sila i razdvajaju se i
sastojci ispitivanog uzorka
prednosti: jednostavnost izvođenja, jednostavna i jeftina aparatura, velika moć
razdvajanja, laka detekcija i mala količina uzorka potrebna za analizu
nedostatak: manje pogodna za kvantitativna određivanja i za preparativne svrhe
kromatografski papir skoro je čista celuloza s vrlo malo nečistoća i mora:
imati određenu debljinu i poroznost i plošnu masu (g/m2)
biti jednolične strukture i debljine
omogućavati kapilarno širenje tekućine određenom brzinom
kao pokretna faza upotrebljavaju se različita organska otapala često u smjesi s
vodom, kiselinom ili lužinom, moraju biti vrlo čista (pro chromatographia)
prolaskom pokretne faze kroz područje papira na kojem se nalazi ispitivana tvar
raspodijelit će se ta tvar između dviju faza tj. između otapala i papira
kao aparatura služe stakleni cilindri ili komore različitih izvedbi koje se mogu
hermetički zatvoriti
PAPIRNA KROMATOGRAFIJA
Primjena papirne kromatografije:
identifikacija supstancija
ispitivanje čistoće tvari
Osobine papirne kromatografije:
relativno brza metoda
potrebna mala količina materijala
plošna kromatografska metoda, vrlo slična papirnoj
nepokretna faza tanki sloj finozrnatog (praškastog) materijala koji ima
svojstvo sorpcije
prednosti isti kao kod papirne, no tu je i vrijeme razvijanja kraće,
razdvajanje oštrije, veća je mogućnost detekcije, a zbog mogućnosti
upotrebe različitih materijala za tanki sloj postoji veći izbor povoljnih
uvjeta za razdvajanje različitih vrsta spojeva
kao tanki slojevi primjenjuju se različiti sorbensi
anorganski ( silikagel, aluminijev-oksid, dijatomejska zemlja )
organski ( celuloza, poliamidi, smole za izmjenu iona)
sorbensi su karakterizirani svojom strukturom, veličinom čestica,
stupnjem čvrstoće i prisutnim vezivom
mehanizam je najčešće adsorpcijski, no može biti i razdjelnim
ionskoizmjenjivački ili mehanizam na principu molekularnih sila
prilikom priprave tankog sloja treba najprije pripraviti suspenziju
sorbensa u vodi ili nekom organskom otapalu
suspenzija homogenizirana mućkanjem nanosi se na ploče koje služe
kao nosioci (podloge) sloja sorbensa, ploče su staklene potpuno čiste
danas se najčešće kupuju gotove kromatografske podloge
TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA
kapilarnost - kapilarni protok fenomen je koji se javlja uglavnom u
plošnoj kromatografiji kao glavna vučna sila
neželjena posljedica kapilarnoga protoka je smanjenje brzine
pokretne faze s povećanjem puta otapala, što utječe na vrijeme
separacije i smanjenje razlučivosti
Za praktičnu izvedbu kromatografskoga postupka potrebna je sljedeća oprema:
kromatografske ploče,
uređaj za nanošenje uzorka na kromatografsku podlogu,
UV-lampa za tankoslojnu kromatografiju,
komore za razvijanje kromatograma,
prskalice za vizualizaciju kromatograma,
sušilo,
termostatirani sušionik ili topla ploča s regulatorom temperature,
instrument za kvantifikaciju.
nanošenje uzorka na tanki sloj može biti u obliku točke ili u obliku linije
(vrpce)
Otapalo za uzorak:
uzorak mora biti dobro topljiv
male viskoznosti
lako hlapljivo nakon nanašanja
treba imati moć prodiranja u sloj sorbensa (zbog boljeg raspoređivanja uzorka)
ne bi smjelo biti kromatografski pogodno za taj uzorak (RF < 0,1)
prva je detekcija obično vizualna: promatranje kromatograma uz
obično svjetlo ili pod UV-lampom
pored vizualnog detektiranja mrlje se na kromatogramu mogu
detektirati i instrumentima
neki od načina vizualizacije:
djelovanjem reagensa na razdvojeni spoj u mrlji pojavljuje se novi,
obojeni spoj ili spoj koji fluorescira djelovanjem UV-zračenja
primjenom indikatora koji mijenja boju u prisutnosti ispitivanog
spoja, odnosno postaje fluorescentan ili gubi fluorescenciju
djelovanjem topline ili svjetla razdvojeni spoj daje karakteristično
obojenje ili fluorescira pod UV-zračenjem
primjenjuje se za analizu višekomponentnih plinskih i organskih
smjesa
pokretna faza je u plinovitom stanju, a nepokretna u čvrstom ili
tekućem
ako se odjeljivanje provodi pomoću krutog adsorbensa postupak se
naziva plinska adsorpcijska kromatografija
ako se primjeni tekući adsorbens govori se o plinsko-tekućinskoj
razdjelnoj kromatografiji
plinsku kromatografiju možemo primijeniti za odjeljivanje i analizu
svake smjese u kojoj pojedine komponente smjese imaju kod radne
temperature od -70oC do +400oC napon para veći od 133,322 Pa
mogu se analizirati i čvrste tvari koje se razgrađuju pa se ispitivanje
njihovih hlapivih produkata provodi tako da ona služi kao nepokretna
faza, taj tip kromatografije se naziva «obratna kromatografija»
PLINSKA KROMATOGRAFIJA
Pokretna faza:
inertni plin koji eluira komponente smjese u koloni napunjenoj
nepokretnom fazom
za razliku od tekućinske kromatografije u plinskoj kromatografiji analit
ne reagira s pokretnom fazom te zbog toga njegova brzina kretanja
kroz kolonu ne ovisi o kemijskoj strukturi pokretne faze
Nepokretna faza:
za odjeljivanje komponenti male molekulske mase: stacionarna faza je čvrsta tvar velike specifične površine na koju se adsorbiraju analizirane komponente = plinska adsorpcijska kromatografija
za odjeljivanje komponenti velike molekulske mase: stacionarna faza je tekuća faza nanesena na površinu čvrstog nosača adsorpcijom ili kemijskim vezanjem = plinsko-tekućinskoj razdjelnoj kromatografiji
Nepokretna faza max temp., °C primjena
polidimetilsiloksan 350 Nepolarna faza općenite
namjene: ugljikovodici,
polinuklearni aromati
5% fenilpolidimetilsiloksan 350 Metilni esteri masnih
kiselina; alkaloidi, droge;
halogeni spojevi
50% fenilpolidimetilsiloksan
250 Droge; steroidi; pesticidi;
glikoli
50% trifluoropropilpolidimetilsiloksan
200 Klorirani aromati;
nitroaromati; alkil-
supstituirani benzeni
polietilenglikol 250 Slobodne kiseline; alkoholi;
eteri; esencijalna ulja;
glikoli
50% cijanpropilpolidimetilsiloksan 240 Nezasićene masne
kiseline; kisele smole;
slobodne kiseline; alkoholi
Nekoliko uobičajenih nepokretnih faza za plinsko-tekućinsku
kromatografiju
razdvajanje smjese koja mora biti u plinovitom stanju izvodi se u
kromatografskoj koloni različitom adsorpcijom pojedinih sastojaka na
krutom adsorbensu ili selektivnim otapanjem u tekućini
pri postupku eluiranja određena količina ispitivane smjese se unosi
strujom inertnog plina (plin nosioc) u kromatografsku kolonu
prolaženjem kroz kolonu smjesa se razdvaja između nepokretne faze
i struje plina nosioca
sastojci smjese po izlasku iz kolone pomiješani su samo s plinom
nosiocem
ako je razlika u adsorpciji pojedinih komponenata dovoljno velika
onda je i brzina putovanja toliko različita da se u koloni stvaraju
odvojeni slojevi sastojaka (odvojeni čistim plinom nosiocem) ili vrpce
odijeljeni sastojci smjese nakon izlaska iz kolone određuju se u
uređaju koji registrira prisutnost izeluiranog sastojka u struji plina
nosioca kao funkciju vremena (detektor)
odziv detektora registrira se kao kromatogram
primjena metode unutarnjeg standarda!
Shema plinskog kromatografa
regulator protoka
plina nosioca
uzorak
sustav za uštrcavanje
uzorka
signal procesor
detektor
termostat
kromatografska kolona boca s plinom nosiocem
osnovni dijelovi uloga
boca za komprimirane plinove izvor plina nosioca
sustav za uštrcavanje uzorka za unošenje uzorka u kolonu
kromatografska kolona za razdvajanje komponenata
ispitivane smjese
termostat za održavanje konstantne
temperature (sobne < T < 400°C)
detektor detektira komponente smjese istim
redoslijedom kako one napuštaju
kolonu
pisač ili kompjuter za dobivanje trajnog dokumenta o
pojavljivanju svake komponenti iz
ispitivane smjese
mora biti inertan prema punilu u koloni i prema analiziranom uzorku
viskoznost plina ne smije biti prevelika zbog povećanog tlaka u koloni i
povećane molekulske difuzije
izbor plina ovisi o načinu detekcije
ako je detektor na osnovu plinske vodljivosti, plin mora imati različitu
toplinsku vodljivost od sastojaka; koriste se H2 ili He
za ostale načine detekcije sastojaka koriste se N2 , Ar , CO2
PLIN NOSILAC
treba brzo unijeti malu količinu uzorka (do 20 L), kako bi se smanjilo
širenje zone eluiranog sastojka
tekući uzorci se unose najčešće kroz gumenu ili silikonsku membranu
(septum) u zagrijani dio uređaja smješten na vrhu kolone pomoću
mikrolitarske štrcaljke
mjesto unosa uzorka uglavnom je zagrijano 50°C iznad temperature
vrelišta najmanje hlapljivog sastojka kako bi uzorak tijekom unošenja
trenutno ispario
plinoviti uzorci se unose pomoću plinskih (dozirnih) ventila
čvrste uzorke unosimo nakon otapanja
SUSTAV ZA UŠTRCAVANJE UZORKA
u obliku spirale, kruga, ili slova U
punjene kolone su duljine 2-3 m, unutarnjeg promjera 2-4 nm; savijene u svitak
promjera cca 15 cm
punjene su metalne, staklene ili teflonske cijevi ispunjene odgovarajućim
selektivnim adsorbensom (silikagel, zeolit, Al-oksid, aktivni ugljen, …) ili čvrstim
nosačem (diatomejska zemlja) na koji je nanesen tanki sloj nepokretne tekuće
faze
kapilarne kolone mogu biti duljine i do 2000 m, unutarnjeg promjera do 0,3 mm
(svjetski rekord za duljinu kapilarne kolone 1987.godine)
kapilarne kolone su u početku bile isto od metala ili teflona, ali danas se
preferiraju one od izvučenog kvarca
razdvajanje ovisi o dužini i širini kolone (što je kolona duža to je razdvajanje
bolje)
kolona je uvijek termostatirana jer temperatura u njoj mora biti stalna i dovoljno
visoka kako bi odjeljivane komponenate imale potreban napon para
Kod plinske kromatografije vrlo je bitna temperatura te temperaturno
programiranje koje ovisi o ispitivanoj smjesi
KOLONE
kapilarne ili punjenje
uređaji za indikaciju i mjerenje odvojenih frakcija u plinskom
kromatografu
može služiti svaki uređaj koji na osnovu nekog fizikalnog ili kemijskog
svojstva analita registrira njegovu prisutnost u plinu nosiocu
komponente analiziranog uzorka određuju se odmah po izlasku iz
kolone, mjeri se promjena koncentracije komponenata u plinu kao
funkcija vremena eluiranja
poželjna svojstva detektora:
treba biti što osjetljiviji na sve plinove i pare
stabilan prema promjenama p, T i protoka plina nosioca
mora imati brz odziv
jednolik odziv za mnoge kemijske spojeve ili bar predvidljiv i selektivan odziv za jednu
vrstu ili više spojeva
linearno reagirati na promjenu koncentracije sastojaka u plinu nosiocu
stabilnost detektora se očituje na osnovnoj liniji (signal dobiven u
prisutnosti čistog plina nosioca) koja ne smije pokazivati porast ili
oscilacije uz konstantne uvjete rada
možemo ih podijeliti s obzirom na selektivnost prema određenom tipu
spojeva na univerzalne ili neselektivne i selektivne
DETEKTORI
detektor toplinske vodljivosti (katarometar)
neselektivan, izdržljiv u radu, jednostavne izvedbe i niske cijene
temelji se na promjenama toplinske vodljivosti struje plina nosioca koja nastaje
zbog prisutnosti analita
osjetljivost ovisi o razlici toplinske vodljivosti analita i plina nosioca
sastoje se od dva žarena žičana otpornika, niti (platina ili volfram) pod strujom
stalne jakosti smještene u ćelijama kroz koje protječe plin konstantnog protoka
niti ćelije spojene su u Wheatstoneov most
kroz dvije ćelije, smještene u mostu dijagonalno, protječe čisti plin nosioc
(referentna ćelija), a kroz druge dvije plin iz kromatografske kolone (mjerna
ćelija)
kada kroz sve četiri ćelije prolazi samo plin nosioc, most je u ravnoteži; ulaskom
jednog od analita u ćeliju ravnoteža se poremeti = dobiveni signal se registrira
temperatura i otpor užarene žice ovise o toplinskoj vodljivosti okolnog plina
osjetljivost 10-8 g/mL
osjetljivost detektora na toplinsku vodljivost može se povećati upotrebom
poluvodiča
stabilan prema promjenama protoka i temperaturi
osjetljivost 10-15 g/mL
veliko područje linearnosti odziva
detektor se sastoji od malog plamenika u kojem izgara vodik
radi na principu ionizacije u vodikovom plamenu
efluent s kolone miješa se s vodikom i zrakom i spaljuje
organski sastojci sagorijevaju u plamenu stvarajući ione i elektrone koji mogu
provoditi elektricitet kroz plamen
na vrh plamenika dovodi se visoki električni potencijal, a iznad plamena postavljena
je kolektorska elektroda
mjeri se električna struja izazvana pirolizom organskih sastojaka
plameno-ionizacijski detektor osjetljiv je samo na
spojeve koji imaju organski vezani C, dok na ostale
spojeve nije osjetljiv
zato se smatra selektivnim detektorom (osjetljiv je
samo na određenu vrstu spojeva)
zbog toga se može izravno koristiti za određivanje
onečišćenja zraka organskim tvarima
plameno-ionizacijski detektor
plin prelazi preko beta emitera (radioaktivni spoj koji emitira elektrone)
kao što je 63Ni ili tricij adsorbiran na platinskoj ili titanovoj foliji
emitirani elektroni ioniziraju plin nosioc (često N2), čime nastaje snop
elektrona
kad u plinu nosiocu nisu prisutni organski spojevi, između elektroda se
pojavljuje stalna struja koja rezultira iz spomenute ionizacije
odziv detektora apsorpcije elektrona selektivan je i osjetljiv na
elektronegativne funkcionalne skupine kao što su halogeni, peroksidi,
kinoni i nitro skupine
neosjetljiv je na amine, alkohole i ugljikovodike
pogodan je za detekciju i kvantitativno
određivanje kloriranih pesticida
ne razara uzorak (za razliku od
plamenoionizacijskog detektora)
detektor apsorpcije elektrona
Preporučena literatura
1. M. Kaštelan-Macan, Kemijska analiza u sustavu
kvalitete, Školska knjiga, Zagreb 2003.
2. M. Kaštelan-Macan, M. Medić-Šarić, S. Turina, Plošna
kromatografija, Farmaceutsko-biokemijski fakultet
Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, 2006.
3. D. Skoog, D. A. West, F. J. Holler, Osnove analitičke
kemije, Školska knjiga, Zagreb 1999.