8. vaja#– imunološke#metode#–določanje#...
TRANSCRIPT
8. vaja – Imunološke metode – določanje govejih IgG v siru
Matevž Korenč
Pro;telesa
=
Imunoglobulin G (IgG), kot bi ga videli pod elektronskim mikroskopom.
Kvartarna struktura imunoglobulina G (IgG), s poudarjenimi terciarnimi strukturami.
Pro@telo (IgG) z obarvanimi verigami; modro in rdeče težki verigi, rumeno in zeleno lahki verigi
Vezavno mesto za an;gen
Vezavno mesto za an;gen Pro;telesa
• so glikoproteini iz naddružine imunoglobulinov • fragmenta Fab in Fc sestavljajo pro@telo oblike črke Y • sestavljeni iz dveh iden@čnih težkih (modrih) in dveh iden@čnih lahkih (rdečih) verig • disulfidne vezi med težko in lahko verigo in dvema težkima verigama (označene z rumeno) • Klasično pro@telo tvorijo ponavljajoče se imunoglobulinske domene, vsaka domena (na sliki označena kot kvadratek) ima značilno imunoglobulinsko zvitje
• konstantne (CH1, CH2, CH3, CL) in variabilne (VH, VL) domene • variabilni domeni težke in lahke verige (VH in VL) z šes@mi hipervariabilnimi zankami tvorita vbočeno vezavno mesto za an;gen
Shematski prikaz strukture pro@telesa IgG s težko in lahko verigo.
Fab= (angl. fragment an@gen binding) Fc= (angl. fragment cristallizable) C = (angl. constant (domain)) V= (angl.variable (domain)) H 1,2,3 = (angl. heavy (chain)) L = (angl.light (chain)) Primer: VH = variabilna domena težke verige CL= konstantna domena lahke verige
Pro;telesa Nastanejo kot odziv na prisotnost tuje snovi – an;gena
An;gen je lahko: • protein • polisaharid • nukleinske kisline • lipidi • druge molekule Mesto na an;genu, kamor se veže pro@telo = epitop Velike molekule imajo več različnih epitopov.
hVp://student.ccbcmd.edu/courses/bio141/lecguide/unit4/an@gens/u3fg9a.html
Za pro@telesa je značilno, da se z veliko afiniteto vežejo samo na @ste an@gene, pro@ katerim so bila ustvarjena, se pravi da je vezava STROGO SPECIFIČNA!
Mesto na pro;telesu, kamor se veže epitop = paratop
paratop
Monoklonska in poliklonska pro;telesa Pro@telesa se site@zirajo v limfoci;h, ki so celice imunskega sistema. Vsak limfocit je zmožen izdelova@ le eno vrsto pro@teles in vsako prepoznava le eno an@gensko determinanto. Taka pro@telesa imenujemo monoklonska pro;telesa (pridobljena iz ene celične linije). Z imunizacijo živali pa lahko dobimo poliklonski an;serum. Pro@telesa nastala pro@ enemu an@genu, s katerim smo imunizirali žival, so produk@ različnih limfocitov B in posledično reagirajo z različnimi epitopi tega an@gena. Pro@telesa se razlikujejo po specifičnos@ in afinite@ vezave na epitop. Pri uporabi poliklonskih pro;teles lahko nastanejo številne težave (na primer nastanek navzkrižnih reakcij), zato se v raziskavah pogosteje uporabljajo monoklonska pro;telesa
hVp://qwikstep.eu/search/monoclonal-‐polyclonal-‐[email protected]
Shema pridobivanja nesmrtnih celičnih linij limfocitov in monoklonskih pro@teles
Detekcija proteinov s pro;telesi
hVp://qwikstep.eu/search/monoclonal-‐polyclonal-‐[email protected]
Izhajamo iz dejstva, da se pro@telesa specifično vežejo na točno določen an@gen
Pro@telesa uporabljamo pri tehnikah: • prenos western • afinitetna kromatografija • točkovni prenos / črtovni prenos • flurescenčna mikroskopija • ELISA
Membrane za imobilizacijo proteinov
Nitrocelulozna (NC) in polivinilidendifluoridna (PVDF) membrana • visoka nespecifična afiniteta do aminokislin • nastanejo močne hidrofobne interakcije, ki držijo proteine na membrani hVp://en.wikipedia.org/wiki/File:Nitrocellulose-‐2D-‐skeletal.png
nitrocelulozna
polivinilidendifluorid Površina PVDF membrane pod elektronskim mikroskopom
hVp://en.wikipedia.org/wiki/Polyvinyl_fluoride
Prenos western (angl. Western bloeng)
hVp://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot
• Pro@telesa so prevelika, da bi po ločbi proteinov na PAGE prodrla v poliakrilamidni gel, zato proteine s pomočjo električnega toka najprej prenesemo na membrano (nitrocelulozno (NC) ali polivinilidendifluoridno (PVDF)).
• Nega@vno nabi@ proteini bodo potovali pro; pozi;vni anodi. • Primerno za prenos proteinov na membrano po na@vni ali NaDS – PAGE. • Proteini vezani na membrano so primerni za nadaljnje analize (npr. detekcija s pro@telesi).
• Glej animacijo: hVp://www.youtube.com/watch?v=aGu-‐NKvKIoA
Western prenos (detekcija s pro@telesi)
• po elektroforeznem prenosu vsa nezasedena mesta na membrani blokiramo (blocking buffer) s proteini, na katere se pro@telo ne bo vezalo. S tem preprečimo nespecifično vezavo pro;telesa na membrano, za blokacijo največkrat uporabimo protein BSA ali pa kazein • speremo nevezane proteine in dodamo primarna pro;telesa, ki se bodo specifično vezala na točno določen an@gen • speremo nevezana primarna pro@telesa in dodamo sekundarna pro;telesa, ki se specifično vežejo samo na Fc regijo primarnih pro;teles. Najpogosteje je na sekundarna pro@telesa kovalentno vezan encim, ki ob inkubaciji membrane v razstopini brezbarvnega kromogenega substrata nastane na mestu vezave sekundarnih pro@teles obarvan produkt • Glej animacijo: hVp://www.youtube.com/watch?v=aGu-‐NKvKIoA
hVp://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot
Western prenos (detekcija s pro@telesi)
hVp://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/Techniques/TechElectrophoresis.htm
Imunološka detekcija proteinov po elektroforezi
NaDS-‐PAGE
Imunološka detekcija proteinov po NaDS-‐PAGE na nitrocelulozni membrani
hVp://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/Techniques/TechElectrophoresis.htm
Točkovni prenos (angl. dot blot) Soroden prenosu western, le da proteine na membrano nanesemo v obliki točke. Dobimo le kvan@ta@vno informacijo o iskanem an@genu. Prednost metode je hitrost: ni potrebna elektroforezna ločitev in prenos na membrano.
• vzorec nanesemo diretno na membrano • blokriramo nezasedena mesta • detek@ramo s pro@telesi
Močnejša pika pomeni večjo koncentracijo iskanega an@gena
Točkovni prenos (angl. dot blot) Pozi;vna in nega;vna kontrola
Preverimo, če se uporabljena pro@telesa vežejo na naš an@gen in koliko bodo k intenzite@ lise prispevala nespecifično vezana pro@telesa.
Primer uporabe pro;teles v afinitetni kromatografiji
• na agarozni nosilec vežemo protein (streptavidin), ki močno veže molekulo bio@na
• na Fc regiji pro@telesa, kovalentno vežemo molekulo bio@na • preko interakcije streptavidin-‐bio@n imobiliziramo pro@telo na nosilec
• Imobilizirano pro@telo bo specifično vezalo an@gen
• nosilec speremo
• pro@telo z vezanim an@genom eluiramo z visoko koncentracijo bio@na
Fluorescenčna mikroskopija S fulescenčnimi proteini (npr. GFP) konjugirana pro@telesa vezana na an@gene v eukariontski celici.
ELISA (angl. Enzyme-‐linked immunosorbent assay)
indirektna ELISA – določanje pro;teles Na nosilec vezan an@gen, dodamo vzorec s
preiskovanimi pro@telesi.
Indirektna ELISA
hVp://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=12065
ELISA (angl. Enzyme-‐linked immunosorbent assay)
Direktna ali sendvič ELISA – določanje an;genov Na nosilec vezana pro@telesa dodamo vzorec s
preiskovanimi an@geni, speremo nespecifično vezane an@gene, dodamo specifična pro@telesa, ki so označena.
Uporabno za večje molekule, ki imajo dva ločena epitopa, ki
se ne prekrivata.
Direktna ali sendvič ELISA http://blog.leinco.com/wp-content/uploads/2010/06/sandwichELISA.gif