1111 1111

EESTI VABARIIK

PATENDIAMET

ouEE-EP 2 750 707 B1

(51) Int. Cl. A61K 39/39 (2006.0)) A61K 9/127 p006" A6IK 9/00 (2006.0))

EE

-EP

2 75

0 707 B

1

(12) EESTIS KEHTIVA EUROOPA PATENDI PATENDIKIRJELDUSE TÕLGE

(10) Registreeringu number: E016747 (73) Patendiomanik:

(11) Patendikirjelduse tõlke number:

GlaxoSmithKline Biologicals SA Rue de l'Institut 89, 1330 Rixensart, BE

EE-EP 2 750 707 B1

(30) Prioriteediandmed: 31.08.2011 US 201161529878 P (72) Leiutise autorid:

(96) Euroopa patenditaotluse esitamise kuupäev: 31.08.2012

(96) Euroopa patendi- taotluse number:

12769787.8

(97) Euroopa patendi väljaand- m isest teatamise kuupäev: 24.10.2018

(97) Euroopa patendi number: EP 2 750 707

Patendikirjelduse tõlke esitamise kuupäev: 14.01.2019

Patendikirjelduse tõlke avalikustamise kuupäev: 15.03.2019

GEALL, Andrew Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc, IP Services M/s X-100b, 4560 Horton Street, Emeryville, CA 94608-2916, US

VERMA, Ayush Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc, IP Services M/s X-100b, 4560 Horton Street, Emeryville, CA 94608-2916, US

(74) Patendivolinik:

Leevi Markus Patendibürco KkOSAAR Of) T5he 94, 50107 Tartu, EE

(54) Pegüiditud liposoomid immunogeeni kodeeriva RNA manustamiseks

EE-EP 2 750 707 B1

EE – EP2750707 B1

Pegüülitud liposoomid immunogeeni kodeeriva RNA manustamiseks

Leiutiskirjeldus

TEHNIKA VALDKOND

Käesolev leiutis kuulub immuniseerimiseks mõeldud RNA mitteviirusliku

transportimise valdkonda.5

TAUST

Nukleiinhapete transportimine loomade immuniseerimiseks on olnud eesmärgiks

mitu aastat. Katsetatud on mitmesuguseid võtteid, sealhulgas DNA või RNA,

viiruslike või mitteviiruslike transpordivehiikulite (või „puhtas“ vaktsiinis isegi mitte

ühegi transpordivehiikuli), paljunevate või mittepaljunevate vektorite või viirus- või10

mitteviiruslike vektorite kasutamist. Amidi et al., Syst. Synth. Biol. (2011) 5:21–31

on avaldanud antigeeni ekspresseerivad immunostimuleerivad liposoomid, mis on

valmistatud ühendist DSPE-PEG5000. Patendis WO 2011/08974 ja WO

2010/088537 on avaldatud liposoomid, mis hõlmavad RNA-d ja sisaldavad ainet

PEG2000.15

Endiselt on vaja täiendavaid ja täiustatud nukleiinhappe vaktsiine ning täpsemalt

nukleiinhappe vaktsiinide transportimisviise.

LEIUTISE OLEMUS

Leiutise ulatus on määratletud patendinõudlusega. Leiutise kohaselt

immuniseeritakse nukleiinhape liposoomi kapseldatud RNA transportimise teel.20

RNA kodeerib huvipakkuvat immunogeeni. Liposoom sisaldab PEGüülitud lipiidi, st

lipiidi on modifitseeritud polüetüleenglükooli kovalentse sidemega. PEG lisab

liposoomidele katte, mis võib tekitada soodsad farmakokineetilised omadused, nt

võib see suurendada stabiilsust ning takistada liposoomide mittespetsiifilist

adsorptsiooni. Leiutajad on avastanud, et PEG pikkus võib mõjutada kapseldatud25

RNA in vivo ekspressiooni ning seetõttu kasutatakse leiutises liposoome, mis

sisaldavad PEG-d keskmise molekulmassiga rohkem kui 3 kDa, kuid väiksem kui

11 kDa. PEG molekulmassiga väiksem kui 1 kDa (nt 500 või 750 Da) ei moodusta

2 EE – EP2750707 B1

stabiilseid liposoome ning molekulmassiga vahemikus 1–3 kDa PEG-ga valmistatud

liposoomidega on immunogeensuse katsetes täheldatud väiksemat tõhusust (vaata

allpool).

Järelikult on leiutises esitatud liposoom, milles huvipakkuvat immunogeeni kodeeriv

RNA on kapseldatud, kusjuures liposoom hõlmab vähemalt ühte lipiidi, mis sisaldab5

polüetüleenglükooliosa, nii et polüetüleenglükool asub liposoomi välisel osal,

kusjuures polüetüleenglükooli keskmine molekulmass on suurem kui 3 kDa, aga

väiksem kui 11 kDa. Need liposoomid sobivad RNA in vivo transportimiseks

selgroogse rakku ning järelikult on need kasulikud komponendid farmatseutilistes

koostises subjektide immuniseerimiseks mitmesuguste haiguste vastu.10

Avaldatud on protsess RNA-d sisaldava liposoomi valmistamiseks, hõlmates RNA

segamise etappi ühe või mitme lipiidiga nii, et lipiidid moodustavad liposoomi,

millesse RNA on kapseldatud, kusjuures vähemalt üks lipiid sisaldab

polüetüleenglükooliosa, mille asukohaks saab protsessi käigus liposoomi väline

osa, ning kusjuures polüetüleenglükooli keskmine molekulmass on suurem kui15

3 kDa, aga väiksem kui 11 kDa.

Liposoom

Leiutises kasutatakse liposoome, millesse immunogeeni kodeeriv RNA on

kapseldatud. Järelikult on RNA (nagu looduslikus viiruses) igasugusest

väliskeskkonnast eraldatud. Liposoomi kapseldamise puhul on avastatud, et see20

kaitseb RNA-d RNaasiga lagundamise eest. Liposoomid võivad sisaldada osa välist

RNA-d (nt oma pinnal), aga vähemalt pool RNA-st (ja ideaalis kogu RNA) on

liposoomi tuuma kapseldatud. Liposoomidesse kapseldamine erineb näiteks viites

1 avaldatud lipiidi/RNA kompleksidest, milles RNA on kokku segatud eeltöödeldud

liposoomidega.25

Amfifiilsed lipiidid võivad moodustada kaksikkihte veekeskkonnas, et kapseldada

RNA-d sisaldavat veepõhist tuuma liposoomina. Nendel lipiididel on anioonne,

katioonne või tsvitterioonne hüdrofiilne pearühm. Liposoomide moodustamine

anioonsetest fosfolipiididest algas 1960ndatel ning katioonseid liposoome

moodustavaid lipiide on uuritud alates 1990ndatest. Mõned fosfolipiidid on30

3 EE – EP2750707 B1

anioonsed, samas kui teised on tsvitterioonsed ja mõned katioonsed. Fosfolipiidi

sobivate liikide seas on muu hulgas fosfatidüületanoolamiinid, fosfatidüülkoliinid,

fosfatidüülseriinid ja fosfatidüül-glütseroolid ning osa kasulikke fosfolipiide on

loetletud tabelis 1.

Kasulike katioonsete lipiidide seas on muu hulgas5

dioleoüültrimetüülammooniumpropaan (DOTAP), 1,2-distearüüloksü-N,N-dimetüül-

3-aminopropaan (DSDMA), 1,2-dioleüüloksü-N,N-dimetüül-3-aminopropaan

(DODMA), 1,2-dilinoleüüloksü-N,N-dimetüül-3-aminopropaan (DLinDMA), 1,2-

dilinolenüüloksü-N,N-dimetüül-3-aminopropaan (DLenDMA); järgmised kasulikud

katioonsed lipiidid on avaldatud viites 2 ja 3. Tsvitterioonsete lipiidide seas on muu10

hulgas atsüüli tsvitterioonsed lipiidid ja eetri tsvitterioonsed lipiidid. Kasulike

tsvitterioonsete lipiidide näited on DPPC, DSPC, DOPC, dodetsüülfosfokoliin, 1,2-

dioleoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüületanoolamiin (DOPE) ja 1,2-difütanoüül-sn-

glütsero-3-fosfoetanoolamiin (DPyPE). Lipiidid võivad olla küllastunud või

küllastumata. Liposoomide valmistamiseks eelistatakse vähemalt ühe küllastumata15

lipiidi kasutamist. Kui küllastumata lipiidil on kaks saba, võivad mõlemad sabad olla

küllastumata või võib sellel olla üks küllastunud saba ja üks küllastumata saba. Lipiid

võib sisaldada ühes sabas steroidrühma, nt nagu RV05-s.

Järelikult on leiutises ühes teostusviisis esitatud liposoom, millel on veepõhist tuuma

kapseldav lipiidne kaksikkiht, kusjuures: (i) lipiidne kaksikkiht hõlmab20

polüetüleenglükooliosa sisaldavat vähemalt ühte lipiidi, nii et polüetüleenglükool

asub liposoomi välisel osal, kusjuures polüetüleenglükooli keskmine molekulmass

on suurem kui 3 kDa, kuid väiksem kui 11 kDa; ning (ii) veepõhine tuum sisaldab

immunogeeni kodeerivat RNA-d.

Liposoomid võib moodustada ühest lipiidist või lipiidide segust. Segu võib hõlmata25

(i) anioonsete lipiidide segu, (ii) katioonsete lipiidide segu, (iii) tsvitterioonsete

lipiidide segu, (iv) anioonsete lipiidide ja katioonsete lipiidide segu, (v) anioonsete

lipiidide ja tsvitterioonsete lipiidide segu, (vi) tsvitterioonsete lipiidide ja katioonsete

lipiidide segu või (vii) anioonsete lipiidide, katioonsete lipiidide ja tsvitterioonsete

lipiidide segu. Samamoodi võib segu hõlmata nii küllastunud kui ka küllastumata30

lipiide. Näiteks võib segu hõlmata DSPC-d (tsvitterioonne, küllastunud), DlinDMA-d

(katioonne, küllastumata) ja/või DMG-d (anioonne, küllastunud). Kui kasutatakse

4 EE – EP2750707 B1

lipiidide segu, ei pea segu kõik lipiidsed komponendid amfifiilsed olema, nt üks või

mitu amfifiilset lipiidi võib segada kolesterooliga.

Kui leiutise liposoom moodustatakse lipiidide segust, eelistatakse, et siin kirjeldatud

PEGüülitud lipiidide osa oleks väiksem kui 10% lipiidide üldkogusest, nt vahemikus

0,5–5%, vahemikus 1–4% või umbes 2%. Näiteks on kasulikud liposoomid näidatud5

allpool, milles 2% lipiidide üldkogusest on PEGDMG. Ülejäänu võib moodustada nt

kolesterool (nt 35–50% kolesterooli) ja/või katioonne lipiid (nt 30–70%) ja/või DSPC

(nt 5–15%). Taolisi segusid on kasutatud allpool. Need protsentuaalsed väärtused

on mooliprotsendid.

Järelikult saab liposoomi moodustada katioonsest lipiidist (nt DlinDMA-st, RV05-st),10

tsvitterioonsest lipiidist (nt DSPC-st, DPyPE-st), kolesteroolist ning PEGüülitud

lipiidist. Näidetes on kasutatud DSPC, DlinDMA, PEG-DMG ja kolesterooli segu

ning ka mitut teist segu.

Vähemalt üks lipiid liposoomis sisaldab polüetüleenglükooliosa. Neid PEGüülitud

lipiide sisaldavatel liposoomidel on PEG orienteeritud nii, et see esineb vähemalt15

liposoomi välisel osal (kuid osa PEG-d võib ka puutuda kokku liposoomi seesmise

osaga, st veepõhise tuumaga). Taolise orientatsiooni võib saada PEG kinnitamisel

lipiidi sobivale osale. Näiteks amfifiilses lipiidis oleks PEG kinnitatud hüdrofiilsele

peale, kuna just see pea suunab ennast lipiidse kaksikkihi veeosa vastas oleva

välise osa poole. Sel viisil PEGüülimist saab teha PEG kovalentsel sidumisel20

lipiidiga, kasutades nt neid võtteid, nagu on avaldatud viites 1 ja 2.

Järelikult sisaldavad PEG-üülitud lipiidid PEG struktuuri:

milles n tekitab suurema PEG molekulmassi kui 3 kDa, aga väiksema kui 11 kDa,

nt 5 kDa PEGüülimisel 69 või rohkem või vahemikus 70 ja 240 või umbes 113.25

PEG-osa võib lõppeda -O-metüülrühmaga ning järelikult võib PEGüülitud lipiid

hõlmata:

5 EE – EP2750707 B1

Sisaldades lämmastikule kinnitumist lipiidi pearühmas, võib leiutises kasulik

PEGüülitud lipiid järelikult hõlmata:

Üks sobiv PEGüülitud lipiid leiutises kasutamiseks on PEG-DMG, nagu kasutatakse5

näidetes. Kasutada võib teisi PEGüülitud lipiide, nt valemi (X) lipiide:

milles:

[Z]n on hüdrofiilne PEG pearühma komponent, milles polümeer võib olla

lineaarne või hargnenud ning milles polümeer võib olla soovi korral10

asendatud;

Z on polümeriseeritud n allüksusega;

n on polümerisatsiooni arvkeskmistatud väärtus vahemikus 10 ja 200 Z-i

ühikut (ning võib olla optimeeritud erinevatele Z-rühmadele);

L1 on valikuliselt asendatud C1–10alküleen- või C1–10heteroalküleeni linker,15

hõlmates null, üks või kaks eetrit (nt -O-), estrit (nt -C(O)O-), suktsinaati (nt -

O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-)), karbamaati (nt -OC(O)-NR’-), karbonaati

(nt -OC(O)O-), uureat (nt -NRC(O)NR’-), amiini (nt -NR’-), amiidi (nt -

C(O)NR’-), imiini (nt -C(NR’)-), tioeetrit (nt -S-), ksantaati (nt -OC(S)S-) ja

fosfodiestrit (nt -OP(O)2O-), kusjuures R’ valitakse sõltumatult -H, -NH-, -NH2,20

-O-, -S-, fosfaadi või valikuliselt asendatud C1–10alküleeni hulgast;

X1 ja X2 valitakse sõltumatult süsiniku või heteroaatomi hulgast, mis

valitakse -NH-, -O-, -S-i või fosfaadi hulgast;

A1 ja A2 valitakse kumbki sõltumatult C6–30alküüli, C6–30alkenüüli ja

6 EE – EP2750707 B1

C6–30alkünüüli hulgast, kusjuures A1 ja A2 võivad olla samasugused või

erinevad või A1 ja A2 moodustavad koos süsinikuaatomiga, millega need on

ühendatud, valikuliselt asendatud steroidi.

Leiutise liposoom sisaldab tavaliselt suurt hulka PEG osi, mis võivad olla

samasugused või erinevad. PEG keskmine molekulmass leiutise liposoomis on5

suurem kui 3 kDa, aga väiksem kui 11 kDa, nt vahemikus 3,5–9 kDa, vahemikus 4–

7,5 kDa, vahemikus 4,5–6 kDa, vahemikus 4,8–5,5 kDa või 5 kDa. Järelikult võib

PEG olla selline PEG, mis on tavaliselt tuntud kui „PEG 5000“ või „PEG 5k“. Mõnes

teostusviisis ei hõlma leiutis liposoome, mis sisaldavad PEG-konjugeeritud lipiidi,

milles PEG keskmine molekulmass on 8 kDa; mõnes teostusviisis ei hõlma leiutis10

liposoome, mis sisaldava PEG-konjugeeritud lipiidi, milles PEG keskmine

molekulmass on vahemikus 7,9–8,1 kDa.

PEG sisaldab tavaliselt lineaarseid polümeerahelaid, kuid mõnes teostusviisis võib

PEG sisaldada hargnenud polümeerahelaid.

Mõnes teostusviisis võib PEG olla asendatud PEG, nt milles üks või mitu süsiniku15

aatomit polümeeris on asendatud ühe või mitme alküül-, alkoksü-, atsüül- või

arüülrühmaga.

Mõnes teostusviisis võib PEG sisaldada kopolümeeri rühmasid, nt ühte või mitut

propüleeni monomeeri, et PEG polüpropüleeni polümeeri moodustada.

Liposoomid on tavaliselt jagatud kolme rühma: multilamellaarsed vesiikulid (MLV-d);20

väiksed unilamellaarsed vesiikulid (SUV-d); ning suured unilamellaarsed vesiikulid

(LUV-d). MLV-del on mitu kaksikkihti igas vesiikulis, moodustades mitu eraldi

veekambrit. SUV-del ja LUV-del on üks veepõhist tuuma kapseldav kaksikkiht;

SUV-de läbimõõt on tavaliselt ≤ 50 nm ning LUV-de läbimõõt on > 50 nm. Leiutise

liposoomid on ideaaljuhul LUV-d läbimõõduga vahemikus 60–180 nm ning25

soovitatavalt vahemikus 80–160 nm.

Leiutise liposoom võib moodustada osa koostisest, mis sisaldab mitut liposoomi

ning need mitu liposoomi võivad olla erineva läbimõõduga. Erineva läbimõõduga

liposoomide populatsiooni sisaldavas koostises: (i) peaks vähemalt 80%

liposoomide arvust olema läbimõõduga vahemikus 60–180 nm ning soovitatavalt30

7 EE – EP2750707 B1

vahemikus 80–160 nm ja/või (ii) on populatsiooni keskmine läbimõõt (intensiivsuse

järgi, nt Z-keskmine) ideaaljuhul vahemikus 60–180 nm ning soovitatavalt

vahemikus 80–160 nm. Liposoomide kogumis peaksid läbimõõdud olema

ideaaljuhul polüdisperssuse indeksiga < 0,2. Viite 1 liposoomi/RNA komplekside

läbimõõt peaks eeldatavasti olema vahemikus 600–800 nm ning need peaksid5

olema suure polüdisperssusega.

Sobivate liposoomide valmistamise võtted on valdkonnas üldtuntud, vaata nt viiteid

6 kuni 8. Ühte kasulikku meetodit on kirjeldatud viites 9 ning see hõlmab (i) lipiidide

etanoolilahuse, (ii) nukleiinhappe veelahuse ja (iii) puhvri kokkusegamist, millele

järgneb segamine, tasakaalustamine, lahjendamine ja puhastamine. Leiutise10

eelistatud liposoome saab selle segamisprotsessiga. Soovitud läbimõõduga

(läbimõõtudega) liposoomide saamiseks võib segada protsessiga, milles RNA

veelahuse kaks toiteliini kombineeritakse ühes segamisalas lipiidse etanoolilahuse

ühe toiteliiniga ning kõik on sama voolukiirusega, nt allpool kirjeldatud mikrovedeliku

kanalis.15

RNA

Leiutise liposoomid sisaldavad RNA molekuli, mis (vastupidiselt siRNA-le, nagu

viites 4) kodeerib immunogeeni. Pärast osakeste in vivo manustamist vabaneb RNA

osakestest ning transleeritakse rakus, et immunogeeni in situ anda.

RNA on +-ahelaline ning järelikult saavad rakud seda transleerida ilma, et oleks vaja20

vahepealseid replikatsioonietappe, nagu pöördtranskriptsiooni. See võib ka

seonduda immuunrakkude ekspresseeritavate TLR7 retseptoritega, käivitades

seeläbi adjuvandi efekti.

Eelistatud +-ahelalised RNA-d on isepaljunevad. Isepaljunev RNA molekul

(replikon) võib isegi ühegi valguta selgroogse rakku viiduna transkriptsiooni teel25

iseendast valmistada mitu tütar-RNA-d (antisenss-koopiaga, mille see iseendast

loob). Isepaljunev RNA molekul on järelikult tavaliselt +-ahelaline molekul, mida

saab pärast rakku transportimist otse transleerida ning taoline translatsioon annab

RNA-sõltuva RNA polümeraasi, mis seejärel toodab transporditud RNA-st nii

antisenss- kui ka senss-transkripte. Järelikult toob transporditud RNA kaasa mitme30

8 EE – EP2750707 B1

tütar-RNA valmistamise. Neid tütar-RNA-sid ning ka kollineaarseid subgenoomseid

transkripte võib transleerida, et võimaldada kodeeritud immunogeeni in situ

ekspressiooni, või transkribeerida, et anda sama sensiga nagu transporditud RNA-

l veel transkripte, mis transleeritakse immunogeeni in situ ekspressiooni

võimaldamiseks. Transkriptsioonide taolise järjestuse üldine tulemus on lisatud5

replikon-RNA-de arvu tohutu amplifikatsioon ning järelikult muutub kodeeritud

immunogeen rakkude peamiseks polüpeptiidi saaduseks.

Üks sobiv süsteem isepaljunemise tekitamiseks on alfaviirusel põhineva RNA

replikoni kasutamine. Need +-ahelalised replikonid transleeritakse pärast rakku

transportimist, et replikaasi (või replikaasi-transkriptaasi) anda. Replikaas10

transleeritakse polüproteiinina, mis automaatselt lõhustub, et anda

replikatsioonikompleks, mis loob +-ahelalise transporditud RNA

genoomsed --ahelalised koopiad. Need --ahelalised transkriptid võib

transkribeerida, et anda veel +-ahelalise vanem-RNA koopiaid ning samuti

subgenoomse transkripti, mis kodeerib immunogeeni. Subgenoomse transkripti15

translatsioon põhjustab järelikult immunogeeni in situ nakatunud raku

ekspressiooni. Sobivad alfaviiruse replikonid võivad kasutada Sindbisi viiruselt,

Semliki metsa viiruselt, hobuste lääne entsefaliidi viiruselt, Venetsueela hobuste

entsefaliidi viiruselt jne pärit replikaasi. Kasutada võib mutant- või metsiktüüpi

viiruste järjestusi, nt replikonides on kasutatud VEEV nõrgestatud TC83 mutanti20

[10].

Eelistatud isepaljunev RNA molekul kodeerib järelikult (i) RNA-st sõltuvat RNA

polümeraasi, mis võib transkribeerida RNA-d isepaljunevast RNA molekulist, ning

(ii) immunogeeni. Polümeraas võib olla alfaviiruse replikaas, hõlmates nt ühte või

mitut alfaviiruse valku nsP1, nsP2, nsP3 ja nsP4.25

Kuigi looduslikud alfaviiruse genoomid kodeerivad strukturaalseid virioni valke

lisaks mittestrukturaalsele replikaasi polüproteiinile, eelistatakse, et leiutise

isepaljunev RNA molekul ei kodeeriks alfaviiruse strukturaalseid valke. Järelikult

võib eelistatud isepaljunev RNA põhjustada iseenda genoomse RNA koopiate

tootmist rakus, kuid mitte RNA-d sisaldavate virionide tootmist. Nende virionide30

tootmise võimetus tähendab, et vastupidiselt metsiktüüpi alfaviirusele ei suuda

isepaljunev RNA molekul ennast nakkaval kujul alal hoida. Metsiktüüpi viirustes

9 EE – EP2750707 B1

alalhoidmiseks vajalikud alfaviiruse strukturaalsed valgud puuduvad leiutise

isepaljunevatest RNA-dest ning nende asemel on geen(id), mis kodeerib

(kodeerivad) huvipakkuvat immunogeeni, nii et subgenoomne transkript kodeerib

pigem immunogeeni kui strukturaalseid alfaviiruse virioni valke.

Järelikult võib leiutises kasulikul isepaljuneval RNA molekulil olla kaks avatud5

lugemisraami. Esimene (5’) avatud lugemisraam kodeerib replikaasi; teine (3’)

avatud lugemisraam kodeerib immunogeeni. Mõnes teostusviisis võivad RNA-l olla

täiendavad (nt allavoolu) avatud lugemisraamid, et nt kodeerida täiendavaid

immunogeene (vaata allpool) või kodeerida lisapolüpeptiide.

Isepaljuneval RNA molekulil võib olla 5’ järjestus, mis ühtib kodeeritud replikaasiga.10

Isepaljunevad RNA molekulid võivad olla erineva pikkusega, aga need on tavaliselt

5000 – 25 000 nukleotiidi pikkused, nt 8000 – 15 000 nukleotiidi või 9000 – 12 000

nukleotiidi pikkused. Järelikult on RNA pikem kui siRNA transportimisel.

Leiutises kasulikul RNA molekulil võib olla 5’-müts (nt 7-metüülguanosiin). See müts

võib parandada RNA in vivo translatsiooni.15

Leiutises kasuliku RNA molekuli 5’-nukleotiidil võib olla 5’-trifosfaatrühm.

Mütsistatud RNA-s võib see olla ühendatud 7-metüülguanosiiniga 5’-st 5’-ni silla

kaudu. 5’-trifosfaat võib parandada RIG-I sidumist ning seeläbi soodustada

adjuvandi toimeid.

RNA molekulil võib olla 3’ polü-A-saba. See võib ka sisaldada polü-A polümeraasi20

äratundmisjärjestust (nt AAUAAA) oma 3’-otsa lähedal.

Leiutises kasulik RNA molekul on tavaliselt üheahelaline. Üheahelalised RNA-d

võivad üldiselt käivitada adjuvandi toime, seondudes TLR7, TLR8, RNA helikaaside

ja/või PKR-iga. Kaheahelalisel kujul transporditud RNA (dsRNA) võib seonduda

TLR3-ga ning seda retseptorit võib ka valla päästa dsRNA, mis moodustub kas25

üheahelalise RNA replikatsiooni käigus või üheahelalise RNA sekundaarses

struktuuris.

Leiutises kasulikku RNA molekuli saab mugavalt valmistada in vitro

transkriptsiooniga (IVT-ga). IVT võib kasutada (cDNA) matriitsi, mida luuakse ja

10 EE – EP2750707 B1

paljundatakse plasmiidi kujul bakterites või luuakse sünteetiliselt (näiteks geenide

sünteesi ja/või polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR-i) tehnoloogia meetoditega).

Näiteks võib kasutada DNA-sõltuvat RNA polümeraasi (nagu bakteriofaagi T7, T3

või SP6 RNA polümeraase), et DNA matriitsilt RNA-d transkribeerida. Sobivaid

mütsistamise ja polü-A lisamise reaktsioone võib kasutada vajaduse järgi (kuigi5

replikoni polü-A on DNA matriitsis tavaliselt kodeeritud). Nendel RNA

polümeraasidel on tavaliselt ranged tingimused transkribeeritud 5’-nukleotiidile

(nukleotiididele) ning mõnes teostusviisis tuleb need tingimused sobitada

kodeeritud replikaasi tingimustega, et tagada IVT-transkribeeritud RNA tõhusat

funktsioneerimist substraadina selle enda kodeeritud replikaasile.10

Nagu arutletud viites 11, võib isepaljunev RNA sisaldada (lisaks mis tahes 5’-mütsi

struktuurile) ühte või mitut nukleotiidi, millel on modifitseeritud nukleotiidalus.

Näiteks võib isepaljunev RNA sisaldada ühte või mitut modifitseeritud pürimidiini

nukleotiidalust, nagu pseudouridiini ja/või 5-metüültsütosiini jääke. Kuid mõnes

teostusviisis ei sisalda RNA ühtegi modifitseeritud nukleotiidalust ning ei pruugi15

sisaldada ühtegi modifitseeritud nukleotiidi, st kõik nukleotiidid RNA-s on

standardsed A, C, G ja U ribonukleotiidid (välja arvatud mis tahes 5’-mütsi

struktuuril, mis võib sisaldada 7’-metüülguanosiini). Teistes teostusviisides võib

RNA sisaldada 5’-mütsi, mis hõlmab 7’-metüülguanosiini, ning esimesed 1, 2 või 3

5’-ribonukleotiidi võivad olla riboosi 2’ positsioonil metüülitud.20

Leiutises kasutatav RNA sisaldab ideaaljuhul nukleosiidide vahel ainult

fosfodiestersidemeid, kuid mõnes teostusviisis võib see sisaldada fosforamidaat-,

fosforotioaat- ja/või metüülfosfonaatsidemeid.

Ideaaljuhul sisaldab liposoom väiksem kui 10 RNA liiki, nt 5, 4, 3 või 2 erinevat liiki;

kõige soovitatavamalt sisaldab liposoom ühte RNA liiki, st kõikidel RNA molekulidel25

on liposoomis samasugune järjestus ja pikkus.

RNA kogus ühe liposoomi kohta võib varieeruda. Üksikute isepaljunevate RNA

molekulide arv ühe liposoomi kohta on tavaliselt ≤ 50, nt < 20, < 10, < 5 või 1–4 ühe

liposoomi kohta.

30

11 EE – EP2750707 B1

Immunogeen

Leiutises kasutatavad RNA molekulid kodeerivad polüpeptiidset immunogeeni.

Pärast liposoomide manustamist transleeritakse RNA in vivo ning immunogeen

saab kutsuda retsipiendil esile immuunvastuse. Immunogeen võib esile kutsuda

immuunvastuse bakteri, viiruse, seene või parasiidi vastu (või mõnes teostusviisis5

allergeeni vastu; ning teistes teostusviisides kasvajaantigeeni vastu).

Immuunvastus võib hõlmata antikeha vastust (hõlmates tavaliselt IgG-d) ja/või

rakkude vahendatud immuunvastust. Polüpeptiidne immunogeen kutsub tavaliselt

esile immuunvastuse, mis tuvastab vastavat bakteriaalset, viiruslikku, seene või

parasiidi (või allergeeni või kasvaja) polüpeptiidi, kuid mõnes teostusviisis võib10

polüpeptiid toimida mimotoobina, et kutsuda esile immuunvastus, mis tuvastab

bakteriaalset, viiruslikku, seene või parasiidi sahhariidi. Immunogeen on tavaliselt

rakupinna polüpeptiid, nt adhesiin, hemaglutiniin, ümbrise glükoproteiin, oga-

glükoproteiin jne.

RNA molekul võib kodeerida ühte polüpeptiidset immunogeeni või mitut polüpeptiidi.15

Mitut immunogeeni võib esitada üksiku polüpeptiidse immunogeenina

(liitpolüpeptiidina) või eraldi polüpeptiididena. Kui immunogeene ekspresseeritakse

eraldi polüpeptiididena replikonist, siis neist ühe või mitu võib lisada ülesvoolu

IRES--iga või täiendava viiruse promootori elemendiga. Teisel juhul võib mitut

immunogeeni ekspresseerida polüproteiinist, mis kodeerib lühikese20

autokatalüütilise proteaasiga ühendatud üksikuid immunogeene (nt suu- ja

sõrataudi viiruse valgust 2A), või inteinidena.

Vastupidiselt viitele 1 ja 12 kodeerib RNA immunogeeni. Kahtluste vältimiseks ei

hõlma leiutis RNA-d, mis kodeerib jaanimardika lutsiferaasi või kodeerib E. coli β-

galaktosidaasi liitvalku või kodeerib rohelist fluorestseeruvat valku (GFP-d).25

Taolised polüpeptiidid võivad olla kasulikud markerina või isegi geeniteraapia

kontekstis, kuid leiutises käsitletakse RNA transportimist immunoloogilise

reaktsioonisüsteemi esilekutsumiseks. Järelikult ei ole immunogeen ka iseenda

valk, mida transporditakse puuduliku peremeesvalgu täiustamiseks või

asendamiseks (nagu geeniteraapias). RNA ei ole ka kogu hiire tüümuse RNA.30

12 EE – EP2750707 B1

Mõnes teostusviisis kutsub immunogeen esile immuunvastuse järgmistest ühe

bakteri vastu:

Neisseria meningitidis: kasulike immunogeenide seas on muu hulgas

membraanvalgud, nagu adhesiinid, autotransporterid, toksiinid, raua

omastamise valgud ja H-faktorit siduv valk. Kolme kasuliku polüpeptiidi5

kombinatsioon on avaldatud viites 13;

Streptococcus pneumoniae: kasulikud polüpeptiidsed immunogeenid on

avaldatud viites 14. Nende seas on muu hulgas RrgB piluse allüksus, beeta-

N-atsetüül-heksoosaminidaasi prekursor (spr0057), spr0096, üldine

stressivalk GSP-781 (spr2021, SP2216), seriini/treoniini kinaas StkP10

(SP1732) ja pneumokoki pindmine adhesiin PsaA;

Streptococcus pyogenes: kasulike immunogeenide seas on muu hulgas

viites 15 ja 16 avaldatud polüpeptiidid;

Moraxella catarrhalis;

Bordetella pertussis: kasulike pertussise immunogeenide seas on muu15

hulgas pertussise toksiin või toksoid (PT), niitjas hemaglutiniin (FHA),

pertaktiin ning aglutinogeen 2 ja 3;

Staphylococcus aureus: kasulike immunogeenide seas on muu hulgas viites

17 avaldatud polüpeptiidid, nagu hemolüsiin, esxA, esxB, ferrikroomi siduv

valk (sta006) ja/või sta011 lipoproteiin;20

Clostridium tetani: tüüpiline immunogeen on teetanuse toksoid;

Cornynebacterium diphtheriae: tüüpiline immunogeen on difteeria toksoid;

Haemophilus influenzae: kasulike immunogeenide seas on muu hulgas viites

18 ja 19 avaldatud polüpeptiidid;

Pseudomonas aeruginosa;25

Streptococcus agalactiae: kasulike immunogeenide seas on muu hulgas

viites 15 avaldatud polüpeptiidid;

13 EE – EP2750707 B1

Chlamydia trachomatis: kasulike immunogeenide seas on muu hulgas PepA,

LcrE, ArtJ, DnaK, CT398, OmpHlike, L7/L12, OmcA, AtoS, CT547, Eno, HtrA

ja MurG (nt nagu avaldatud viites 20). LcrE [21] ja HtrA [22] on kaks eelistatud

immunogeeni;

Chlamydia pneumoniae: kasulike immunogeenide seas on muu hulgas viites5

23 avaldatud polüpeptiidid;

Helicobacter pylori: kasulike immunogeenide seas on muu hulgas CagA,

VacA, NAP ja/või ureaas [24];

Escherichia coli: kasulike immunogeenide seas on muu hulgas

enterotoksigeenselt E. colilt (ETEC-lt), enteroagregatiivselt E. colilt10

(EAggEC-lt), difuusselt kinnitunud E. colilt (DAEC-lt), enteropatogeenselt E.

colilt (EPEC-lt), sooleväliselt patogeenselt E. colilt (ExPEC-lt) ja/või

enterohemorraagiliselt E. colilt (EHEC-lt) saadud immunogeenid. ExPEC

tüvede seas on uropatogeenne E. coli (UPEC) ja meningiidi/sepsisega

seotud E. coli (MNEC). Kasulikud UPEC polüpeptiidsed immunogeenid on15

avaldatud viites 25 ja 26. Kasulikud MNEC immunogeenid on avaldatud viites

27. Kasulik immunogeen mitmele E. coli tüübile on AcfD [28];

Bacillus anthracis;

Yersinia pestis: kasulike immunogeenide seas on muu hulgas need, mis on

avaldatud viites 29 ja 30;20

Staphylococcus epidermis;

Clostridium perfringens või Clostridium botulinums;

Legionella pneumophila;

Coxiella burnetii;

Brucella, nagu B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B. ovis, B.25

suis, B. pinnipediae;

Francisella, nagu F. novicida, F. philomiragia, F. tularensis;

14 EE – EP2750707 B1

Neisseria gonorrhoeae;

Treponema pallidum;

Haemophilus ducreyi;

Enterococcus faecalis või Enterococcus faecium;

Staphylococcus saprophyticus;5

Yersinia enterocolitica;

Mycobacterium tuberculosis;

Rickettsia;

Listeria monocytogenes;

Vibrio cholerae;10

Salmonella typhi;

Borrelia burgdorferi;

Porphyromonas gingivalis;

Klebsiella.

Mõnes teostusviisis kutsub immunogeen esile immuunvastuse järgmistest viirustest15

ühe vastu:

Orthomyxovirus: kasulikud immunogeenid võivad pärineda A-, B- või C-tüüpi

gripiviiruselt, nagu hemaglutiniin, neuraminidaas või M2 maatriksvalgud. Kui

immunogeen on A-tüüpi gripiviiruse hemaglutiniin, võib see pärineda mis

tahes alamtüübilt, nt alamtüübilt H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10,20

H11, H12, H13, H14, H15 või H16;

Paramyxoviridae viirused: viiruslike immunogeenide seas on muu hulgas

need, mis on saadud pneumoviirustelt (nt respiratoorselt süntsütiaalselt

15 EE – EP2750707 B1

viiruselt RSV), rubulaviirustelt (nt mumpsiviiruselt), paramüksoviirustelt (nt

paragripiviiruselt), metapneumoviirustelt ja morbilliviirustelt (nt leetriviiruselt);

Poxviridae: viiruslike immunogeenide seas on muu hulgas need, mis on

saadud Orthopox-viiruselt, nagu viiruselt Variola vera, muu hulgas Variola

major ja Variola minor;5

pikornaviirus: viiruslike immunogeenide seas on muu hulgas need, mis on

saadud pikornaviirustelt, nagu enteroviirustelt, rinoviirustelt, heparnaviiruselt,

viirustelt Cardiovirus ja Aphthovirus. Teatud teostusviisis on enteroviirus

polioviirus, nt 1. tüübi, 2. tüübi ja/või 3. tüübi polioviirus. Järgmises

teostusviisis on enteroviirus EV71 enteroviirus. Järgmises variandis on10

enteroviirus Coxsackie viiruse A- või B-serotüüp;

Bunyavirus: viiruslike immunogeenide seas on muu hulgas need, mis on

saadud sugukonnalt Orthobunyavirus, nagu Kalifornia entsefaliidi viiruselt,

sugukonnalt Phlebovirus, nagu Rift Valley palaviku viiruselt, või sugukonnalt

Nairovirus, nagu Krimmi-Kongo hemorraagilise palaviku viiruselt;15

Heparnavirus: viiruslike immunogeenide seas on muu hulgas need, mis on

saadud sugukonnalt Heparnavirus, nagu A-hepatiidi viiruselt (HAV-lt);

filoviirus: viiruslike immunogeenide seas on muu hulgas need, mis on saadud

filoviiruselt, nagu Ebola viiruselt (sealhulgas Zaire’i, Taï metsa, Restoni või

Sudaani ebolaviiruselt) või Marburgi viiruselt;20

togaviirus: viiruslike immunogeenide seas on muu hulgas need, mis on

saadud togaviiruselt, nagu rubiviiruselt, alfaviiruselt või arteriviiruselt. Siia

kuulub punetiste viirus;

flaviviirus: viiruslike immunogeenide seas on muu hulgas need, mis on

saadud flaviviiruselt, nagu puukentsefaliidi (TBE) viiruselt, Dengue’ (1., 2., 3.25

või 4. tüübi) viiruselt, kollapalaviku viiruselt, Jaapani entsefaliidi viiruselt,

Kyasanuri metsahaiguse viiruselt, Lääne-Niiluse entsefaliidi viiruselt, St.

Louise entsefaliidi viiruselt, Venemaa kevad-suvise entsefaliidi viiruselt,

Powassani entsefaliidi viiruselt;

16 EE – EP2750707 B1

pestiviirus: viiruslike immunogeenide seas on muu hulgas need, mis on

saadud pestiviiruselt, nagu veiste viirusdiarröalt (BVDV-lt), sigade

klassikaliselt katkult (CSFV-lt) või Borderi haiguselt (BDV-lt);

hepadnaviirus: viiruslike immunogeenide seas on muu hulgas need, mis on

saadud hepadnaviiruselt, nagu B-hepatiidi viiruselt. Koostis võib sisaldada B-5

hepatiidi viiruse pinnaantigeeni (HBsAg-d);

muud hepatiidiviirused: koostis võib sisaldada C-hepatiidi viiruselt, D-

hepatiidi viiruselt, E-hepatiidi viiruselt või G-hepatiidi viiruselt pärit

immunogeeni;

rabdoviirus: viiruslike immunogeenide seas on muu hulgas need, mis on10

saadud rabdoviiruselt, nagu lüssaviiruselt (nt marutõve viiruselt) ja

perekonnalt Vesiculovirus (VSV-lt);

Caliciviridae: viiruslike immunogeenide seas on muu hulgas need, mis on

saadud sugukonnalt Calciviridae, nagu Norwalki viiruselt (noroviiruselt) ning

Norwalki-sarnastelt viirustelt, nagu Hawaii viiruselt ja suusakuurortides15

esinevalt (Snow Mountain) viiruselt;

koronaviirus: viiruslike immunogeenide seas on muu hulgas need, mis on

saadud SARS-i koronaviiruselt, lindude infektsioosselt bronhiidilt (IBV-lt),

hiirte hepatiidiviiruselt (MHV-lt) ja sigade transmissiivse gastroenteriidi

viiruselt (TGEV-lt). Koronaviiruse immunogeen võib olla oga-polüpeptiid;20

retroviirus: viiruslike immunogeenide seas on muuhulgas need, mis on

saadud onkoviiruselt, lentiviiruselt (nt HIV-1-lt või HIV-2-lt) või spumaviiruselt;

reoviirus: viiruslike immunogeenide seas on muu hulgas need, mis on saadud

ortoreoviiruselt, rotaviiruselt, orbiviiruselt või perekonnalt Coltivirus;

parvoviirus: viiruslike immunogeenide seas on muu hulgas need, mis on25

saadud parvoviiruselt B19;

herpesviirus: viiruslike immunogeenide seas on muu hulgas need, mis on

saadud inimese herpesviiruselt, nagu näiteks lihtherpesviirustelt (HSV-lt) (nt

17 EE – EP2750707 B1

HSV 1. ja 2. tüübilt), tuulerõugeviiruselt (VZV-lt), Epstein-Barri viiruselt (EBV-

lt), tsütomegaloviiruselt (CMV-lt), inimese herpesviiruselt 6 (HHV6-lt),

inimese herpesviiruselt 7 (HHV7-lt) ja inimese herpesviiruselt 8 (HHV8-lt);

papovaviirused: viiruslike immunogeenide seas on muu hulgas need, mis on

saadud papilloomiviirustelt ja polüoomiviirustelt. (Inimese) papilloomiviirus5

võib olla 1., 2., 4., 5., 6., 8., 11., 13., 16., 18., 31., 33., 35., 39., 41., 42., 47.,

51., 57., 58., 63. või 65. serotüüp, nt ühest või mitmest 6., 11., 16. ja/või 18.

serotüübist;

adenoviirus: viiruslike immunogeenide seas on need, mis on saadud

adenoviiruse 36. serotüübilt (Ad-36-lt).10

Mõnes teostusviisis kutsub immunogeen esile immuunvastuse kalu nakatava

viiruse, nagu: lõhilaste infektsioosse aneemia viiruse (ISAV), lõhede pankreasetõve

viiruse (SPDV), nakkusliku pankrease nekroosi viiruse (IPNV), merihuntide viiruse

(CCV), kalade lümfotsüstilise haiguse viiruse (FLDV), kalade vereloomeorganite

infektsioosse nekroosi viiruse (IHNV), karpkalade herpesviiruse, lõhede15

pikornasarnase viiruse (tuntud ka kui Atlandi lõhede pikornasarnane viirus),

kalakasvanduse lõhede viiruse (LSV), Atlandi lõhede rotaviiruse (ASR-i), forellide

punalaiksuse viiruse (TSD), kisutši kasvajaviiruse (CSTV) või viirusliku

hemorraagilise septitseemia viiruse (VHSV) vastu.

Seente immunogeenid võib saada dermatofüütidelt, sealhulgas seenelt:20

Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis,

Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum,

Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum,

Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton

mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton25

schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var.

album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum ja/või Trichophyton

faviforme; või seenelt Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger,

Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus,

Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida30

enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida

18 EE – EP2750707 B1

parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida

lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii,

Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans,

Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae,

Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalis ja Enterocytozoon5

bieneusi; vähem tuntud on seened Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema

spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp., Paracoccidioides

brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale,

Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe,

Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii,10

Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp.,

Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus

spp., Mucor spp., Absidia spp., Mortierella spp., Cunninghamella spp., Saksenaea

spp., Alternaria spp., Curvularia spp., Helminthosporium spp., Fusarium spp.,

Aspergillus spp., Penicillium spp., Monolinia spp., Rhizoctonia spp., Paecilomyces15

spp., Pithomyces spp. ja Cladosporium spp.

Mõnes teostusviisis kutsub immunogeen esile immuunvastuse plasmoodiumi

perekonnast pärit parasiidi vastu, nagu parasiidi P. falciparum, P. vivax, P. malariae

või P. ovale vastu. Järelikult võib leiutist kasutada malaariavastaseks

immuniseerimiseks. Mõnes teostusviisis kutsub immunogeen esile immuunvastuse20

sugukonnast Caligidae pärit parasiidi vastu, täpsemalt nende vastu, mis on pärit

perekonnast Lepeophtheirus ja Caligus, nt meretäide, nagu parasiidi

Lepeophtheirus salmonis või Caligus rogercresseyi vastu.

Mõnes teostusviisis kutsub immunogeen esile immuunvastuse: õietolmu

allergeenide (puude, rohttaimede, umbrohu ja heina õietolmu allergeenid); putuka25

või arahniidi allergeenide (inhalandi, sülje ja mürgi allergeenid, nt lesta allergeenid,

prussaka ja sääse allergeenid, kiletiivaliste mürgi allergeenid); loomakarva ja kõõma

allergeenide (nt koeralt, kassilt, hobuselt, rotilt, hiirelt jne); ning toiduallergeenide (nt

gliadiini) vastu. Olulised õietolmu allergeenid puudelt, heintelt ja ravimtaimedelt on

need, mis pärinevad sellisest taksonoomilisest seltsist nagu Fagales, Oleales,30

Pinales ja plaatanilised, muu hulgas kask (Betula), lepp (Alnus), sarapuu (Corylus),

valgepöök (Carpinus) ja oliivipuu (Olea), seeder (Cryptomeria ja Juniperus), plaatan

19 EE – EP2750707 B1

(Platanus), kõrreliselaadsete selts, sealhulgas heinad perekonnast Lolium, Phleum,

Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale ja Sorghum, astrilaadsete ja

nõgeselaatsete selts, sealhulgas ambroosia, puju ja juudinõgese perekonna

rohttaimed. Muud olulised inhaleeritavad allergeenid on need, mis pärinevad

eluruumide tolmulestalt perekonnast Dermatophagoides ja Euroglyphus,5

hoiuruumide lestalt, nt Lepidoglyphyselt, Glycyphaguselt ja Tyrophaguselt,

prussakatelt, sääskedelt ja kirpudelt pärit allergeenid, nt Blatellalt, Periplanetalt,

Chironomuselt ja Ctenocepphalideselt, ning imetajatelt, nagu kassilt, koeralt ja

hobuselt pärit allergeenid, mürgi allergeenid, sealhulgas need, mis pärinevad

nõelavatelt või hammustavatelt putukatelt, nagu need, mis pärinevad kiletiivaliste10

taksonoomilisest seltsist, sealhulgas mesilastelt (Apidae), herilastelt (Vespidea) ja

sipelgatelt (Formicoidae).

Mõnes teostusviisis on immunogeen kasvajaantigeen, mis valitakse järgmiste

hulgast: (a) vähi-testise antigeenid, nagu NYESO-1, SSX2, SCP1 ning RAGE,

BAGE, GAGE ja MAGE perekonna polüpeptiidid, näiteks, GAGE-1, GAGE-2,15

MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 ja MAGE-12 (mida võib

kasutada näiteks melanoomi, kopsu-, pea- ja kaela-, NSCLC, rinna-, seedetrakti- ja

põiekasvajatega tegelemiseks); (b) muteerunud antigeenid, näiteks, p53 (seotud

erinevate soliidtuumoritega, nt kolorektaal-, kopsu-, pea- ja kaelavähiga), p21/Ras

(seotud nt melanoomi, pankrease vähi ja kolorektaalvähiga), CDK4 (seotud nt20

melanoomiga), MUM1 (seotud nt melanoomiga), kaspaas-8 (seotud nt pea- ja

kaelavähiga), CIA 0205 (seotud nt põievähiga), HLA-A2-R1701, beeta-kateniin

(seotud nt melanoomiga), TCR (seotud nt T-rakulise mitte-Hodgkini lümfoomiga),

BCR-abl (seotud nt kroonilise müelogeense leukeemiaga), trioosfosfaadi

isomeraas, KIA 0205, CDC-27 ja LDLR-FUT; (c) üleekspresseeritavad antigeenid,25

näiteks, galektiin-4 (seotud nt kolorektaalvähiga), galektiin-9 (seotud nt Hodgkini

tõvega), proteinaas 3 (seotud nt kroonilise müelogeense leukeemiaga), WT1

(seotud nt erinevate leukeemiatega), süsihappeanhüdraas (seotud nt neeruvähiga),

aldolaas A (seotud nt kopsuvähiga), PRAME (seotud nt melanoomiga), HER-2/neu

(seotud nt rinna-, käärsoole-, kopsu- ja munasarjavähiga), mammaglobiin,30

alfafetoproteiin (seotud nt hepatoomiga), KSA (seotud nt kolorektaalvähiga), gastriin

(seotud nt pankrease ja maovähiga), telomeraasi katalüütiline valk, MUC-1 (seotud

nt rinna- ja munasarjavähiga), G-250 (seotud nt neeruraku kartsinoomiga), p53

20 EE – EP2750707 B1

(seotud nt rinna- ja käärsoolevähiga) ning kartsinoembrüonaalne antigeen (seotud

nt rinnavähi, kopsuvähi ning seedetraktivähkidega, nagu kolorektaalvähiga); (d)

jagatavad antigeenid, näiteks melanoomi-melanotsüüdi diferentseerumise

antigeenid, nagu MART-1/Melan A, gp100, MC1R, melanotsüüti stimuleeriva

hormoonretseptor, türosinaas, türosinaasiga seotud valk-1/TRP1 ja türosinaasiga5

seotud valk-2/TRP2 (seotud nt melanoomiga); (e) eesnäärmega seotud antigeenid,

nagu PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, mis on seotud nt

eesnäärmevähiga; (f) immunoglobuliini idiotüübid (seotud näiteks müeloomide ja B-

raku lümfoomidega). Teatud teostusviisides on kasvaja immunogeenide seas

muuhulgas p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYLRAR,10

Epstein-Barri viiruse antigeenid, EBNA, inimese papilloomiviiruse (HPV) antigeenid,

sealhulgas E6 ja E7, B- ja C-hepatiidi viiruse antigeenid, inimese T-raku

lümfotroopse viiruse antigeenid, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-

23H1, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17,1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA,

CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beeta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA15

27,29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733

(EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1,

SDCCAG16, TA-90 (Mac-2 siduv valk/tsüklofiliin C-ga seotud valk), TAAL6, TAG72,

TLP, TPS ja muu sarnane.

Ravimkoostised20

Leiutise liposoomid on ravimkoostiste kasulikud komponendid subjektide

immuniseerimisel mitme erineva haiguse vastu. Need koostised sisaldavad lisaks

liposoomidele tavaliselt farmatseutiliselt aktsepteeritavat kandeainet.

Farmatseutiliselt aktsepteeritavate kandeainete põhjalik käsitlus on olemas viites

31.25

Leiutise ravimkoostis võib sisaldada ühte või mitut väikese molekuliga

immuunvõimendajat (immunopotentiator). Näiteks võib koostis sisaldada TLR2

agonisti (nt Pam3CSK4), TLR4 agonisti (nt aminoalküülglükoosamiini fosfaati, nagu

E6020), TLR7 agonisti (nt imikvimoodi), TLR8 agonisti (nt resikvimoodi) ja/või TLR9

agonisti (nt IC31). Iga taolise agonisti molekulmass on ideaaljuhul < 2000 Da.30

Mõnes teostuses on taoline agonist (taolised agonistid) kapseldatud ka

liposoomidesse RNA-ga, kuid teistes teostusviisides on need kapseldamata.

21 EE – EP2750707 B1

Leiutise ravimkoostised võivad sisaldada liposoome puhtas vees (nt süstevees) või

puhvris, nt fosfaatpuhvris, Tris-puhvris, boraatpuhvris, suktsinaatpuhvris,

histidiinpuhvris või tsitraatpuhvris. Puhversoolasid lisatakse tavaliselt vahemikus 5–

20 mM.

Leiutise ravimkoostiste pH võib olla vahemikus 5,0 ja 9,5, nt vahemikus 6,0 ja 8,0.5

Leiutise koostised võivad sisaldada naatriumsoolasid (nt naatriumkloriidi), et

toonsust lisada. Tavapärane NaCl kontsentratsioon on 10 ± 2 mg/ml, nt umbes

9 mg/ml.

Leiutise koostised võivad sisaldada metalliooni kelaatoreid. Need võivad pikendada

RNA stabiilsust ioonide eemaldamisel, mis võivad kiirendada fosfodiestri10

hüdrolüüsi. Järelikult võib koostis sisaldada ühte või mitut EDTA-d, EGTA-d,

BAPTA-d, penteenhapet jne. Taolisi kelaatoreid on tavaliselt vahemikus 10–

500 mM, nt 0,1 µM. Tsitraatsool, nagu naatriumtsitraat, võib olla ka kelaator, lisades

ka samal ajal puhverdavat toimet.

Leiutise ravimkoostiste osmolaalsus võib olla vahemikus 200 mOsm/kg ja15

400 mOsm/kg, nt vahemikus 240–360 mOsm/kg või vahemikus 290–310 mOsm/kg.

Leiutise ravimkoostised võivad sisaldada ühte või mitut säilitusainet, nagu

tiomersaali või 2-fenoksüetanooli. Eelistatakse elavhõbedavabu koostiseid ning

valmistada võib säilitusainevabu vaktsiine.

Leiutise ravimkoostised on soovitatavalt steriilsed.20

Leiutise ravimkoostised on soovitatavalt mittepürogeensed, sisaldades ühes doosis

nt < 1 EU (endotoksiini ühikut, standardmõõtühik) ja soovitatavalt < 0,1 EU ühes

doosis.

Leiutise ravimkoostised on soovitatavalt gluteenivabad.

Leiutise ravimkoostisi võib valmistada ühikulise ravimvormina. Mõnes teostuses25

võib ühe doosi maht olla vahemikus 0,1–1,0 ml, nt umbes 0,5 ml.

Koostiseid võib valmistada süstidena, mis on kas lahustes või suspensioonides.

Koostise võib valmistada kopsudesse manustamiseks, nt inhalaatoriga, kasutades

22 EE – EP2750707 B1

väikeste osakestena pihustamist. Koostise võib valmistada ninna, kõrva või silma

manustamiseks, nt pihusti või tilkadena. Tavalised on süstid intramuskulaarseks

manustamiseks.

Koostised sisaldavad liposoomide immunoloogiliselt tõhusat kogust ning ka mis

tahes muid komponente vajaduse põhjal. „Immunoloogiliselt tõhusa kogusega“ on5

mõeldud, et selle koguse manustamine subjektile kas üheosalise annusena või

kuuri osana on ravimiseks või ennetamiseks tõhus. See kogus varieerub olenevalt

ravitava subjekti tervisest ja füüsilisest seisundist, vanusest, ravitava subjekti

taksonoomilisest rühmast (ahviline, primaat jne), subjekti immuunsüsteemi

suutlikkusest antikehasid sünteesida, soovitud kaitsemäärast, vaktsiini10

kompositsioonist, raviarsti hinnangust meditsiinilisele olukorrale ning teistest

olulistest teguritest. Eeldatakse, et kogus jääb suhteliselt laia vahemikku, mille saab

tavapäraste katsetega kindlaks määrata. Leiutise koostiste liposoomi ja RNA

sisaldust väljendatakse üldiselt RNA kogusena ühes annuses. Eelistatud annuses

on ≤ 100 µg RNA-d (nt vahemikus 10–100 µg, nagu umbes 10 µg, 25 µg, 50 µg,15

75 µg või 100 µg). Kuigi ekspressiooni võib näha palju väiksema määraga

(nt ≤ 1 mg/doos, ≤ 100 ng/doos, ≤ 10 ng/doos, ≤ 1 ng/doos), on eelistatav

minimaalne annus 0,1 µg.

Leiutises on ka esitatud manustamisvahend (nt süstal, nebulisaator, pihusti,

inhalaator, nahaplaaster jne), mis sisaldab leiutise farmatseutilist koostist. Seda20

vahendit saab kasutada koostise manustamiseks selgroogsele subjektile.

Leiutise liposoomid ei sisalda ribosoome.

Ravimeetodid ja meditsiiniline kasutus

Vastupidiselt viites 12 avaldatud osakestele on leiutise liposoomid ja

farmatseutilised koostised mõeldud in vivo kasutuseks immuunvastuse25

esilekutsumiseks huvipakkuva immunogeeni vastu.

Leiutises on esitatud meetod selgroogsel immuunvastuse tekitamiseks, mis hõlmab

leiutise liposoomi või ravimkoostise tõhusa koguse manustamise etappi.

Immuunvastus on soovitatavalt kaitsev ning hõlmab soovitatavalt antikehasid ja/või

rakkude vahendatud immuunsust. Meetod võib tekitada lisaannuse reaktsiooni.30

23 EE – EP2750707 B1

Leiutises on ka esitatud leiutise liposoom või ravimkoostis kasutamiseks

selgroogsel immuunvastuse tekitamise meetodis.

Leiutises on ka esitatud leiutise liposoomi kasutamine selgroogsel immuunvastuse

tekitamise ravimi valmistamisel.

Selgroogsel immuunvastuse tekitamisel nende kasutusvõimaluste ja meetoditega5

saab selgroogset kaitsta mitmesuguste haiguste ja/või nakkuste eest, nt eespool

käsitletud bakteriaalsete ja/või viirushaiguste eest. Liposoomid ja koostised on

immunogeensed ning veel soovitatavamalt vaktsiini koostised. Leiutisekohased

vaktsiinid võivad olla kas profülaktilised (st infektsiooni ennetamiseks) või

terapeutilised (st infektsiooni ravimiseks), kuid on tavaliselt profülaktilised.10

Selgroogne on soovitatavalt imetaja, nagu inimene, või veterinaarne suur imetaja

(nt hobused, kariloomad, hirved, kitsed, sead). Kui vaktsiin on profülaktiliseks

kasutuseks, on inimene soovitatavalt laps (nt mudilane või imik) või teismeline; kui

vaktsiin on terapeutiliseks kasutuseks, on inimene soovitatavalt teismeline või

täiskasvanu. Lastele mõeldud vaktsiini võib manustada ka täiskasvanutele, et nt15

hinnata ohutust, annust, immunogeensust jne.

Leiutisekohaselt valmistatud vaktsiine võib kasutada nii laste kui ka täiskasvanute

ravimiseks. Järelikult võib inimpatsient olla noorem kui 1-aastane, noorem kui 5-

aastane, 1–5-aastane, 5–15-aastane, 15–55-aastane või vähemalt 55-aastane.

Eelistatud patsiendid vaktsiinide saamiseks on eakad (nt ≥ 50-aastased, ≥ 60-20

aastased ja soovitatavalt ≥ 65-aastased), noored (nt ≤ 5-aastased),

hospitaliseeritud patsiendid, tervishoiutöötajad, relvajõudude ja sõjaväe personal,

kuid vaktsiinid ei sobi ainult nendele rühmadele ning neid võib kasutada

populatsioonis laiemalt.

Leiutise koostiseid manustatakse patsiendile üldiselt otse. Otse manustamist saab25

teha parenteraalse süstiga (nt subkutaanselt, intraperitoneaalselt, intravenoosselt,

intramuskulaarselt, intradermaalselt või kudedevahelisse piirkonda; vastupidiselt

viitele 1 ei kasutata käesolevas leiutises tavaliselt keele sisse süstimist). Teiste

manustamisviiside seas on rektaalne, suukaudne (nt tabletina, pihustina), bukaalne,

sublingvaalne, vaginaalne, paikne, transdermaalne või transkutaanne,30

24 EE – EP2750707 B1

intranasaalne, okulaarne, kõrva, kopsu või muu limaskesta kaudu manustamine.

Kaks eelistatud manustamisviisi on intradermaalne ja intramuskulaarne. Süsti võib

teha nõelaga (nt hüpodermilise nõelaga), kuid teisel juhul võib kasutada nõelavaba

süsti. Tavaline intramuskulaarne annus on 0,5 ml.

Leiutist võib kasutada süsteemse ja/või limaskesta immuunsuse esilekutsumiseks,5

soovitatavalt parema süsteemse ja/või limaskesta immuunsuse esilekutsumiseks.

Annust võib anda üheosalise annuse kava või mitme annuse kava järgi. Mitut annust

võib kasutada primaarses immuniseerimiskavas ja/või lisaannuse

immuniseerimiskavas. Mitme annusega kavas võib erinevaid annuseid anda

samasugusel või erineval viisil, nt parenteraalse algannuse ja limaskesta10

lisaannusega, limaskesta algannuse ja parenteraalse lisaannusega jne. Mitut

annust manustatakse tavaliselt vähemalt 1-nädalase (nt umbes 2-nädalase, umbes

3-nädalase, umbes 4-nädalase, umbes 6-nädalase, umbes 8-nädalase, umbes 10-

nädalase, umbes 12-nädalase, umbes 16-nädalase jne) vahega. Ühes teostusviisis

võib mitut annust manustada ligikaudu 6 nädalat, 10 nädalat ja 14 nädalat pärast15

sündi, nt vanuses 6 nädalat, 10 nädalat ja 14 nädalat, nagu sageli kasutatakse

Maailma Tervishoiuorganisatsiooni laiendatud immuniseerimise programmis

(„EPI-s“). Lisateostusviisis manustatakse kaks primaarset annust umbes kahekuuse

vahega, nt umbes 7-, 8- või 9-nädalase vahega, millele järgneb üks või mitu

lisaannust umbes 6 kuud kuni 1 aasta pärast teist primaarset annust, nt umbes 6,20

8, 10 või 12 kuud pärast teist primaarset annust. Täiendavas teostusviisis

manustatakse kolm primaarset annust umbes kahekuuse vahega, nt umbes 7-, 8-

või 9-nädalase vahega, millele järgneb üks või mitu lisaannust umbes 6 kuud kuni

1 aasta pärast kolmandat primaarset annust, nt umbes 6, 8, 10 või 12 kuud pärast

kolmandat primaarset annust.25

Valem (X)

Siin on avaldatud valemi (X) ühendid, mis sisaldavad lipiidosaga ühendatud

hüdrofiilset polümeeri pearühma. Neid võib kirjeldada kui „varjatud lipiide“ ning need

on valemiga:

25 EE – EP2750707 B1

milles:

[Z]n on hüdrofiilne pearühma komponent, mis valitakse PEG ja polümeeride

hulgast polü(oksasoliini), polü(etüleenoksiidi), polü(vinüülalkoholi),

polü(glütserooli), polü(N-vinüülpürrolidooni), polü[N-(2-5

hüdroksüpropüül)metakrüülamiidi] ja polü(aminohappe) (aminohapete)

põhjal, milles polümeer võib olla lineaarne või hargnenud ning milles

polümeer võib olla soovi korral asendatud;

kusjuures Z on polümeriseeritud n allüksusega;

n on polümerisatsiooni arvkeskmistatud määr vahemikus 10 ja 200 Z-i ühikut,10

kusjuures n on optimeeritud erinevatele polümeeri liikidele;

L1 on valikuliselt asendatud C1–10alküleen- või C1–10heteroalküleeni linker,

hõlmates null, üks või kaks eetrit (nt -O-), estrit (nt -C(O)O-), suktsinaati (nt -

O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-)), karbamaati (nt -OC(O)-NR’-), karbonaati

(nt -OC(O)O-), uureat (nt -NRC(O)NR’-), amiini (nt -NR’-), amiidi (nt -15

C(O)NR’-), imiini (nt -C(NR’)-), tioeetrit (nt -S-), ksantaati (nt -OC(S)S-) ja

fosfodiestrit (nt -OP(O)2O-), kusjuures R’ valitakse sõltumatult -H, -NH-, -NH2,

-O-, -S-i, fosfaadi või valikuliselt asendatud C1–10alküleeni hulgast;

X1 ja X2 valitakse sõltumatult süsiniku või heteroaatomi hulgast, mis

valitakse -NH-, -O-, -S-i või fosfaadi hulgast;20

A1 ja A2 valitakse sõltumatult C6–30alküüli, C6–30alkenüüli ja C6–30alkünüüli

hulgast, kusjuures A1 ja A2 võivad olla samasugused või erinevad või A1 ja

A2 moodustavad koos süsinikuaatomiga, millega need on ühendatud,

valikuliselt asendatud steroidi.

Teatud teostusviisis on valemi (X) ühend valemiga (X’)25

26 EE – EP2750707 B1

milles

PEG on polü(etüleenglükool), kusjuures PEG võib olla lineaarne või

hargnenud;

n on polümerisatsiooni arvkeskmistatud määr vahemikus 70 ja 2405

etüleenoksiidi ühikut;

L1 on soovi korral asendatud C1–10heteroalküleeni linker, mis sisaldab ühte

või kahte eetrit, estrit, suktsinaati, karbamaati, karbonaati, uureat, amiini,

amiidi, imiini, tioeetrit, ksantaati ja fosfodiestrit;

X1 ja X2 on hapnik;10

A1 ja A2 valitakse sõltumatult C6–30alküüli, C6–30alkenüüli ja C6–30alkünüüli

hulgast, kusjuures A1 ja A2 võivad olla samasugused või erinevad või

kusjuures A1 ja A2 moodustavad koos süsinikuaatomiga, millega need on

seotud, valikuliselt asendatud steroidi.

Mõnes leiutise teostusviisis, milles lipiid on valemiga X’, ei hõlma leiutis lipiide, milles15

n on polümerisatsiooni arvkeskmistatud määr 200 PEG ühikut. Teistes

teostusviisides, milles lipiid on valemiga X’, ei hõlma leiutis lipiide, milles n on

polümerisatsiooni arvkeskmistatud määr vahemikus 190–210 PEG ühikut. Teistes

teostusviisides, milles lipiid on valemiga X’, ei hõlma leiutis lipiide, milles n on

polümerisatsiooni arvkeskmistatud määr suurem kui 150 PEG ühikut või suurem kui20

130 PEG ühikut. Mõnes leiutise teostusviisis, milles lipiid on valemiga X’, ei hõlma

leiutis lipiide, milles n on polümerisatsiooni arvkeskmistatud määr vahemikus 10 ja

200 PEG ühikut. Mõnes teostusviisis ei hõlma leiutis liposoome, mis sisaldavad

lipiidi valemiga X’.

Kui valemi (X) ja (X’) lipiidid on liposoomide moodustamiseks valmistatud25

katioonsete lipiididega, võivad need pikendada aega, mille jooksul liposoom võib

eksisteerida in vivo (nt veres). Need võivad kaitsta liposoomi pinda ning seeläbi

27 EE – EP2750707 B1

vähendada verevalkude opsonisatsiooni ning imendumist makrofaagide poolt.

Täiendavad üksikasjad on viites 32 ja 33. Ühes teostusviisis sisaldab lipiid rühma,

mis valitakse PEG (nimetatakse mõnikord polü(etüleenoksiidiks)) ja polümeeride

hulgast polü(oksasoliini), polü(vinüülalkoholi), polü(glütserooli), polü(N-

vinüülpürrolidooni), polü[N-(2-hüdroksüpropüül)metakrüülamiidi] ja5

polü(aminohappe) (aminohapete) põhjal.

Leiutises kasutamiseks sobivate PEGüülitud lipiidide seas on polüetüleenglükool-

diatsüülglütserooli või polüetüleenglükool-diatsüülglükamiidi (polyethyleneglycol-

diacylglycamide PEG-DAG) konjugaadid, sealhulgas need, mis sisaldavad

dialküülglütserool- või dialküülglükamiidrühma, mille alküülahela pikkus sisaldab10

sõltumatult alates umbes C4 kuni umbes C40 küllastunud või küllastumata süsiniku

aatomit. Dialküülglütserool- või dialküülglükamiidrühm võib veel sisaldada ühte või

mitut asendatud alküülrühma. PEGüülitud lipiidi võib valida PEG-

dilaurüülglütserooli, PEG-dimüristüülglütserooli (kataloogi # GM-020 ettevõttelt

NOF), PEG-dipalmitoüülglütserooli, PEG-disterüülglütserooli, PEG-15

dilaurüülglükamiidi, PEG-dimüristüülglükamiidi, PEG-dipalmitoüülglükamiidi ning

PEG-disterüülglükamiidi, PEG-kolesterooli (1-[8’-(kolest-5-een-3[beeta]-

oksü)karboksamido-3’,6’-dioksaoktanüül]karbamoüül-[oomega]-metüül-

polü(etüleenglükooli), PEG-DMB (3,4-ditetradekoksüülbensüül-[oomega]-metüül-

polü(etüleenglükool)eetri), 1,2-dimüristoüül-sn-glütsero-3-fosfoetanoolamiin-N-20

[metoksü(polüetüleenglükool)-5000] (kataloogi # 880210P ettevõttelt Avanti Polar

Lipids) hulgast.

Keemilised terminid ja definitsioonid

Halo

Termin „halogeen“ (või „halo“) hõlmab fluori, kloori, broomi ja joodi.25

Alküül, alküleen, alkenüül, alkünüül, tsükloalküül jne

Termineid „alküül“, „alküleen“, „alkenüül“ ja „alkünüül“ on siin kasutatud nii sirge kui

ka hargnenud ahelata atsüklilistele vormidele viitamiseks. Nende tsüklilisi analooge

nimetatakse tsükloalküüliks jne.

28 EE – EP2750707 B1

Termin „alküül“ hõlmab monovalentseid, sirgeid või hargnenud küllastunud

atsüklilisi hüdrokarbüülrühmi. Ühes teostusviisis on alküül C1–10alküül, järgmises

teostusviisis C1–6alküül, järgmises teostusviisis C1–4alküül, nagu metüül-, etüül-, n-

propüül-, i-propüül- või t-butüülrühmad.

Termin „tsükloalküül“ hõlmab monovalentseid küllastunud tsüklilisi5

hüdrokarbüülrühmi. Teatud teostusviisis on tsükloalküül C3–10tsükloalküül,

järgmises teostusviisis C3–6tsükloalküül, nagu tsüklopentüül ja tsükloheksüül.

Termin „alkoksü“ tähendab alküül-O-d.

Termin „alkenüül“ hõlmab monovalentseid sirgeid või hargnenud küllastumata

atsüklilisi hüdrokarbüülrühmi, millel on vähemalt üks süsinik-süsiniku kaksikside10

ning ühes teostusviisis mitte ühtegi süsinik-süsiniku kolmiksidet. Teatud

teostusviisis on alkenüül C2–10alkenüül, järgmises teostusviisis C2–6alkenüül,

järgmises teostusviisis C2–4alkenüül.

Termin „tsükloalkenüül“ hõlmab monovalentseid osaliselt küllastumata tsüklilisi

hüdrokarbüülrühmi, millel on vähemalt üks süsinik-süsinik kaksikside ning teatud15

teostusviisis mitte ühtegi süsinik-süsinik kolmiksidet. Teatud teostusviisis on

tsükloalkenüül C3–10tsükloalkenüül, järgmises teostusviisis C5–10tsükloalkenüül, nt

tsükloheksenüül või bensotsükloheksüül.

Termin „alkünüül“ hõlmab monovalentseid sirgeid või hargnenud küllastumata

atsüklilisi hüdrokarbüülrühmi, millel on vähemalt üks süsinik-süsinik kolmikside ning20

teatud teostusviisis mitte ühtegi süsinik-süsinik kaksiksidet. Teatud teostusviisis on

alkünüül C2–10alkünüül, järgmises teostusviisis C2–6alkünüül, järgmises teostusviisis

C2–4alkünüül.

Termin „tsükloalkünüül“ hõlmab monovalentseid osaliselt küllastumata tsüklilisi

hüdrokarbüülrühmi, millel on vähemalt üks süsinik-süsiniku kolmikside ning teatud25

teostusviisis mitte ühtegi süsinik-süsiniku kaksiksidet. Teatud teostusviisis on

tsükloalkünüül C3–10tsükloalkenüül, järgmises teostusviisis C5–10tsükloalkünüül.

Termin „alküleen“ hõlmab divalentseid sirgeid või hargnenud küllastunud atsüklilisi

hüdrokarbüülrühmi. Teatud teostusviisis on alküleen C1–10alküleen, järgmises

29 EE – EP2750707 B1

teostusviisis C1–6alküleen, järgmises teostusviisis C1–4alküleen, nagu metüleen-,

etüleen-, n-propüleen-, i-propüleen- või t-butüleenrühmad.

Termin „alkenüleen“ hõlmab divalentseid sirgeid või hargnenud küllastumata

atsüklilisi hüdrokarbüülrühmi, millel on vähemalt üks süsinik-süsiniku kaksikside

ning teatud teostusviisis mitte ühtegi süsinik-süsiniku kolmiksidet. Teatud5

teostusviisis on alkenüleen C2–10alkenüleen, järgmises teostusviisis C2–6alkenüleen,

järgmises teostusviisis C2–4alkenüleen.

Termin „alkünüleen“ hõlmab divalentseid sirgeid või hargnenud küllastumata

atsüklilisi hüdrokarbüülrühmi, millel on vähemalt üks süsinik-süsiniku kolmikside

ning teatud teostusviisis mitte ühtegi süsinik-süsiniku kaksiksidet. Teatud10

teostusviisis on alkünüleen C2–10alkünüleen, järgmises teostusviisis C2–6alkünüleen,

järgmises teostusviisis C2–4alkünüleen.

Heteroalküül jne

Termin „heteroalküül“ hõlmab alküülrühmi, milles kuni kuus süsiniku aatomit, teatud

teostusviisis kuni viis süsiniku aatomit, järgmises teostusviisis kuni neli süsiniku15

aatomit, järgmises teostusviisis kuni kolm süsiniku aatomit, järgmises teostusviisis

kuni kaks süsiniku aatomit, järgmises teostusviisis üks süsiniku aatom on kõik

sõltumatult asendatud O, S(O)q, N, P(O)r või Si-ga (ning soovitatavalt O, S(O)q või

N-iga) tingimusel, et vähemalt üks alküüli süsiniku aatomitest jääb alles.

Heteroalküülrühm võib olla C-sidemega või hetero-sidemega, st see võib olla seotud20

ülejäänud molekuliga süsiniku aatomi või O, S(O)q, N-i, P(O)r-i või Si kaudu.

Termin „heterotsükloalküül“ hõlmab tsükloalküülrühmi, milles kuni kuus süsiniku

aatomit, teatud teostusviisis kuni viis süsiniku aatomit, järgmises teostusviisis kuni

neli süsiniku aatomit, järgmises teostusviisis kuni kolm süsiniku aatomit, järgmises

teostusviisis kuni kaks süsiniku aatomit, järgmises teostusviisis üks süsiniku aatom25

on kõik sõltumatult asendatud O, S(O)q või N-iga tingimusel, et vähemalt üks

tsükloalküüli süsiniku aatomitest jääb alles. Heterotsükloalküülrühmade näidete

seas on oksiranüül, tiaranüül, asiridinüül, oksetanüül, tiatanüül, asetidinüül,

tetrahüdrofuranüül, tetrahüdrotiofenüül, pürrolidinüül, tetrahüdropüranüül,

tetrahüdrotiopüranüül, piperidinüül, 1,4-dioksanüül, 1,4-oksatianüül, morfolinüül,30

30 EE – EP2750707 B1

1,4-ditianüül, piperasinüül, 1,4-asatianüül, oksepanüül, tiepanüül, asepanüül, 1,4-

dioksepanüül, 1,4-oksatiepanüül, 1,4-oksaasepanüül, 1,4-ditiepanüül, 1,4-

tieasepanüül ja 1,4-diasepanüül. Heterotsükloalküülrühm võib olla C-sidemega või

N-sidemega, st see võib olla seotud ülejäänud molekuliga süsiniku aatomi või

lämmastiku aatomi kaudu.5

Termin „heteroalkenüül“ hõlmab alkenüülrühmi, milles kuni kolm süsiniku aatomit,

teatud teostusviisis kuni kaks süsiniku aatomit, järgmises teostusviisis üks süsiniku

aatom on kõik sõltumatult asendatud O, S(O)q või N-iga tingimusel, et vähemalt üks

alkenüüli süsiniku aatomitest jääb alles. Heteroalkenüülrühm võib olla C-sidemega

või hetero-sidemega, st see võib olla seotud ülejäänud molekuliga süsiniku aatomi10

või O, S(O)q või N-i kaudu.

Termin „heterotsükloalkenüül“ hõlmab tsükloalkenüülrühmi, milles kuni kolm

süsiniku aatomit, teatud teostusviisis kuni kaks süsiniku aatomit, järgmises

teostusviisis üks süsiniku aatom on kõik sõltumatult asendatud O, S(O)q või N-iga

tingimusel, et vähemalt üks tsükloalkenüüli süsiniku aatomitest jääb alles.15

Heterotsükloalkenüülrühmade näidete seas on 3,4-dihüdro-2H-püranüül, 5-6-

dihüdro-2H-püranüül, 2H-püranüül, 1,2,3,4-tetrahüdropüridinüül ja 1,2,5,6-

tetrahüdropüridinüül. Heterotsükloalkenüülrühm võib olla C-sidemega või N-

sidemega, st see võib olla seotud ülejäänud molekuliga süsiniku aatomi või

lämmastiku aatomi kaudu.20

Termin „heteroalkünüül“ hõlmab alkünüülrühmi, milles kuni kolm süsiniku aatomit,

teatud teostusviisis kuni kaks süsiniku aatomit, järgmises teostusviisis üks süsiniku

aatom on kõik sõltumatult asendatud O, S(O)q või N-iga tingimusel, et vähemalt üks

alkünüüli süsiniku aatomitest jääb alles. Heteroalkünüülrühm võib olla C-sidemega

või hetero-sidemega, st see võib olla seotud ülejäänud molekuliga süsiniku aatomi25

või O, S(O)q või N-i kaudu.

Termin „heterotsükloalkünüül“ hõlmab tsükloalkünüülrühmi, milles kuni kolm

süsiniku aatomit, teatud teostusviisis kuni kaks süsiniku aatomit, järgmises

teostusviisis üks süsiniku aatom on kõik sõltumatult asendatud O, S(O)q või N-iga

tingimusel, et vähemalt üks tsükloalkünüüli süsiniku aatomitest jääb alles.30

31 EE – EP2750707 B1

Heterotsükloalkenüülrühm võib olla C-sidemega või N-sidemega, st see võib olla

seotud ülejäänud molekuliga süsiniku aatomi või lämmastiku aatomi kaudu.

Termin „heteroalküleen“ hõlmab alküleenrühmi, milles kuni kolm süsiniku aatomit,

teatud teostusviisis kuni kaks süsiniku aatomit, järgmises teostusviisis üks süsiniku

aatom on kõik sõltumatult asendatud O, S(O)q või N-iga tingimusel, et vähemalt üks5

alküleeni süsiniku aatomitest jääb alles.

Termin „heteroalkenüleen“ hõlmab alkenüleenrühmi, milles kuni kolm süsiniku

aatomit, teatud teostusviisis kuni kaks süsiniku aatomit, järgmises teostusviisis üks

süsiniku aatom on kõik sõltumatult asendatud O, S(O)q või N-iga tingimusel, et

vähemalt üks alkenüleeni süsiniku aatomitest jääb alles.10

Termin „heteroalkünüleen“ hõlmab alkünüleenrühmi, milles kuni kolm süsiniku

aatomit, teatud teostusviisis kuni kaks süsiniku aatomit, järgmises teostusviisis üks

süsiniku aatom on kõik sõltumatult asendatud O, S(O)q või N-iga tingimusel, et

vähemalt üks alkünüleeni süsiniku aatomitest jääb alles.

Arüül15

Termin „arüül“ hõlmab monovalentseid aromaatseid tsüklilisi hüdrokarbüülrühmi,

nagu fenüüli või naftüüli (nt 1-naftüüli või 2-naftüüli). Üldiselt võivad arüülrühmad

olla monotsüklilised või polütsüklilised liitringi aromaatsed rühmad. Eelistatud arüül

on C6–C14arüül.

Arüülrühmade teised näited on atseantrüleeni, atsenaftüleeni, atsefeenantrüleeni,20

antratseeni, asuleeni, krüseeni, koroneeni, fluoranteeni, fluoreeni, as-indatseeni, s-

indatseeni, indeeni, naftaleeni, ovaleeni, perüleeni, fenaleeni, fenantreeni, pitseeni

(picene), pleiadeeni, püreeni, pürantreeni ja rubitseeni monovalentsed derivaadid.

Termin „arüülalküül“ tähendab alküüli, mis on asendatud arüülrühmaga, nt bensüül.

Termin „arüleen“ hõlmab divalentseid aromaatseid tsüklilisi hüdrokarbüülrühmi,25

nagu fenüleeni. Üldiselt võivad arüleenrühmad olla monotsüklilised või

polütsüklilised liitringiga aromaatsed rühmad. Eelistatud arüleen on C6–C14arüleen.

Arüleenrühmade muud näited on atseantrüleeni, atsenaftüleeni, atsefeenantrüleeni,

antratseeni, asuleeni, krüseeni, koroneeni, fluoranteeni, fluoreeni, as-indatseeni, s-

32 EE – EP2750707 B1

indatseeni, indeeni, naftaleeni, ovaleeni, perüleeni, fenaleeni, fenantreeni, pitseeni,

pleiadeeni, püreeni, pürantreeni ja rubitseeni divalentsed derivaadid.

Heteroarüül

Termin „heteroarüül“ hõlmab monovalentseid heteroaromaatseid tsüklilisi

hüdrokarbüülrühmi, mis lisaks sisaldavad ühte või mitut O, S-i, N-i ja NRN-i hulgast5

sõltumatult valitud heteroaatomit, milles RN on määratletud allpool (ning teatud

teostusviisis on H alküül (nt C1–6alküül)).

Üldiselt võivad heteroarüülrühmad olla monotsüklilised või polütsüklilised (nt

bitsüklilised) liitringiga heteroaromaatsed rühmad. Teatud teostusviisis sisaldavad

heteroarüülrühmad 5–13 ringi liiget (soovitatavalt 5–10 liiget) ning 1, 2, 3 või 4 ringi10

heteroaatomit valitakse sõltumatult O, S-i, N-i ja NRN-i hulgast. Teatud teostusviisis

võib heteroarüülrühm olla 5-, 6-, 9- või 10-liikmeline, nt 5-liikmeline monotsükliline,

6-liikmeline monotsükliline, 9-liikmeline bitsükliline liitring või 10-liikmeline

bitsükliline liitring.

Monotsükliliste heteroaromaatsete rühmade seas on heteroaromaatsed rühmad,15

mis sisaldavad 5–6 ringi liiget ning 1, 2, 3 või 4 heteroaatomit, mis valitakse O, S-i,

N-i või NRN-i hulgast.

Teatud teostusviisis sisaldavad 5-liikmelised monotsüklilised heteroarüülrühmad 1

ringi liiget, mis on -NRN-rühm, -O-aatom või -S-aatom, ning soovi korral 1–3 ringi

liiget (nt 1 või 2 ringi liiget), mis on =N-aatomid (milles ülejäänud 5 ringi liiget on20

süsiniku aatomid).

5-liikmeliste monotsükliliste heteroarüülrühmade näited on pürrolüül, furanüül,

tiofenüül, pürasolüül, imidasolüül, isoksasolüül, oksasolüül, isotiasolüül, tiasolüül,

1,2,3-triasolüül, 1,2,4-triasolüül, 1,2,3-oksadiasolüül, 1,2,4-oksadiasolüül, 1,2,5-

oksadiasolüül, 1,3,4-oksadiasolüül, 1,3,4-tiadiasolüül, püridüül, pürimidinüül,25

püridasinüül, pürasinüül, 1,3,5-triasinüül, 1,2,4-triasinüül, 1,2,3-triasinüül ja

tetrasolüül.

6-liikmeliste monotsükliliste heteroarüülrühmade näited on püridinüül, püridasinüül,

pürimidinüül ja pürasinüül.

33 EE – EP2750707 B1

Teatud teostusviisis sisaldavad 6-liikmelised monotsüklilised heteroarüülrühmad 1

või 2 ringi liiget, mis on =N-aatomid (milles ülejäänud 6 ringi liiget on süsiniku

aatomid).

Bitsüklilised heteroaromaatsed rühmad hõlmavad liitringiga heteroaromaatseid

rühmi, mis sisaldavad 9–13 ringi liiget ning 1, 2, 3, 4 või enamat heteroaatomit, mis5

valitakse O, S-i, N-i või NRN-i hulgast.

Teatud teostusviisis sisaldavad 9-liikmelised bitsüklilised heteroarüülrühmad 1 ringi

liiget, mis on -NRN-rühm, -O-aatom või -S-aatom, ning soovi korral 1–3 ringi liiget

(nt 1 või 2 ringi liiget), mis on =N-aatomid (milles ülejäänud 9 ringi liiget on süsiniku

aatomid).10

9-liikmeliste liitringiga bitsükliliste heteroarüülrühmade näited on bensofuranüül,

bensotiofenüül, indolüül, bensimidasolüül, indasolüül, bensotriasolüül, pürrolo[2,3-

b]püridinüül, pürrolo[2,3-c]püridinüül, pürrolo[3,2-c]püridinüül, pürrolo[3,2-

b]püridinüül, imidaso[4,5-b]püridinüül, imidaso[4,5-c]püridinüül, pürasolo[4,3-

d]püridinüül, pürasolo[4,3-c]püridinüül, pürasolo[3,4-c]püridinüül, pürasolo[3,4-15

b]püridinüül, isoindolüül, indasolüül, purinüül, indolininüül, imidaso[1,2-a]püridinüül,

imidaso[1,5-a]püridinüül, pürasolo[1,2-a]püridinüül, pürrolo[1,2-b]püridasinüül ja

imidaso[1,2-c]pürimidinüül.

Teatud teostusviisis sisaldavad 10-liikmelised bitsüklilised heteroarüülrühmad 1–3

ringi liiget, mis on =N-aatomid (milles ülejäänud 10 ringi liiget on süsiniku aatomid).20

10-liikmeliste liitringiga bitsükliliste heteroarüülrühmade näited on kinolinüül,

isokinolinüül, tsinnolinüül, kinasolinüül, kinoksalinüül, ftalasinüül, 1,6-naftüridinüül,

1,7-naftüridinüül, 1,8-naftüridinüül, 1,5-naftüridinüül, 2,6-naftüridinüül, 2,7-

naftüridinüül, pürido[3,2-d]pürimidinüül, pürido[4,3-d]pürimidinüül, pürido[3,4-

d]pürimidinüül, pürido[2,3-d]pürimidinüül, pürido[2,3-b]pürasinüül, pürido[3,4-25

b]pürasinüül, pürimido[5,4-d]pürimidinüül, pürasino[2,3-b]pürasinüül ja

pürimido[4,5-d]pürimidinüül.

Termin „heteroarüülalküül“ tähendab heteroarüülrühmaga asendatud alküüli.

34 EE – EP2750707 B1

Termin „heteroarüleen“ hõlmab divalentseid heteroaromaatseid tsüklilisi

hüdrokarbüülrühmi, mis sisaldavad veel ühte või mitut O, S-i, N-i ja NRN-i hulgast

sõltumatult valitud heteroaatomit, milles RN on määratletud allpool (ning teatud

teostusviisis on H või alküül (nt C1–6alküül)). Üldiselt võivad heteroarüleenrühmad

olla monotsüklilised või polütsüklilised (nt bitsüklilised) liitringiga heteroaromaatsed5

rühmad. Teatud teostusviisis sisaldavad heteroarüleenrühmad 5–13 ringi liiget

(soovitatavalt 5–10 liiget) ning 1, 2, 3 või 4 ringi heteroaatomit, mis valitakse

sõltumatult O, S-i, N-i ja NRN-i hulgast. Teatud teostusviisis võib heteroarüleenrühm

olla 5-, 6-, 9- või 10-liikmeline, nt 5-liikmeline monotsükliline, 6-liikmeline

monotsükliline, 9-liikmeline bitsükliline liitring või 10-liikmeline bitsükliline liitring.10

Termin „heteroarüleen“ hõlmab iga eespool käsitletud heteroarüülrühma

divalentseid derivaate.

Terminid „arüül“, „aromaatne“, „heteroarüül“ ja „heteroaromaatne“ hõlmavad ka

osaliselt taandatud rühmasid. Järelikult hõlmab näiteks „heteroarüül“ ühendatud

liike, milles üks või mitu ringi on taandatud küllastunud ringiks (nt 1,2,3,4-tetrahüdro-15

1,8-naftüridiin-2-üüliks).

Üldine

Kui rühmade kombinatsioone on siin nimetatud üheks osaks, nt arüülalküüliks,

sisaldab viimane nimetatud rühm aatomit, millega osa on ülejäänud molekulile

kinnitunud, kui ei ole selgelt märgitud teisiti.20

Kui on viidatud alküülrühma või O, S(O)q, N-i või P(O)r-iga asendatava muu rühma

süsiniku aatomile, on mõeldud seda, et

asemel on

25

35 EE – EP2750707 B1

(milles E ei saa olla H);

-CH= on asendatud -N=-iga või -P(O)r=-iga;

≡C-H on asendatud ≡N-iga või ≡P(O)r-iga; või

-CH2- on asendatud -O-, -S(O)q-, -NRN-i või -P(O)rRN-iga, milles RN on H või

soovi korral asendatud C1–6alküül, C1–6heteroalküül, C3–6tsükloalküül, C3–5

6heterotsükloalküül, C2–6alkenüül, C2–6heteroalkenüül, C3–6tsükloalkenüül,

C3–6heterotsükloalkenüül, fenüül või heteroarüül, mis sisaldab 5 või 6 ringi

liiget. RN on soovitatavalt H, C1–6alküül või C3–6tsükloalküül;

q on sõltumatult 0, 1 või 2. Teatud teostusviisis on q 0;

r on sõltumatult 0 või 1. Teatud teostusviisis on r 0.10

Kui on viidatud Si-ga asendatavale süsiniku aatomile, on mõeldud seda, et süsiniku

aatom on asendatud räni aatomiga, kuid sidemed jäävad muidu samaks. Järelikult,

näiteks -CH2- asendatakse -SiH2-ga; -CH= asendatakse -SiH=-ga ning ≡C-H

asendatakse ≡Si-H-ga.

Kui on esitatud süsiniku aatomite arv, näiteks C3–6heteroalküül, on selguse huvides15

seoses eespool mainitud heteroaatomit sisaldavate rühmadega (nagu

heteroalküüliga jne) mõeldud C3–6alküüli põhjal rühma, milles üks või mitu 3–6 ahela

süsiniku aatomist on asendatud O, S(O)q või N-iga. Järelikult sisaldaks C3–

6heteroalküülrühm näiteks vähem kui 3–6 ahela süsiniku aatomit. Järgmise näitena

liigitataks püridüülrühm C6 heteroarüülrühmaks, kuigi see sisaldab 5 süsiniku20

aatomit.

Asendamine

Leiutises kasutatavate ühendite rühmad (nt alküül-, tsükloalküül-, alkoksü-,

alkenüül-, tsükloalkenüül-, alkünüül-, alküleen-, alkenüleen-, heteroalküül-,

heterotsükloalküül-, heteroalkenüül-, heterotsükloalkenüül-, heteroalkünüül-,25

heteroalküleen-, heteroalkenüleenarüül-, arüülalküül-, arüülheteroalküül-,

heteroarüül-, heteroarüülalküül- või heteroarüülheteroalküülrühmad jne) võivad olla

asendatud või asendamata, teatud teostusviisis asendamata. Tavaliselt hõlmab

36 EE – EP2750707 B1

asendamine vesiniku aatomi mõttelist asendamist asendajarühmaga või =O-ga

asendamise korral kahe vesiniku aatomi asendamist.

Asenduse korral on igal rühmal üldiselt 1 kuni 5 asendajat, teatud teostusviisis 1

kuni 3 asendajat, teatud teostusviisis 1 või 2 asendajat, teatud teostusviisis 1

asendaja. Üks teostusviis hõlmab enam kui ühte asendajat samal aatomil, nt5

atsetaalrühma.

Teatud teostusviisis on asendaja(d) sõltumatult Sub1 või Sub2 (teatud teostusviisis

Sub2), kusjuures

Sub1 on sõltumatult halogeen, trihalometüül, trihaloetüül, -NO2, -

CN, -N+(Rs)2O-, -CO2H, -CO2Rs, -SO3H, -SORs, -SO2Rs, -SO3Rs, -10

OC(=O)ORs, -C(=O)H, -C(=O)Rs, -OC(=O)Rs, =O, -NRs2, -C(=O)NH2, -

C(=O)NRs2, -N(Rs)C(=O)ORs, -N(Rs)C(=O)NRs2, -OC(=O)NRs2, -

N(Rs)C(=O)Rs, -C(=S)NRs2, -NRsC(=S)Rs, -SO2NRs2, -NRsSO2Rs, -

N(Rs)C(=S)NRs2, -N(Rs)SO2NRs2, -Rs või -ZsRs, kusjuures

Zs on sõltumatult O, S või NRs;15

Rs on sõltumatult H või C1–6alküül, C1–6heteroalküül, -(alka)f-C3–

6tsükloalküül, -(alka)f-C3–6heterotsükloalküül, C2–6alkenüül, C2–

6heteroalkenüül, -(alka)f-C3–6tsükloalkenüül, -(alka)f-C3–

6heterotsükloalkenüül, C2–6alkünüül, C2–6heteroalkünüül, -(alka)f-C6–

14arüül, -(alka)f-C6–14arüül või -(alka)f-heteroarüül (milles heteroarüül20

sisaldab 5–13 ringi liiget), milles

f on 0 või 1;

alka on C1–6alküleen või C1–6heteroalküleen; ning

Rs on soovi korral ise asendatud (teatud teostusviisis

asendamata) 1 kuni 3 asendajaga Sub2;25

Sub2 on sõltumatult halogeen, trihalometüül, trihaloetüül, -NO2, -CN, -N+(C1–

6alküül)2O-, -CO2H , -CO2C1–6alküül, -SO3H, -SOC1–6alküül, -SO2C1–6alküül,

-SO3C1–6alküül, -OC(=O)OC1–6alküül, -C(=O)H, -C(=O)C1–

37 EE – EP2750707 B1

6alküül, -OC(=O)C1–6alküül, =O, -N(C1–6alküül)2, -C(=O)NH2, -C(=O)N(C1–

6alküül)2, -N(C1–6alküül)C (=O)O(C1–6alküül), -N(C1–6alküül)C(=O)N(C1–

6alküül)2, -OC(=O)N(C1–6alküül)2, -N(C1–6alküül)C(=O)C1–6alküül, -

C(=S)N(C1–6alküül)2, -N(C1–6alküül)C(=S)C1–6alküül, -SO2N(C1–6alküül)2, -

N(C1–6alküül)SO2C1–6alküül, -N(C1–6alküül)C(=S)N(C1–6alküül)2, -N(C1–5

6alküül)SO2N(C1–6alküül)2, -C1–6alküül, -C1–6heteroalküül, -C3–

6tsükloalküül, -C3–6heterotsükloalküül, -C2–6alkenüül, -C2–6heteroalkenüül, -

C3–6tsükloalkenüül, -C3–6heterotsükloalkenüül, -C2–6alkünüül, -C2–

6heteroalkünüül, -C6–14arüül, -C5–13heteroarüül, -Zt-C1–6alküül, -Zt-C3–

6tsükloalküül, -Zt-C2–6alkenüül,-Zt-C3–6tsükloalkenüül või -Zt-C2–6alkünüül;10

ning Zt on sõltumatult O, S, NH või N(C1–6alküül).

Kuigi Rs-i võib asendajas Sub1 soovi korral asendada 1 kuni 3 asendajaga Sub2, on

Sub2 asendamata. Kuid teatud teostusviisis on Rs asendamata.

Teatud teostusviisis on Rs H või C1–6alküül, mis on soovi korral asendatud 1 kuni 3

asendajaga Sub2.15

Teatud teostusviisis on Sub2 sõltumatult halogeen, trihalometüül, trihaloetüül, -NO2,

-CN, -N+(C1–6alküül)2O-, -CO2H, -SO3H, -SOC1–6alküül, -SO2C1–6alküül, -

C(=O)H, -C(=O)C1–6alküül, =O, -N(C1–6alküül)2, -C(=O)NH2, -C1–6alküül, -C3–

6tsükloalküül, -C3–6heterotsükloalküül,-Zt-C1–6alküül või -Zt-C3–6tsükloalküül.

Kui teatud teostusviisis on asendatud rühm atsükliline (nt alküül, heteroalküül,20

alkenüül jne), ei ole Sub1 -Rs ning Sub2 ei ole -C1–6alküül, -C1–6heteroalküül, -C2–

6alkenüül, -C2–6heteroalkenüül, -C2–6alkünüül ega -C2–6heteroalkünüül.

Kui Sub2-st erineval rühmal on vähemalt 2 positsiooni, mida võib asendada, võib

rühma asendada alküleen-, alkenüleen-, alkünüleen-, heteroalküleen-,

heteroalkenüleen- või heteroalkünüleenahela mõlema otsaga (sisaldades teatud25

teostusviisis 1 kuni 6 aatomit, järgmises teostusviisis 3 kuni 6 aatomit ning

täiendavas teostusviisis 3 või 4 aatomit), et tsüklilist osa moodustada. See ahel

asendatakse soovi korral 1 kuni 3 asendajaga Sub2. Teatud teostusviisis seda

ahelat ei asendata. Järelikult hõlmavad terminid soovi korral asendatud

„tsükloalküül“, „tsükloalkenüül“, „tsükloalkünüül“, „heterotsükloalküül“,30

38 EE – EP2750707 B1

„heterotsükloalkenüül“, „heterotsükloalkünüül“, „arüül“ ja „heteroarüül“ ühendatud

liike. Nt hõlmab „soovi korral asendatud tsükloalküül“ liike, milles kaks tsükloalküüli

ringi on ühendatud ning „soovi korral asendatud heteroarüül“ hõlmab liike, milles

heterotsükloalküüli ring on ühendatud aromaatse ringiga (nt 5,6,7,8-tetrahüdro-1,8-

naftüridiin-2-üül).5

Kui Sub2-st erineval rühmal on aatom, mida võib asendada kaks korda, võib selle

aatomi asendada alküleen-, alkenüleen-, alkünüleen-, heteroalküleen-,

heteroalkenüleen- või heteroalkünüleenahela mõlema otsaga (sisaldades teatud

teostusviisis 2 kuni 8 aatomit, täiendavas teostusviisis 3 kuni 6 aatomit ning

lisateostusviisis 4 või 5 aatomit), et tsüklilist osa moodustada. See ahel asendatakse10

soovi korral 1 kuni 3 asendajaga Sub2. Teatud teostusviisis seda ahelat ei asendata.

Järelikult hõlmavad terminid soovi korral „tsükloalküül“, „tsükloalkenüül“,

„tsükloalkünüül“, „heterotsükloalküül“, „heterotsükloalkenüül“,

„heterotsükloalkünüül“, „arüül“ ja „heteroarüül“ spiro-liike.

Selguse huvides võib asendaja siduda heteroaatomiga, kui rühmal on heteroaatom.15

Järelikult hõlmab näiteks „soovi korral asendatud heteroalküül“ -CH2-N(Sub1)-CH2-,

-CH(Sub1)-NH-CH2- ja -CH(Sub1)-N(Sub1)-CH2- jne.

Laiendiga terminid

Kui loetelule eelneb laiend, on mõeldud seda, et laiend kehtib loetelu iga artikli

kohta. Näiteks väljend „soovi korral asendatud C3–20-heterotsükloalküül-, C3–20-20

heterotsükloalkenüül-, C3–20-heterotsükloalkünüül- või C5–20-heteroarüülrühm“

tähendab, et loetelu iga artikli, nimelt C3–20-heterotsükloalküülrühma, C3–20-

heterotsükloalkenüülrühma, C3–20-heterotsükloalkünüülrühma ja C6–20-

heteroarüülrühma võib soovi korral asendada.

Kui rühma iseloomustatakse esimese laiendiga ning seejärel hiljem25

iseloomustatakse sama rühma järgmise laiendiga, on mõeldud seda, et rühmale on

iseloomulikud mõlemad laiendid samal ajal. Näiteks kui rühma on kirjeldatud kui

„C3–20-heterotsükloalkünüül-“ (esimene laiend) rühma ning hiljem on sama rühma

kirjeldatud kui „C5–16-“ (järgmine laiend) rühma, on mõeldud C5–16-

heterotsükloalkünüülrühma.30

39 EE – EP2750707 B1

Steroidid

Siin kasutatud termin „steroid“ viitab mis tahes rühmale, mis sisaldab järgmist

struktuuri (seda nimetatakse siin „steroidskeletiks“).

Üksnes illustreerimise eesmärgil on steroidskelett eespool joonistatud täielikult5

küllastununa. Kuid termin steroid hõlmab ka juhtusid, milles steroidskeletis esineb

küllastumatus. Näiteks hõlmab termin steroid rühma, mis sisaldab täiesti

küllastumata (mancude) põhiskeletti, 15H-tsüklopenta[a]fenantreeni:

Termin steroid hõlmab ka rühma, mis sisaldab osaliselt küllastumata steroidskeletti.10

Termin steroid hõlmab ka steroidskeleti „seco-“ derivaate, st rühmi, milles on tehtud

ringi lõhustamine; „steroidskeleti nor-“ ja „homo-“ derivaate, mis hõlmavad vastavalt

ringi kokkutõmbumist ja laienemist (vaata „Systemic Nomenclature of Organic

Chemistry“ autorilt D. Hellwinkel, avaldanud Springer, 2001, ISBN: 3-540-41138-0,

„seco-“ puhul lehekülg 203 ning „nor-“ ja „homo-„ puhul lehekülg 204). Kuid teatud15

teostusviisis ei hõlma termin „steroid“ taolisi seco-derivaate. Järgmises teostusviisis

ei hõlma „steroid“ taolisi nor-derivaate. Järgmises teostusviisis ei hõlma „steroid“

taolisi homo-derivaate. Järelikult ei hõlma termin „steroid“ teatud teostusviisis taolisi

seco-, nor- ega homo-derivaate.

Termin steroid hõlmab ka juhtusid, milles üks või mitu süsiniku aatomit on20

steroidskeletinimelises struktuuris asendatud heteroaatomiga. Ühes taolises

teostusviisis on kuni kuus süsiniku aatomit, teatud teostusviisis kuni viis süsiniku

aatomit, järgmises teostusviisis kuni neli süsiniku aatomit, järgmises teostusviisis

40 EE – EP2750707 B1

kuni kolm süsiniku aatomit, järgmises teostusviisis kuni kaks süsiniku aatomit,

järgmises teostusviisis üks süsiniku aatom kõik sõltumatult asendatud O, S(O)q, N-

i, P(O)r-i või Si-ga (ja soovitatavalt O, S(O)q või N-iga). Kuid teatud teostusviisis

hõlmab termin „steroid“ liike, milles „põhiline steroidskelett“ ei sisalda ühtegi

heteroaatomit.5

Steroidi tsükli üsteem on nummerdatud allpool esitatud kokkuleppe kohaselt.

Termin steroid hõlmab steroole, steroidhormoone, sapphappeid ning sapphappe

soolasid. Sterool on mis tahes steroid hüdroksüülrühmaga A-ringi 3-positsioonil.

Küllastumatus10

Standardkasutuse kohaselt viitab oomega-3 positsioon kolmandale sidemele ahela

(metüül-)otsast; oomega-6 positsioon viitab kuuendale sidemele ahela

(metüül-)otsast ning oomega-9 positsioon viitab üheksandale sidemele ahela

(metüül-)otsast.

Üldine15

Kui ei ole märgitud teisiti, kasutatakse käesoleva leiutise rakendamisel keemia,

biokeemia, molekulaarbioloogia, immunoloogia ja farmakoloogia tavapäraseid

meetodeid, mida valdkonnas pädevad isikud teavad. Taolisi võtteid on

erialakirjanduses täielikult selgitatud. Vaata nt viiteid 34–40 jne.

Termin „hõlmab“ tähendab „sisaldama“ ning „koosnema“, nt koostis „hõlmab“ X-i20

võib koosneda ainult X-ist või sisaldada midagi veel, nt X + Y.

Seoses numbrilise väärtusega x on termin „umbes“ valikuline ning tähendab näiteks

x ± 10%.

41 EE – EP2750707 B1

Sõna „põhiliselt“ ei välista „täielikult“, nt Y-ist „põhiliselt vaba“ koostis võib olla Y-ist

täielikult vaba. Vajadusel võib sõna „põhiliselt“ leiutise definitsioonist välja jätta.

Viited laengule, katioonidele, anioonidele, tsvitterioonidele jne on võetud pH-l 7.

TLR3 on Tolli-sarnane retseptor 3. See on üksik membraani kattev retseptor, mis

mängib loomulikus immuunsüsteemis põhirolli. Tuntud TLR3 agonistide seas on5

polü(I:C). „TLR3“ on heakskiidetud HGNC nimi seda retseptorit kodeerivale geenile

ning selle unikaalne HGNC ID on HGNC:11849. RefSeq järjestus inimese TLR3

geenile on GI:2459625.

TLR7 on Tolli-sarnane retseptor 7. See on üksik membraani kattev retseptor, mis

mängib loomulikus immuunsüsteemis põhirolli. Tuntud TLR7 agonistide seas on nt10

imikvimood. „TLR7“ on heakskiidetud HGNC nimi seda retseptorit kodeerivale

geenile ning selle unikaalne HGNC ID on HGNC:15631. RefSeq järjestus inimese

TLR7 geenile on GI:67944638.

TLR8 on Tolli-sarnane retseptor 8. See on üksik membraani kattev retseptor, mis

mängib loomulikus immuunsüsteemis põhirolli. Tuntud TLR8 agonistide seas on nt15

resikvimood. „TLR8“ on heakskiidetud HGNC nimi seda retseptorit kodeerivale

geenile ning selle unikaalne HGNC ID on HGNC:15632. RefSeq järjestus inimese

TLR8 geenile on GI:20302165.

RIG-I-sarnase retseptori („RLR-i“) perekond hõlmab erinevaid RNA helikaase, mis

mängivad loomulikus immuunsüsteemis põhirolli [41]. RLR-1-l (tuntud ka kui RIG-I20

ehk retinoehappe indutseeritav geen I) on kaks kaspaasi värbavat domeeni oma N-

otsa lähedal. Heakskiidetud HGNC nimi RLR-1 helikaasi kodeerivale geenile on

„DDX58“ (ehk DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box-polüpeptiidile 58) ning unikaalne

HGNC ID on HGNC:19102. RefSeq järjestus inimese RLR-1 geenile on

GI:77732514. RLR-2-l (tuntud ka kui MDA5 ehk melanoomi diferentseerumisega25

seotud geen 5) on ka kaks kaspaasi värbamise domeeni oma N-otsa lähedal.

Heakskiidetud HGNC nimi RLR-2 helikaasi kodeerivale geenile on „IFIH1“ (ehk

helikaas C domeeni 1 indutseeritud interferoon) ning unikaalne HGNC ID on

HGNC:18873. RefSeq järjestus inimese RLR-2 geenile on GI:27886567. RLR-3-l

(tuntud ka kui LGP2 ehk geneetika ja füsioloogia labor 2) ei ole ühtegi kaspaasi30

42 EE – EP2750707 B1

värbamise domeeni. Heakskiidetud HGNC nimi RLR-3 helikaasi kodeerivale geenile

on „DHX58“ (ehk DEXH (Asp-Glu-X-His) box-polüpeptiidile 58) ning unikaalne

HGNC ID on HGNC:29517. RefSeq järjestus inimese RLR-3 geenile on

GI:149408121.

PKR on kaheahelaline RNA-sõltuv valgukinaas. See mängib loomulikus5

immuunsüsteemis põhirolli. „EIF2AK2“ (ehk eukarüootse translatsiooni käivitamise

faktor 2-alfa kinaas 2) on heakskiidetud HGNC nimi seda ensüümi kodeerivale

geenile ning selle unikaalne HGNC ID on HGNC:9437. RefSeq järjestus inimese

PKR geenile on GI:208431825.

JOONISTE LÜHIKIRJELDUS10

Joonisel fig 1 on näidatud RNA-ga värvitud geel. Ribad näitavad (1)

markereid, (2) paljast replikoni, (3) replikoni pärast RNaasiga töötlemist, (4)

liposoomi kapseldatud replikoni, (5) liposoomi pärast RNaasiga töötlemist,

(6) RNaasiga töödeldud liposoomi, mis edastati seejärel fenooli/kloroformiga

ekstraktsiooni.15

Joonisel fig 2 on näidatud RNA-ga värvitud geel. Ribad näitavad (1)

markereid, (2) paljast replikoni, (3) liposoomi kapseldatud replikoni, (4)

liposoomi pärast RNaasiga töötlemist, mis edastati seejärel

fenooli/kloroformiga ekstraktsiooni.

Joonisel fig 3 on näidatud valgu ekspressioon (valguse suhtelistes ühikutes20

RLU) 1, 3 ja 6 päeva pärast RNA transportimist liposoomidesse erineva

pikkusega PEG-dega: 1 kDa (kolmnurgad); 2 kDa (ringid); 3 kDa (ruudud).

Joonisel fig 4 on näidatud valgu ekspressioon 1, 3 ja 6 päeva pärast RNA

transportimist virioni pakitud replikonina (ruudud), puhta RNA-na (rombid) või

liposoomides (+ = 0,1 µg, x = 1 µg).25

Joonisel fig 5 on näidatud log10 F-spetsiifilised IgG tiitrid BALB/c hiirtel. 5

rühma PEG pikkused olid vasakult paremale 1, 2, 3, 5 või 10 kDa. Ringid

näitavad tiitreid 2 nädalat pärast 1 süsti; kolmnurgad näitavad tiitreid 2

nädalat pärast teist süsti; tulbad tähistavad kahe tiitri keskmist.

43 EE – EP2750707 B1

LEIUTISE TEOSTAMISE VIISID

RNA replikonid

Allpool on kasutatud erinevaid replikone. Üldiselt põhinevad need hübriidsel

alfaviiruse genoomil, millel on mittestrukturaalsed valgud Venetsueela hobuste

entsefaliidi viiruselt (VEEV-lt), pakkimise signaal VEEV-lt ning 3’ UTR-i Sindbisi5

viiruselt või VEEV mutandilt. Replikon on umbes 10 kb pikkune ja sellel on polü-A

saba.

Plasmiidi DNA-d kodeerivad alfaviiruse replikonid (nimega: pT7-mVEEV-FL.RSVF

ehk A317; pT7-mVEEV-SEAP ehk A306; pSP6-VCR-GFP ehk A50) toimisid

matriitsina RNA in vitro sünteesimiseks. Replikonid sisaldavad RNA replikatsiooniks10

vajalikke alfaviiruse geneetilisi elemente, kuid neil puuduvad osakeste

kokkupanekuks vajalikud kodeerivad geenisaadused; strukturaalsed valgud

asendatakse hoopis huvipakkuva valguga (kas reporteriga, nagu SEAP või GFP-

ga, või immunogeeniga, nagu täispika RSV F valguga) ning seetõttu ei suuda

replikonid nakkuslike osakeste põlvkonda indutseerida. Alfaviiruse cDNA suhtes15

ülesvoolu bakteriofaagi (T7 või SP6) promootor soodustab replikon-RNA in vitro

sünteesi ning polü(A)-saba suhtes vahetult allavoolu D-hepatiidi viiruse (HDV)

ribosüüm loob õige 3’-otsa ise lõhustuva aktiivsuse kaudu.

Pärast HDV ribosüümi suhtes allavoolu plasmiidi DNA lineariseerimist sobiva

restriktsiooni endonukleaasiga sünteesiti run-off transkriptid in vitro, kasutades T720

või SP6 bakteriofaagist saadud DNA-sõltuvat RNA polümeraasi. Transkriptsioone

tehti 2 tundi temperatuuril 37 °C 7,5 mM (T7 RNA polümeraas) või 5 mM (SP6 RNA

polümeraas) iga nukleosiidi trifosfaadi (ATP, CTP, GTP ja UTP) juuresolekul tootja

(Ambion) antud juhiseid järgides. Pärast transkriptsiooni lagundati DNA matriitsi

ensüümiga TURBO DNase (Ambion). Replikon-RNA sadestati LiCl-iga ning taastati25

nukleaasivabas vees. Mütsistamata RNA mütsistati transkriptsioonijärgselt

vaktsiinia viirusel põhineva mütsistamise vaktsiiniga (VCE), kasutades süsteemi

ScriptCap m7G Capping System (Epicentre Biotechnologies) vastavalt

kasutusjuhendile; niimoodi mütsistatud replikonidele lisatakse eesliide „v“, nt vA317

on VCE-ga mütsistatud A317 replikon. Transkriptsioonijärgselt mütsistatud RNA30

sadestati LiCl-iga ning taastati nukleaasivabas vees. RNA proovide

44 EE – EP2750707 B1

kontsentratsioon määrati kindlaks OD260nm mõõtmisel. In vitro transkriptide

terviklikkust kinnitati denatureerival agaroos-geelelektroforeesil.

Liposomaalne kapseldamine

RNA kapseldati liposoomidesse, mis tehti sisuliselt viite 9 ja 42 meetodiga. Lühidalt,

lipiidid lahustati etanoolis, RNA replikon lahustati puhvris ning need segati puhvriga,5

millele järgnes tasakaalustamine. Segu lahjendati puhvriga, seejärel see filtreeriti.

Tekkiv saadus sisaldas liposoome, millel oli suur kapseldumise tõhusus.

Liposoomid valmistati 10% DSPC-st (tsvitterioonne), 40% DlinDMA-st (katioonne),

48% kolesteroolist ja 2% PEG-konjugeeritud DMG-st. Need proportsioonid viitavad

mooliprotsentidele koguliposoomis.10

DlinDMA (1,2-dilinoleüüloksü-N,N-dimetüül-3-aminopropaan) sünteesiti viite 4

protseduuri kasutades. DSPC (1,2-diastearoüül-sn-glütsero-3-fosfokoliin) osteti

ettevõttelt Genzyme. Kolesterool saadi ettevõttelt Sigma-Aldrich. PEG-

konjugeeritud DMG (1,2-dimüristoüül-sn-glütsero-3-fosfoetanoolamiin-N-

[metoksü(polüetüleenglükool), ammooniumsool), DOTAP (1,2-dioleoüül-3-15

trimetüülammonium-propaan, kloriidsool) ja DC-chol (3β-[N-(N’,N’-

dimetüülaminoethane)-karbamoüül]kolesterool-vesinikkloriid) saadi ettevõttelt

Avanti Polar Lipids.

Mõnes liposoomis kasutati DlinDMA asemel alternatiivseid katioonseid lipiide, nt

RV05 või RV17:20

45 EE – EP2750707 B1

Üldiselt on liposoomide valmistamiseks kasutatud kaheksat erinevat meetodit. Neile

viidatakse tekstis kui meetoditele (A) kuni (H) ning need erinevad peamiselt

filtratsiooni ja TFF-i etappide poolest. Üksikasjad on järgmised:

(A) valmistati värsked lipiidi lähtelahused etanoolis. Kaaluti 37 mg DlinDMA-

d, 11,8 mg DSPC-d, 27,8 mg kolesterooli ja 8,07 mg PEG-DMG 2000 ning5

need lahustati 7,55 ml etanoolis. Värskelt valmistatud lipiidi lähtelahust

loksutati õrnalt temperatuuril 37 °C umbes 15 min, et homogeenset segu

moodustada. Seejärel lisati 755 µl lähtelahust 1,245 ml etanooli, et

valmistada töötamiseks lipiidi lähtelahust 2 ml. Seda lipiidide kogust kasutati

liposoomide valmistamiseks 250 µg RNA-ga. 2 ml RNA töölahust valmistati10

ka ∼1 µg/µl lähtelahusest 100 mM tsitraatpuhvris (pH 6). Kolme 20 ml

klaasviaali (segamisvardaga) loputati RNase Away lahusega (Molecular

BioProducts) ning pesti enne kasutamist piisavas koguses MilliQ veega, et

viaale RNaaside saastumisest puhastada. Ühte viaali kasutati RNA

töölahuse jaoks ning teisi lipiidi ja RNA segude kogumiseks (nagu15

kirjeldatakse edaspidi). Lipiidi ja RNA töölahuseid kuumutati 10 min

temperatuuril 37 °C enne 3 cc Luer-Lok süstaldesse panemist. 2 ml

tsitraatpuhvrit (pH 6) pandi teise 3 cc süstlasse. RNA-d ja lipiide sisaldavad

süstlad ühendati T-kujulise seguriga (PEEK™ 500 µm ID liitmik, Idex Health

Science) FEP voolikuid kasutades (fluoritud etüleen-propüleen; al-FEP20

voolikute sisediameeter on 2 mm ja välidiameeter 3 mm, tootja Idex Health

Science). T-kujulise seguri väljalaskeavaks olid ka FEP voolikud.

Tsitraatpuhvrit sisaldav kolmas süstal ühendati FEP voolikute eraldi osale.

Kõikidel süstaldel kasutati seejärel voolukiirust 7 ml/min, kasutades

süstlapumpa. Toru väljalaskeavad seati nii, et korjata segud 20 ml klaasviaali25

(segades). Segamisvarras võeti välja ning etanooli-/veelahusel lasti 1 tunni

jooksul toatemperatuurile tasakaalustuda. 4 ml segu pandi 5 cc süstlasse,

mis ühendati FEP voolikute osaga, ning järgmine 5 cc süstal ühendati samas

pikkuses FEP voolikutega, lisati võrdne kogus 100 mM tsitraatpuhvrit (pH 6).

Kahel süstlal kasutati voolukiirust 7 ml/min, kasutades süstlapumpa ning30

lõplik segu koguti 20 ml klaasviaali (segades). Järgmisena lasti teisest

segamisetapist (liposoomid) kogutud segu läbi Mustang Q membraani

(ioonvahetustugi, mis seob ja eemaldab anioonseid molekule, saadi

46 EE – EP2750707 B1

ettevõttelt Pall Corporation). Enne liposoome lasti 4 ml 1 M NaOH-d, 4 ml

1 M NaCl-i ja 10 ml 100 mM tsitraatpuhvrit (pH 6) üksteise järel läbi Mustangi

membraani. Liposoome soojendati 10 min temperatuuril 37 °C enne läbi

membraani laskmist. Järgmisena kontsentreeriti liposoomid mahule 2 ml ning

dialüüsiti 10–15 mahu IX PBS suhtes, kasutades TFF-i enne lõppsaaduse5

taastamist. TFF-i süsteem ja filtreerimise õõneskiudmembraanid osteti

ettevõttelt Spectrum Labs ning neid kasutati tootja juhiste kohaselt. Kasutati

polüsulfoonist filtreerimise õõneskiudmembraane, mille poori suuruse

piirmäär oli 100 kD ja pindala 8 cm2. In vitro ja in vivo katseteks lahjendati

kompositsioonid vajalikule RNA kontsentratsioonile 1x PBS-iga;10

(B) nagu meetod (A), kuid pärast loksutamist lisati 226,7 µl lähtelahust

1,773 ml etanoolile, et teha töötamiseks 2 ml lipiidi lähtelahust,

modifitseerides seeläbi lipiidi : RNA suhet;

(C) nagu meetod (B), kuid Mustangi filtratsioon jäeti ära, nii et liposoomid lasti

20 ml klaasviaalist TFF-i dialüüsi;15

(D) nagu meetod (C), kuid TFF-is kasutati polüeetersulfoonist (PES-ist)

õõneskiudmembraane (detaili number PC1–100E-100-01N), mille poori

suuruse piirväärtus oli 100 kD ning pindala 20 cm2;

(E) nagu meetod (D), kuid kasutati Mustangi membraani nagu meetodis (A);

(F) nagu meetod (A), kuid Mustangi filtratsioon jäeti ära, nii et liposoomid20

liikusid 20 ml klaasviaalist TFF-i dialüüsi;

(G) nagu meetod (D), kuid 4 ml RNA töölahus valmistati ∼1 µg/µl

lähtelahusest 100 mM tsitraatpuhvris (pH 6). Seejärel valmistati neli 20 ml

klaasviaali samamoodi. Neist kahte kasutati RNA töölahuse jaoks (2 ml

kummaski viaalis) ning teisi lipiidi ja RNA segude kogumiseks nagu meetodis25

(C). T-kujulise seguri kasutamise asemel ühendati RNA-d ja lipiide

sisaldavad süstlad vahendiga Mitos Droplet Junction Chip (klaasist

mikrovedeliku seade, mis saadi ettevõttelt Syrris, detaili nr 3000158),

kasutades PTFE voolikuid (sisediameeter 0,03 tolli ja välidiameeter 1/16 tolli)

ning neljasuunalist pistikühendust (Syrris). Kahte RNA voolu ja ühte lipiidi30

47 EE – EP2750707 B1

voolu juhiti süstlapumpadega ning etanooli ja veefaasi segamine tehti kiibi X-

liitekohas (100 µm x 105 µm). Kõigi kolme voolu kiirust hoiti 1,5 ml/min juures,

millest tulenevalt oli veepõhise ja etanooli kogu voolukiiruse suhe 2 : 1.

Voolikute väljalaskeava oli seatud nii, et koguda segud 20 ml klaasviaali

(segades). Segamisvarras võeti välja ning etanooli/-veelahusel lasti 1 h5

jooksul toatemperatuurile tasakaalustuda. Seejärel pandi segu 5 cc

süstlasse, mis paigaldati järgmisele PTFE vooliku osale; teise 5 cc süstlasse,

mis oli samasuguse PTFE voolikupikkusega, lisati võrdses mahus 100 mM

tsitraatpuhvrit (pH 6). Kahel süstlal kasutati süstlapumba abil voolukiirust

3 ml/min ning lõplik segu koguti 20 ml klaasviaali (segades). Järgmisena10

kontsentreeriti liposoomid mahule 2 ml ning dialüüsiti 10–15 mahu IX PBS-i

suhtes, kasutades TFF-i nagu meetodis (D);

(H) nagu meetod (A), kuid 2 ml töötamise lipiidi lähtelahus valmistati 120,9 µl

lipiidi lähtelahuse segamisel 1,879 ml etanooliga. Samuti pandi 20 ml viaalist

saadud liposoomid pärast T-kujulises seguris segamist dialüüsikassetti15

Pierce Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette (Thermo Scientific, eriti tugev,

mahutavus 0,5–3 ml) ning neid dialüüsiti 400–500 ml IX PBS-i suhtes öö

jooksul temperatuuril 4 °C autoklaavitud plastkonteineris enne lõppsaaduse

taastamist.

Pärast liposoomi moodustumist saab kapseldatud RNA ja RNA kontsentratsiooni20

kindlaks määrata komplektiga Quant-iT RiboGreen RNA Reagent Kit (Invitrogen)

tootja juhiseid järgides, kasutades komplektis olevat ribosomaalset RNA standardit,

et standardkõverat luua. Näiteks lahjendatakse liposoome 10x või 100x (komplektis

olevas) IX TE puhvris enne värvi lisamist. Enne värvi lisamist lahjendatakse

liposoome eraldi 10x või 100x IX TE puhvris, mis sisaldab 0,5% Triton X-i (et25

liposoome segi paisata ning seeläbi kogu-RNA-d analüüsida). Seejärel lisatakse

igale lahusele võrdne kogus värvi ning hiljem pannakse ∼180 µl igat lahust pärast

värvi lisamist kahes eksemplaris 96 süvendiga koekultuuri plaadile. Fluorestsentsi

(Ex 485 nm, Em 528 nm) loetakse mikrotiiterplaadi lugejal. Liposoomi

kompositsioone võib doseerida in vivo RNA kapseldunud koguse põhjal.30

Liposoomidesse kapseldumisega näidati, et see kaitseb RNA-d RNaasiga

lagunemise eest. Katsetes kasutati 3,8 mAU RNaas A-d ühe mikrogrammi RNA

48 EE – EP2750707 B1

kohta, seda inkubeeriti 30 minutit toatemperatuuril. RNaasi inaktiveeriti proteinaas

K-ga temperatuuril 55 °C 10 minuti jooksul. Seejärel lisati suhtel 1 : 1 maht/maht

proovi segu suhtel 25 : 24 : 1 maht/maht/maht fenoolile : kloroformile :

isoamüülalkoholile, et eraldada RNA-d lipiididest veefaasi. Proove segati

pöörlemisel mõne sekundi jooksul ning seejärel pandi need 15 minutiks tsentrifuugi5

kiirusel 12 k RPM. Veefaas (sisaldas RNA-d) eemaldati ning seda kasutati RNA

analüüsimiseks. Enne lisamist (400 ng RNA-d süvendis) inkubeeriti kõiki proove

formaldehüüdi laadimisvärviga, denatureeriti 10 minutit temperatuuril 65 °C ning

need jahutati toatemperatuurile. RNA struktuuri molekulmassi umbkaudseks

hindamiseks kasutati Ambion Millenniumi markereid. Geelil kasutati pinget 90 V.10

Geeli märgistati 0,1% SYBR-i kullaga tootja juhiste kohaselt vees, kiigutades seda

1 tund toatemperatuuril. Joonisel fig 1 on näidatud, et kapseldumise puudumisel

lagundab RNaas RNA täielikult (riba 3). RNA-d ei saa pärast kapseldumist

tuvastada (riba 4) ning muutust ei ole näha, kui neid liposoome töödeldakse

RNaasiga (riba 4). Pärast RNaasiga töödeldud liposoomide edastamist fenooliga15

ekstraktimisse on näha lagundamata RNA-d (riba 6). Isegi pärast 1 nädalat

temperatuuril 4 °C oli RNA-d näha igasuguse fragmenteerumiseta (joonis fig 2,

nool). Valgu ekspressioon in vivo oli muutumatu pärast 6 nädalat temperatuuril 4 °C

ning ühte külmutamise-sulatamise tsüklit. Järelikult on liposoomi kapseldatud RNA

stabiilne.20

Reportergeeni ekspressioon

RNA in vivo ekspressiooni hindamiseks kodeeriti reporterensüümi (SEAP-d,

eritatavat aluselist fosfataasi) replikonis mitte immunogeenis.

Ekspressiooniväärtuseid mõõdeti seerumites, mida oli lahjendatud 1 : 4 IX Phospha-

Lighti lahjenduspuhvris kemoluminestseeruvat aluselist fosfaatsubstraati25

kasutades. 8–10 nädala vanustele BALB/c hiirtele (5/rühm) süstiti

intramuskulaarselt 0. päeval 50 µl ühte jalga RNA doos 0,1 µg või 1 µg. Sama

vektorit manustati ka liposoomideta (RNaasivabas IX PBS-is) annusel 1 µg.

Analüüsiti ka virioni pakitud replikone. Siin kasutatud virioni pakitud replikonid

(nimega „VRP-d“) saadi viite 43 meetoditega, milles alfaviiruse replikon saadakse30

mutantsest VEEV-st või VEEV genoomist saadud kimäärist, mis oli loodud

sisaldama Sindbisi viiruse 3’ UTR-i ja Sindbisi viiruse pakkimissignaali (PS-i), mis

49 EE – EP2750707 B1

pakiti nende ühise elektroporatsiooniga BHK rakkudesse vigaste abistaja-

RNA-dega, mis kodeerivad Sindbisi viiruse kapsiidi ja glükoproteiini geene.

Nagu näidatud joonisel fig 4, suurendas kapseldamine SEAP väärtuseid umbes ½

log võrra annusel 1 µg ning 6. päeval vastas ekspressioon 0,1 µg kapseldunud

annusest väärtustele, mida nähti 1 µg kapseldamata annusega. 3. päevaks ületasid5

ekspressiooniväärtused need, mis saadi VRP-dega (ruudud). Järelikult SEAP

ekspressioon suurenes, kui RNA valmistati liposoomides võrreldes palja RNA

kontrolliga isegi 10x väiksemal annusel. Ekspressioon oli ka suurem VRP kontrolli

suhtes, kuid ekspressiooni kineetika oli väga erinev (vaata joonist fig 4). RNA

transportimise tulemuseks elektroporatsiooniga oli suurem ekspressioon palja10

kontrolliga võrreldes, kuid väärtused olid väiksemad kui liposoomidega.

Et hinnata, kas liposoomirühmadega saadud mõju tulenes ainult liposoomi

komponentidest või oli seotud kapseldamisega, manustati replikoni kapseldatud

kujul (kahe erineva puhastusprotokolliga, 0,1 µg RNA) või segati liposoomidega

pärast nende moodustumist (kapseldamata „lipopleks“, 0,1 µg RNA) või palja15

RNA-na (1 µg). Lipopleks andis väikseima ekspressioonitaseme, mis näitas, et

kapseldamine on tõhusaks ekspressiooniks oluline.

Täiendavad SEAP katsed näitasid selget doosi vastust in vivo, nii et ekspressiooni

oli näha pärast lausa 1 ng RNA transportimist. Kapseldatud ja paljastest

replikonidest ekspressiooni võrdlevad järgmised katsed näitasid, et 0,01 µg20

kapseldatud RNA-d oli võrdväärne 1 µg palja RNA-ga. RNA annusel 0,5 µg tekitas

kapseldatud materjal 12-kordselt suurema ekspressiooni 6. päeval; annusel 0,1 µg

olid väärtused 6. päeval 24 korda suuremad.

Rühmas keskmiste väärtuste vaatamise asemel uuriti ka üksikuid loomi. Kuigi mitu

looma ei reageerinud paljastele replikonidele, elimineeris kapseldamine25

mittereageerijad.

Immunogeenide in vivo ekspressioon

Et hinnata in vivo immunogeensust, loodi replikon täispika F valgu

ekspresseerimiseks respiratoorsest süntsütiaalsest viirusest (RSV-st). Seda

manustati paljana (1 µg) liposoomidesse kapseldatuna (0,1 või 1 µg) või30

50 EE – EP2750707 B1

virionidesse pakituna (106 IU; „VRP“) 0. ja 21. päeval. Liposoomid selgelt

parandasid immunogeensust ning RNA kutsub esile jõulise CD8 T-raku vastuse.

Järgmistes katsetes võrreldi F-spetsiifilisi IgG tiitreid hiirtel, kes said VRP-d, 0,1 µg

liposoomi kapseldatud RNA-d või 1 µg liposoomi kapseldatud RNA-d. Liposoomi

kapseldatud RNA kutsub esile sisuliselt samas suurusjärgus immuunvastuse, nagu5

oli näha virioni transportimisel.

Järgmine uuring kinnitas, et 0,1 µg liposoomi kapseldatud RNA-d tekitas palju

suurema anti-F IgG vastuse (15 päeva pärast teist annust) kui 0,1 µg transporditud

DNA-d ning oli isegi immunogeensem kui 20 µg F-antigeeni kodeerivat plasmiidi

DNA-d, mida transporditi elektroporatsiooniga.10

RSV F-valgu immunogeensuse uurimiseks valmistati isepaljunev replikon „vA317“,

mis kodeerib RSV F-valku. Seda manustati BALB/c hiirtele, keda oli rühmas 4 või 8

tükki, bilateraalsete intramuskulaarsete vaktsineerimistega (50 µl ühte jalga) 0. ja

21. päeval ainult 1 µg replikoniga või moodustati liposoomidena, mis valmistati

eespool kirjeldatud DLinDMA-ga. PEG-DMG sisaldas nendes lipiidides PEG-2000.15

Võrdluseks transporditi paljast plasmiidi DNA-d (20 µg), mis ekspresseeris sama

RSV-F antigeeni, elektroporatsiooni kasutades või liposoomidega (0,1 µg DNA).

Nelja hiirt kasutati töötlemata kontrollrühmana. Seerum koguti antikehade

analüüsiks 14. ja 36. päeval. Põrn eemaldati hiirtelt 49. päeval T-raku analüüsiks.

F-spetsiifilise seerumi IgG tiitrid (GMT) olid järgmised, näidates andmeid 4 erineva20

RNA-d sisaldava liposoomi preparaadi ning võrdluseks DNA-d sisaldavate

liposoomide kohta:

RV 14. päev 36. päevpaljas DNA plasmiid 439 6712

paljas A317 RNA 78 2291

liposoom #1 3020 26170

liposoom #2 2326 9720

liposoom #3 5352 54907

liposoom #4 4428 51316

liposoom #5 (DNA) 5 13

51 EE – EP2750707 B1

Järelikult parandasid liposoomi kompositsioonid immunogeensust oluliselt palja

RNA kontrollidega võrreldes, mis määrati kindlaks F-spetsiifiliste IgG tiitritega (ja ka

T-raku sagedustega; andmeid ei ole näidatud). Liposoomidega moodustatud või

elektroporatsiooniga paljana transporditud plasmiidi DNA oli märkimisväärselt

vähem immunogeenne kui liposoomiga valmistatud isepaljunev RNA.5

Pikem PEG pikkus

PEG pikkuse mõju in vivo immunogeensusele võrdlemiseks valmistati kaks erinevat

liposoomide komplekti meetodiga (H) kas 150 µg RNA-ga või RNA-ta (tühjade

liposoomide tegemiseks). Kasutati kahte erinevat lipiidisegu, milles mõlemad

sisaldasid 40% DlinDMA-d, 10% DSPC-d, 48% kolesterooli ja 2% PEG-DMG-d, aga10

kummaski koostises kasutati kas PEG 2000 või PEG 5000. RNA replikon oli vA375,

mis kodeerib RSV pindmist liitglükoproteiini.

Järgmises tabelis on näidatud liposoomide suurus (Z-keskmine ja polüdisperssuse

indeks) ning RNA kapseldumise % igas koostises:

koostis PEG Z-av (nm) pdI RNA kapseldumineA 2000 152,1 0,053 + 92,5%

B 2000 144 0,13 – –

C 5000 134 0,136 + 71,6%

D 5000 130,3 0,178 – –

Liposoome manustati BALB/c hiirtele (10 tükki rühmas) bilateraalse15

intramuskulaarse süstiga (50 µl ühte jalga) 0. ja 21. päeval. Annused olid 0,01, 0,03,

0,1, 0,3 või 1 µg. F-spetsiifilised seerumi IgG ja PRNT60 tiitrid (GMT) olid 2 nädalat

pärast esimest või teist süsti järgmised:

liposoom RNA (µg) 2wp1 2wp2 PRNT60 (2wp2)puhverkontroll 0 - - 10

B 0 - - 10

D 0 - - 10

A 0,01 3399 50691 37

C 0,01 3959 37025 51

A 0,03 3446 53463 83

52 EE – EP2750707 B1

(järg)

liposoom RNA (µg) 2wp1 2wp2 PRNT60 (2wp2)C 0,03 5842 50763 180

A 0,1 8262 76808 238

C 0,1 7559 122555 314

A 0,3 5913 82599 512

C 0,3 5712 126619 689

A 1 8213 85138 441

C 1 9434 199991 1055

PEG 5000 kaasamine tekitas suuremad F-spetsiifilised tiitrid kui PEG 2000 pärast

kahte RNA annust 0,1 (1,6x), 0,3 (1,5x) või 1 µg (2,4x). Statistiline analüüs (T-test)

näitas, et F-spetsiifilised tiitrid (2wp2) olid PEG 5000 ja PEG 2000 rühmade vahel

statistiliselt erinevad (P < 0,05) RNA annustel 0,01, 0,1, 0,3 ja 1 µg. PEG 50005

tekitas suuremad neutraliseerivad tiitrid (2,4x) RNA annusel 1 µg, P < 0,05.

Sarnased võrdlevad katsed tehti vA317 replikoniga. Liposoomid valmistati

meetodiga (H) 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% kolesterooli ja 2% PEG DMG-ga

(PEG 2000 või PEG 5000). Nende omadused olid järgmised:

nimi PEG Zav (nm) pdI kapseldumine2k 2000 122,3 0,068 95,23%

5k 5000 106,1 0,136 61,61%

BALB/c hiirtele, keda oli igas rühmas 8 tükki, tehti bilateraalsed intramuskulaarsed10

vaktsineerimised (50 µl ühte jalga) 0. ja 21. päeval palja (1 µg) või liposoomi

kapseldatud (0,1 µg) RNA-ga. Seerum koguti 14. ja 35. päeval ning põrnad

eemaldati 49. päeval.

F-spetsiifiline seerumi IgG (GMT) oli 2 nädalat pärast esimest või teist süsti

järgmine:15

rühm 14. päev 35. päevpaljas RNA 28 721

2k 2237 12407

5k 5654 39927

53 EE – EP2750707 B1

Keskmised F-spetsiifilised tsütokiin-positiivsed T-raku jääksagedused (CD4+ või

CD8+) olid järgmised, näidatud on ainult arvud, mis olid nullist statistiliselt oluliselt

suuremad (CD4+ puhul RSV peptiidi F51-66, F164-178, F309-323 suhtes

spetsiifilised või CD8+ puhul peptiidi F85-93 ja F249-258 suhtes spetsiifilised):

rühm CD4-CD8+ CD4-CD8+IFNγ IL2 IL5 TNFα IFNγ IL2 IL5 TNFα

paljas 0,02 0,02 0,04 0,36 0,16 0,28

2k 0,03 0,04 0,03 0,66 0,17 0,56

5k 0,06 0,08 0,07 1,42 0,46 1,09

Järelikult suurenesid F-spetsiifilised IgG tiitrid 2,5-kordselt (2wp1) ja 3-kordselt5

(2wp2), kui PEG pearühma molekulmassi suurendati 2000 pealt 5000 peale. Esines

ka positiivne mõju T-raku vastustele.

PEG pikkuse kuni 10 kDa mõju

BALB/c hiiri kasutati PEG erinevate pikkuste vahemikus 1–10 kDa mõju uurimiseks.

Viis rühma said kaks annust (0. ja 21. päev) RSV F valku (vA375 replikoni)10

kodeerivat 0,1 µg RNA-d liposoomides, mis valmistati DLinDMA katioonsest lipiidist

ja erineva pikkusega PEG-DMG-st (1 kDa, 2 kDa, 3 kDa, 5 kDa, 10 kDa). F-

spetsiifilisi IgG tiitreid mõõdeti 14 päeva pärast esimest ja teist annust ning

tulemused on esitatud joonisel fig 5. Andmed näitavad, et PEG pikkusega 2, 3, 5 ja

10 kDa tekitab sisuliselt samad tiitrid mõlemal ajahetkel ning need on kõik paremad15

kui 1 kDa pikkuse PEG-ga.

Kontrollloomad said DLinDMA liposoome 2 kDa PEG-DMG-ga, aga mitte RNA-d.

Nendel loomadel avaldus anti-F IgG tiiter, mis ka suurenes pärast teist annust (aga

palju väiksemal määral kui kapseldatud RNA-d saanud loomadel). Sellest rühmast

saadud seerumiproovidel ei esinenud mittespetsiifilist reaktsiooni gp140 ega20

PBS-iga kaetud ELISA plaatidel.

Seerumi tsütokiine mõõdeti 5 tundi pärast liposoomide süsti. Üldiselt ei olnud ühelgi

hiirel näha IL-1β ega TNF-α reaktsioone ning reaktsioon IL-12/p70, IL-6, IL-10,

IFN-γ ja IP-10 suhtes oli võrdväärne kõikide PEG pikkustega. KC/GRO reaktsioon

54 EE – EP2750707 B1

oli hiirtel, kes said liposoome 5 kDa või 10 kDa pikkuse PEG-DMG-ga,

märkimisväärselt väiksem kui PEGüülimiseta liposoomidega.

PEG5000 uuringud RSV-ga

Selleks uuringuks kasutati nelja erinevat replikoni, millest kõik kodeerisid RSV

täispikka metsiktüüpi F glükoproteiini, milles liitpeptiid oli kustutatud. vA372 replikon5

moodustatakse run-off transkriptsiooniga. vA142 replikoni 3’-ots moodustatakse

ribosüümi vahendatud lõhustamisel. vA368-s juhib valgu ekspressiooni EV71

seesmine ribosoomi sisenemiskoht (IRES). vA369 replikonis juhib ekspressiooni

EMCV IRES.

Liposoomid moodustati 40% RV17 katioonse lipiidi, 10% DSPC, 49,5% kolesterooli,10

0,5% PEG DMG 5000-ga meetodiga (H) ning 175 µg RNA partii suurusega.

BALB/c hiirele, keda oli rühmas 7 tükki, tehti bilateraalsed intramuskulaarsed

vaktsineerimised (50 µl ühte jalga) 0. ja 21. päeval

1. rühmas liposoomides valmistatud isepaljuneva RNA-ga (vA372, 1,0 µg);

2. rühmas liposoomides valmistatud isepaljuneva RNA-ga (vA142, 1,0 µg);15

3. rühmas vA142 RNA-d sisaldava VRP-ga (1x106 IU);

4. rühmas liposoomides valmistatud isepaljuneva RNA-ga (vA368, 1,0 µg);

5. rühmas vA368 RNA-d sisaldava VRP-ga (1x106 IU);

6. rühmas liposoomides valmistatud isepaljuneva RNA-ga (vA369, 1,0 µg);

7. rühmas vA369 RNA-d sisaldava VRP-ga (1x106 IU);20

8. rühmas puhta kontrolliga (4 looma).

Seerumid võeti antikehade analüüsimiseks 0., 20., 35. päeval. Põrnad eemaldati T-

raku analüüsiks 35. päeval.

F-spetsiifilised seerumi IgG tiitrid ja neutralisatsiooni tiitrid (GMT) olid järgmised:

25

55 EE – EP2750707 B1

rühm IgG 20. päev IgG 35. päev neutraln

1 4678 76715 195

2 2471 51963 116

3 2898 42441 202

4 1463 33194 134

5 2236 33456 65

6 1524 37330 49

7 2785 31640 66

8 5 5 -

Järelikult olid kõik neli replikoni immunogeensed ning igaüks tekitas seerumi F-

spetsiifilised IgG antikehad pärast esimest vaktsineerimist, nii et teine

vaktsineerimine võimendas reaktsiooni tõhusalt. RSV neutraliseerivad antikehad

tuvastati pärast teist vaktsineerimist. Sarnased teise vaktsineerimise järgsed5

antikeha tiitrid kutsus esile replikon, milles 3’-ots oli moodustatud ribosüümi

vahendatud lõhustamisel (vA142), ning replikon, milles 3’-ots moodustati run-off

transkriptsiooniga (vA372). EV71 või EMCV poolt juhitud F-antigeeni ekspressioon

ei parandanud antikeha reaktsiooni replikonile (vA368 või vA369 vs. vA142).

Samamoodi ei eristanud T-raku vastused (ei ole näidatud) replikone, milles 3’-ots10

oli moodustatud ribosüümi vahendatud lõhustamisel (vA142) või run-off

transkriptsiooniga (vA372), ning ei näidanud kasu EV71 või EMCV poolt juhitud F-

antigeeni ekspressioonile (vA238 või vA369 vs. vA142).

vA142 replikoni analüüsiti puuvillarottidel (Sigmodon hispidis) liposoomidega, mis

moodustati15

(a) 40% DlinDMA-st, 10% DPSC-st, 48% kolesteroolist ja 2% PEG DMG

2000-st, mis valmistati meetodiga (D) ja 175 µg RNA partii suurusega;

(b) 40% RV17-st, 10% DSPC-st, 49,5% kolesteroolist ja 0,5% PEG DMG

5000-st, mis valmistati meetodiga (H) ja 200 µg RNA partii suurusega.

(c) 40% RV05-st, 30% DLoPE-st (18 : 2 PE), 28% kolesteroolist ja 2% PEG20

DMG 2000-st, mis valmistati meetodiga (H) ja 200 µg RNA partii suurusega.

56 EE – EP2750707 B1

Rühmas 4–8 loomaga puuvillarottidele tehti intramuskulaarsed vaktsineerimised

(100 µl ühte jalga) 0. ja 21. päeval

1. rühmas liposoomides (a) valmistatud isepaljuneva RNA-ga (vA142, 1 µg,

RSV-F);

2. rühmas liposoomides (a) valmistatud isepaljuneva RNA-ga (vA142, 0,15

µg, RSV-F);

3. rühmas liposoomides (b) valmistatud isepaljuneva RNA-ga (vA142, 1 µg,

RSV-F);

4. rühmas liposoomides (b) valmistatud isepaljuneva RNA-ga (vA142, 0,1

µg, RSV-F);10

5. rühmas liposoomides (c) valmistatud isepaljuneva RNA-ga (vA142, 1 µg,

RSV-F);

6. rühmas liposoomides (c) valmistatud isepaljuneva RNA-ga (vA142, 0,1

µg, RSV-F);

7. rühmas RSV täispikka metsiktüüpi pindmist F-glükoproteiini15

ekspresseerivate VRP-dega (1x106 IU);

8. rühmas alumiiniumhüdroksiidiga adjuvanteeritud RSV-F valgu

allühikvaktsiiniga (5 µg);

9. rühmas puhta kontrolliga (3 looma).

Kõik puuvillarotid (välja arvatud 9. rühm) vaktsineeriti 5 µg F allüksuse +20

alumiiniumhüdroksiidiga 49. päeval (neli nädalat pärast teist vaktsineerimist).

Seerum koguti antikehade analüüsiks 0., 21., 35., 49. ja 64. päeval.

57 EE – EP2750707 B1

F-spetsiifilised seerumi IgG tiitrid (GMT) olid järgmised:

rühm 21. päev 35. päev 49. päev 64. päev1 558 3938 2383 16563

2 112 1403 943 15123

3 330 2927 2239 25900

4 51 503 503 20821

5 342 3207 2151 24494

6 49 1008 513 15308

7 1555 7448 4023 25777

8 8425 81297 54776 82911

9 5 5 5 5

RSV seerumi neutraliseeriva antikeha tiitrid olid järgmised:

rühm 21. päev 35. päev 49. päev 64. päev1 66 788 306 161

2 26 162 58 1772

3 69 291 198 3221

4 24 72 43 1135

5 75 448 201 5733

6 27 371 163 2449

7 137 2879 1029 1920

8 307 2570 1124 2897

9 10 - - 10

Valguga vaktsineerimine ei suurendanud antikeha tiitreid puuvillarottidel, keda oli

eelnevalt valguga vaktsineeritud, kuid tekitas suure võimenduse eelnevalt RNA-ga

vaktsineeritud puuvillarottidel. Enamikul juhtudel olid RSV seerumi neutralisatsiooni5

tiitrid pärast kahte RNA-ga ja seejärel valguga vaktsineerimist võrdväärsed tiitritega,

mis tekitati kahe või kolme järjestikuse adjuvanteeritud valguga vaktsineerimisega.

CMV immunogeensus

Liposoome kasutati tsütomegaloviiruse (CMV) glükoproteiine kodeerivate RNA

replikonide transportimiseks. „vA160“ replikon kodeerib täispikki glükoproteiine H ja10

L (gH/gL), samas kui „vA322“ replikon kodeerib lahustuvat vormi (gHsol/gL). Neid

58 EE – EP2750707 B1

kahte valku reguleerivad eraldi subgenoomsed promootorid ühes replikonis; kahe

eraldi vektori, millest üks kodeerib gH-d ja teine gL-i, koos manustamine ei andnud

häid tulemusi.

Rühmas 10 loomaga BALB/c hiirtele tehti bilateraalsed intramuskulaarsed

vaktsineerimised (50 µl ühte jalga) 0., 21. ja 42. päeval gH/gL-i ekspresseerivate5

VRP-dega (1x106 IU), gHsol/gL-i ekspresseerivate VRP-dega (1X106 IU) ning

PBS-iga kontrollidena. Kaks katserühma said liposoomides valmistatud 1 µg vA160

või vA322 replikoni (40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% kol., 2% PEG-DMG 2000;

valmistatud meetodiga (D), aga 150 µg RNA partii suurusega).

vA160 liposoomide Zav (Z-keskmine) diameeter oli 168 nm, pdI (polüdisperssuse10

indeks) oli 0,144 ning kapseldumine oli 87,4%. vA322 liposoomide Zav diameeter

oli 162 nm, pdI oli 0,131 ning kapseldumine oli 90%.

Replikonid suutsid ühest vektorist kahte valku ekspresseerida.

Seerumid võeti immunoloogiliseks analüüsid 63. päeval (3wp3). CMV

neutralisatsiooni tiitrid (kontrollide suhtes positiivsete viiruskollete arvus 50%15

vähenemise tekitav seerumi lahjenduse pöördväärtus) olid järgmised

gH/gL VRP gHsol/gL VRP gH/gL liposoom gHsol/gL liposoom4576 2393 4240 10062

CMV gH/gL kompleksi täispikka või lahustuvat vormi ekspresseeriv RNA tekitas

järelikult neutraliseerivate antikehade suuremad tiitrid, nagu analüüsiti

epiteelrakkudel. Liposoomi kapseldatud RNA-de tekitatud keskmised tiitrid olid

vähemalt sama suured kui vastavate VRP-dega.20

Korduvkatsed kinnitasid, et replikon suutis ühest vektorist kahte valku

ekspresseerida. RNA replikon andis 3wp3 tiitri 11457 võrreldes VRP-dega saadud

tiitriga 5516.

Järgmistes katsetes kasutati erinevaid replikone lisaks vA160-le ning liposoomides

kasutati pikemat PEG-d. vA526 replikon ekspresseerib CMV pentameerset25

kompleksi (gH-gL-UL128-UL130-UL-131) kolme subgenoomse promootori

juhtimisel: esimene juhib gH ekspressiooni; teine juhib gL-i ekspressiooni; kolmas

59 EE – EP2750707 B1

juhib UL128-2A-UL130-2A-UL131 polüproteiini ekspressiooni, mis sisaldab kahte

2A lõhustamiskohta kolme UL-geeni vahel. vA527 replikon ekspresseerib CMV

pentameerset kompleksi kolme subgenoomse promootori ja kahe IRES-i kaudu:

esimene subgenoomne promootor juhib gH ekspressiooni; teine subgenoomne

promootor juhib gL-i ekspressiooni; kolmas subgenoomne promootor juhib UL1285

ekspressiooni; UL130 reguleerib EMCV IRES; UL131 reguleerib EV71 IRES. Need

kolm replikoni transporditi liposoomi (valmistati meetodiga (H), 150 µg partii

suurusega; 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% kolesterool, 2% PEG DMG 5000) või

VRP-dega.

BALB/c hiirele, keda oli 10 rühmas10 tükki, tehti bilateraalsed intramuskulaarsed10

vaktsineerimised (50 µl ühte jalga) 0., 21. ja 42. päeval

1. rühmas gH FL/gL-i ekspresseerivate VRP-dega (1x106 IU);

2. rühmas pentameerse 2A VRP-ga (1x105 IU);

3. rühmas pentameerse 2A VRP-ga (1x106 IU);

4. rühmas pentameerse IRES VRP-ga (1x105 IU);15

5. rühmas liposoomides valmistatud isepaljuneva RNA vA160-ga (1 µg);

6. rühmas liposoomides valmistatud isepaljuneva RNA vA526-ga (1 µg);

7. rühmas liposoomides valmistatud isepaljuneva RNA vA527-ga (1 µg);

8. rühmas katioonses nanoemulsioonis valmistatud isepaljuneva RNA

vA160-ga (1 µg);20

9. rühmas katioonses nanoemulsioonis valmistatud isepaljuneva RNA

vA526-ga (1 µg);

10. rühmas katioonses nanoemulsioonis valmistatud isepaljuneva RNA

vA527-ga (1 µg).

Seerumid võeti immunoloogiliseks analüüsiks 21. (3wp1), 42. (3wp2) ja 63. (3wp3)25

päeval. CMV seerumi neutralisatsiooni tiitrid 21., 42. ja 63. päeval olid:

60 EE – EP2750707 B1

vaktsiinirühm 3wp1 3wp2 3wp31 126 6296 26525

2 N/A N/A 6769

3 N/A 3442 7348

4 N/A N/A 2265

5 347 9848 42319

6 179 12210 80000

7 1510 51200 130000

8 N/A N/A 845

9 N/A N/A 228

10 N/A N/A 413

Järelikult võib isepaljunevat RNA-d kasutada mitme antigeeni ekspresseerimiseks

ühest vektorist ning tõhusa ja spetsiifilise immuunvastuse tekitamiseks. Replikon

suudab ekspresseerida viit antigeeni (CMV pentameerset kompleksi (gH-gL-UL128-

UL130-UL-131) ning tekitada tõhusa immuunvastuse. Liposoomides PEG5000-ga5

transporditud isepaljunev RNA suudab tekitada neutraliseeriva antikeha suuremad

tiitrid kõikidel analüüsitud ajahetkedel (3wp1, 3wp2 ja 3wp3), nagu analüüsiti

epiteelrakkudel. Need reaktsioonid olid vastavatest VRP-dest ja katioonsetest

nanoemulsioonidest paremad.

Tabel 1. Kasulikud fosfolipiidid10

DDPC 1,2-didekanoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

DEPA 1,2-dierukoüül-sn-glütsero-3-fosfaat

DEPC 1,2-erukoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

DEPE 1,2-dierukoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüületanoolamiin

DEPG 1,2-dierukoüül-sn-glütsero-3[fosfatidüül-rac-(1-

glütserool...)

DLOPC 1,2-linoleoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

DLPA 1,2-dilauroüül-sn-glütsero-3-fosfaat

DLPC 1,2-dilauroüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

61 EE – EP2750707 B1

(järg)

DLPE 1,2-dilauroüül-sn-glütsero-3-fosfatidüületanoolamiin

DLPG 1,2-dilauroüül-sn-glütsero-3[fosfatidüül-rac-(1-

glütserool...)

DLPS 1,2-dilauroüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülseriin

DMG 1,2-dimüristoüül-sn-glütsero-3-fosfoetanoolamiin

DMPA 1,2-dimüristoüül-sn-glütsero-3-fosfaat

DMPC 1,2-dimüristoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

DMPE 1,2-dimüristoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüületanoolamiin

DMPG 1,2-müristoüül-sn-glütsero-3[fosfatidüül-rac-(1-

glütserool...)

DMPS 1,2-dimüristoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülseriin

DOPA 1,2-dioleoüül-sn-glütsero-3-fosfaat

DOPC 1,2-dioleoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

DOPE 1,2-dioleoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüületanoolamiin

DOPG 1,2-dioleoüül-sn-glütsero-3[fosfatidüül-rac-(1-

glütserool...)

DOPS 1,2-dioleoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülseriin

DPPA 1,2-dipalmitoüül-sn-glütsero-3-fosfaat

DPPC 1,2-dipalmitoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

DPPE 1,2-dipalmitoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüületanoolamiin

DPPG 1,2-dipalmitoüül-sn-glütsero-3[fosfatidüül-rac-(1-

glütserool...)

DPPS 1,2-dipalmitoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülseriin

DPyPE 1,2-difütanoüül-sn-glütsero-3-fosfoetanoolamiin

DSPA 1,2-distearoüül-sn-glütsero-3-fosfaat

DSPC 1,2-distearoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

DSPE 1,2-diostearüül-sn-glütsero-3-fosfatidüületanoolamiin

DSPG 1,2-distearoüül-sn-glütsero-3[fosfatidüül-rac-(1-

glütserool...)

DSPS 1,2-distearoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülseriin

EPC Muna PC

62 EE – EP2750707 B1

(järg)

HEPC Hüdrogeenitud muna PC

HSPC Ülipuhas hüdrogeenitud soja PC

HSPC Hüdrogeenitud soja PC

LYSOPC-MYRISTIC 1-müristoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

LYSOPC-PALMITIC 1-palmitoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

LYSOPCSTEARIC 1-stearoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

Piima sfingomüeliin

MPPC

1-müristoüül,2-palmitoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

MSPC 1-müristoüül,2-stearoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

PMPC 1-palmitoüül,2-müristoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

POPC 1-palmitoüül,2-oleoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

POPE 1-palmitoüül-2-oleoüül-sn-glütsero-3-

fosfatidüületanoolamiin

POPG 1,2-dioleoüül-sn-glütsero-3[fosfatidüül-rac-(1-

glütserool)...]

PSPC 1-palmitoüül,2-stearoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

SMPC 1-stearoüül,2-müristoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

SOPC 1-stearoüül,2-oleoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

SPPC 1-stearoüül,2-palmitoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüülkoliin

VIITED

[1] Johanning et al. (1995) Nucleic Acids Res 23:1495–1501.

[2] WO2011/057020.

[3] WO2011/076807.5

[4] Heyes et al. (2005) J Controlled Release 107:276–87.

[5] WO2005/121348.

[6] „Liposomes: Methods and Protocols“, 1. köide: „Pharmaceutical

Nanocarriers: Methods and Protocols“, (toim. Weissig). Humana Press,

2009. ISBN 160327359X.10

63 EE – EP2750707 B1

[7] „Liposome Technology“, I, II ja III köide. (toim. Gregoriadis). Informa

Healthcare, 2006.

[8] „Functional Polymer Colloids and Microparticles“, 4. köide („Microspheres,

microcapsules & liposomes“). (toim.-d Arshady ja Guyot). Citus Books, 2002.

[9] Jeffs et al. (2005) Pharmaceutical Research 22 (3):362–372.5

[10] WO2005/113782.

[11] WO2011/005799.

[12] El Ouahabi et al. (1996) FEBS Letts 380:108–12.

[13] Giuliani et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103(29):10834–9.

[14] WO2009/016515.10

[15] WO02/34771.

[16] WO2005/032582.

[17] WO2010/119343.

[18] WO2006/110413.

[19] WO2005/111066.15

[20] WO2005/002619.

[21] WO2006/138004.

[22] WO2009/109860.

[23] WO02/02606.

[24] WO03/018054.20

[25] WO2006/091517.

[26] WO2008/020330.

64 EE – EP2750707 B1

[27] WO2006/089264.

[28] WO2009/104092.

[29] WO2009/031043.

[30] WO2007/049155.

[31] Gennaro (2000), „Remington: The Science and Practice of Pharmacy“.5

20. trükk, ISBN: 0683306472.

[32] Romberg et al. (2008) Pharmaceutical Research 25:55–71.

[33] Hoekstra et al. Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41–52.

[34] „Methods In Enzymology“ (S. Colowick ja N. Kaplan, toim.-d, Academic

Press, Inc.).10

[35] „Handbook of Experimental Immunology“, I–IV köide (D. M. Weir ja C. C.

Blackwell, toim.-d, 1986, Blackwell Scientific Publications).

[36] Sambrook et al. (2001) „Molecular Cloning: A Laboratory Manual“, 3.

trükk (Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[37] „Handbook of Surface and Colloidal Chemistry“ (Birdi, K. S. toim., CRC15

Press, 1997)

[38] Ausubel et al. (toim.-d). (2002) „Short protocols in molecular biology“, 5.

trükk (Current Protocols).

[39] „Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course“, (Ream

et al., toim.-d, 1998).20

[40] „PCR (Introduction to Biotechniques Series)“, 2. tr. (Newton ja Graham

toim.-d, 1997).

[41] Yoneyama ja Fujita. (2007) Cytokine & Growth Factor Reviews 18:545–

51.

[42] Maurer et al. (2001) Biophysical Journal, 80: 2310–2326.25

[43] Perri et al. (2003) J Virol 77:10394–10403.

65 EE – EP2750707 B1

Patendinõudlus

1. Liposoom, millesse on kapseldatud huvipakkuvat immunogeeni kodeeriv RNA,

milles liposoom sisaldab vähemalt ühte lipiidi, mida on modifitseeritud

polüetüleenglükooli osa kovalentse sidemega ühendamisega, nii et

polüetüleenglükool asub liposoomi välisel osal, milles polüetüleenglükooli keskmine5

molekulmass on suurem kui 3 kDa, aga väiksem kui 11 kDa ja milles liposoom ei

sisalda ribosoome.

2. Liposoom vastavalt nõudluspunktile 1, mis sisaldab PEG-DMG-d ja/või

(i) lipiidi valemiga (X)

10

milles:

[Z]n on hüdrofiilne PEG pearühma komponent, mis on

polümeriseeritud n alamühikuga, milles n on polümerisatsiooni

arvkeskmistatud määr vahemikus 10 ja 200 Z-i ühikut ja milles PEG

võib olla lineaarne või hargnenud ning see võib olla valikuliselt15

asendatud;

L1 on valikuliselt asendatud C1–10alküleeni või C1–10heteroalküleeni

linker, hõlmates null, üks või kaks eetrit (nt -O-), estrit (nt -C(O)O-),

suktsinaati (nt -O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-)), karbamaati (nt -OC(O)-

NR’-), karbonaati (nt -OC(O)O-), uureat (nt -NRC(O)NR’-), amiini (nt20

-NR’-), amiidi (nt -C(O)NR’-), imiini (nt -C(NR’)-), tioeetrit (nt -S-),

ksantaati (nt -OC(S)S-) ja fosfodiestrit (nt -OP(O)2O-), milles R’

valitakse sõltumatult -H, -NH-, -NH2, -O-, -S-i, fosfaadi või valikuliselt

asendatud C1–10alküleeni hulgast;

X1 ja X2 valitakse sõltumatult süsiniku või heteroaatomi hulgast, mis25

valitakse -NH-, -O-, -S-i või fosfaadi hulgast;

66 EE – EP2750707 B1

A1 ja A2 valitakse kumbki sõltumatult C6–30alküüli, C6–30alkenüüli ja

C6–30alkünüüli hulgast, milles A1 ja A2 võivad olla samasugused või

erinevad, või A1 ja A2 moodustavad koos süsinikuaatomiga, millega

need on ühendatud, valikuliselt asendatud steroidi; ja/või

(ii) lipiidi valemiga (X’):5

milles:

PEG on polü(etüleenglükool), mis on polümeriseeritud n alamühikuga,

milles n on polümerisatsiooni arvkeskmistatud määr vahemikus 70 ja

240 etüleenoksiidi ühikut, milles PEG võib olla lineaarne või10

hargnenud ning see võib olla valikuliselt asendatud;

L1 on valikuliselt asendatud C1–10heteroalküleeni linker, mis sisaldab

ühte või kahte eetrit, estrit, suktsinaati, karbamaati, karbonaati, uureat,

amiini, amiidi, imiini, tioeetrit, ksantaati ja fosfodiestrit;

X1 ja X2 on hapnik;15

A1 ja A2 valitakse sõltumatult C6–30alküüli, C6–30alkenüüli ja

C6–30alkünüüli hulgast, milles A1 ja A2 võivad olla samasugused või

erinevad, või milles A1 ja A2 moodustavad koos süsinikuaatomiga,

millega need on ühendatud, valikuliselt asendatud steroidi.

3. Liposoom vastavalt nõudluspunktile 1, milles polüetüleenglükooli osa kovalentse20

sidemega modifitseeritud lipiid sisaldab PEG struktuuri:

milles n on vahemikus 70 ja 240, näiteks milles n on umbes 113, ning milles PEG

osa lõppeb valikuliselt -O-metüülrühmaga.

4. Liposoom vastavalt nõudluspunktile 3, milles lipiid sisaldab struktuuri:25

67 EE – EP2750707 B1

5. Liposoom vastavalt ükskõik millisele eelnevale nõudluspunktile, milles liposoomi

diameeter on vahemikus 80–160 nm.

6. Liposoom vastavalt ükskõik millisele eelnevale nõudluspunktile, milles liposoom

sisaldab katioonse pearühmaga lipiidi.5

7. Liposoom vastavalt ükskõik millisele eelnevale nõudluspunktile, milles liposoom

sisaldab tsvitterioonse pearühmaga lipiidi.

8. Liposoom vastavalt ükskõik millisele eelnevale nõudluspunktile, milles RNA on

isepaljunev RNA molekul.

9. Liposoom vastavalt nõudluspunktile 8, milles isepaljunev RNA molekul kodeerib10

(i) RNA-sõltuvat RNA polümeraasi, mis transkribeerib RNA isepaljunevast RNA

molekulist, ja (ii) immunogeeni.

10. Liposoom vastavalt nõudluspunktile 9, milles isepaljuneval RNA molekulil on

kaks avatud lugemisraami, millest esimene kodeerib alfaviiruse replikaasi ja teine

kodeerib immunogeeni.15

11. Liposoom vastavalt ükskõik millisele eelnevale nõudluspunktile, milles RNA

molekul on 9000 –12 000 nukleotiidi pikkune.

12. Liposoom vastavalt ükskõik millisele eelnevale nõudluspunktile, milles

immunogeen suudab tekitada immuunvastuse in vivo bakteri, viiruse, seene või

parasiidi vastu.20

13. Ravimkoostis, mis sisaldab ükskõik millisele eelnevale nõudluspunktile vastavat

liposoomi.

14. Liposoom vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktide 1–12 või ravimkoostis

vastavalt nõudluspunktile 13 kasutamiseks selgroogsel kaitsva immuunvastuse

esilekutsumiseks.25

EE - EP2750707 B11/3

EE - EP2750707 B12/3

EE - EP2750707 B13/3