7. vorlesung ws 2006/07softwarewerkzeuge1 v7 homologie-basierte proteinmodellierung (swissmodel)...

7. Vorlesung WS 2006/07

Softwarewerkzeuge 1

V7 Homologie-basierte Proteinmodellierung (SwissModel)

• Methode: Wissensbasierter Ansatz.

• Erfordernis: Mindestens 1 bekannte 3D-Struktur eines verwandten Proteins,

• Prozedur:

• finde Proteine bekannter Struktur, die zu Inputsequenz verwandt sind.

• Erzeugung eines multiplen Sequenzalignments mit der Zielsequenz.

• Generierung eines Frameworks für die neue Sequenz.

• Konstruiere fehlende Loops.

• Vervollständige und korrigieren das Proteinrückgrat.

• Korrigiere die Seitenketten.

• Überprüfe die Qualität der modellierten Struktur und deren Packung.

• Strukturverfeinerung durch Energieminimierung und Moleküldynamik.


Softwarewerkzeuge 2

Modellierung von Proteinstrukturen

Protein structure modeling for structural genomics.

R. Sánchez et al. Nat. Struct. Biol. 7, 986 - 990 (2000)


Softwarewerkzeuge 3

Methode zur Fold-Erkennung: Threading

• Gegeben:

– Sequenz:

IVACIVSTEYDVMKAAR…

– Ein Datenbank von möglichen

Proteinstrukturen (“folds”)

• Bilde die Sequenz auf jeden fold ab

• Starte dabei bei jeder möglichen

Position

• Bestimme anhand einer energetischen

Bewertungsfunktion, welcher Fold am

besten zu dieser Sequenz passt.


Softwarewerkzeuge 4

Homologie/Komperative Modellierung

Protein structure modeling for structural genomics. R. Sánchez et al. Nat. Struct. Biol. 7, 986 - 990 (2000)

Qualität der Modellierung

hängt von Sequenzidentität

mit Vorlage ab.


Softwarewerkzeuge 5

Überlagerung der 3D-Strukturen

Regionen mit Sequenzähnlichkeit werden automatisch ausgewählt und ihre

Residuen in 3D überlagert.

Diese erste Auswahl wird weiter verfeinert.

www.expasy.org/swissmodel/SWISS-MODEL.html


Softwarewerkzeuge 6

(a) Für alle Atome, die eine ähnliche Position besitzen und vermutlich eine

strukturelle Entsprechung in der neuen Struktur besitzen, werden gemittelte

Positionen als Framework-Koordinaten bestimmt.

(b) Seitenketten mit völlig inkorrekter Geometrie werden entfernt.

(c) Matrix mit Gewichten für lokale Ähnlichkeit.

3D Framework für die neue Sequenz



Softwarewerkzeuge 7

Konformationen für strukturell abweichende Loops zu konstruieren, ist ein ernstes

Problem bei der vergleichende Modellierung. Seine Lösung ist (noch) offen.

Dies gilt nicht nur für lange Loops, in denen zahlreiche Mutationen auftraten,

sondern auch für kurze Loops im Fall von Insertionen und Deletionen.

Sobald das Alignment von Zielsequenz und der Vorlagesequenz vorliegt, sollte

man überprüfen, ob die eingefügten Gaps ausserhalb von Sekundärstruktur-

elementen in der 3D-Struktur der Vorlage liegen.

Ein paar Regeln:

- bei sehr kurzen Loops können wir Daten über beta-turns verwenden

Konstruktion fehlender Loops


Softwarewerkzeuge 8

Eine Aminosäurekette kann ihre

Richtung dadurch umkehren, daß

ein „reverse turn“ durch Bildung

einer H-Bindung zwischen C=O

und H-N gebildet wird.

Beta-Turns

Wenn dies zwischen zwei antiparallelen beta-Strängen, nennt man diesen einen beta-Haarnadel (hairpin).Es ergeben sich folgende Diederwinkel:

table 1.1

table 1.1

Fig. 1.9

[Tramontano book]


Softwarewerkzeuge 9

Ein paar Regeln:

- falls mittellange Loops kompakte

Substrukturen bilden, spielt die

Ausbildung von Wasserstoffbrücken-

bindungen mit den Atomen des

Rückgrats die wichtigste Rolle für die

Konformation

- falls mittellange Loops ausgedehnte

Konformationen haben, ist für ihre

Stabilisierung meistens eine

hydrophobe Seitenkette

verantwortlich, die ins Proteininnere

zeigt und zwischen die

Sekundärstrukturelemente gepackt ist,

zwischen denen der Loop liegt.


Fig 4.16

[Tramontano book]


Softwarewerkzeuge 10

Sehr ähnliche Konformation

dreier Loops mit

unterschiedlicher Sequenz.

Zwei Loops enthalten ein cis-

Prolin. Die stabilisierenden H-

Bindungen werden mit sehr

unterschiedlichen

Proteingruppen ausgebildet.


Fig 4.17

[Tramontano book]



Basierend auf den Verankerungen der Loops werden

(a) wird eine Datenbank bekannter Loopfragmente in der PDB-Datenbank

durchsucht.

Für den neuen Loop verwendet man entweder das am besten passende

Fragment oder ein Framework aus den 5 besten Fragmenten.

(b) Der Torsionsraum der Loopresiduen wird durchsucht

- 7 erlaubte Kombinationen der - Winkel

- benötigter Raum für den gesamten Loop





Rekonstruktion von fehlendem Proteinrückgrat

Das Rückgrat wird auf der Grundlage von

C -Positionen konstruiert.

- 7 Kombinationen der - Winkel sind

erlaubt.

- Durchsuche Datenbank für Backbone-

Fragmente mit Fenster aus 5 Residuen,

Verwende die Koordinaten der 3 zentralen

Residuen des am besten passenden

Fragments.




Ponder & Richards (1987): einige Aminosäuren bevorzugen bestimmte Winkel-

bereiche für ihre Seitenkettenwinkel Rotamerbibliotheken.

Verwende Bibliothek erlaubter Seitenketten-Rotamere geordnet nach der

Häufigkeit des Auftretens in der PDB-Datenbank.

- Erst werden verdrehte (aber komplette) Seitenketten korrigiert.

- fehlende Seitenketten werden aus der Rotamer-Bibliothek ergänzt.

Teste dabei, ob van-der-Waals Überlapps auftreten und ob die

Torsisonswinkel in erlaubten Bereichen liegen.

Konstruktion unvollständiger/fehlender Seitenketten




Rotamer-Bibliotheken: günstige Diederwinkel

http://dunbrack.fccc.edu/bbdep/confanalysis.php

Phe, Tyr, His, Trp

r1 chi1 chi1-120 chi2 chi2+180 Syn-pentane (N-CA-CB-CG) (C-CA-CB-CG) (CA-CB-CG-XD1) (CA-CB-CG-XD2) interactions --- ----------- ----------- ------------ -------------- ----------- g+ 60 -60 60 -120 C,XD1

60 -60 120 -60 N,XD2 60 -60 -120 60 C,XD2 60 -60 -60 120 N,XD1

Conformation likely to be near chi2=+90 or -90

Aromatic sidechain chi2's are perturbed by interaction between XD1 and XD2 and backbone N and C. Without perturbation, chi2 would be near +90 or -90. When r1 is trans, interaction between backbone N and XD2 and XD1 at chi2=120 or -60 pushes the average for chi2 to values below 90 or below -90 respectively. Similarly, for r1 of g-, the averages are pushed to values above chi2=90 and chi2=-90 by interactions of N and XD1 and XD2 when chi2 is 60 or -120. For g+ rotamers, interactions at chi2=60 and 120 exert steric conflict about equally, so that chi2 averages 90 degrees.



Paarungs-Präferenz von Aminosäuren

Bei der Orientierung der Seitenketten wird üblicherweise jede für sich

betrachtet (Rotamer-Bibliothek berüchsichtigt zwar die Konformation des

Rückgrats, aber nicht die Umgebung).

Aminosäuren nehmen jedoch je nach Umgebung unterschiedliche

Konformationen ein.

Diese “Packungseffekte” könnten in der Zukunft ebenfalls für komparative

Modellierung berücksichtigt werden.

K



Salzbrücken

Datenbank für statistische Präferenz für die

Orientierung von Aminosäure-Seitenketten in

der PDB-Datenbank:

http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/

sidechains/index.html#

Häufigkeit von 1845 Asp-Lys-Kontakte

in PDB-Datenbank

K

84

66

60

34

31



-stacking von aromatischen Ringen

Aromatische Ringe (z.B. Phenol, Benzol, Seitenketten von Tyrosin,

Phenylalanin, Tryptophan, Histidin …) besitzen delokalisiertes

Elektronensystem ausserhalb der Ringebene.

Mehrere dieser Ringe “packen” gerne aufeinander bzw. senkrecht zueinander.

Cluster Phe-Tyr 1 4



Kationen--Wechselwirkung

Die gleichen aromatischen Ringe

wechselwirken gerne senkrecht zur

Ringebene mit positiv geladenen

Gruppen.

Beispiele: Acetylcholin in

Bindungstasche von

Acetylcholinesterase

K

Tyr-LysCluster 6

Bevorzugte Geometrien für die Wechselwirkung von Trimethyl-Ammoniumgruppen mit Phenyl-Ringen Gohlke & Klebe, JMB 2000



Kationen--Wechselwirkung

Wechselwirkung der positiv geladenen Guanidinium-Gruppe von Arg mit dem

-Elektronensystem von His.

Fast immer planare Packung. Nur in Cluster 3 Ausbildung einer

Wasserstoffbrücke N-H … N

1 2 3 4

K



Überprüfe die Qualität der 3D-Modelle

Analysiere 3D-Umgebung jeder Seitenkette. Erlaubt die Identifizierung missgefalteter Regionen.

Auch: WHATCHECK

überprüft auch die

Packungsdichte




Berechne, welche Bereiche des Proteins für eine kleine Probe zugänglich sind

(Connolly-Oberfläche bzw. Kubisches Gitter). Algorithmus entdeckt Oberflächen

innerhalb und ausserhalb des Proteins. Der Vergleich von Grösse und Verteilung

von internen Cavities zwischen Modell und Kristallstruktur-Vorlage erlaubt es,

Fehler im Modell aufzuspüren.

Analyse der Packungsdichte eines atomaren Modells




Bewertung der Qualität eines Homologiemodells1. Allgemeine Gesichtspunkte

• Ein Modell wird als falsch angesehen, wenn mindestens eines seiner strukturellen Elemente gegenüber dem Rest des Modells falsch angeordnet ist. Dies kann durch ein falsches

Sequenzalignment entstehen.

Das Modell kann dennoch korrekte Stereochemie besitzen.

• Man kann ein Modell als ungenau ansehen wenn seine atomare Koordinaten mehr als 0.5 Å von einer experimentellen Kontrollstruktur abweichen.

• Ungenauigkeiten können auch in der Stereochemie (Bindungslängen und –winkel auftreten). Dies kann leicht mit WhatCheck überprüft werden.

• Statistische Paarpotentiale für die Verteilung von Aminosäuren in bekannten Proteinen erlauben manchmal die Aufspürung von fehlerhaften Modellen.




2. Fehlerquellen

Die Qualität eines Modells hängt von 2 Kriterien ab

1 Seine Korrektheit hängt von der Qualität des Sequenzalignments ab.

2 Seine Genauigkeit wird durch seine Abweichung von einer (zukünftig zu bestimmenden) experimentellen Struktur bestimmt.

Strukturelle Abweichungen haben 2 Ursachen

- der inherente Fehler der Modellierungsprozedur

- durch Umgebung und Methoden der Datenerfassung bewirkte Variationen der experimentellen Strukturen, die als Vorlage verwendet werden.

• Ein durch komparative Methoden abgeleitetes Protein-Modell kann nicht genauer sein als der Unterschied zwischen einer NMR-Struktur und einer Kristallstruktur desselben Proteins.




3 Proteinkern und Loops

Fast jedes Proteinmodell enthält nicht-konservierte Loops, die als die am wenigsten zuverlässigen Teile des Proteinmodells angesehen werden

können.

Andererseits sind diese Bereiche der Struktur oft auch am flexibelsten –

hohe Temperaturfaktoren in Kristallstrukturen oder hohe Unterschiede zwischen verschiedenen (gleichsam gültigen) NMR-Strukturen.

Die Residuen im Proteinkern werden gewöhnlich fast in der identischen Orientierung wie in experimentellen Kontrollstrukturen modelliert.

Residuen an der Proteinoberfläche zeigen grössere Abweichungen.




Einordnung von Proteinmodellen in 3 Kategorien1 Modelle, die auf falschen Alignments zwischen Vorlage und Zielprotein

basieren.

Strategie: konstruiere mehrere Modelle für unterschiedliche Alignments.

Wähle das am besten erscheinende Modell.

2 Modelle, die auf korrekten Alignments beruhen, können für zielgerichtete

Mutagenese-Experimente hilfreich sein.

Sind oft nicht zuverlässig genug für detaillierte Untersuchung von

Ligandenbindung.

3 Modelle, die auf einer hohen Sequenzidentität (> 70%) mit der Vorlage

beruhen. Solche Modelle können in Drug Design Projekten verwendet werden.

Fehler sind jedoch immer, also auch bei sehr hoher Identität möglich.



Test für die Zuverlässigkeit von SwissModell

3DCrunch-Projekt von Expasy zusammen mit SGI. Generiere „Homologie-

Modelle“ für Proteine mit bekannter 3D-Struktur.

Die Vorlagen besaßen 25 – 95 % Sequenzidentität mit dem Zielprotein.

1200 Kontrolle-Modelle.

Grad der Identität [%] Modell innerhalb von x Å RMSD zur Vorlage

< 1 < 2 < 3 < 4 < 5 > 5

25-29 0 10 30 46 67 33

30-39 0 18 45 66 77 23

40-49 9 44 63 78 91 9

50-59 18 55 79 86 91 9

60-69 38 72 85 91 92 8

70-79 42 71 82 85 88 12

80-89 45 79 86 94 95 5

90-95 59 78 83 86 91 9




Zusammenfassung – Homologiemodellierung

• Gemeinsamer Kern von Proteinen mit 50% Sequenzidentität

besitzt ca. 1 Å RMSD

• Dies gilt sogar für absolute identische Sequenzen.

• Der zuverlässigste Teil eines Proteinmodells ist der Sequenzabschnitt,

den es mit der Vorlage gemeinsam hat. Die größten Abweichungen liegen in

den konstruierten Schleifen.

• Die Wahl der Modellvorlage ist entscheidend!

Die An- oder Abwesenheit von Ko-faktoren, anderen Untereinheiten oder

Substraten kann Proteinkonformation sehr beeinflussen und somit alle Modelle,

die von ihnen abgeleitet werden.

• Jeder Fehler im Alignment produziert falsche Modelle!

Solche Alignment-Fehler treten bei Sequenzidentität unter 40% auf.



IV The importance of being unfolded?

Anscheinend sind nicht wenige Proteine der Zelle einen Großteil der Zeit teilweise

entfaltet (P.E. Wright, H.J. Dyson, J. Mol. Biol. 293, 321 (1999))

Dies klingt sehr unerwartet. Was wären mögliche biologische Vorteile davon?

(1) Entfaltete Proteine können schneller abgebaut werden

kann für Regulation eines schnellen Zellzyklus erforderlich sein.

(2) Molekulare Erkennung ist schneller, wenn Faltung und Bindung gekoppelt sind

(3) Loopstrukturen können viele biologische Targets erkennen wichtig für Kommunikation und Regulierung bzw. Bildung großer Komplexe?

(4) Entfaltete Proteine können schnell in andere Zellkompartments transportiert

werden.



NORS regions: no regular secondary structure NORS regions are defined to have at least 70

consecutive residues with less than 12%

regular secondary structure (helix or strand).

We found four types of proteins.

(A) Connecting loops: long loops that connect

two domains or chains (shown Formate

Dehydrogenase H, 1AA6). of interactions.

(B) Loopy ends: long N- or C-terminal regions

that lack regular secondary structure (shown

Hexon from adenovirus type 2, 1DHX).

(C) Loopy wraps: long loopy regions wrapping

around globular domains (shown Class II

chitinase, 2BAA.

(D) Loopy domains: entire structures that

have almost no regular secondary structure

(shown extra-cellular domain of T beta RI,

1TBI).

Liu, Tan, Rost, J Mol Biol (2002)

332, 53-64



NORS regions use particular amino acidsThe height of the one-letter amino acid code is

proportional to the abundance of the respective

acid in each data set. The actual value is the

difference in occurrence with respect to the

frequency observed in a sequence-unique subset

of PDB:

.

Inverted letters indicate acids that are less

frequent than 'expected'. The amino acids are

sorted by 'flexibility' , with the more rigid ones

on the left. Overall, NORS regions are as

abundant in more flexible residues as loop

regions in PDB . However, we found considerably

more Serine (S), Glutamine (Q), and Glycine (G)

and considerably fewer Arginine (R), Aspartic

acid (D), Glutamic acid (E), Tryptophan (W), and

Phenylalanine (F) in NORS regions than in loop

regions, in general.

Liu, Tan, Rost, J Mol Biol (2002) 332, 53-64

21

21

PP

ppz



Many NORS regions predicted in proteomesWe predicted many NORS regions in 31 entirely

sequenced organisms. NORS proteins appeared

particularly abundant in eukaryotes.

(A) gives the percentage of proteins in respective

proteome for which at least one NORS region is

predicted. High enrichment in eukaryotic

proteomes!

(B) illustrates the percentage of all the residues

of the respective proteome for which a NORS

region is predicted.

(C) gives the percentage of all predicted NORS

regions that are between N and N+10 residues

long (note that, by definition, NORS regions are

longer than 70 residues). Surprisingly, almost

15% of all the predicted NORS regions extend

over more than 200 residues (inset of C). Liu, Tan, Rost, J Mol Biol (2002) 332, 53-64



Das Prion-Protein PrPc:

ist ein normales zelluläres Glycoprotein- ist an die Plasmamembran über einen

GPI-Anker angehängt - hat 209 Aminosäuren

Seine genaue Funktion ist unbekannt.

Cu2+ Speicherung, Erinnerung?

Struktur aus NMR-Bestimmungen bekannt:

Die N-terminale Region 23-120 ist sehr

flexibel und meist ungeordnet.

C-terminale Region enthält 3 -Helices,

2 kurze -Stränge

PrPc wird schnell durch Proteinase K abgebaut

Prion: ein ungeklärtes Beispiel für misgefaltete Proteine

7. vorlesung ws 2006/07softwarewerkzeuge1 v7 homologie-basierte proteinmodellierung (swissmodel)...

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