6. techniken der protein- reinigung - unifr.ch · pdf file1.schritte in der protein-reinigung...
TRANSCRIPT
![Page 1: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/1.jpg)
6. Techniken der Protein-Reinigung
1. Protein-IsolationA) Wahl der ProteinquelleB) Methoden der SolubilisierungC) Stabilisierung von ProteinenD) Protein AssaysE) Generelle Strategien zur
Protein-Reinigung2. Löslichkeit von Proteinen
A) SalzeffekteB) Organische LösungsmittelC) pH-EffekteD) Kristallisierung
3. Chromatographische SeparierungA) Ionentauscher-ChromatographieB) PapierchromatographieC) GelfiltrationD) AffinitätschromatographieE) Andere chromatographische Techniken
4. ElektrophoreseA) Papier ElektrophoreseB) Gel ElektrophoreseC) SDS-PAGED) Isolelektrische FokusierungE) Kapillar Elektrophorese
5. UltrazentrifugationA) SedimentationB) Präparative Ultrazentrifugation
![Page 2: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/2.jpg)
Protein-Reinigung: Das Problem
o Unser Protein beträgt ~0.1% des Zelltrockengewichtes(oftmals liegt es gar nur in wenigen Kopien pro Zellevor), muss aber zur Charakterisierung ~98% rein sein.
o Besseres Verständnis der biochemischen Abläufe gehtHand in Hand mit verbesserten Methoden der Analyse.-> Verständnis der Methodik ist sehr wichtig.
![Page 3: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/3.jpg)
1.Schritte in der Protein-Reinigung
1. Selektion der Proteinquelle– Hämoglobin von Erythrozyten– Lac Repressor aus E. coli– Rekombinante Expression
2. Methoden der Solubilisierung– Zytosolisch <-> Membrangebunden / unlöslich– Osmotische Lyse der Zelle durch hypotone Lösung– Zellwand-Abbau bei Bakterien durch Lysozym– Mechanische Zerkleinerung des Gewebes– Klärung des Lysates (Filtration/Zentrifugation) -> Homogenat– Eventuelle Anreicherung für ein Organell (Mitochodrien,..)
mittels differenzieller Zentrifugation
![Page 4: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/4.jpg)
Schritte in der Protein-Reinigung(2)
3. Stabilisierung des Proteins– Kontrolle des pH durch geeignete Pufferlösungen– Temperatur (4°C), Salzgehalt– Inaktivierung der Proteasen
4. Protein Assay– Unser Protein muss „gesehen“ werden– Bsp. Enzyme über ihre Aktivität– Bindungseigenschaften, Bsp. Rezeptor - Ligand– Biologische Aktivität, Bsp. Toxin– Immunologische Techniken, Bsp. ELISA
• Antikörper: Monoklonal / Polyklonal
![Page 5: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/5.jpg)
ELISAenzyme-linked
immunosorbant assay
Bsp. Schwangerschaftstestbasierend auf ELISA detektierenChorion Gonadotropin im Urin
![Page 6: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/6.jpg)
Generelle Strategie derProteinreinigung
o James Summer (1926) ersteProteinkristallisation,Urease aus Sojabohnen
o ~1940, ca. 20 Enzymegereinigt
o Heute, tausende
o Prinzip: Alle physiko-chemischen undbiologischen EigenschaftenIhres Proteins werdenausgenützt
![Page 7: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/7.jpg)
2.Löslichkeit von Proteinen– Was bedeutet Löslichkeit ?– Da Proteine viele Säure-Base Gruppen
besitzen, ist ihre Löslichkeit abhängigvon:• pH• Salzkonzentration• Art von Salz• Temperatur• Polarität des Lsm
Ammonium Sulfate
![Page 8: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/8.jpg)
Einfluss der Salzkonzentration
o Ionenstärke: I = 1/2∑ci Zi2
ci molare conc.Zi ionische Ladung
o Bei tiefer Ionenstärkenimmt die Löslichkeit mitder Salzkonzentration zu(Einsalzen)
o Bei hoher Ionenstärkenimmt die Löslichkeit ab(Aussalzen) [AmmoniumsulfatFraktioinierung]
Salzabhängige Löslichkeit von Carboxy-Hemoglobin bei pI
![Page 9: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/9.jpg)
Einfluss organischer Lösungsmittel
o Wasserlösliche organische Lösungsmittelkönnen zugesetzt werden, um dadurch diePolarität und Dielektrizitätskonstante derwässrigen Lösung zu erniedrigen ->Prezipitation des Proteins, bei 4°C
o Organische Lösungsmittel mit hoher Dielk.Hingegen sind gute Lsm für Proteine (DMF,DMSO)
o Vorsicht: Denaturierung von Proteinen
![Page 10: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/10.jpg)
pH-Abhängigkeit der Löslichkeit
• Minimal beimisoelektrischen Punkt, pI,des Proteins, isoelektrischePrezipitation
• pI eines Proteins: Summeder neg. = Summe der pos.Ladungen– Keine Nettoladung– Keine Mobilität im
elektrischen Feld.
![Page 11: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/11.jpg)
Isoelektrischer Punkt von einigenhäufigen Proteinen
![Page 12: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/12.jpg)
Proteinkristalle
• Kristallisation ausgehendvon hochgereinigtenProteinlösungen
• Induzierte, langsamePrezipitation
• Röntgenkristallstruktur-Analyse
![Page 13: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/13.jpg)
3.ChromatographischeTrennungen
o Chromatographie: Gr. chroma, Farbe + graphie,schreiben
o Auftrennen von Farbe in ihre Bestandteileo Prinzip: Mobile Phase - stationäre Phase
Dabei treten Wechselwirkungen zwischen dem in dermobilen Phase gelösten Analyten und der stationärenPhase auf
o Klassifikation nach Art der Wechselwirkung mit derstationären Phase, Bsp. Ionentauscher Chr., AdsorptionsChr.
o Zur Proteinreinigung werden typischerweise mehrere Chr.Separationen hintereinander durchgeführt.
![Page 14: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/14.jpg)
Papierchromatographie
• Set 1941, einfache Technik zurSeparierung von kleinen Molekülen, AS,Oligopeptide
• Stationäre Phase ist polar (Cellulose),mobile Phase ist apolar -> Separationaufgrund der Polarität der Substanz
• Migrationsrate hängt vomPartitionskoeffizienten ab:Kp = conc. Stat. Phase / conc. Mobil Phase
• Migrationsrate charakteristisch für jedeSubstanz,Rf = Distanz der Substanz /Distanz des Lsm
• Dedektion: Radioaktiv, Fluoreszenz,Derivatisierung, Bsp. Ninhydrin für AS
• Zwei-dimensional
![Page 15: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/15.jpg)
Reaktion von Ninhydrinmit Aminosäuren
![Page 16: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/16.jpg)
Zwei-dimensionalePapierchromatographie
![Page 17: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/17.jpg)
![Page 18: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/18.jpg)
Gradientenmischer (linear)
C = C2-(C2 -C1)ƒ
C1, conc. Mixing chamberC2, conc. Reservoirƒ, remaining fraction of combinedvolumes initially present
![Page 19: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/19.jpg)
Ionentauscher Chromatographie
o Reversibler Austausch von Ionen an der inerten Matrix (stationärePhase, R+) mit Ionen in der Lösung (mobile Phase, B-)
R+A- + B- <-> R+B- + A- (Anionen Tausch)o Proteine sind Polyelektrolyte, können daher über Anionen- oder
Kationen-Tauscher gereinigt werdeno Affinität der Interaktion hängt von der Präsenz anderer
Bindungspartner ab, Salz, pHo Vorgehen: 1. Bindung der Proteine an den Ionentauscher
unter gegebenen Bedingungen2. Selektive Elution entweder schrittweise oder mittels eines Gradienten
![Page 20: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/20.jpg)
Typen von Ionentauscher
o Resign: support Matrix der stationären Matrix, Bsp.Cellulose, cross-linked polyacrylamide, polydextran (allesind komprimierbar, daher nicht für HPLC geeignet).
o Beeinflusst Durchfluss, Ionen-Zugang, Stabilität derMatrix
o Trägt die ionisierbare Gruppe
![Page 21: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/21.jpg)
Bsp. von IonentauscherMatrix
![Page 22: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/22.jpg)
Gel-Filtrations Chromatographieo Gel-Filtration = Size Exclusion Chromatography =
Molekularsieb, Separierung aufgrund der Grösse undForm von Proteinen
o Stationäre Phase, Kügelchen (beads) mit kleinen Poreno Exclusion Limit, Ausschluss Grenze, Grösse des
kleinsten Moleküls, das nicht in die Poren eindringenkann.
o Vt = Vx + V0 Vt, Bett Volumen der Säule; Vx, Volumen der Gelbeads;V0, Volumen des Lösungsmittel um die Beads (voidvolume), Typischerweise ist V0 ~35% von Vt
o Ve, Elutionsvolumen eines bestimmten Proteinso Relatives Elutionsvolumen, charakteristisch für jedes
Protein, normalisiert für Säulengrösse, Ve/V0
![Page 23: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/23.jpg)
![Page 24: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/24.jpg)
Gelfiltration zur Mw BestimmungDas relative Elutionsvolumen eines Proteins, Ve/V0, ist
invers proportional zu seiner Masse
![Page 25: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/25.jpg)
Gebräuchliche Materialien zurGelfiltration
o Resign: Dextran (polymervon Glucose), Agarose (redalgae), Polyacrylamid
o Porengrösse wird über denGrad an crosslinkingkontrolliert
o Entsalzen vonProteinlösungen
![Page 26: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/26.jpg)
Dialyseo Dialyse ist ebenfalls eine Art
der Molekulargewichts-Filtration
o Semipermeable Membran ausCellophan (Cellulose Acetat)
o Wechsel des Lsm.o Dialyse gegen Polyethylenglykol
zur Aufkonzentration derProtein Lösung
![Page 27: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/27.jpg)
Affinitätschromatographieo Nutzt die Eigenschaft vieler Proteine an
Liganden zu binden aus, Bsp. Enzymekönnen an Substratanaloga binden
o Ligand ist über Spacer kovalent an dieMatrix gekoppelt.
o Lösung der Ligand - Proteininteraktion zB.mit einem Liganden höherer Affinität oderpH, Salz-Sprung
o Cyanogen Bromid oder Epoxy aktivierteResigns zur Kopplung des Liganden an dieMatrix
o Immunaffinitätschromatographie,spezifische Antikörper werden an dieMatrix gebunden
![Page 28: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/28.jpg)
Cyanogen Bromid oder Epoxy-aktivierte Trägerzur kovalenten Kopplung des Liganden an das
Resign
Epoxy-aktivierte Agarose
![Page 29: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/29.jpg)
Bsp. Affinitätsreinigung der Nucleaseaus Staphylococcus
![Page 30: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/30.jpg)
Bsp. Reinigung der Rattenleber Glucokinase
![Page 31: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/31.jpg)
Weitere chromatographischeTechniken
o Adsorptions Chromatographie zur Separierung vonapolaren Substanzen, Bsp. Lipide. Matrix(hydrophil):Silica Gel, Kieselguhr, Aluminium Oxid
o Hydroxyapatit, unlösliche Form des Calzium Phosphateso Dünnschicht Chromatographie (TLC), Separierung
organischer Moleküle, Bsp. Lipideo Reverse Phase Chromatography (RPC), (reversed relativ
zu Papierchromatographie) Stationäre Phase ist eineapolare Flüssigkeit, die mobile Phase ist polar,normalerweise denaturierend, Bsp. Lipide, Oligopeptide
o Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) wieRPC, aber die hydrophile Matrix ist nur leicht hydrophobderivatisiert (Octyl, Phenyl-Gruppen)
o HPLC
![Page 32: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/32.jpg)
HPLCo High pressure liquid chromatograpy
unkomprimierbare Matrix basierend aufGlaskügelchen oder Silica, welche derivatisiertwerden -> Ionentauscher, RPC, HIC, Affinitäts Chr.
o Lange, dünne Säulen in Metallröhrchen welche mitsehr hohem Druck (bis 5000 psi) gefahren werden– Gute Auflösung– Schnell <1h– Sensitiv– Automatisierbar
![Page 33: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/33.jpg)
4.Elektrophorese
o Migration von Ionen in einem elektrischen Feld,o Elektrische Kraft, Felectric, auf Ion mit Ladung q in
einem elektrischen Feld E ist: Felectric = qEo Diese Migration wird durch einen Widerstand, Ffriction,
gebremst, der sich aus dem Produkt derBeschleunigung, v (velocity), mit einemWiderstandskoeffizienten, f, ergibt: Ffriction = vf
o Bei Konstanz, d.h. Ionen bewegen sich nicht: qE = vfo Elektrophoretische Mobilität eines Ions: µ = v/E = q/f
![Page 34: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/34.jpg)
Wandernde Grenze
• 1937, erste elektrophoretische Trennungvon Proteinen durch Arne Tiselius
![Page 35: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/35.jpg)
Papierelektrophorese
o Eine Art zonaler Elektrophorese,die Probe muss auf einem Trägerund nicht in Lösung wandern
o ~20 V/cmo Hochspannungs Elektrophr. ~200
V/cmo Kombination von Papierelektroph.
(Trennung aufgrund der Ladung)und Papierchromatography(Trennung aufgrund der Polarität)wird zum Fingerprinting eingesezt
![Page 36: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/36.jpg)
Gelelektrophorese
o Eine der häufig gebrauchten und bestenMethoden, um Makromoleküle zu trennen.
o Agarose und Polyacrylamide als Trägero Kombination von Elektrophorese mit Gel
Filtration
![Page 37: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/37.jpg)
PAGEo Polyacrylamid Gelelektrophoreseo Die Polymerisation von Acrylamid
wird durch freie Radikale(Ammonium Persulfat, TEMED alsStabilisator) induziert
o Porengrösse wird durch denAnteil an Acrylamid undBisacrylamid bestimmt
o Lauf bei pH ~9 -> Proteine sindnegativ geladen
![Page 38: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/38.jpg)
Elektrodenreaktion in derElektrophorese
![Page 39: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/39.jpg)
Sammel- und Trenngele erhöhendie Auflösung
o Diskontinuierlicher pH, Disc Elektrophoreseo Konzentration der aufgetragenen Probe in einem
dünnen Bereich durch Sammelgel + Trenngelo Trick: pH im Sammelgel 2 Einheiten Tiefer +
grössere Poren -> Fokusierung der Proteine an derGrenzschicht
![Page 40: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/40.jpg)
Färbung von Proteineno Coomassie-Färbung, detektiert µg
Fraktioneno Silber-Färbung, ca. 50x sensitivero Fluorescamin modifiziert Lys
– Radioaktive Proben -> Autoradiographie
– Scintillations Zählung
![Page 41: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/41.jpg)
Western blottingo Zur Detektion spezifischer Proteine mittels Antikörper
![Page 42: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/42.jpg)
SDS-PAGEo SDS, starkes anionisches Detergents, Bindung
von ca. einem SDS Molekül pro 2 AS ->negative Ladung
o Alle Proteine haben die selben Ladung-zu-Masse Verhältnisse und eine ähnliche Form, dadenaturiert
o Trennung aufgrund der Massedurch die Gel Filtration vonPAGE
![Page 43: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/43.jpg)
Isoelektrische Fokusierung
o Elektrophorese durch einen pH-Gradienten, Wanderung stoppt, wenndas Protein seinen isolektrischen Punkt erreicht
o Der stabile pH-Gradient wird durch ein Gemisch von Polyampholytenmit unterschiedlichen pI realisiert. Diese wandern im elek. Feld undbauen den pH-Gradienten auf.
o Mit Zusatz von Harnstoff zur Denaturierung der Proteine
![Page 44: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/44.jpg)
Zwei-dimensionaleGelelektrophorese
• Isoelektrische Fokusierung gepaart mit SDS-PAGE
![Page 45: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/45.jpg)
5.Ultrazentrifugation
o Separation aufgrund unterschiedlicher Dichteo Die Kraft, Fsed, welche auf ein Partikel mit Masse m, welches in einer
Distanz von r vom Drehzentrum, um welches es sich mit derGeschwindigkeit ω dreht (in rad s-1), entspricht der Zentrifugalkraftdes Partikels (mω2r) abzüglich der Auftreibkraft durch die Lösung (Vpρω2r): Fsed = mω2r - Vpρω2r ; wobei Vp das Partikelvolumen und ρ dieDichte der Lösung
o Ein Partikel hat eine charakteristische Sedimentationskonstante(analog zur elektrophoretischem Mobilität), in Svedbergs (S) (10-13 s)
o Die Partikelmasse kann durch analytische Ultzrazentrifugationbestimmt werden
![Page 46: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/46.jpg)
Physikalische Parametereiniger Proteine
![Page 47: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/47.jpg)
Sedimentations-Koeffizienten in
Svedbergs
![Page 48: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/48.jpg)
PreparativeUltrazentrifugation
• Preparative Trennung von Partikeln durch:– Differenzielle Zentrifugation– Zonale Zf.– Equilibriums Zf.
![Page 49: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/49.jpg)
Zonale Ultrazentrifugationo In Dichtegradienten (linear, step), Bsp. Sucrose, CsClo Trennung aufgrund der Masse (Beschleunigung)
![Page 50: 6. Techniken der Protein- Reinigung - unifr.ch · PDF file1.Schritte in der Protein-Reinigung 1. Selektion der Proteinquelle –Hämoglobin von Erythrozyten –Lac Repressor aus E](https://reader034.vdocuments.site/reader034/viewer/2022042800/5a78b8c47f8b9ae6228c061a/html5/thumbnails/50.jpg)
Gleichgewichts / isopyknischeUltrazentrifugation
o In linearen Dichtegradienteno Trennung aufgrund der Dichte