6 metode 1_3

1

MetodeMetode

Laboratorijska mjerenja

Kvalitativna Semi-kvantitativna Kvantitativna

Ima - NemaManje – isto- više od

Funkcionalna specifičnostBrojčani izraz

Strukturalna specifičnost

Imunokemijske metodeImunokemijske metode

JezeroJezero Duž: 2,5 kmDuž: 2,5 km

Šir: 0,5 kmŠir: 0,5 km

Dubina; 20 mDubina; 20 m

Volumen: 2,5 Volumen: 2,5

2 g šećera u 0,1 mL vode

(0,23 pmol/L)

šećera

Imunokemijske tehnikeImunokemijske tehnike

• U većini IK tehnika radni reagens

– sadrži poliklonalna (monoklonalna) At

– služi za kvalitativnu i kvantitativnu analizu Ag u uzorku

2

MetodeMetode

• [Ag] + [At] [Ag – At]

Vezanje At na Ag izravno je razmjerno:

• Afinitetu

• Avidnosti

• Koncentraciji At

• Gustoći epitopa

• Jačina veze obrnuto je razmjerna

udaljenosti aktivnih mjesta

udesno [Ag] i [At] > [Ag-At]

MetodeMetode

• afinitet i avidnost – mogućnost križne

reaktivnosti

• Avidnost je fenomen u kojem jakost veze

svih parova "paratop – epitop" nadmašuje zbroj pojedinačnih veza paratop – epitop

• [Hp - At ]n > { [Hp - At ] + .....[Hp - At ]n}

Imunokemijske tehnikeImunokemijske tehnike

1. Neobilježene – izravne

– Reagens sadrži poliklonalna At (pAt)

2. Obilježene – posredne

– Reagnes sadrži monoklonalna At (mAt)

3

ČČemu služe osjetljive IK metode?emu služe osjetljive IK metode?

1. Određivanje niskih koncentracija Ag (hormoni, specifični proteini)

2. Istodobno određivanje više Ag (hormoni hipotalamusa, faktori rasta)

3. Rana dijagnostika tumora (tumorski biljezi)

4. Otkrivanje virusnih Ag i At (HIV, HBV, HCV...)

5. Otkrivanje novih Ag (nepoznati biljezi)

Pregled IK metodaPregled IK metoda

I - Taložne reakcije

II – Kvalitativne metode u gelu

III – Kvantitativne metode u gelu

IV – Izravne metode u otopini

V – Metode s obilježenim reagensima

Taložne reakcijeTaložne reakcije -- ((serološkeserološkemetodemetode))

• Taloženje nastaje zbog reakcije između

velikoga broja hidrofobnih skupina.

• Kada broj hidrofobnih skupina dosegne

određenu kritičnu razinu kompleks postajesposoban izbaciti vodu, i istaložiti se.

• Tako topljivi reaktanti stvaraju netopljivi

produkt.

4

Taložne reakcije Taložne reakcije -- PovezanostPovezanost omjeraomjera

Ag/At i Ag/At i sastavasastava kompleksakompleksa

Omjer Ag/At Vrsta kompleksa2,25 AgnAtn>1, topljiv, slobodni Ag

2,27 AgnAtn=1, AgnAtn, slobodni Ag i At

0,71 svi tipovi kompleksa, topljivi, netopljivi, slobodni Ag i At

0,40 Ag1Atn,Ag2Atn , slobodni Ag i At

0,23 malo kompleksa Ag1Atn, malo

slobodnog Ag, puno slobodno At

0,13 Ag1At8, nema slobodnog Agnetopljiv

topljiv

Taložne reakcijeTaložne reakcije ––((serološkeserološke metodemetode))

1. precipitacija

a. kvalitativna precipitacija

b. kvantitativna precipitacija

2. aglutinacija

a. izravna aglutinacija

b. posredna aglutinacija

* aglutinacija stanica ili inertnih čestica obloženihantigenom

** obrnuta aglutinacija stanica ili inertnih česticaobloženih antitijelom

*** spontana aglutinacija (virusna aglutinacija)

Kvalitativne tehnike u geluKvalitativne tehnike u gelu

1. Imunodifuzija

A. jednostruka imunodifuzija

a. jednostruka jednodimenzionalna imunodifuzija

b. jednostruka dvodimenzionalna imunodifuzija

B. dvostruka imunodifuzija

a. dvostruka jednodimenzionalna imunodifuzija

b. dvostruka dvodimenzionalna imunodifuzija

2. Imunoelektroforetske tehnike

a. imunoelektroforeza

b. protusmjerna imunoelektroforeza

c. Imunoblot (Western Blot) tehnika

5

Kvantitativne tehnike u geluKvantitativne tehnike u gelu

1. Radijalna imunodifuzija

2. Elektroimunoprecipitacija

- elektroforeza antigena u gelu;

- raketna elektroforeza

Izravne tehnike u otopiniIzravne tehnike u otopini

a. turbidimetrija

b. nefelometrija

c. laserska nefelometrija

Metode s obilježenim reagensimaMetode s obilježenim reagensima

1. Radioimunokemijske metode(RIA)

2. Imunoradiometrijska metoda (IRMA)

3. Enzimimunokemijska metoda (EIA)

4. Fluoroimunokemijska metoda (FIA)

5. Luminoimunokemijska metoda (LIA)

a. kemiluminiscencija

b. bioluminiscencija

6

PrecipitaPrecipitacijacija

Antigen Antigen

AntiAntitijelotijelo

PrecipitaPrecipitacijacija1. faza – specifično vezanje pojedinačnih molekula u Ag-At

- ovisi o koncentraciji reaktanata (10-6) – djelić sekunde; (10-9) – nekoliko minuta

2. faza – stvaranje vidljivih agregata - ravnoteža- nekoliko sati ili dana- važni fizik.čimbenici: konc. soli, pH, temp, vrijeme

Količina At u precipitatu jednaka ukupnoj količini specif. At dodanom volumenu antiseruma

3. faza - ovisno o relativnim koncentracijama antigena i protutijela kompleksi se mogu križno povezivati pri čemunastanu veliki trodimenzionalni kompleksi. Kad se uravnoteže svi nastali kompleksi prestaje njihova daljnjirast.


Kvalitativna precipitacija

• Za dokazivanje pripadnosti vrsti (mišji, goveđi, kunićji proteini)

• Za dokazivanje tipa proteina (primjese

serumskih proteina u pročišćenim preparatima)

7


• Kvanitativna precipitacija

* konst (At) + ili (Ag) - mjeri se konc. Ag

Epruveta u kojoj se pojavi talog = ZE (titar ili g/L)

** konst. (Ag) + ili (At) – mjeri se konc. At

ZE

pre-zona post-zona

višak At višak Ag

optimalan Ag : Atprecipitat

[At] 1

[At] 1/128


• Mjerenje ZE (točke ekvivalencije) –

fotometrijski, spektrofotometrijski

• Standard Ag – ne trebaju razrjeđenja

• - baždarna krivulja – 2 točke

(uzlazni i silazni krak)

• Prednost: jednostavnost, brzina, pouzdanost

• Nedostatak; nedovoljna osjetljivost

8

AglutinacijaAglutinacija

• Ag = korpuskula (bakterija, Erc) – aglutinat (ugrušak)

• Izravna aglutinacija :

Erc, bakterije, gljivice + At aglutinacija

• Posredna (pasivna) aglutinacija

* aglutinacija stanica ili inertnih čestica koje su obložene s Ag i koje su pasivni nosači inače topljivih Ag (aglutinacija čestica lateksa)

** obrnuta aglutinacija: čestice lateksa ili Erc se oblažu s At

*** spontana aglutinacija Erc koju izazivaju neki virusi (virusna hemaglutinacija)


Eritrociti

• Lako dostupni

• Osjetljivi (kao indikator)

• Mogućnost čuvanja (+4oC)

• Potrebno je ukloniti heterofilna At s površine Erc (mogu aglutinirati)

• Erc se tretiraju s formalinom, glutaraldehidom

oblažu se s proteinskim Ag (prethodno s

taninskom kis.)

Krvne grupe

9

Ligandi

Hh antigenski sustav (antigen prisutan u osoba s krvnom grupom O- molekularna struktura ABO(H) antigenskog sustava

Osobe s rijetkim fenotipom Bombay (hh) nemaju H antigen("substance H") (antigen prisutan

u krvnoj grupi O).

Kompatibilnost

A-B-O Davatelj & Primatelj

PrimateljPrimatelj

Davatelj

AB

B

A

O

AB

Nema

B

anti-A

A

anti-B

Oanti-Aanti-B

Aleli &Antitijela

NR - Nema reakcijeAG - Aglutinacija

Kompatibilnost

A-B-O Davatelj & Primatelj

PrimateljPrimatelj

Davatelj

NRAglutinacija

AglutinacijaAglutinacijaAB

NRNRAglutinacijaAglutinacijaB

NRAglutinacija

NRAglutinacijaA

NRNRNRNRO

AB

Nema

B

anti-A

A

anti-B

Oanti-Aanti-B

Aleli &Antitijela

NR - nema reakcije

10

Određivanje krvnih grupaDodati kap anti-A antitijela kapi krvne grupe ADodati kap anti-B antitijela kapi krvne grupe B

anti-A antitijela anti-B antitijela

Rh

Rh senzibilizacija

Prva trudnoća

Druga trudnoća

11

Rh - antigeni

Rh Rh --dddd

OtacOtacDdDd

Rh +Rh +DDDD

DDDddd

Rh + Rh-

MajkaMajka

Rh - antigeni

Rh Rh --dddd

OtacOtacDdDd

Rh +Rh +DDDD

DDDddd

Rh + Rh-

MajkaMajka

Rh - antigeni

Rh Rh --ddddRh +Rh +Rh +Rh + (Rh(Rh--))RhRh--

OtacOtacDdDd

Rh +Rh +RhRh ++ (Rh(Rh--))Rh +Rh + (Rh(Rh--))

Rh +Rh +DDDDRh +Rh +Rh +Rh +Rh +Rh +

DDDddd

Rh + Rh-

MajkaMajka

12

AglutinaAglutinacijacija

ERC

ERC

ERC

ERC

IgMIgM

IgG IgG

ERC

ERCERC

ERC ERC

ERCERC

LateksLatekspolimerizacija

stirenski monomer polistirenski lateks

– Stiren + surfaktant (Na dodecil sulfat) - emulzija s bilijun čestica jednakog promjera

– Dodatak K-persulfata (počelo polimerizacije) ------------- polimerizacija

– Polistirenski lanci tvore micele (u središtu hidrokarbon, a na periferiji sulfatni ioni)

– Veličina čestica (0,5 – 2 µm) ovisi omjerima hidrokarbona, surfaktanta, počela i uvjeta polimerizacije

– Površinski naboj = negativan

Sulfatne skupine surfaktanta

Polistiren

Sulfatni slobodni radikali

Hidrokarbonski krajevi sufaktanta

Lateks

• Najrašireniji korpuskularni nosač (0,1-2,0µm)

• Može vezati Ag ili At

• Velika kontaktna površina (omogućuje detekciju već kod pojave prvih količina Ag/At

• osjetljivost, brzina reakcije (nakon 1. min) dovoljno za kvalitativnu analizu

• Gruba kvantitativna procjena– pozitivan / negativan standard

• Kvantitativna analiza –razrijeđeni uzorci—turbidimetrijski (CRP, RF, ASO)

13


• Mononukleoza (kvalitativna , semikvantitativna

– Princip: Određuju se IgM heterofilna antitijela (koristi se antigen bubrega zamorca, eritrociti konja koji povećavaju specifičnost, osjetljivost i budući da su obojeni vidljivost reakcije)

• Reumatski faktori

– lateks aglutinacija

– Pročišćeni humani IgG kovalentno vezan na modro obojene latex čestice. U prisustvu RF čestice aglutiniraju, vidljivi agregati.

• Virus Rubela

– Određuju se IgG i IgM prema virusu rubele u serumu

– polistirenske lateks čestice obložene denaturiranim virusom (soj HPV77)

Aglutinacija

At

Ag

Metode vezanja proteina na lateks

Pasivna adsorbcija

-Lateks + protein + pufer

- postizanje ravnoteže

- višekratno ispiranje

Kovalentno vezanje

- preko funkcionalnih skupina

karboksilati, amino-, aldehidne- ,

amidi-,

Lateks

• Preduvjeti za kvalitetan lateks

– Dobro pročišćeni ligandi. Nečistoća smanjuje osjetljivost i specifičnost testa

– Količina vezanog liganda na površini čestice mora biti idealna. Aglutinacija se može

smanjiti ako čestice ne sadrže dovoljan (ili prevelik) broj liganada

– Nevezani ligandi moraju se ukloniti nakon vezanja

14

Lateks Lateks -- odre određđivanje RFivanje RF

• Negativan rezultat

+

Lateks prekriven Serum s niskoms humanim IgG konc RF (IgM)

• Pozitivan rezultat

Niska konc RF u serumu

+Serum s visokom konc. RF

Visoka konc RF u serumuTURBIDIMETRIJA

LateksLateks

???CV (%)

1,140,660,53SD (IU/L)

50,6120,0811,07X (IU/L)

202020broj uzoraka

321serum br.

Preciznost unutar određivanja (RF)

LateksLateks

2,253,294,78CV (%)

1,140,660,53SD (IU/L)

50,6120,0811,07X (IU/L)

202020broj uzoraka

321serum br.

Preciznost unutar određivanja (RF)

15

Kvalitativne tehnike u geluKvalitativne tehnike u gelu

• Reakcija Ag : At se izvodi u polučvrstom

mediju:

»Agarozni – gel»Agaroza»Poliakrilamidni gel

Agarozni gelAgarozni gel

• Pročišćen polisaharid – dobiven od agara

• Dostupan u različitim

koncentracijama

temperature taljenja

jačine gela,

razine elektroendoosmoze

čistoće

AgarozaAgaroza

• Otapanjem praha u kipućoj vodi :

• Hidroklorid povezan H- i hidrofobnim

vezama

• Hlađenjem na 40 oC ---- gel

• Stabilan na temp. < 100 oC

• konc. - pore; radna konc. 0,4 – 4,0 %

• Lomljiv – oprezno rukovanje

16

Poliakrilamidni gelPoliakrilamidni gel

• Akrilamid – križno povezani monomeri

• Polimerizacija: dugi lanci kovalentno povezani

• Najmanja križno povezana jedinica:

N,N'-metilen-bis-akrilamid

• Polimerizaciju kataliziraju

- slobodni radikali (peroksid)

- fotokemijski (UV-svjetlo)

- hlađenje 20 – 60 min

Pasivna difuzija u geluPasivna difuzija u gelu

• Pasivna difuzija Ag i At opisana Fickovom

jednadžbom:

• dQ dC

• Dt dx• dQ = količina molekula koje difundiraju

• Dt = vrijeme difuzije

• A = površina

• dC/dx koncentracijski gradijent (C = konc, x = difuzijski put

• D = koeficijent difuzije

= - D x A x

O čemu ovisi brzina difuzije?O čemu ovisi brzina difuzije?

• Koncentracija Ag i At

• Mr Ag i At

• Građa, površinski naboj Ag i At

• Gustoća ili koncentracija gela

• Temperatura, pH, koncentracija elektrolita

17

ImunodifuzijaImunodifuzija

Jednostruka imunodifuzija Dvostruka imunodifuzija

ImunodifuzijaImunodifuzija

1. reakcija identičnosti 2. reakcija djelomične identičnosti 3. reakcija neidentičnosti

ImunelektroforezaImunelektroforeza

1. Zonska elektroforeza antigena

2. Reakcija Ag - At

Ag

At

18

Imunoelektroforeza - elektroforeza proteina – naboj, Mr; pI

- difuzija- precipitacijski lukovi

Antigeni

Antitijela

Protusmjerna imunoelektroforezaProtusmjerna imunoelektroforeza

Ag

At+

+

Dvostruka imunodifuzijaDvostruka imunodifuzija

19


• Radijalna imunodifuzija (Mancini i Carbonara)

pasivna difuzija Ag u agarozni gel koji sadrži

jednolično raspoređena At

• Elektroimunoprecipitacija (Laurell) Raketna IEF

• Elektroforeza Ag u gelu koji sadrži specifična

At


• Agarozni gel je puferiran, pH = 8,6

• Ukupan naboj At = 0 (At ne putuju)

RadiRadijjalalna imunodifuzija (RID)na imunodifuzija (RID)

Gel s Gel s AAtt

Ag/8Ag/8 Ag/4Ag/4 Ag/2Ag/2 Ag/1Ag/1

PrecipitPrecipitacijski acijski prstenprsten

Koncentracija aKoncentracija antigenntigenaa

20

Radijalna imunodifuzijaRadijalna imunodifuzija

ZEZE

Reakcija precipitacije u gelu vidljiva je tvorbom precipitacijske linije u ZE;

u području viška Ag ili At nema vidljivih precipitata


Reakcija precipitacije u gelu vidljiva je tvorbom precipitacijske linije u ZE; u području viška Ag ili At nema vidljivih precipitata

Zona ekvivalencije

At

Difuzija Ag

Precipitacija

razmjerna konc. antigena

Antitijelo


At u polukrutoj podlozi

Ručno očitavanje Automatizacija

matematički algoritam

21

ElektroimunoprecipitacijaElektroimunoprecipitacija

+

At At

konc. Ag (g/L)

Duljina putovanja

(mm)

Dvosmjerna imunoelektroforezaDvosmjerna imunoelektroforeza

Križna imunoelektroforeza

1. Zonska elektroforeza 2. elektoimunoprecipitacija

+

+

22

Tehnike u otopiniTehnike u otopini

Tehnike se razlikuju prema načinu mjerenja reakcije Ag + At

• Mjerenje u ZE, metoda završne točke – End point (neobilježene, izravne): turbidimetrija, nefelometrija. Uzorak antigena pomiješa se sa stalnom koncentracijom At

• Mjerenje primarne reakcije Ag + At u točno određenom vremenu - Fixed time method. Mjeri se brzina stvaranja kompleksa Ag-At ( u prvih nekoliko minuta)

Izravne tehnike u otopiniIzravne tehnike u otopini

• Mjerenje završne točke u ZE (u trenutku

najveće konc. Ag-At

• Polietilen-glikol

• Pojačava reakciju vezanja

• Pomiče točku ekvivalencije prema višim

koncentracijama Ag

• Održava homogenost (Ag-At) koji lebdi u otopini

Turbidimetrija Turbidimetrija –– Nefelometrija Nefelometrija

70o

Pad intenziteta

svjetla

TURBIDIMETRIJA

Zamućenost (Ag)

Rasipanje

svjetlaNEFELOMETRIJA

-(Ag) mjeri se na uzlaznom dijelu krivulje

- ne postoji razmjerna zavisnost (Ag) i optičke gustoće—visoke

konc. razrijediti

start

E1

E

Aps.

t (min)

23

Nefelometrija

Osjetljivost imunokemijskih metodaOsjetljivost imunokemijskih metoda

Metoda Osjetljivostmg/L


Reakcija precipitacije u gelu vidljiva je tvorbom precipitacijske linije u ZE; u području viška Ag ili At nema vidljivih precipitata

Zona ekvivalencije

At

Difuzija Ag

Precipitacija

razmjerna konc. antigena

Antitijelo


At u polukrutoj podlozi

6 metode 1_3

Documents