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6. Chromatographie
(LC: Flüssigchromatographie)
Analytische Chemie 2016/18
M. Gey: Analytische Chemie 06. Chromatographie
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6.1 Einführung
6.2 Definition
6.3 Prinzip der Chromatographie
6.4 Systematik der Chromatographie
6.5 Das Chromatogramm und seine Aussagen
6.6 Das Chromatogramm - quantitativ
6.7 Das Chromatogramm - Parameter
6.8 Das Chromatogramm – Formeln
6.9 Bandenverbreiterung innerhalb der Säule
6.10 Partikelgröße vs. Trennstufenhöhe H [µm]
6.11 Partikelgrößenverteilung von 3 µm-Material
6.12 Chemische Modifizierung von Trennphasen
M. Gey: Analytische Chemie 06. Chromatographie
6. Chromatographie - Gliederung
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6.1. Einführung
• Cvet, Farbenlehre,
• Synonym,
• Kryptonym, Krypta
• Farbe, chroma,
• “Boot-Rennen”
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6. Chromatographie
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⎜ 1906 Chromatographie
◊ Cbet (Tswett):
◊ russ.Botaniker;
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6.1. Einführung
• “Boot-Rennen” der Chromatographie
M. Gey: Analytische Chemie 06. Chromatographie
6. Chromatographie
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6
6.1. Einführung
cstationär K cmobil
K: Verteilungskoeffizient
cstationär : Konzentration einer Substanz in der stationären Phase
cmobil : Konzentration einer Substanz in der mobilen Phase
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6. Chromatographie
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6.1 Einführung
M. Gey: Analytische Chemie 06. Chromatographie
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6.1 Einführung
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6.2. Definition
• Ist ein Trennprozeß, bei dem das Probengemisch
zwischen 2 Phasen im chromatographischen Bett
(Trennsäule oder Ebene) verteilt wird.
• Die eine Hilfsphase - die stationäre Phase - ruht.
• Die andere Hilfsphase - die mobile Phase - strömt
daran im chromatographischen Bett vorbei.
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6. Chromatographie
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10
Proben-
aufgabe
Substanz 1
Substanz 2
Stat. Phase
Mob. Phase(Eluent)
Sign
al
t1 t2 tSubstanz 1t3 tSubstanz 2
ChromatogrammZeit
Detektion der Substanzen (Peaks)
Säule
Detek-tor
Detek-tor
Detek-tor
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6.3 Prinzip der Chromatographie
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Trennmethoden: Elektrophorese
Chromatographie
Chromatographie: LC - SFC - GC
LC: Säulenchromatograph.: HPLC, BioLC
Planarchromatographie: PC, DC, TLC
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6.4 Systematik in der Chromatographie
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Proben-aufgabe
t0 tR1 t R2
t0 Totzeit einer nicht retardierten Substanz S0
tR1 Retentionszeit der Substanz S1
tR2 Retentionszeit der Substanz S2
S0
S1
S2
Chromatogramm( qualitativ )
Signal
Retentionsszeitt R
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6.5 Das Chromatogramm und seine Aussagen
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Proben-aufgabe
h0 h1 h2
S0
S1
S2
A0 A1 A2
Signal
Zeit
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6.6 Das Chromatogramm - quantitativ
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Peakhöhe h
a b
Peakbreite
Peakbasisbreite wb
Tangenten
in halber Höhe
wh
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6.7 Das Chromatogramm - Parameter
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RR : Chromatographische Auflösung
α : Selektivität
N : Trennstufenzahl
k´ : Kapazitätsfaktor
14
( α - 1 ) Nk´
1 + k´
N
k´ α 2
k 1́
tR - t0
t0
k´
tR
σ
2
2 LH
6.8 Das Chromatogramm: Formeln
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16
1. Ursache : Eddy-Diffusion (Streudiffusion)
Sieb Partikel Säule Mobile Phasestationäre Phase
ideal
real
Peakprofil zu Beginnder Trennung
Peakprofil nach der Trennung
6.9 Bandenverbreiterung innerhalb der Säule
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17
2. Ursache : Strömungsverteilung
Partikel
Partikel
3. Ursache : Diffusion der Probemoleküle in der mobilen Phase
4. Ursache : Stoffaustausch zwischen mobiler " stagnierender mobiler " und " stationärer " Phase
6.9 Bandenverbreiterung innerhalb der Säule
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Van-Deemter-Gleichung
H(HETP) A + Bu + C u
H : Bodenhöhe ( "high equivalent to a theoretical plate", HETP )
u : lineare Strömungsgeschwindigkeit
A : Eddy-Diffusion (Streudiffusion) + Strömungsverteilung
B : Längsdiffusion
C : Stoffaustauschphänomene
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6.9 Bandenverbreiterung innerhalb der Säule
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Van-Deemter-Kurve
H [µm]
u[cm/min]
A Bandenverbreiterung durch Eddy-Diffusion und Strömungsverteilung
A
B Bandenverbreiterung durch Längsdiffusion
B
C Bandenverbreiterung durch Stoffaustauschphänomene
C
Resultierende H-u-Kurve, Van-Deemter-Kurve
uoptimal
Hmin
6.9 Bandenverbreiterung innerhalb der Säule
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20
10
20
30
40
50
60Tr
enns
tufe
nhöh
e H
(µm
)
Flußrate F (ml/min)Lineare Geschwindigkeit u (cm/s)
1,0
20 µm
10 µm
5 µm
3 µm
6.10 Partikelgröße vs. Trennstufenhöhe H [µm]
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21
1 2 3 4 5 6
10
50
90
dp 90
dp 50dp 10
Korngröße (µm)
Teilc
hgrö
ßenv
erte
ilung
(%)
6.11 Partikelgrößenverteilung von 3µm-Material
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22
OH + HOSi R OR + H OSi 2
1. Veresterung mit Alkohol
OH + SOClSi Cl + SO + HClSi 2
Cl + H NSi R NH R + HClSi
2
2
2. Umsetzung mit Thionylchlorid / Aminen
M. Gey: Analytische Chemie 06. Chromatographie
6.12 Chemische Modifizierung von Trennphasen
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23
3. Umsetzung mit Chlorsilanen
OH + Cl SiSi R
CH 3
CH 3
O SiSi R + HCl
CH 3
CH 3
M. Gey: Analytische Chemie 06. Chromatographie
6.12 Chemische Modifizierung von Trennphasen
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24
Funktionelle Gruppen am Silicagel
Octadecyl (ODS, C18)
Octyl
Hexyl
Trimethyl
Phenyl
Dimethylamino
Aminopropyl
Nitro
Nitril
Alkylnitril
Hydroxyl (Diol)
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25
6.A
Säulenfüll-Apparatur,
HPLC-Apparatur
M. Gey: Analytische Chemie 06. Chromatographie
6. Chromatographie
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Säulenfüllapparatur
Druckflüssigkeit
Pumpe(600 bar)
Slurry
Trennsäule/H
auptsäuleV S
N S
Waste
Filter
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27
HPLC-Apparatur
Elutionsmittel-vorratsgefäß
He
Pumpe
Probenaufgabe
Inje
ktor
Vors
äule
Hau
ptsä
ule
Dämpfung
Manometer
Filter
Detektor 1
IntegratorPC
Chromatogramm
Fraktionssammler
Waste
Detektor 2
IntegratorPC
Chromatogramm
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28
HPLC-Injektionsventil
1 2
3
45
6
EinlaßHochruck- Pumpe
Säule
Prob
esch
leife
Auslaß
Normaldruck
A : Füllen der Probeschleife bei Normaldruck
1 2
3
45
6
Hochruck- Pumpe
Säule
Prob
esch
leife
Normaldruck
Hochruck
B : Injektion der Probe auf die Säule unter Hochdruck
M. Gey: Analytische Chemie 06. Chromatographie
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29
Mikrodurchflußküvette eines HPLC-Detektors
: 1mm
Säuleneluat
Kapillare
Küvettenablauf
: 0,15 mm
Kapillare: 0,5 mm
1cm d:
Küvetten-fenster
Küvetten-fenster
UV-LichtEm
pfängerAbsorptionPeak
M. Gey: Analytische Chemie 06. Chromatographie
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30
Funktion einer Doppelkolbenpumpe in der HPLC
Dic
htun
g
Dichtung
Einlaßventil
Ven
tilku
geln
Kolben
Dichtung
Dichtung
Saphir
Dic
htun
g
Dichtung
Auslaßventil
Kolben
Dichtung
Dichtung
Saphir
M. Gey: Analytische Chemie 06. Chromatographie
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31
Isokratische Elution und binäre Gradienten
10 20 30 40 50 60
10
50
100
Zeit (min)
Ace
toni
trilg
ehal
t(%)
isokratisch (z.B. ACN / Wasser 90:10)
stufenförmig
Gra
dien
tenv
erlä
ufe
konvex
konkav
linear
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32
Flüssig-Chromatographie
Klassische Säulenflüssig-Flüssigchromatographie LC
Hochleistungsflüssig-chromatographie HPLC
Tswett 1906, Trennungvon Pflanzenfarbstoffen
Säulen 1m x 3 cm, Meter / cm-Bereich
25 cm x 4,6 mm(cm / mm-Bereich)
Korngrößed. Füllung
100- 200 µmoberer µm-Bereich
3-10 µmunterer µm-Bereich
Eluentför-derung
Hydrostatisch,Schlauchpumpe bismax 0,5 MPa (5 bar)
Hochdruckpumpen,1- max. 20 MPa
Säulen-material
Glas Stahl, gehärtetes Glas
StationärePhasen
Silikagel, Aluminium-oxid
Silikagel, Polymere
1965 / 68,HPLC
M. Gey: Analytische Chemie 06. Chromatographie
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33
Flüssig-Chromatographie
Säulenfüll-druck
Hydrostatisch, wenige bar
40 - 80 MPa: Silikagel10-120 bar : Polymere
Säulenvor-druck
ca. 1 bar 20 - max. 200 bar
Flußrate
Analysenzeit Stundenbereich Minuten-(Sekunden)Bereich
Probemenge Gramm-Bereich Mikrogamm-Bereich
Bodenzahl 1-100 5000 -100 000
Anzahl derPeaks
2-10 5-50
mehrere ml / Stunde ml / min
Klassische Säulenflüssig-Flüssigchromatographie LC
Hochleistungsflüssig-chromatographie HPLC
M. Gey: Analytische Chemie 06. Chromatographie