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8/20/2019 5control Microorg Utiles 6427

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Módulo 5Conservación y Control

Las fermentaciones producidas por las bacterias ácido lácticas se hanreconocido desde la antigüedad. Se han utilizado diferentes cultivos en muchaspartes del mundo con la finalidad de mejorar características en el

almacenamiento, palatabilidad y valores nutrimentales de los alimentosperecederos tales como leche, verduras, carne, pescado, legumbres ycereales. Los microorganismos que producen este tipo de fermentación, lasbacterias ácido lácticas, han tenido un importante papel en la conservación delos alimentos, en la prevención de enfermedades a través del consumo dealimentos, e indirectamente, en la alimentación de personas desnutridas entodos los continentes.

En los países desarrollados, las bacterias ácido lácticas principalmente se hanasociado con los productos lácteos fermentados, tales como queso,mantequilla, y yogurt. La utilización de cultivos iniciadores se ha vuelto todauna industria desde el siglo pasado. Debido a esto, los aspectos tecnológicosde la fermentación ácido láctica se han cubierto tanto en el aspecto de lainvestigación, como en el de capacitación, en el campo de la ciencia de losalimentos.

Desde épocas ancestrales, las bacterias ácido lácticas se han asociado conefectos benéficos para la salud. En la actualidad, un número creciente dealimentos benéficos y los llamados alimentos funcionales, así comopreparaciones farmacéuticas promotoras de la salud utilizan las característicasde ciertas especies de bacterias ácido lácticas. Algunas bacterias lácticas,sobre todo especies de lactobacilos se han identificado como bacteriasprobióticas, las cuales tienen la capacidad de colonizar el intestino humano,confiriendo protección ante algunos microorganismos patógenos, interactuandocon el sistema inmunológico mediante las células dendríticas, provocando lainactivación de actividades de otras especies sobre éstas y favoreciendo labuena digestión de los alimentos, entre otras características.Para que una bacteria sea considerada como probiótica, debe cubrir ciertosrequisitos como son: resistir el paso a través del tracto gastrointestinal, y lapresencia de fenol, producir sustancias antimicrobianas, ser capaz de crecer enun medio con sales biliares, y no presentar resistencia a antibióticos; entreotras características. Los microorganismos probióticos se pueden encontrarcomúnmente en productos fermentados, por ejemplo leche, productos lácteos,yogurt de soya, carne, vino, yuca; con toda seguridad también en el pulque yciertos quesos. Además, se han aislado a partir de heces de puerco, humanas,

de niños y leche bronca de vaca.Existe una amplia evidencia de experimentos realizados en los laboratorios,que comprueban que la ingesta de microorganismos probióticos, especialmentebacterias ácido lácticas y bifidobacterias, alivian o previenen varios desórdenescomo la intolerancia a la lactosa y la diarrea por rotavirus, reducen laincidencia de enterocolitis necrosante neonatal, disminuyen la duración de ladiarrea gastroentérica, reducen el nivel de colesterol en sangre, tienen unefecto positivo en el sistema inmunológico de niños con VIH y reducen la


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recurrencia de diarrea provocada por Clostridium difficile , entre otros beneficiosreportados.

La secuenciación genómica de Bifidobacterium longum, Lactobacillusplantarum WCFS1, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri,Lactobacillus casei, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus johnsonnii,

Lactobacillus bulgaricus y Lactobacillus rhamnosus proveen de informaciónacerca de la actividad potencial como bacterias benéficas para el hospedero.

Se define como alimento funcional “ aquellos que pueden satisfactoriamentedemostrar que afectan benéficamente una o más funciones del organismohumano, mas allá de los efectos nutricionales adecuados, en una formarelevante para mejorar el estado de salud y la reducción de enfermedades ”. Deesta manera, los alimentos fermentados que contienen probióticos, prebióticos(ingredientes del alimento que no son digeribles y que tienen un efecto benéficoen la salud del hospedero mediante la estimulación selectiva de crecimiento oactividad de una o algunas bacterias en el colon), o ambos, son consideradosalimentos funcionales.

En la actualidad, el desarrollo de nuevos productos para la industria alimenticiaestá enfocado a crear alimentos funcionales que confieran al consumidor unapropiedad extra que beneficie su salud.

Es necesario realizar correctamente técnicas microbiológicas confiables paraenumerar microorganismos viables en estos productos, en los cuales elbeneficio adicional, depende precisamente del número de microorganismosviables.

Como parte fundamental de un buen control de calidad de los procesos en laindustria alimentaria, se requiere de respaldar analíticamente la estimación dede microorganismos presentes en los alimentos funcionales de aquellosconsiderados como probióticos, ya que la legislación mexicana, así como lainternacional, coinciden en que para que dichos microorganismos aportenbeneficios al consumidor, es requisito que se encuentren en el alimentofuncional en cierto número y no menor.

De igual manera, como parte del control de calidad, por ejemplo, en laindustria que elabora leches fermentadas, es importante enumerarconfiablemente las bacterias lácticas que se han añadido a la leche con lafinalidad de obtener productos con características mejoradas en elalmacenamiento, palatabilidad y/o valores nutrimentales. Errores en la

proporción de los microorganismos iniciadores o bien, la utilización de cepas noadecuadas dará como resultado productos terminados de pobre calidad.

Referencias: (2004). Lactic acid bacteria. Microbiological and Functional Aspects . 3 th ed. Seppo, S. & Atte von Wright. (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York.USA.

Pascual, M. R & Calderón, V. (2000). Microbiología Alimentaria. Metodologíaanalítica para alimentos y bebidas. 2ª. Ed. Diaz de Santos. Madrid, España.


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Estimación de la cifra de microorganismos presentes en yogurt

OBJETIVOS:• Aplicar el método de enumeración de microorganismos característicos en

yogurt mediante la técnica de cuenta en placa a 37 ºC.• Comprobar que en el yogurt los microorganismos característicos están

viables y presentes..

GENERALIDADES

La fermentación desde el punto de vista económico, es un método temporal deconservación de los alimentos. De ahí que, desde hace tiempo se utilizancultivos iniciadores lácticos con fines comerciales para realizar los procesos defermentación de forma controlada, sobre todo en productos lácteos.

Las bacterias ácido lácticas (LAB) constituyen un grupo de bacterias gram-positivas que se han unido debido a sus características morfológicas,metabólicas y fisiológicas. La descripción general de las bacterias incluye eneste grupo a cocos o bacilos gram-positivo, no esporulados, que produce ácidoláctico como producto terminal debido a la fermentación de los carbohidratos.La fermentación del alimento por bacterias ácido lácticas principalmente,aunque también las levaduras y otros microorganismos pueden estarinvolucrados, depende además, de la concentración de las sales y otrosfactores en el medio. Existen muchas clases de medios selectivos ydiferenciales disponibles para caracterizar las bacterias ácido láctico viable.

El agar MRS y M17 son medios de cultivo ampliamente recomendados paraestimar el número de bacterias lácticas viables en yogurt, Lactobacillusbulgaricus y Streptococcus thermophilus. La mayoría de los biotipos de S.thermophilus no forma colonias viables en el MRS acidificado en diluciones quenormalmente se utilizan para la estimación de la cifra de microorganismospresente de bulgaricus, y por otra parte, la mayoría de los L. bulgaricus noforman colonias visibles en placas de agar M17 en las diluciones quenormalmente se utilizan para efectuar cómputos de S. thermophilus .

El L. bulgaricus es un microorganismo mesofílico de forma lenticular y coloniasgeneralmente en forma puntiaguda, con diámetro de 1-3 mm, en medio MRSacidificado. Su apariencia microscópica corresponde a la de bacilos

generalmente largos, no esporulado, gram-positivo, catalasa-negativo.El S. thermophilus es un microorganismo termofílico que forma coloniaslenticulares de 1-2 mm en el medio M 17. Su apariencia microscópicacorresponde a células ovoides o esférica, 0.7-0.9 µm, en forma de pares ocadenas largas, gran-positivo, catalasa-negativo.


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FUNDAMENTO

El principio del método de prueba, consiste en inocular diluciones decimalesde la muestra en:

1. agar MRS acidificado, seguido de incubación aneróbica a 37ºC/72 hr, para laestimación de la cifra de microorganismos presente de L. bulgaricus .2. agar M17, seguido por incubación aeróbica a 37 ºC/48hr para la estimaciónde la cifra de microorganismos presente de S. thermophilus .

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

• 1 matraz Erlenmeyer de 250,0 mL con tapa rosca conteniendo 90,0 mL desolución amortiguadora de peptonas a .

• 6 tubos de 16 x 150 con tapa rosca conteniendo 9,0 mL de soluciónamortiguador de peptonas a .

• 1 matraz de 500,0 mL con 250,0 mL de medio MRS acidificado a .• 1 matraz de 500, mL con 250,0 mL de medio M17 completo a .

SOLUCIONES Y REACTIVOS

• Colorantes para Tinción de Gram d.

MATERIALES Y EQUIPO

• Incubadora 37 ± 1ºCa

.• Motor para licuadora estéril o Stomacher a.• Agitador de tubos tipo vortex a .• Contador de colonias c,d .• Baño de agua con control de temperatura de 45 ± 1 ºC a.• 6 pipetas graduadas de 1,0 mL a .• 1 pipetas graduada de 10,0 mL a .• 16 cajas de Petri a .• Espátula de metal a • Microscopio óptico d.• Asa bacteriológica d.• Portaobjetos d.

NOTASa Material necesario al inicio de la práctica.b Material necesario a las 24 horas de iniciada la práctica.c Material necesario a las 48 horas de iniciada la práctica.d Material necesario a las 72 horas de iniciada la práctica.


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PROCEDIMIENTO

1. Preparación de la muestra y porción de prueba.

NOTASAntes de abrir el envase del yogurt, limpiar la superficie externa que rodea laparte por la cual la muestra será tomada, con el objeto de retirar cualquiermaterial que pueda contaminar la muestra. Desinfectar el área de trabajo conetanol al 70% (v/v) para prevenir futura contaminación, Abrir el envaseasépticamente.

En esta etapa es importante obtener no solamente una dilución homogénea,sino poder fragmentar las cadenas de estreptococos y lactobacilos en célulasindividuales o cadenas cortas para que en el resultado sea posible expresar laestimación de la cifra de microorganismos presente de viables por gramo de

muestra.

1.1. Yogurt natural.

Mezclar el contenido del envase con espátula estéril. Pesar 10,0 a 10,1 g de lamuestra en un recipiente adecuado.

1.2. Yogurt con fruta ó cereales

Licuar el contenido del yogurt durante un minuto utilizando stomacher.Pesar 10,0 a 10,1 g de la muestra.

2. Preparación de la primera dilución.

NOTA

• Añadir la solución amortiguadora de peptonas a la porción de prueba hastaque la masa de la porción de ensayo y diluyente sea de 50 g, homogeneizardurante un minuto.

• Llevar a 100,0 g con el mismo diluyente para obtener la dilución 1:10.

3. Preparación de diluciones decimales.

• Realizar diluciones seriadas en tubos con 9,0 mL de solución amortiguadorade peptonas añadiendo 1,0 mL de la primera dilución al primer tubo.

• Repetir esta operación hasta obtener la dilución requerida (10 -7) utilizandouna pipeta diferente para cada dilución.


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4. Inoculación e incubación.

• El tiempo máximo entre la inoculación de las diluciones y el vertido en cajaspetri, no debe exceder de 15 min.

• Colocar un mL de las cuatro últimas diluciones duplicado en cajas Petri.• Para S. thermophilus , verter 12-15 mL de M17 mantenido a 45 ± 1ºC en un

baño de agua.• Para L. bulgaricus , verter 12-15 mL de MRS acidificado mantenido a 45 ±

1ºC en un baño de agua.• Mezclar cuidadosamente, y dejar solidificar en una superficie horizontal las

cajas Petri en posición invertida.• Incubar las placas destinadas para la numeración de L.bulgaricus a 37 ± 1ºC

durante 72 h. en jarra de aneorobiosis (atmósfera de 90 % nitrógeno y 10 %CO2). No apilar más de 6 cajas Petri.

• Incubar las placas destinadas para la enumeración de S. thermophilus 37 ± 1ºC durante 48 h.

5. Cómputo de colonias.

Después del periodo de incubación especificado, contar las colonias quemuestren las características para cada microorganismo en las placas quetengan de 10-300 colonias. Evitar contabilizar la materia extraña utilizando unlente de ampliación.

6. Confirmación.

Teñir estas colonias utilizando el método de Gram, y confirmar que no sonformadoras de esporas. Bacilos Gram-positivo, catalasa-negativo para aquellosque crecen en el medio MRS, y cadenas de cocos o diplococos Gram-positivo,

catalasa-negativo en el caso de que crezcan en el medio M17.

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS.

Utilizar las cuentas de las placas que contengan 10-300 colonias.El número de microorganismos característicos por gramo es igual a:

Σ C / (n1 + 0,1n2) dDonde:C: Es la suma de colonias contadas en las placas n1 y n2.n1: Es el número de placas contadas en la menor dilución.n2: Es el número de placas contadas en la mayor dilución.d: Es la dilución en la cual la primer cuenta se obtuvo.

NOTA

Si hay más de dos diluciones contables, la fórmula se modifica:Así para tres diluciones:


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Σ EC / (n1 + 0,1n2 + 0,1n3) d

• Redondear el resultado obtenido en a dos cifras significativas. Para unnúmero de tres dígitos, redondear el tercer dígito al cero más cercano. Si eltercer dígito es cinco redondear el dígito hacia abajo en caso de que los dos

primeros dígitos sean número par, y al dígito superior en caso de que los dosprimeros dígitos sean número impar, por ejemplo:

Para 234 redondear a 230235 240225 220245 240

• Si existen solamente cuentas menores de 10, reportar el número demicroorganismos por gramo como “menor que”, siendo el valorcorrespondiente a la menor dilución.

• El número total de microorganismos característicos por gramo de yogurt.

Nl + Ns

Donde:Nl Es el número de L. bulgaricus por gramo.Ns Es el número de S. thermphilus por gramo.

Ejemplo:Asumir que la estimación de la cifra de microorganismos presente L. bulgaricus dio los siguientes resultados en dos cajas de Petri por dilución:

10- 5

, 295 y 245 colonias,10 - 6 , 33 y 40 colonias,Σ C/(n1 + 0,1n2) d = 295 + 245 + 33 + 40 /(2 + 0,1 x 2) 10 -5

= 613 / 2.2 x 10 -5 = 278,6 x 10 5

Con el redondeo el número estimado de L. bulgaricus es 2,8 x 10 7 UFC/ g deyogurt.

BIBLIOGRAFÍA

(2004). Lactic acid bacteria. Microbiological and Functional Aspects . 3 th ed. Seppo, S. & Atte von Wright. (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York.USA.Pascual, M. R & Calderón, V. (2000). Microbiología Alimentaria. Metodologíaanalítica para alimentos y bebidas. 2ª. Ed. Diaz de Santos. Madrid, España.

Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of DairyProducts. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C.

De Man. J.C. Rogosa, M & Sharpe, M. E. (1960). J. Applied Bacteriology. 23,130-134.


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International IDF Standard 117 A. Yogurt, enumeration of characteristicmicroorganisms colony count technique at 37ºC.


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Medios de Cultivo

Solución amortiguadora de peptonas (cuentas viables en yogurt)

Peptona 1 (digerido tríptico de caseína) 0,5 gPeptona 2 (digerido tríptico de carne) 0,5 gAgua 1,0 LpH final 25°C 7,0 ± 0,2

Disolver las peptonas en agua. Distribuir la solución en porciones de 90,0 o 9,0mL en recipientes según se requiera. Esterilizar a 121 ºC / 15 min.

NOTA

La mezcla de peptonas de este tipo (peptona 1 y 2), se consigue en formacomercial con el nombre de polipeptonas.

Reactivos para ajustar el pHHidróxido de sodio (Na OH), aproximadamente 0,1 mol/L de solución.Acido clorhídrico (HCl) aproximadamente 0.1 mol/L de solución.

Agar MRS acidificado

Peptona de caseína 10,0 gExtracto de malta 10,0 gExtracto de levadura 5,0 gDextrosa 20,0 gTween 80 (sorbitán mono-oleato) 1,0 mLFosfato dipótasico (K 2HPO 4) 2,0 gAcetato de sodio trihidratado (CH 3CO 2Na) 3. 3 H 2O 2,0 gCitrato de amonio [C6H6O7( NH4) 2] 2,0 gSulfato de magnesio heptahidratado (MgSO 4.7H 2O) 0,2 gSulfato de manganeso heptahidratado (MnSO 4.7H 2O) 0,05 gAgar bacteriológico 15,0 g

Reactivos para ajustar el pHAcido acético (CH 3COOH), 100% glacial.

Disolver los componentes en un baño de agua. Enfriar a 50 ºC y añadir ácidoacético para ajustar el pH, comprobar por medio de potenciómetro, de tal formaque después de esterilizado llegue a 5,4 a temperatura ambiente. Distribuir enporciones de 500,0 mL. Esterilizar a 121º C durante 15 min.


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Principio de acción

La peptona es fuente de carbono y nitrógeno. El extracto de levadura es fuentede elementos traza, vitaminas y amino ácidos. La dextrosa es fuente decarbohidratos que proporciona carbono. El acetato de sodio y citrato deamonio, inhiben los estreptococos, hongos y otros microorganismos. El sulfato

de magnesio y sulfato de manganeso son fuente de iones inorgánicos. El tween80 actúa como surfactante.

Medio M17

Medio básico:Peptona 1 (digerido tríptico de caseína) 2,50 gPeptona 2 (digerido péptico de carne) 2,50 gPeptona 3 (digerido papaínico de soya) 5,00 gExtracto de levadura 2,50 gExtracto de carne 5,00 gSal disódica del β- glicerofosfato (C 3H7O6PNa 2) 9,00 gSulfato de magnesio heptahidratado (MgSO 4.7H 2O) 0,25 gAcido ascórbico 0,50 gAgar bacteriológico 15,0 gAgua 950,0 mL

Disolver los componentes en agua hirviendo enfriar a 50ºC y ajustar el pH,utilizando los reactivos para ajustar el pH de tal forma que después deesterilizado llegue a 7,1-7,2 a temperatura ambiente. Transferir el medio enporciones de 95,0 mL en frascos de 150,0 mL de capacidad. Esterilizar a121ºC/15 min.

Solución de lactosa:

Lactosa 10,0 gAgua 100,0 mL

Disolver la lactosa en agua. Esterilizar a 121ºC/ 15 min.

Medio completo:

Medio básico 950,0 mLSolución de lactosa 5,0 mL

Inmediatamente antes de utilizar, fundir el medio básico en un baño de aguahirviente y enfriar a 48-50ºC. Calentar la solución de lactosa a 48-50ºC. Añadirla solución de lactosa al medio básico y mezclar. Mantener el medio en unbaño de agua (48-50ºC) hasta su utilización.

Principio de acción.


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El agar M17 contiene peptonas y carne que son fuente de carbono, nitrógeno,vitaminas y minerales. El extracto de levadura proporciona vitaminas delcomplejo B que estimula al crecimiento bacteriano. La sal disódica del β-glicerofosfato amortigua el ácido que se produce por la fermentación de lalactosa. El ácido ascórbico estimula el crecimiento de estreptococos lácticos. Elsulfato de magnesio provee de iones esenciales para el crecimiento. El agar es

el agente solidificante.


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Estimación de la cifra presente de Lactobacillus casei o deLactobacillus acidophilus

OBJETIVO

Estimar la cifra presente de Lactobacillus casei o de Lactobacillus acidophillus ,en asociación o no, con Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, y Bifidobacterium, en productos lácteos.

FUNDAMENTO

El principio del método de prueba, consiste en inocular diluciones decimalesde la muestra en

1. agar MRS acidificado adicionado con clindamicina, seguido deincubación aneróbica a 37ºC/72 h., para la estimación de la cifra de

microorganismos presente de L. acidophillus .2. agar MRS acidificado adicionado con sales biliares, seguido deincubación aneróbica a 37ºC/72 h., para la estimación de la cifra demicroorganismos presente de L. casei .

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

• 1 matraz Erlenmeyer de 250,0 mL con tapa rosca conteniendo 90,0 mL desolución de triptona sal a .

• 6 tubos de 16 x 150 con tapa rosca conteniendo 9,0 mL de solución detriptona sal a .

• 1 matraz de 500,0 mL con 250,0 mL de medio MRS + clindamicinaacidificado a (para enumeración de L. acidophilus ).

• 1 matraz de 500,0 mL con 250,0 mL de medio MRS + oxgall acidificado a (para enumeración de L. casei ).

SOLUCIONES Y REACTIVOS

• Colorantes para Tinción de Gram d.

MATERIALES Y EQUIPO

• Incubadora 37 ± 1ºC a .• Motor para licuadora estéril o Stomacher a.• Agitador de tubos tipo vortex a .• Contador de colonias c,d .• Baño de agua con control de temperatura de 45 ± 1 ºC a.• 5 pipetas graduadas de 1,0 mL a .


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• 1 pipetas graduada de 10,0 mL a .• 6 cajas de Petri a .• Espátula de metal a • Microscopio óptico d.• Asa bacteriológica d.• Portaobjetos d.

NOTASa Material necesario al inicio de la práctica.b Material necesario a las 24 horas de iniciada la práctica.c Material necesario a las 48 horas de iniciada la práctica.d Material necesario a las 72 horas de iniciada la práctica.

PROCEDIMIENTO

Preparación de la muestra y porción de prueba.

NOTAS

• Para productos con frutas, únicamente tomar la masa sin la fruta, porque lamasa sola contiene las bacterias lácticas viables.

• En el caso de producto sólidos, homogeneizar el producto que se va analizarhaciendo “8” (una docena de veces) con ayuda de una pipeta estéril.Eliminar esta pipeta. De ninguna manera utilizar la pipeta para efectuar lasdemás diluciones porque contiene producto en el interior y exteriormente.

• En el caso de productos líquidos, homogeneizar agitando en forma de arcodurante 1 min.

• Para la preparación de la muestra, realizar la primera dilución tomandoaproximadamente 10,0 mL de producto y trasvasarlo asépticamente en 90,0mL de diluyente. Enjuagar la pipeta varias veces hasta la completadisolución. Asegurar de no sumergir demasiado la pipeta dentro de lamuestra con el fin de evitar agregar producto residual de las paredesexternas de la pipeta.

• Para homogenizar las diluciones seriadas del alimento a analizar, serecomienda una rotación manual y no en vortex debido a que se puedendañar las bacterias viables.

1. Una vez realizada la primera dilución al 10 -1, desechar la pipeta después desu uso. Realizar agitaciones en arco durante 25 veces en cada dilución.

2. Realizar diluciones seriadas con la ayuda de una pipeta nueva estéril, tomar1,0 mL de la dilución al 10 -1 e introducirlo en la pared de un nuevo tubo con9,0 mL de diluyente sin tocar este diluyente y sin enjuagar. Se obtiene unadilución al 10 -2, desechar la pipeta después de utilizarla. Continuar así lasdiluciones sucesivas hasta 10 -8.

3. Simultáneamente a las diluciones, sembrar por duplicado las 3 ultimasdiluciones a razón de 1,0 mL por caja de Petri


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4. Vaciar inmediatamente el medio de cultivo fundido y enfriado y homogenizarpor rotación las cajas. Después de solidificar (aprox. 30 min) sobre unasuperficie horizontal).

5. Después de la solidificación poner las cajas en jarra de anaerobiosis(invertidas).

6. Incubar a 37ºC (+2ºC) durante 72 h. (+ 3 h) bajo atmósfera de CO 2.


Utilizar las cuentas de las placas que contengan 20-200 colonias.Para efectuar los cálculos y expresión de resultados, consultar el protocolo deenumeración de microorganismos viables en yogurt.

BIBLIOGRAFÍA

(2004). Lactic acid bacteria. Microbiological and Functional Aspects . 3 th ed. Seppo, S. & Atte von Wright. (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York.USA.




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Medios de Cultivo

Triptona sal, solución deTriptona (peptona de caseína) 1gCloruro de sodio (NaCl) 8,5 gAgua destilada 1,0 L

Disolver los componentes en el agua destilada. Si es necesario, ajustar antesde la esterilización el pH para obtener 7,0 (+ 0,1) a 25º C (+ 2ºC). Repartir paratener 9,0 mL por tubo y después de la esterilización. Esterilizar durante 20 mina 121ºC (+ 2ºC).Utilizar solución de triptona sal, solo si el producto a analizar no contieneBifidobacterium .

MRS + oxgall, medio

MRS, agar + 1,5 g/L de Bacto oxgall (sales biliares)

Poner en suspensión 70,3 g del polvo MRS en agua destilada, añadir las salesbiliares. Disolver la suspensión en baño María hirviente hasta la obtención deun líquido claro.Ajustar el pH antes de la esterilización a 5.65 (+0,1) con ácido acético glacialconcentrado (alrededor de 5,0 mL) para que el pH después del autoclave sea5,4 (+ 0,1) a 25ºC (+ 2ºC). Esterilizar en autoclave durante 15 min. a 121ºC (+2ºC). Almacenar hasta por un máximo de un mes a 4°C

Principio de acciónEl principio selectivo de este medio reposa en la resistencia a las sales biliaresde L. casei

MRS + clindamicina, medio ácido.

MRS (polvo comercial listo para su uso) 70,3 gAgua destilada 1,0 LSolución de clindamicina al 0,005% (clindamicina 5,0 mg, agua destilada 100,0mL), esterilizada por filtración (0,45 µm). Almacenar máximo por un mes a4°C.

Poner en suspensión 70,3 g del polvo MRS en agua destilada. Disolver lasuspensión en baño María hirviente hasta la obtención de un líquido claro.Ajustar el pH antes de la esterilización a 5.65 (+ 0,1) con ácido acético glacialconcentrado (alrededor de 5,0 mL) para que el pH después del autoclave sea5,4 (+ 0,1) a 25ºC (+ 2ºC). Esterilizar en autoclave durante 15 min. a 121ºC (+


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2 ºC). Añadir 0,2% de solución de clindamicina en 100, 0 mL de medio MRS,en condiciones de asepsia. Conservar máximo un mes en oscuridad a unatemperatura entre 0 y 5º C.

Principio de acciónEl principio selectivo de este medio reposa en la resistencia a la clindamicina

del L. acidophilus .


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a Material necesario al inicio de la práctica.b Material necesario a las 24 horas de iniciada la práctica.c Material necesario a las 120 horas de iniciada la práctica.

PROCEDIMIENTO

Preparación de la muestra y porción de prueba.

NOTAS

• Para productos con frutas, únicamente tomar la masa sin la fruta, porque lamasa sola contiene las bacterias lácticas viables.

• En el caso de producto sólidos, homogeneizar el producto que se va analizarhaciendo “8” (una docena de veces) con ayuda de una pipeta estéril.Eliminar esta pipeta. De ninguna manera utilizar la pipeta para efectuar lasdemás diluciones porque contiene producto en el interior y exteriormente.En el caso de productos líquidos, homogeneizar agitando en forma de arcodurante 1 min.

• Para la preparación de la muestra, realizar la primera dilución tomandoaproximadamente 10,0 mL de producto y trasvasarlo asépticamente en 90,0mL de diluyente. Enjuagar la pipeta varias veces hasta la completadisolución. Asegurar de no sumergir demasiado la pipeta dentro de lamuestra con el fin de evitar agregar producto residual de las paredesexternas de la pipeta.

• Para homogenizar las diluciones seriadas del alimento a analizar, serecomienda una rotación manual y no en vortex debido a que se puedendañar las bacterias viables.

1. Una vez realizada la primera dilución al 10 -1, desechar la pipeta después desu uso. Realizar agitaciones en arco durante 25 veces en cada dilución.

2. Realizar diluciones seriadas con la ayuda de una pipeta nueva estéril, tomar1,0 mL de la dilución al 10 -1 e introducirlo en la pared de un nuevo tubo con9,0 mL de diluyente sin tocar este diluyente y sin enjuagar. Se obtiene unadilución al 10 -2, desechar la pipeta después de utilizarla. Continuar así lasdiluciones sucesivas hasta 10 -8.

3. Simultáneamente a las diluciones, sembrar por duplicado las 3 ultimasdiluciones a razón de 1,0 mL por caja de Petri

4. Vaciar inmediatamente el medio de cultivo fundido y enfriado y homogenizarpor rotación las cajas. Después de solidificar (aprox. 30 min) sobre una

superficie horizontal).5. Después de la solidificación poner las cajas en jarra de anaerobiosis

(invertidas).6. Incubar a 37ºC (+ 2ºC) durante 120 h. (+ 3 h) bajo atmósfera de CO 2.


Utilizar las cuentas de las placas que contengan 20-200 colonias.


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Para efectuar los cálculos y expresión de resultados, consultar el protocolo deenumeración de microorganismos viables en yogurt.

BIBLIOGRAFÍA

(2004). Lactic acid bacteria. Microbiological and Functional Aspects . 3th

ed. Seppo, S. & Atte von Wright. (Eds.) Marcel Dekker, Inc. New York.USA.




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Medios de Cultivo

Triptona sal, solución de, (TSC)Triptona (peptona de caseína) 1gCloruro de sodio (NaCl) 8,5 gClorhidrato de L-cisteina 0,30 g

Agua destilada 1,0 L

Disolver los componentes en el agua destilada. Si es necesario, ajustar antesde la esterilización el pH para obtener 7,0 (+ 0,1) a 25º C (+ 2ºC). Repartir paratener 9,0 mL por tubo después de la evaporación que se presenta durante laesterilización. Esterilizar durante 20 min a 121ºC (+ 2ºC).

Es recomendable regenerar los tubos de TSC durante 20+/- 5 min a 100 +/-2°C en un baño María antes de su uso.

MRS neutro + dicloxacilina, medio

MRS neutro pH 6,5 + 0,1 después autoclave + 1,0 mL de solución antioxígeno

+ 1,0 mL de una solución al 1/10 de antibiótico dicloxacilina por cada 100,0 mL

de medio de cultivo.

Poner en suspensión 15 g de agar bacteriológico en un recipiente con 500,0

mL de agua destilada. Disolver la suspensión en baño María hirviente hasta laobtención de un líquido claro.

Poner en suspensión 55g de polvo MRS neutro en otro recipiente con

igualmente 500,0 mL de agua destilada (alrededor de 50ºC).

Mezclar las dos soluciones agitando bien.

Ajustar el pH antes de la esterilización a 6,5 (+ 0,1).

Esterilizar en autoclave durante 15 min a 121ºC (+ 2ºC).

Conservar un mes máximo a la oscuridad a una temperatura entre 0 y 5º C.

Solución anti—oxigeno

Hidrocloruro de L-cisteína 3,0 g

Agua destilada 100,0 mL


23/23

• Después de la disolución, esterilizar por filtración en membrana estéril de

0.45 µm. Conservación 15 días a 4ºC. (Después de este tiempo la solución

pierde su efectividad).

Solución de antibiótico

Dicloxacilina 25,0 mg

Agua 50,0 mL

Después de la disolución, esterilizar por filtración sobre membrana estéril de

0,45 µm. Conservación 15 días a 4ºC. Repartir a razón de 10,0 mL en tubos

estériles. Conservación 15 días a 4ºC. En el momento del empleo, efectuar una

dilución al 1/10 de esta solución madre con solución de triptona sal cisteína

regenerada.

5control microorg utiles 6427

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