免疫分析方法

免疫学方法在食品分析中正得到越来越广泛的运用，其中酶联免疫吸附法（ ELISA ）已经在食品工业中广泛应用，它能够用于测定人们希望含有的物质，以及不希望含有的物质。例如现在人们所关注的食品安全性问题中一些物质的检测：杀虫剂、药物残留物、激素、生长素、微生物毒素、真菌毒素或肠毒素、天然毒素，以及一些添加剂。

免疫分析法具备有效的灵敏度、特异性、快速和低成本的优点；可对大量的样品进行常规分析；能够用于样品的定性筛选，也能够对样品进行定量测定以确定样品中待测组分的含量。

免疫分析技术

免疫分析技术的分类

标记免疫分析技术 非标记的免疫分析技术

免疫扩散

免疫电泳

酶联免疫分析

放射免疫分析

荧光免疫技术

化学发光免疫技术

胶体金免疫技术

抗原及相应的抗体分子在凝胶中扩散相遇，达到合适浓度比例时形成抗原抗体复合体沉淀的技术。可以检测特定的抗原或抗体。 抗原与抗体成分的一种定性与半定量分析方法，通常采用半固态透明琼脂凝胶作为支持介质。置于孔中的抗原和抗体相向扩散，在两者浓度比例适当处相遇后如能结合形成复合物则形成沉淀线。分为单向扩散（ single immunodiffusion ）、放射状扩散（ radial immunodiffusion ）和双向扩散（ double immunodiffusion ）等。

1.1 免疫扩散

1 、非标记免疫分析技术

实验原理 可溶性抗原和相应抗体在含有电解质的琼脂凝胶中扩散相遇，特异性

地结合，在比例合适处，形成肉眼可见的沉淀物的一种免疫血清学技术。

（一）单向扩散实验一种定量实验，将一定量的抗体混合于琼脂内，倾注于玻片上，凝固

后，在琼脂层上打孔，再将抗原加入孔中，使其向四周扩散。抗原抗体复合物形成的沉淀环直径与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量即可从标准曲线中求出。本实验主要用于检查标本中各种免疫球蛋白和血清 IgG 含量。

（二）双向扩散实验抗原抗体在一定 pH 和离子存在的琼脂糖凝胶中相向扩散，一定时间

后，两者相遇而形成不明显的抗原抗体聚合物并继续扩散，当扩散至两者的适当比例时便形成大的抗原抗体复合物而出现明显沉淀，形成垂直于扩散方向的免疫沉淀线即等价线。

1.2 免疫电泳

免疫电泳是一种将区带电泳和

双向免疫扩散相结合的免疫化

学分析技术。

实验原理先将抗原样品在琼脂平板

上进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而被分离成肉眼不可见的区带。

停止电泳后，在与电泳方向平行的槽内加入相应抗血清，使抗原和抗体呈双向扩散，已分离的各抗原与相应抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例合适处形成肉眼可见的沉淀弧。

根据沉淀弧的数量、位置和形状与已知标准抗原进行比较，可分析、鉴定样品中所含的抗原成分及其性质。

采用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原 - 抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物的测定，达到对免疫反应进行监测的目的。

2 、免疫标记技术

2.1酶联免疫法• 免疫酶技术：把抗原抗体的免疫反应和酶

的高效催化作用原理有机地结合起来。它具有免疫荧光试验和放射免疫试验的优点，并克服上述两种方法的缺点。

• 酶标记试剂制备容易、稳定、有效期长，免疫酶技术的敏感性接近放射免疫试验，可直接肉眼观察也可借助简单的仪器作定量测定，所得结果比较客观。

ELISA 的基本原理和方法

ELISA 的种类和变化

ELISA 的特点

ELISA 的应用实例

酶联免疫吸附法 ELISA

基本原理

ELISA 是一种免疫测定（ immunoassay， IA ）

基础 : 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。

在这种测定方法中有 3 种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）

酶及其底物 酶结合物是酶与抗体或抗原 , 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是 ELISA 成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反应。

酶 底 物 显色反应 测定波长

辣根过氧化物酶

邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺基 -2(3-乙基 - 并噻唑啉磺酸 -6)铵盐

橘红色黄色棕色兰色蓝绿色

492

460

449425642

碱性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸盐 (PNP)萘酚 -AS-Mx磷酸盐+重氮盐

黄色红色

400500

葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖 +甲硫酚嗪+噻唑兰

黄色深蓝色

405

420

β-Ｄ - 半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷 (4MuG)硝基酚半乳糖苷 (ONPG)

荧光黄色

360,450

420

ELISA 的种类和变化

（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法 （四）双位点一步法（五）捕获法测 IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的 ELISA

（一）双抗体夹心法

此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原

步骤：A 将已知抗体吸附于载体上，温育后清洗；

B 加入待检标本溶液，使溶液中的抗原与吸附的抗体结合，温育后清洗；

C 加入酶标记特异性抗体，温育后清洗；D 加入酶作用底物，产生显色反应，颜色

的改变与所加的待检标本溶液中的抗原量成正比。

间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。

（二）间接法（二）间接法

步骤：

A 将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），经温育后清洗；

B 加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则与吸附的抗原结合，温育后清洗；

C 加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗抗体与吸附的抗原抗体复合物结合，温育后清洗；

D 加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用光电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。

（三）竞争法

此法可用于检测小分子抗原。

步骤：

A 将已知抗体吸附于固相载体表面，温育后清洗；

B 将可能含抗原的待检溶液和酶标记的已知抗原溶液以适当比例混合，加入已包被的载体孔中，温育后清洗；

C 加入酶作用的底物，产生显色反应。色深表示结合的酶标记抗原多，而待检溶液中未标记的抗原量少；反之，色浅表示结合的酶标记抗原少，而待检溶液中抗原量多。

ELISA 特点特点一：灵敏性 该测定法的灵敏度来自酶。众所周知 , 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。 ELISA 实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。

特点二： 特异性 其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。

饲料安全检测

农药的检测

疾病诊断

ELISA应用实例

饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，

简曲霉毒素 ） 饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏菌

）

甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析

ELISA 在饲料安全检测中的应用

ELISA 用于农药残留的检测

河豚毒素

植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素

苯并芘

主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松（ FN ）、 甲氟磷酸异已酶（ SOMAN ）、 草不绿（ Alachor ）、 西维因（ Carbaryl ）、 多菌灵及克菌丹（ Captan ）等。

农药的检测：

ELISA检测 “非典型肺炎”冠状病毒

ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2（ hnRNPA2） / 类风湿性关节炎（ PtA） 33抗体

ELISA 在疾病诊断中的作用

ELISA法检测幽门螺杆菌抗体

ELISA 法测定 SARS 抗体效价SARS 抗体效价的测定．目前国内外报道的定性检测方法主要有：间接免疫荧光法 (IFA) 、病毒中和蚀斑法和 ELISA方法。由于 ELISA 方法具有灵敏度高，操作简便，样本处理量大，可定量测定等优点。我们选择了 ELISA 法进行改进．建立了 SARS IgG 抗体效价定量测定的方法。经初步验证，该方法的稳定性、准确度、重复性、精密度、特异性、线性和范围等均能达到免疫学定量测定方法的要求．适用于血浆及静脉注射用人 SARS 免疫球蛋白制品的 SARS IgG抗体效价检测和质量控制。

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几种酶标分析仪

2.2 放射免疫标记技术

放射免疫测定（ radioimmunoassay， RIA ）是 1959年由 Berson和 Yalow首先用于糖尿病患者胰岛素含量的测定，是一种将同位素分析的灵敏性和抗原抗体反应的特异性这两大特点结合起来的免疫标记测定技术。 女科学家 R.Yalow （美 ,1921~） 1950’

末发明（胰岛素）， 1977年获诺贝尔医学奖

放射免疫优缺点

其优点是灵敏度高、特异性强、精确性好、样品用量少，而且不需要复杂的提纯步骤。缺点是需要特殊的仪器设备和一定的防护条件，而且有些同位素标记物的半衰期较短以及试验废物难以处理，对环境造成放射性污染。

基本原理 放射免疫测定是建立在待测抗原和标记抗原对有限量抗体进行竞争性结合的基础上。待测抗原是指人体内某种微量活性物质（如微生物＆寄生虫抗原、激素、维生素、酶、药物等），而标记抗原使将已知的上述物质标记上放射性同位素，具有示踪作用。

（ 1 ）竞争结合分析： Ag + Ab AgAb *Ag + Ab *AgAb（ 2） IRMA （免疫放射分析）：常用标记核素：（ 1） 125I ： γ 射线，半衰期 60 天（ 2） 3H ： β 射线，半衰期 12.3 年测量仪器（ 1 ） γ 计数仪（ 2 ） β 液闪仪

放射免疫分析的临床应用• 临床常用近 200 种• （ 1 ）肿瘤相关抗原的测定： AFP 、 CEA 、 CA199 、 CA-

125 、 CA153 、 CA724 、 CYFRA211 、 PSA 等• （ 2 ）激素的测定：下丘脑 - 垂体 -甲状腺轴激素，下丘脑 - 垂

体 - 性腺轴激素，下丘脑 - 垂体 -肾上腺皮质轴激素，胃肠道激素，心血管激素，甲状旁腺素与降钙素，生长激素等

• （ 3 ）非激素蛋白质的测定：铁蛋白、各种尿微量蛋白、铜蓝蛋白、肌红蛋白、血栓素、 III 型前胶原肽、层黏蛋白等

• （ 4 ）酶的测定：前列腺酸性磷酸酶、 SOD 、 NSE 等• （ 5 ）药物及维生素的测定：地高辛、叶酸、 VitB12 等• （ 6 ）免疫分子的测定：各种 Ig 、抗

DNA 、 IL 、 CD 、 CIC

• （ 7 ）病原学研究：现已基本淘汰，但细菌代谢产物的测定仍有一定的价值

• （ 8 ）其它：甘胆酸、透明质酸等

基本原理 放射免疫测定是建立在待测抗原和标记抗原对有限量抗体进行竞争性结合的基础上。待测抗原是指人体内某种微量活性物质（如微生物＆寄生虫抗原、激素、维生素、酶、药物等），而标记抗原使将已知的上述物质标记上放射性同位素，具有示踪作用。

（ 1 ）竞争结合分析： Ag + Ab AgAb *Ag + Ab *AgAb（ 2） IRMA （免疫放射分析）：常用标记核素：（ 1） 125I ： γ 射线，半衰期 60 天（ 2） 3H ： β 射线，半衰期 12.3 年测量仪器（ 1 ） γ 计数仪（ 2 ） β 液闪仪

应用：放射性免疫检测四环素类药物残留

测试原理本方法的基本原理是微生物细胞表面存在着能与各种四环素类药物共有功能基团相结合的特异性位点，能与各种四环素类药物发生相应的微生物受体反应。检测四环素类药物残留时，同时加入微生物受体结合物和『 3HI 标记过的金霉素。如果样品中残留有四环素类药物，就会同[3H1 标记过的金霉素竞争结合微生物受体结合物的相关位点。用液体闪烁计数仪测定样品反应后的【 3H J 含量的 cpm值 (count per minute ，即每分钟脉冲数 ) ， cpm 值与样品中的四环素类药物残留量成反比。

免疫荧光技术

免疫荧光分析 (Immunofluorescence assay， IFA) 始创于 40年代初， 1942年 Coons 等多次报道用异氰酸荧光素标记抗体．检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原，当时由于此种荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。直至 50年代末期， Riggs等 (1958) 合成性能较为优良的异硫氰酸荧光黄。 Mashall等(1958) 对荧光抗体的标记方法又进行改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。

2.3 荧光免疫分析（ IFA ）

常用荧光免疫的类型

• （ 1 ）荧光免疫染色：主要用于抗原抗体的定位，用荧光显微镜观察

• （ 2 ）荧光免疫测定 a. 荧光偏振免疫测定（ FPIA ） b. 荧光酶免疫测定（ FEIA ）• （ 3 ）时间分辨荧光免疫测定（ TRFIA ）

基本原理　　 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与已知的抗体 ( 或抗原 ) 结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。在实际工作中，由于用荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用，所以一般通称为荧光抗体技术。

荧光及荧光素　　 荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一种能吸收激发光的光能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄 (FITC) 、四乙基罗丹明及四甲基异硫氰酸罗丹明。

荧光抗体染色方法　　 直接法：这是荧光抗体技术最简单和基本的方法。滴加荧光抗体于待检标本片上，经反应和洗涤后在荧光显微镜下观察。标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体特异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。此法的优点是简单、特异。但其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法。

间接法：根据抗球蛋白试验的原理，用荧光素标记抗球蛋白抗体 ( 简称标记抗抗体 ) 的方法。 　　

免疫荧光技术的最重要的三部分

（一）荧光物质　　 荧光素系由异硫氰基与蛋白质分子中的碱性氨基耦联而完成标记。许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。我总结了一下要能用作荧光物质需要满足以下几点：a: 具备化学上的活泼集团，易于蛋白质结合，未与蛋白质结合的色素及降解产物容易消除b: 能发射可见的，对视觉敏感的荧光颜色c: 荧光效率强，与蛋白质结合后性质比较稳定，不影响标记物活性，且具有无毒和不具附加性的抗原性d: 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明e: 于蛋白质结合的方法快速而简单

现在主要应用的荧光物质

1 、异硫氰酸荧光素（ fluoresceinisothiocyanate ， FITC ）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为 389.4 ，最大吸收光波长为 490495nm ，最大发射光波长 520530nm ，呈现明亮的黄绿色荧光。有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。

2、四乙基罗丹明（ rhodamine ， RIB200 ）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为 570nm ，最大发射光波长为 595 ～ 600nm ，呈橘红色荧光。

3、四甲基异硫氰酸罗丹明（ tetramethylrhodamineisothiocyanate， TRITC ）最大吸引光波长为 550nm ，最大发射光波长为 620nm ，呈橙红色荧光。与 FITC 的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。

（三）标记蛋白

用于荧光标记的蛋白质，多用于特异性抗体或抗原成分，因抗原理化特异性差别甚大，不易高效标记远较抗体标记少，用于标记的抗体要求效价高，特异性强， 标记后活性损失小。虽然单克隆抗体效价高，特异性强，亲和力强，但经与荧光素标记后，理论活性仅是标记前的 50 ％左右。故常用标记抗鼠lg 的方式以弥补

荧光检测仪 :

A: 荧光显微镜B: 荧光分光光度计C: 流式细胞仪（ FCM ）  

流式细胞仪 (FCM)

流式细胞仪 (FCM) 是目前分析细胞学的最据代表性的先进仪器，是流体喷射技术，激光技术，空气计数，－射线能谱术，电子计算机以及显微影分光光度计等等高技术密切结合的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。 

2.4 胶体金免疫技（ CGIA ）

基本原理 : 以胶体金作为示踪标记物，主要利用了金 颗粒具有高电子密度的特性 ，在金标蛋白结合处，在显 微镜下可见黑褐色颗粒，当 这些标记物在相应的配体处 大量聚集时，肉眼可见红色 或粉红色斑点。

2.5 化学发光免疫技术（ LIA ）

1. 原理：（ 1） LIA ：在氧化还原反应中电子被激发，可释放光子，使鲁米诺（氨基苯二酰肼类）发光剂发光。用发光剂标记抗原或抗体（ 2 ）发光酶免疫测定（ LEIA ）：用能催化发光反应的酶（如葡萄糖氧化酶）标记抗原或抗体，酶可使发光剂发光。该法经酶促放大，更灵敏 根据发光的强弱对抗原或抗体定量2. 优点： 无放射性，故现正逐步取代 RIA

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参考文献

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