短肽配基分离提纯质粒 DNA

报告人 屠依龙

报告时间 2012.8.13

研究意义

基因疗法， DNA药物的广泛应用

病毒的不安全性

质粒的优势：使用安全

易于转染

生产简易

质粒性质分子量大于 106 ，远远大于蛋白

芳香基的紧密填充双螺旋内部为高度失水

质粒合成与分离

大肠杆菌自主复制

最终 p DNA （ g DNA ≤0.05 ，宿主蛋白无法测得， RNA 无法测得，内毒素≤ 0.1 ）

碱性溶解（ pH≤12.5 ）

色谱法分离提纯

超速离心溶剂萃取

亲和色谱

蛋白配基 氨基酸色素 过渡金属离子

短肽

色谱法分离提纯

色素 承受较苛刻洗脱条件

选择性低有毒

过渡金属离子

成本低 选择性低

蛋白质（酶抑制剂，抗体，辅酶）

高亲和性 成本高，容量小，稳定性差

氨基酸（组氨酸，赖

氨酸，精氨酸）

具有一定选择性，理化性好，成本

低

结构简单，选择性不高

色谱法分离提纯

超速离心溶剂萃取

亲和色谱

蛋白配基 氨基酸色素 过渡金属离子

短肽

研究现状——多肽配基设计

原理：乳糖操纵子 DNA 域（ lacO ）→乳糖阻遏蛋白（ LacI ）

pUC19 （ 2686bp ）中 lacO1 （ 180-196 ）， lacO3 （ 88-104 ）

研究现状——多肽配基设计

LacI 为 DNA 结合蛋白，结合域包括螺旋Ⅰ（ 6-12 ），转角，螺旋Ⅱ（ 17-25 ），螺旋Ⅲ（ 32-45 ），螺旋Ⅳ（ 50-58 ）。其中螺旋Ⅰ和螺旋Ⅱ形成 HTH 结构。

LacI 几乎不与 RNA 反应，固定化后依然具有生物活性

研究现状——多肽配基设计

• 47mer ， 27mer ， 16mer 和14mer 的 KD 分别为 8.8±1.3×10-

10M ， 7.2±0.6×10-10M ， 4.5±0.5×10-8M ， 6.2±0.9×10-

6M• 3 号螺旋虽然能增强结合力，但由于

其空间位阻反使 KD 值降低• 16mer 缩氨酸特异性测试（ pUC19

和 pEGFP-N1 ）

研究现状——多肽配基设计

存在问题

1. 目前依然处于多肽配基研究的早期阶段

2. 多肽配基的合成成本高昂

3. 亲合作用复杂，配基的寻找困难

研究目标

设计寻找短肽配基，特异性结合 sc 质粒DNA

研究思路

• pDNA 与蛋白配基特异性结合位点分析• 以该位点氨基酸序列为根据，设计可能

的短肽配基• 通过分子模拟，筛选出高亲和性的配基• 通过实验验证该配基的实际效益• 通过实验寻找配基的最佳吸附洗脱条件

特色与创新• 分子模拟为配基筛选提供动力学支持，

大幅减少配基筛选过程的实验量

• 提供一种设计独有的短肽配基新思路

• 相对于多肽配基，短肽配基合成成本降低，更具经济效益

研究计划和拟解决的问题

• 选择合适的蛋白配基结合位点，进行仿生设计

• 筛选出具有实际利用价值的短肽配基

• 优化色谱流程的条件

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