基因工程的基本操作程序1 、目的基因的获取

2 、基因表达载体的构建

3 、将目的基因导入受体细胞

4 、目的基因的检测与鉴定

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• 阅读选修一 60 页 PCR 的过程

一、目的基因的获取1 、目的基因主要是指 ______________________

编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子

2 、获取目的基因的常用方法

（ 1 ）从基因文库中获取（ 2 ）利用 PCR 技术扩增（ 3 ）人工合成

(1) 从基因文库中获取目的基因

什么是基因文库？

什么是基因组文库？

什么是部分基因文库？

怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？

目的基因的有关信息与什么相联系？

概念：基因文库 （ gene library ）

基因组文库

部分基因文库（如 cDNA 文库）

将含有某种生物不同基因的许多 DNA 片段 ,导入受体菌的群体中储存 , 各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 , 称为基因文库 (gene library)

基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。

基因组文库 : 基因文库中包含了一种生物所有的基因 , 这种基因文库叫做基因组文库 .

部分基因文库 : 如： cDNA 文库 基因文库中包含了一种生物的一部分基因 , 这种基因文库叫做部分基因文库 .

基因组文库与部分基因文库的关系

（一）基因文库的构建（一）基因文库的构建（（ 11 ）基因组文库的构建）基因组文库的构建

提取某生物全部 DNA

用适当

限制酶切割许 多

DNA 片段与载体连接

导入受体菌群该生物基因组文库

（每个受体菌含有一段不同的 DNA 片段）

（（ 22 ）） cDNAcDNA 文库的构建——文库的构建—— mRNAmRNA 反转录形反转录形成成

与载体连接

导入受体菌群

mRNA

逆转录酶

杂交双链

核酸酶 H

单链 DNA

DNA 聚合酶

双链 DNA

(cDNA)

该生物cDNA 文库

基因组 DNA 文库

cDNA 文库

基因组 DNA 文库与 cDNA 文库的比较

（ 3 ）如何从基因文库中得到所需要的基因？

依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物 mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。

（ 2 ）利用 PCR 技术扩增目的基因

PCR—— 聚合酶链式反应

是一项生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。

PCR 技术• 原理：• 前提：

• 原料

• 方式PCR 扩增仪

DNA 复制

一段已知目的基因的核苷酸序列

：以 _____ 方式扩增， 即 ____ （ n 为扩增循环的次数）

指数2n

模板 DNA ；一对引物；四种脱氧核苷酸；热稳定 DNA 聚合酶（ Taq 酶）；

过程

变性、复性、延伸三步曲（选修一 P60 ）

变性：加热至 90 ～ 95℃ 双链 DNA 解链成为单链 DNA

复性：冷却至 55 ～ 60℃ 部分引物与模板的单链 DNA 的特定互补部位相配对和结合

延伸：加热至 70 ～ 75℃ 以目的基因为模板，合成互补的新 DNA 链

变性

复性

延伸

（ 3 ） 人工合成—— 根据已知的氨基酸序列合成 DNA

蛋白质的氨基酸序列

mRNA 的核苷酸序列

结构基因的核苷酸序列

推测

推测

目的基因化学合成

1 、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是

A 、化学合成法 B 、基因组文库法C 、 cDNA 文库法 D 、聚合酶链反应2 、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是① 从基因文库中获取目的基因 ②利用 PCR 技

术扩增目的基因 ③反转录法 ④通过 DNA 合成仪利用化学方法人工合成

A ．①②③④ B ．①②③ C ．②③④ D ．②③

A

D

3 、目的基因主要是指 _______________ 的结构基因。获得目的基因的常见方法有三种：（ 1 ）从基因文库中获取目的基因，根据基因的 _________ 序列，基因在________ 上的位置，基因的 ________ 产物 mRNA ，基因的 _______ 产物蛋白质等获取目的基因。（ 2 ）利用 PCR 技术扩增目的基因，该技术是一项在 ________ 完成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的 ________ 序列，以便于合成 _________ 。（ 3 ）如果基因较小且核苷酸序列已知，可以通过 ____________ 方法。

编码蛋白质

核苷酸染色体 转录

表达生物体外

核苷酸 引物人工合成

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二、基因表达载体的构建——核心

（ 1 ）用一定的 _________ 切割质粒，使其出现一个切口，露出 ____________ 。

（ 2 ）用 ___________ 切断目 的基因，使其产生 _____ ____________ 。（ 3 ）将切下的目的基因片段插入质粒的 ______处，再加入适量 ___________ ，形成了一个重组 DNA 分子（重组质粒）

限制酶

黏性末端

同一种限制酶

的黏性末端

切口DNA 连接酶

相同

1.过程 :

质粒

目的基因 限制酶处理

一个切口两个黏性末端

两个切口获得目的基因

DNA 连接酶表达载体

同一种

1.过程 :

2 、基因表达载体的功能a 、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代

b 、同时使目的基因能表达和发挥作用

思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？

不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。

不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（ 1 ） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（ 2 ） 通过 cDNA 文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（ 3 ） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（ 4 ） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（ 5 ） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。

3.基因表达载体的组成：

它们有什么作用？

a 、目的基因

b 、启动子

c 、终止子

d 、标记基因

位于基因的首端 , 是mRNA 结合位点位于基因的末端 ,终止转录

检测目的基因是否导入受体细胞

1 、（多选）一个基因表达载体的构建应包括A ．目的基因 B ．启动子 C ．终止子 D ．标记基因

ABCD

2 、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A ．启动子是与 RNA 聚合酶识别和结合的部位，是起始密码

B ．启动子和终止子都是特殊结构的 DNA短片段，对 mRNA 的转录起调控作用

C ．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选

D ．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别

A

3 、目前转基因工程可以A. 打破地理隔离但不能突破生殖隔离B. 打破生殖隔离但不能突破地理隔离C. 完全突破地理隔离和生殖隔离D. 部分突破地理隔离和生殖隔离

C

• 常用的受体细胞：常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。酵母菌和动植物细胞等。

• 将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理

借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。

三、将目的基因导入受体细胞

1 、将目的基因导入植物细胞

（ 1 ）农杆菌转化法

特点 :

能感染双子叶植物和祼子植物 , 对单子叶植物无感染能力Ti 质粒的 T—DNA 可转移至受体细胞并整合到其染色体上

转化过程 :

Ti 质粒

目的基因

构建表达载体 导入 植

物细胞

插入 植物细胞染色 DNA

表达 新性状

转入 农杆菌

（ 2 ）基因枪法

基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体 DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。

（ 3 ）花粉通道法

植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加 DNA （含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

2 、将目的基因导入动物细胞方法 :显微注射技术

操作程序 :

提纯含目的基因表达载体 取受精卵 显微注射 移植到子宫

受精卵发育

新性状动物

3 、将目的基因导入微生物细胞常用法： Ca2+处理

常用菌：大肠杆菌

微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少

过程：

Ca2+处理大肠杆菌

感受态细胞

表达载体与感受态细胞混合

感受态细胞吸收 D

NA

1 、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是

A ．结构简单、操作方便 B ．繁殖速度快 C ．遗传物质含量少、简单 D ．性状稳定、变异少

2 、基因工程常用的受体细胞有 ① 大肠杆菌 ②枯草杆菌 ③支原体 ④动植物细胞A ．①②③④ B ．①②③ C ．②③④ D ．①②

④

B

D

3 、基因工程是在 DNA 分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是

A. 人工合成基因 B. 目的基因与运载体结合C. 将目的基因导入受体细胞 D. 目的基因的检测和表

达

C

4. 采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是① 将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 ②将编码毒素蛋白的 DNA 序列注射到棉受精卵中 ③将编码毒素蛋白的 DNA 序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 ④将编码毒素蛋白的 DNA 序列与质粒重组，导入细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养A ．①② B ．②③ C ．③④ D ．①④

C

5. 下列属于基因工程中导入目的基因方法的是①农杆菌转化法 ②基因枪法 ③花粉管道法 ④显微注射法 ⑤胚胎移植 ⑥ DNA 分子杂交法A ．①②③④⑤⑥ B ．①②③④⑤C ．①②③④ D ．①③④⑤⑥

C

( 四 )目的基因的检测与鉴定

检测

① 导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法—— DNA 分子杂

交

② 表达检测

转录检测——分子杂交

翻译检测——抗原—抗体杂交

分子检测

鉴定抗虫鉴定

抗病鉴定

活性鉴定等

个体生物学水平的鉴定

1 、用 β-珠蛋白的 DNA探针可以检测出的遗传病是 A ．镰刀型细胞贫血症 B ．白血病C ．坏血病 D ．苯丙酮尿症

A

2 、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是 A ．用于检测疾病的医疗器械B ．用放射性同位素或荧光分子等标记的 DNA 分子C ．合成 β-珠蛋白的 DNAD ．合成苯丙羟化酶的 DNA 片段

B

思考与探究：2. 根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理 ,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗 ?若将一个抗病基因导入小麦中 , 理论上讲你应该怎样做 ?①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的 Vir 区（诱导）的基因，使 T-DNA 转移并插入到染色体 DNA 上。3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。

4.β- 珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的 β- 珠蛋白，想一想，应如何进行设计？

（ 1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（ cDNA) 。

（ 2）将 cDNA 前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。

（ 3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。

（ 4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。

复习题

1 ）将目的基因导入受体细胞有哪些方法 ?(试举例说明 )

2 ）简述农杆菌转化法

44 ）有关基因工程的叙述正确的是 （ ））有关基因工程的叙述正确的是 （ ） AA 、限制酶只在获得目的基因时才用 、限制酶只在获得目的基因时才用 BB 、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 CC 、质粒都可作为运载体 、质粒都可作为运载体 DD 、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料

DD

33 ）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ））有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） AA 、、 DNADNA 连接酶将黏性末端的碱基对连接起连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 来 BB 、 限制性内切酶用于目的基因的获得、 限制性内切酶用于目的基因的获得 CC 、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 DD 、 人工合成目的基因不用限制性内切酶、 人工合成目的基因不用限制性内切酶

AA

55））基因工程是在基因工程是在 DNADNA 分子水平上进行设计施工的。在分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是AA 、人工合成目的基因 、人工合成目的基因 BB 、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达CC 、将目的基因导入受体细胞 、将目的基因导入受体细胞 DD 、目的基因与运载体结、目的基因与运载体结合合

CC

6）（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到（ ）

A. 用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接B.把重组后的 DNA 分子导入受体细菌内进行扩增C. 检测重组 DNA 分子是否导入受体细菌内并表达出性状D.筛选出能产生胰岛素的“工程菌”

ABCDABCD

7）下列哪项不属于基因工程技术的步骤 （ ） A ．基因转移 B ．基因扩增C ．基因检测 D ．基因表达

BB

甲：… GTATCCATG

…CATAGGTACTTAA

A A T T C GGCATAC…

GCCGTATG… 乙：… TCCTAG

…AGCATCTTAA

AATTCCATAC…

GGTATG…

作业 14题（ 3 ）答案：

A ATTC G G CTTAA

目的基因

…GTATCCATGAATTC…CATAGGTACTTAAG

GAATTCGGCATAC…

CTTAAGCCGTATG…目的基因

作业 14题（ 4 ）答案：

　 目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。

基因操作的基本步骤一、目的基因的获取——

将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。

供体生物细胞

取出 DNA

用限制酶剪去多余部分

目的基因限制酶

2.基因文库的构建方法①鸟枪法：

供体细胞中的 DNA

许多 DNA 片段

运载体

限制酶

与载体连接

载入

受体细胞 产生特定性状导入

外源 DNA 扩增

目的基因

分离

(直接分离法 )

(一 )从基因文库中获取目的基因

② 反转录法： 以目的基因转录成的信使 RNA 为模板，反转录成互补的单链 DNA ，然后在酶的作用下合成双链 DNA ，从而获得所需的基因。

目的基因的 mRNA

杂交双链( 单链 RNA/单链 DNA)

单链 DNA

反转录酶

核酸酶 H

2.基因文库的构建方法

DNA聚合酶双链 DNA(目的基因 )

③根据已知的氨基酸序列合成 DNA 法 ：

根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使 RNA 序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。

蛋白质的氨基酸序列

mRNA 的核苷酸序列

结构基因的核苷酸序列

推测

推测

目的基因化学合成

2.基因文库的构建方法

上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？

优点 缺点

鸟枪法

反转录法

根据已知氨基酸合成 DNA

法

操作简便广泛使用

工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因

专一性强操作过程麻烦， mRNA很不稳定，要求的技术条件较高

专一性最强 仅限于合成核苷酸对较少的简单基因

思考 :为什么要构建基因文库 ?直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗 ?

1 、构建基因组 DNA 文库时，首先应分离细胞的A 、染色体 DNA   B 、线粒体 DNAC 、总mRNA   D 、 tRNA

2 、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A 、某生物的全套基因就是一个基因文库B 、将含有某种生物不同的许多 DNA 片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库C 、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D 、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫 cDNA文库

A

C

1 、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的 DNA分子片段为 ATGTG／ TACAC ，要使其数量增多，可用 PCR 技术进行人工复制，复制时应给予的条件是

① 双链 DNA 分子为模板 ② ATGTG或 TACAC 模板链 ③四种脱氧核苷酸 ④四种核苷酸 ⑤ DNA 聚合酶 ⑥热稳定 DNA 聚合酶⑦引物 ⑧温度变化 ⑨恒温

A ．①③④⑦⑨ B ．①④⑥⑦⑧C ．②⑤⑥⑦⑨ D ．①③⑥⑦⑧

D

2 、在基因工程中，把选出的目的基因（共 1000 个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是 460 个）放入 DNA 扩增仪中扩增 4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是

A.540 个 B.8100 个 C.17280 个 D.7560 个B

原核细胞的基因结构 (补充内容）非编码区 非编码区编码区

编码区上游 编码区下游

与 RNA 聚合酶结合位点

启动子 终止子

① 不编码蛋白质。

：编码蛋白质 ,连续不间断编码区

非编码区

原核细胞

的 基因结构 ②调控遗传信息表达 ,上

游有启动子，下游有终止子

真核细胞的基因结构（补充内容）编码区非编码区 非编码区

与 RNA 聚合酶结合位点

内含子 外显子

启动子 终止子

编码区上游 编码区下游

真核细胞的 基因结

构

编码区

非编码区

外显子：能编码蛋白质的序列

内含子：不能编码蛋白质的序列

：有调控作用 ,上游有启动子，下游有终止子

非编码序列： 包括非编码区和内含子

• 编码的部分为外显子，不编码的为内含子，内含子没有遗传效应。

• ● 外显子就是在成熟 mRNA 中保留下的部分，也就是说成熟 mRNA 对应于基因中的部分。

• ● 内含子是指在 mRNA 加工过程中被剪切掉的部分，在成熟 mRNA 中不存在的部分。

• 内含子是基因内的间隔序列 , 不出现在成熟的 RNA 分子中 , 在转录后通过加工被切除。大多数真核生物的基因都有内含子。

• 基因组 DNA 中出现在成熟 RNA 分子上的序列。外显子被内含子隔开，转录后经过加工被连接在一起，生成成熟的 RNA 分子。

原核细胞 真核细胞

不同点 编码区是_____ 的

编码区是间隔的、_____ 的

相同点都由能够编码蛋白质的 ______和具有调控作用的 ______区组成的

原核细胞与真核细胞的基因结构比较

连续 不连续编码区

非编码

非编码区 非编码区编码区

RNA 聚合酶结合位点

外显子 内含子

终止子

基因的结构

启动子

原核

真核

知识延伸—— DNA 分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链 DNA解开，把单股的 DNA 小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的 DNA 中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的 DNA或基因。

返 回返 回

DNA

附着在膜上

硝化纤维素

加探针报告基因（含荧光素分子）

变性

DNA 杂交（如检测 SARS病毒等）

a

b

c

d