B GIO DC V O TO TRNG I HC K THUT CNG NGH TP.HCM KHOA MI TRNG V CNG NGH SINH HC --------------------

N TT NGHIP

NNG CAO CHT LNG SA CHUA BNG PHNG PHP VI GI VI KHUN LACTIC

Chuyn ngnh: Cng ngh sinh hc M s ngnh: 111

GVHD: TS. Nguyn Thy Hng SVTH: Quc Cng

TP. H Ch Minh, 7 / 2009

N TT NGHIP LI CM N Em xin chn thnh cm n c Nguyn Thy Hng tn tnh gip , hng dn v truyn t cho em nhiu kin thc qu bu trong sut qu trnh lm n tt nghip. Em xin cm n cc thy, c ph trch Phng Th nghim Cng ngh sinh hc, B mn Cng ngh sinh hc, Khoa Cng ngh Ha hc, Trng i hc Bch khoa Tp. HCM h tr v to mi iu kin tt nht v phng tin em hon thnh n ny. Em xin cm n cc thy, c thuc Khoa Mi trng v Cng ngh sinh hc, Trng i hc K thut Cng ngh Tp. HCM tn tnh ch dy v truyn t kin thc cho em trong sut thi gian em hc tp ti trng. Em xin cm n cc anh, ch lp Cao hc Cng ngh sinh hc nin kha 2006 v 2007, Trng i hc Bch khoa Tp. HCM gip em trong sut thi gian lm n tt nghip. Ti xin cm n cc bn Nguyn Mnh Tng, Trn Thu Trang, Nguyn Th B, Nguyn Th Qunh Ly v tt c cc bn thuc lp Cng ngh sinh hc nin kha 2005, Trng i hc K thut Cng ngh Tp. HCM gip ti trong sut thi gian hc tp ti trng v thi gian lm n tt nghip. Cui cng, ti xin cm n b m ti v ton th i gia nh ca ti ng vin v gip ti trong nhng giai on kh khn nht. Tp. H Ch Minh, thng 6/2009 Quc Cng

i

N TT NGHIP MC LC M U..1 Chng 1: TNG QUAN TI LIU... 2 1.1 Tng quan v vi khun lactic..3 1.1.1 c im chung ca vi khun lactic. 3 1.1.2 Hot ng sinh ha, trao i cht ca vi khun lactic v mt s chng vi khun lactic in hnh...4 1.1.3 Vi khun Lactobacillus acidophilus..... 7 1.2 Tng quan v sa v sa chua 9 1.2.1 Thnh phn dinh dng, c im ca sa v sa chua.. 9 1.2.2 H vi sinh vt tn ti trong sa v sa chua... 17 1.2.3 Quy trnh cng ngh sn xut sa chua.. 18 1.3 Tng quan v vi gi.. 21 1.3.1 Khi nim, c im, u v nhc im ca vi gi... 21 1.3.2 Cc phng php vi gi hin nay... 24 1.3.2.1 Phng php nh git24 1.3.2.2 Phng php polymer ha lin kt b mt 26 1.3.2.3 Phng php ngng t polymer ha..27 1.3.2.4 Phng php tch pha ng t.. 27 1.3.3 Vt liu vi gi, c im ca vt liu vi gi... 30 1.3.3.1 Gelatin... 30 1.3.3.2 Alginate. 32 1.3.3.3 Cc hp cht vi gi khc... 34 Chng 2: VT LIU V PHNG PHP TH NGHIM.. 39 2.1 Trang thit b, ha cht, vt liu... 40 2.2 Ni dung th nghim. 40 2.2.1 S ni dung th nghim..40 2.2.2 B tr th nghim. 40 2.2.2.1 Hot ha, tng sinh v gi ging vi khun L. acidophilus 40 2.2.2.2 Kho st sinh hc ging vi khun L. acidophilus. 41 2.2.2.3 Thu sinh khi t bo.. 42

ii

N TT NGHIP 2.2.2.4 Vi gi vi khun L. acidophilus.. 43 2.2.2.5 Kho st cht lng ht vi gi... 44 2.3 Cc phng php lin quan.. 47 2.3.1 Cc phng php vi sinh 47 2.3.1.1 Phng php pha ch mi trng dinh dng MRS. 47 2.3.1.2 Phng php nghin cu hnh thi vi sinh vt.. 48 2.3.1.3 Phng php kim tra s lng t bo.. 49 2.3.2 Phng php ha sinh Phng php kim tra qu trnh ln men lactic.. 50 2.3.3 Cc phng php khc... 51 Chng 3: KT QU V BN LUN.. 53 3.1 Kho st c im sinh hc ca ging vi khun L. acidophilus...54 3.1.1 Tng sinh v gi ging trn mi trng MRS54 3.1.2 Quan st vi th, i th vi khun L. acidophilus.54 3.1.3 Kho st kh nng ln men lactic ca L. acidophilus.55 3.2 Kho st quy trnh vi gi vi khun L. acidophilus56 3.2.1 Kho st nng gelatin 56 3.2.2 To ch phm vi gi v kho st kch thc ht gel.. 57 3.3 Kho st cht lng ht vi gi.. 58 3.3.1 Kho st kh nng tn ti ca vi khun lactic trong mi trng d dy nhn to SGJ... 58 3.3.2 Kho st bin ng pH, acid lactic trong qu trnh ln men.. 60 3.3.3 Kho st nh gi cht lng cm quan trong sn phm sa ln men... 60 Chng 4: KT LUN V KIN NGH.. 63 4.1 Kt lun.64 4.2 Kin ngh.. 64 TI LIU THAM KHO66 PH LC

iii

N TT NGHIP DANH MC BNG Bng 1.1 Mt s ch tiu vt l ca sa b9 Bng 1.2 S thay i hm lng cc cht trong sa b.. 10 Bng 1.3 Hm lng mt s vitamin trong sa b..12 Bng 1.4 Thnh phn mt s nguyn t vi lng trong sa b...12 Bng 1.5 Thnh phn dinh dng ca sa chua.. 15 Bng 1.6 Mt vi loi vitamin c mt trong sa chua.16 Bng 3.1 Bng gi tr o pH, VNaOH v hm lng acid lactic ( a)... 55 Bng 3.2 Mt s tnh cht ca ch phm vi gi.. 57 Bng 3.3 Kt qu mt t bo sng st sau khi kho st trong mi trng d dy nhn to SGJ. 58 Bng 3.4 % t bo tn ti so vi mt ban u pH=2... 58 Bng 3.5 So snh kh nng ln men ca hai hnh thc tip ging l t bo t do v cc ch phm vi gi... 60 Bng 3.6 Bng tng hp th t so hng.. 61 Bng 3.7 Bng kt qu cm quan theo phng php cp i..61

iv

N TT NGHIP DANH MC HNH NH Hnh 1.1 Lactobacillus acidophilus... 8 Hnh 1.2 Quy trnh cng ngh sn xut yaourt 19 Hnh 1.3 Cc loi vi gi...21 Hnh 1.4 S nguyn tc ca phng php nh git24 Hnh 1.5 S m t phng php polymer ha26 Hnh 1.6 S m t qu trnh ngng t polymer ha lin kt b mt.. 27 Hnh 1.7 Cc giai on ca qu trnh tch pha ng t n28 Hnh 1.8 S quy trnh iu ch vi gi bng phng php tch pha ng t n 28 Hnh 1.9 S quy trnh iu ch vi gi bng phng php tch pha ng t phc.. 29 Hnh 1.10 Thnh phn cc acid amin trong gelatin. 30 Hnh 1.11 Cu trc ha hc ca gelatin...30 Hnh 1.12 Thnh phn cu trc ca alginate... 33 Hnh 2.1 S ni dung th nghim41 Hnh 3.1 Mi trng tng sinh v gi ging L. acidophilus........... 54 Hnh 3.2 Hnh chp vi th, i th t bo vi khun L. acidophilus. 55 Hnh 3.3 Hnh chp ch phm vi gi...57

v

N TT NGHIP DANH MC TH th 1 Biu din gi tr pH ca mu i chng v mu dch ln men. 56 th 2 Biu din hm lng acid lactic sinh ra trong thi gian nui cy. 56 th 3 Biu din mt t bo trong mi trng d dy nhn to SGJ pH=2... 59

vi

N TT NGHIP M U T rt lu trong lch s loi ngi, chng ta bit n mt ngun thc phm rt giu dinh dng l sa. Sa l ngun thc phm dnh cho cc loi ng vt c v cn non mi sinh cha th s dng cc loi thc phm khc. Trong sa c cha nhiu cht dinh dng nh glucid, protein, lipid, khong, vitamin,Nhng hp cht ny rt c li v cn thit cho sc khe v s tng trng, pht trin ca con ngi v cc loi ng vt. L ngun thc phm quan trng, nn cc sn phm t sa c a dng ha nh ph mai, b, sa ln men yaourt, kefir l cc sn phm truyn thng c t rt lu trc y cho n cc sn phm hin i c sn xut theo dy chuyn cng nghip nh sa ti thanh trng, tit trng, sa nguyn kem, sa bt, sa gy, sa c c,Tt c nhm nng cao cht dinh dng v bo qun sa tt hn. Trong sa chua l mt trong nhng thc phm c quan tm hng u, bi n c xem nh l mt dng thc phm chc nng cha cc vi khun probiotic c li cho sc khe con ngi. Tuy nhin, sn phm sa chua c sn xut theo kiu truyn thng, cng vi vic phn phi v bo qun khng tt nn lm cho vi khun probiotic khng c bo v, dn n khng pht huy c tc dng tch cc khi i vo mi trng cc oan trong c th con ngi nh mi trng d dy, mui mt, ti Nng cao cht lng sa chua bng phng php vi gi vi khun lactic m ra mt hng nghin cu mi bo v vi khun probiotic v nng cao gi tr ca sa chua v ch tiu vi sinh vt.

1

N TT NGHIP

Chng 1: TNG QUAN TI LIU

2

N TT NGHIP 1.1. Tng quan v vi khun lactic. 1.1.1. c im chung ca vi khun lactic. Vi khun lactic l nhng vi khun ln men lactic thuc h Lactobacterium, l vi khun Gram (+). y l nhng trc khun hoc cu khun, a s khng sinh bo t, thng khng chuyn ng v k kh ty tin, vi hiu kh, chng khng cha cytochrom v enzyme catalase, chng c kh nng sinh tng hp enzyme peroxydase rt mnh, phn gii H2O2 pht trin. a s chng ln men c mono v disaccharide, mt s khng ln men c saccharose, s khc khng ln men c ng maltose. Cc vi khun lactic khng c kh nng ln men tinh bt v cc polysaccharide khc (ch c loi L. delbruckii l ng ha c tinh bt). Vi khun lactic thng c dng hnh cu, hnh oval v hnh que, ng knh ca dng cu khun lactic t 0,5-1,5 m, cc t bo hnh cu xp thnh tng cp hoc chui c chiu di khc nhau. Kch thc t bo trc khun lactic t 1-8 m, trc khun thng ng ring l hoc kt thnh chui. Cc loi vi khun lactic c kh nng rt khc nhau to thnh acid trong mi trng v sc chu ng acid cng khc nhau. a s cc trc khun lactic ng hnh to thnh acid cao hn (khong 2-3,5%), lin cu khun (khong 1%). Cc trc khun ny c th pht trin c pH = 4-3,8 cn cu khun khng th pht trin c mi trng ny. Hot lc ln men tt nht ca trc khun lactic vng pH = 5,5-6. a s vi khun lactic (c bit l trc khun ng hnh) rt kn chn thnh phn dinh dng, chng ch pht trin khi trn mi trng c tng i y cc yu t dinh dng cn thit nh acid amin, peptide, protein, vitamin (B1, B2, B6, PP, cc acid pantotenic v acid folic), Vi khun lactic c hot tnh protease, chng phn hy c protein ca sa ti peptide v acid amin. Hot tnh ny cc loi c khc nhau, thng trc khun l cao hn. Chng chu c trng thi kh hn, bn vng vi CO2 v cn ethylic, nhiu loi vn sng c trong mi trng c 10-15% cn hoc cao hn, mt s trc khun bn vi NaCl ti 7-10%. Cc vi khun lactic a m c nhit sinh trng ti u l 25-350C, cc loi a nhit c nhit ti u l 40-450C, loi a lnh c th

3

N TT NGHIP pht trin c nhit tng i thp (khong 50C hoc thp hn). Khi gia nhit ti 60-800C hu ht chng b cht sau 10-30 pht. Mt s loi c kh nng to mng nhy. Mt s khc c kh nng i khng vi th hoi sinh v cc vi sinh vt gy bnh v lm thi ra thc phm. Vi khun lactic ngoi kh nng ln men lactic, chng cn c kh nng sn sinh ra cc cht khng khun gi l bacteriocin v c ng dng nhiu trong y hc cng nh trong bo qun thc phm. Vi khun lactic phn b rng trong thin nhin, trong t, trong nc, trong khng kh, ch yu c mt trn thc vt (c bit c l trn c), trong thc phm (rau, qu, sa, tht,), mt s chng c mt trong h thng ng rut ca c th ngi v ng vt. Trong c th ngi v ng vt, ngoi ng rut chng cn tn ti trong khoang ming. Cc dng cu khun ng rut c gi l Enterococus hay Streptococus fecalis. Phn loi vi khun lactic hin nay cha hon thin v cn nhiu tranh ci, ch yu phn loi da theo hnh dng t bo. Th d: cu khun xp cc ging Streptococcus v Leuconostoc, cn trc khun xp thnh mt ging Lactobacillus [1, 2, 3, 4, 7]. 1.1.2. Hot ng sinh ha, trao i cht ca vi khun lactic v mt s chng vi khun lactic in hnh. 1.1.2.1. Hot ng sinh ha, trao i cht ca vi khun lactic. Hot ng sinh ha, trao i cht tiu biu nht ca vi khun lactic chnh l c ch ca qu trnh ln men lactic. Qa trnh ln men lactic din ra trong t bo vi khun. u tin, ng s c vi khun lactic a vo bn trong t bo nh c ch vn chuyn c trng ca mng t bo. Nu phn t ng l ng n nh glucose th s vo thng chu trnh chuyn ha, cn nu phn t ng l ng i hay cc dng ng khc th s b thy phn thnh cc monosaccharide sau mi vo chu trnh chuyn ha. Sau , phn t ng ny s i vo chu trnh chuyn ha khc nhau v cui cng cho sn phm l acid lactic, acid acetic, CO2, Da vo sn phm to thnh ca qu trnh ln men, m ngi ta chia chng ra hai nhm l vi khun lactic ln men ng hnh hay vi khun lactic ln men d hnh.

4

N TT NGHIP - Trng hp ln men lactic ng hnh: Qu trnh ln men to acid lactic theo chu trnh Embden-Meyerhorf (con ng EMP). Trong t bo vi khun ln men lactic ng hnh c enzyme carboxylase, do vy pyruvate khng b phn gii su hn, m thay vo n nhn hydro c tch ra v chuyn ti pyruvate to thnh acid lactic. Lng acid lactic to thnh chim hn 90% sn phm, ch mt phn nh pyruvate cn li b kh cacbon chuyn thnh acid acetic, ethanol, CO2 v acetone, C6H12O6 CH3-CO-COOH CH3-CHOH-COOH + Nng lng (glucose) (acid lactic) - Trng hp ln men lactic d hnh: Xy ra khi vi khun lactic khng c cc enzyme c bn ca chu trnh EMP l andolase v trizaphosphattizomerase. Do khng theo con ng EMP nn chng chuyn ha theo con ng PentosePhosphate giai on u, t glucose-6-phosphate, 6-phosphoglucose v ribuloae-5phosphate di tc dng ca enzyme epimerase chuyn thnh xilulose-5-phosphate. Xilulose-5-phosphate s i theo hai con ng chuyn ha khc nhau: + Xilulose-5-phosphate s c chuyn ha tip thnh glyceraldehydes-3phosphate. Sau b thy phn tip theo con ng EMP to thnh acid lactic. + Xilulose-5-phosphate b thy phn tip theo mt con ng khc to acetyl phosphate. Sau , di tc dng ca acetatkinase s to thnh acetate hoc b kh tip thnh acetaldehyde ri thnh ethanol, acid acetic, CO2, C6H12O6 CH3-CHOH-COOH + HOOC-CH2-CH2-COOH + CH3-COOH (glucose) (acid lactic) (acid sucxinic) (acid acetic) + CH3-CH2OH + CO2 +H2 (ethanol) + Lng sn phm ph ca qu trnh ln men d lactic nh sau: acid lactic chim 40% (thp hn nhiu so vi ln men lactic ng hnh), acid sucxinic chim 20%, ethanol chim 10%, acid acetic chim 10% v khong 20% cn li l cc loi kh [1, 2, 3, 4, 7]. 1.1.2.2. Mt s chng vi khun lactic in hnh. a. Cc vi khun lactic ln men ng hnh. Streptococcus lactis: L cu khun hoc trc khun rt ngn khi cn non, kt i hoc thnh chui ngn. Chng l ging a m, pht trin tt 30-350C, lm ng

5

N TT NGHIP t sa iu kin ny sau 10-12 gi. Trong mi trng n tch t c 0,8-1% acid lactic. Nhit ti thiu cho pht trin l 100C, ti a l 45-450C. Mt s chng to thnh bacteriocin dng nizin. Streptococus lactis: L lin cu khun lactic c s dng rng ri trong ch bin cc sn phm sa nh sa chua, crem-b chua, phomat. Khi ng t sa cc cc vn cht v nhn c to thnh. Streptococcus cremoris: L t bo hnh cu, kt thnh chui di, a m v to t acid trong mi trng. Nhit thch hp cho pht trin l 250C, ti thiu l 100C, ti a l 36-380C. Khi s dng c phi trn vi Str. lactis. Mt s chng thuc ging Diplococus sinh bacteriocin dng diplococin. Streptococcus thermophilus: C dng hnh cu, kt thnh chui di, pht trin tt nhit 40-450C, tch t khong 1% acid. Dng phi hp vi trc khun lactic ch bin sa chua ni chung v cc loi c bit, sa chua nu chn v pho mt. Lactobacillus bulgaricus: L trc khun trn (i khi dng ht), thng kt thnh chui di, khng ln men c saccharose. y l ging a nhit, nhit ti u l 40-450C, ti thiu l 15-200C. N to thnh acid mnh, tch t trong sa ti 2,5-3,5% acid lactic. Dng trong ch bin sa chua phng nam, sa nga. Lactobacillus casei: L trc khun nh, thng gp dng chui di hoc ngn, tch t ti 1,5% acid. Nhit ti u cho pht trin l 30-350C. Trc khun ny dng nhiu trong ch bin pho mt, nh n c hot tnh protease nn c th phn hy casein ca sa thnh acid amin. Lactobacillus acidophilus: L trc khun di chu nhit, nhit ti u cho pht trin l 37-400C, ti thiu l 200C. Trong sa n tch t ti 2,2% acid. Trc khun ny c phn lp t rut tr em v b non mi , dng trong sn xut sa, acidophin c kh nng sinh bacteriocin c hot tnh c ch vi khun gy bnh ng rut. Mt s chng c kh nng to thnh mng nhy. Lactobacillus delbriieckii: L trc khun lactic chu nhit, thy nhiu cc loi ht ng cc v bt. C l y l ging vi khun lactic duy nht c th ng ha c tinh bt. N khng ln men v ng ha c lactose, v vy khng dng trong cng nghip sa. Nhit ti u l 45-500C, ti thiu l 200C, tch t 2,5% acid. c dng nhiu trong sn xut acid lactic t tinh bt v sn xut bnh m.

6

N TT NGHIP Lactobacillus plantarum: L trc khun nh, thng kt i hoc chui. Nhit ti u cho sinh trng l 300C, tch t 1,3% acid. Ging ny ch yu trong mui chua rau da v chua thc n dng trong chn nui [1, 2, 3, 4, 7]. b. Cc vi khun lactic ln men d hnh. Lactobacillus brevis (L. brassica fermentati ): c tm thy ch yu trong mui chua bp ci, rau c,V vy, n cn c gi l trc khun bp ci. Trong ln men, ngoi acid lactic (khong 1,2%) n cn to thnh acid acetic, ru ethylic (khong 2,4%) v CO2, n cn to hng lm cho sn phm c hng v d chu. Lactobacillus lycopersici: L trc khun sinh hi, ng ring l hoc kt thnh chui, gy h hng thc phm nh thi nhn cung c chua, cng nh lm h hng c chua ng hp, nc c chua qua thanh trng cha trit . Ngy nay, ging ny c coi nh l cc bin chng ca Lactobacillus brevis. Ngoi ra, cn c cc lin cu khun to hng nh Str. citrovorus, S. diacetilactis, S. cremoris,...nhit ti u cho cc vi khun sinh hng ny pht trin l t 25-300C (ring i vi S. diacetilactis pht trin tt nht nhit l 300C). Chng c kch thc t bo nh hn so vi cc ging vi khun ln men lactic khc, thng ng ring l hoc xp thnh i hay thnh chui di ngn khc nhau. im c bit vi khun ny l phn ln chng c cc enzyme citritase, chnh nh cc enzyme ny m chng mi c th ln men c acid citric. Sn phm ca qu trnh ln men citric ca cc lin cu khun sinh hng l cc acid bay hi nh acid acetic, acid propionic, cc cht thm nh este, diacetyl,... lm cho hng v ca sn phm ln men c nng cao v hon thin [1, 2, 3, 4, 7]. 1.1.3. Vi khun Lactobacillus acidophilus. 1.1.3.1. Phn loi. Loi Lactobacillus acidophilus thuc gii vi khun (bacteria), ngnh Fermicutes, lp Bacilli, b Lactobacillilales, h Lactobacillaceae, ging Lactobacillus. N thng c s dng cng vi Streptococcus salivarius v Lactocbacillus delbrueckii spp.bulgaricus trong sn xut yaourt kiu acidophilus. Vi khun ny c m t ln u tin do cng ca mt bc s l Bruno Oppler v mt nh nghin cu d dy rut l Ismar Isidor Boas. Tn gi Lactobacillus

7

N TT NGHIP acidophilus bt ngun t lacto c ngha l sa, bacillus ch hnh dng ging cy gy v acidophilus ngha l mt acid m thm (acid loving). Lactobacillus acidophilus l vi khun Gram (+), hnh que, khng sinh bo t. N c kh nng ln men c hiu kh ln k kh. Trong trng hp ln men ng hnh, glucose c s dng to acid lactic, hoc to thnh nhiu sn phm khc nhau nh acid acetic, ethanol, CO2,trong trng hp ln men d hnh [7, 16]. 1.1.3.2. Hnh thi. Lactobacillus acidophilus l trc khun, c kch thc rng 0,6-0,9m, di 1,5-6m, ln men ng hnh, nhit pht trin ti u l 37-420C. Trong t nhin, chng tn ti ring l, i khi to thnh chui ngn c kh nng chuyn ng [7, 16].

Hnh 1.1 - Lactobacillus acidophilus [33]. 1.1.3.3. c im sinh l sinh ha. L. acidophilus c th pht trin nhit cao nh 450C nhng ti u l 35400C. Tnh chu acid ca n t 0,3-1,9% chun acid, vi pH ti u t 5,5-6. Chng c nhng yu cu pht trin phc tp nh yu cu p lc oxygen thp, c th ln men carbohydrate, protein v cc phn t b ph v t cc cht ny, mt s vitamin v khong nh B-complex, acid nucleic, Mg, Mn, Fe cn cho s pht trin. Lactobacillus acidophilus pht trin pH thp 11, alginate b kh polymer ha lm gim nht do cc lin kt glucoside s b thy phn trong mi trng kim. Kh nng to gel ca dung dch alginate. Khi cho kt hp vi cation ha tr II v III, thng l ion Ca2+ s thy xut hin cc vng ni gia cc mch phn t alginate v to gel theo m hnh hp trng. Cc gel ny c hnh thnh nhit phng hoc nhit = = = = = > = Mi > < = < < = = < < V < < < = < >