核酸の新規安定化技術の開発と、遺伝子

分析ならびに医薬品への応用

産業技術総合研究所 生物プロセス研究部門小松康雄

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2本鎖１本鎖

通常の2本鎖は外的因子、配列の影響を受ける。安定な形成には一定以上鎖長、修飾核酸等が必要になる

2本鎖形成は多様な技術で関わる

• 遺伝子の検出、制御

• 配列解析

• 機能性核酸

• 核酸医薬

• 導電性

etc

2本鎖核酸と特徴

2

2本鎖核酸のクロスリンク（CL）

• 2本鎖の安定化が可能

• DNAの損傷、抗がん剤

• 配列選択的に機能を抑制

Crit Rev Biochem Mol Biol. 2010, 45, 23–49. Nature Reviews Cancer 11, 467-480.

構造的な歪みが生じる

反応の特異性と簡便性

2本鎖の安定化と課題

3

紹介する技術

1. 2本鎖核酸の新規なクロスリンク（CL)技術とその性質

2. 応用例CL2本鎖を利用したプローブ開発

4

新規な2本鎖CL反応

J. Am. Chem. Soc., 131 (37), 13208–13209 (2009).Chem. Commun. (Camb) 48, 2143-2145 (2012). 特許5196448

脱塩基部位

O

O

O

OHOH

O

O

OH

反応

塩基対

クロスリンク（CL)

脱塩基部位のペアー

• 簡便な連結法

• 位置選択的に複数導入可能

クロスリンク（CL）2本鎖

5’

3’5’

3’

5

新規なCL2本鎖の性質

CL2本鎖

高温でもへリックス構造を維持可能

剛直構造

温度（℃）

0.E+00

2.E+05

4.E+05

6.E+05

8.E+05

65 70 75 80 85

分子楕円率（θ）

3’ GCCUCGUCGUCG 5’

5’ CGGAGCAGCAGC 3’

3’ GCCUCGXCGUCG 5’

5’ CGGAGCXGCAGC 3’

mDS mCL

-6.E+05

-2.E+05

2.E+05

6.E+05

1.E+06

220 240 260 280 300 320

25℃80℃

2’-O-methyl RNAの2本鎖

へリックス構造を維持へリックス構造破壊

通常の2本鎖

Chem. Lett., 41, 62-64 (2012) .Langmuir, 28, 17211-17216 (2012) .

e-

通常のDNA

電極

曲がる↓

直接電子移動

Mediator (med)

e-

throughbase pairs

CL-DNA

S S

HO O OP

O

O-

e-

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これまでのCL-DNAの活用例

H2O2H2O

FcOH+ FcOH

グルコース GDL

O2

酵素B

酵素A

電極e-

マイクロ電極

電流計測

抗がん剤の薬剤耐性を上げる物質のスクリーニング系構築に本CL構造が利用された

（通常のCLよりも修復酵素に認識されにくいことが利用）（国外）

Bioorg Med Chem., 23, 6912 (2015)

微小電極上への酵素の配置

解離しない、安定、鎖長可変、簡便

スクリーニング

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CL

CL2本鎖-1本鎖

プローブ

CL2本鎖を新規なプローブに利用

標的核酸

1. 隣接ハイブリへの影響

2. microRNA(miRNA)に対する影響

標的核酸との結合配列の近傍に導入したプローブを作製

従来の核酸プローブ例

8

0

0.05

0.1

0.15

0.2

20 40 60 80

dDS-Itarget (-)

dSS-I

44.7

Tm (℃) (ΔTm） 結合の安定性の指標

43.3 (0)

43.7 (0.4)

I

CL2本鎖による隣接ハイブリの安定化

0

0.05

0.1

0.15

0.2

20 40 60 80

CLプローブ

target (-)dCL-I 54.9 (11.6)

プローブ：DNA標的：RNA（22 mer）

標的RNA

Tm上昇

融解曲線

温度（℃）

ΔA260

ΔA260

温度（℃）

変化無し

dhp-I 43.9 (-0.8)

56.2 (12.9)dCLhp-I 上昇

59.2 (15.9)

プローブ

9

CL-I

CL2-I

CL

• 隣接するハイブリを安定化

• DNA, RNA, 修飾核酸いずれの場合においても安定化効果を有する

• CLx1で15℃、CLx2で20℃程度Tm値は上昇

• 核酸分解酵素に耐性（生体内持続性が高い）

新技術の効果

hp-I

強固なヘリックス構造

安定化効果

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1. 2本鎖核酸の新規なクロスリンク（CL)技術とそのCL2本鎖の性質

2. 応用例CL2本鎖を利用したプローブ開発

紹介技術

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•転写•Processing•核外輸送•トリミング

AAA…An 3’UTRcap

翻訳阻害

AAA…An 3’UTRcap

切断・分解

5’UTRcap

翻訳活性化

mRNA

DNA

RNA-induced silencing complex (RISC)

細胞

1本鎖型

2本鎖型

Anti-miRNA oligo (AMO)

miRNAの相補鎖

B社

A社

microRNAと阻害核酸• miRNAに結合する核酸は核酸医薬品としても期待されている。

• 2本鎖含有AMOは、1本鎖よりも抑制活性が高い。そこで2本鎖部位のCLを実施し、細胞内における効果を評価した。

Nucl. Acids Res., 40, e58 (2012)

RNA, 13, 723, (2007)

結合

RISC-AMO複合体

miRNAの阻害

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miRNA阻害核酸への導入

3’ GCCUCGUCGUCGAUCGAAUAGUCUGACUACAACUGCCUCGUCGUCG 5’

CGGAGCAGCAGC 3’

12bp5’ CGGAGCAGCAGC

2本鎖型 3’ GCCUCGXCGUCGAUCGAAUAGUCUGACUACAACUGCCUCGXCGUCG 5’

CGGAGCXGCAGC 3’5’ CGGAGCXGCAGC CL型

3’ GCCUCGUCGUCGAUCGAAUAGUCUGACUACAACUGCCUCGUCGUCG 5’1本鎖型5’ UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA 3’

miR-21 (miRNA) UCUCGAAGAGCUAUCGAAUAGUCUGACUACAACUUCGAGA

AGCUCUGAA

A

GCUU

ヘアピンループ(HP)型

2’-O-methyl RNAで合成し、細胞内における活性を評価した

3’ GCCUCGXCGUCGAUCGAAUAGUGCCUCGXCGUCG 5’

CGGAGCXGCAGC 3’5’ CGGAGCXGCAGC 短鎖CL型

stable loop

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.20 nM 0.5 nM 1 nM 2 nM 3 nM 4 nM 5 nM 10 nM

X X

82.2℃61.6℃60.1℃ 66.8℃Tm 60.1℃

rela

tive

luc

inte

nsity

A社 B社

細胞内導入48 hr後に評価

mismatch

Dual luciferase assay

Gene Ther. 2011, 18, 1111

CL2本鎖型は最も高い活性を示した

2本鎖型1本鎖型 HP型 CL型 短鎖CL型

CL2本鎖

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❑反応

• 安価な試薬で簡便な反応

新技術の特徴

❑構造

• 連結部位はヘリックス内部に収まる

❑性質

• 剛直かつ低分子の2本鎖核酸を作製可能

• CL試薬に応じて性質が変化（e.g.芳香環→導電性）

• 隣接するハイブリダイゼーションを高度に安定化

• 細胞内においても持続的効果を示す

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本技術に関する知的財産権

• 発明の名称：アミノオキシ基含有の反応性化合物

• 出願番号 ：特許5196448• 出願人 ：産総研、DNAチップ研究所• 発明者 ：小松康雄、小島直、野中 謙

CL試薬関連の特許

• 発明の名称：核酸複合体、核酸ハイブリダイゼーションの形成方法、医薬組成物、核酸検出用プローブ及び相補鎖核酸複合体

• 出願番号 ：特願2014-251847／PCT/JP2015/084402• 出願人 ：産総研

• 発明者 ：小松康雄、平野悠、三重安弘

CLプローブのハイブリに関する特許

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企業への期待

•遺伝子検出にCL構造を有するプローブを

利用することで、高感度化が期待される。

•核酸医薬においては、低濃度化と作用の

持続性が想定される。

•CL試薬ならびにCL核酸は提供可能であ

るため、共同研究さらには事業化を期待

する。

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核酸修飾用リンカーの開発を実施

TCGAポリマー、ポアガラス

5’ 3’

活用例遺伝子解析、診断

DNA チップ研究所、日本ガイシ、東レ等の各製品・Human Pathway analysis、ハイブリ先生（可視化チップ）、3D Gene Yeast Oligochip、SNPs解析カスタムアレイ他

核酸医薬品

製薬企業・核酸医薬（前臨床試験）

ポリエチレングリコール、コレステロール等機能性分子

基礎研究

大学、研究機関

リンカーリンカー

ライセンス

H19年 Sigma-Ald.(US）、H23年 ChemGene(US）

H24年ジーンデザイン社（大阪）

•特許第4336820号（2007年）•US Patent NO.7491857号（2008年）, DE1908829 (2014年)

•特許第5808025号（2015年）

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国立研究開発法人 産業技術総合研究所

生命工学領域研究戦略部

イノベーションコーディネータ 新間 陽一

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