5 lekarska mykologie aspergilózy - is.muni.cz · podle invaze do plicních struktur se rozlišují...

Lékařská mykologie (Bi3390)Aspergilózy

MASARYKOVA UNIVERZITAPŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

Laichmanová Monika

Aspergilózy

zástupci rodu Aspergillus - popsáno 339 druhů, kolem 40 druhů popsáno jako původci mykotických infekcí u člověka

oportunní patogeni

ubikvitní saprofyté celosvětově rozšířeni, jsou přítomny v půdě, ve vzduchu, v rostlinných i živočišných zbytcíchčastý kontaminant potravin a krmivaspergilóza je po kandidóze druhé nej častější mykotické onemocn ění u silně imunokompromitovaných pacientů

Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus nidulans

Aspergilózy

Postižení respiračního systému má 3 základní formy:

1. alergickou plicní aspergilózu

2. plicní aspergilom

3. invazivní aspergilózu (IA)

původci povrchových infekcích – onychomykózy (mykóza nehtového aparátu)

původci infekce zevního zvukovodu - otomykózypůvodci myktoxikóz - producenti mykotoxinů (aflatoxin) poškozujících ledviny a játra, zdrojem jsou zejména arašídy, oříšky kešu, pistácie a sušené plody

Aspergilózy

Alergickou plicní aspergilózabronchiální astma, exogenní alergická alveolitida a alergická bronchopulmonální aspergilóza (ABPA)plicní onemocnění způsobené hypersenzitivitou k aspergilovýmantigenům při kolonizaci dolních dýchacích cest aspergily

postihuje především nemocné s astmatem a cystickou fibrózou a významně zhoršuje průběh těchto onemocnění

výskyt ABPA v populaci: u astmatiků se uvádí 1-2 %, u nemocných s cystickou fibrózou cca 8-10 %

při tomto onemocnění jsou dýchací cesty kolonizovány aspergilem, k invazi do organizmu nedochází

klinickými příznaky jsou kašel, dušnost, teplota

Aspergilózy

Alergickou plicní aspergilózaDiagnostiká kritéria alergické bronchopulmonální aspergilózy (ABPA)

astma

okamžitá kožní reakce na Aspergillus

kultivační průkaz aspergila ve sputu

přítomnost IgG a IgE proti A. fumigatus v séru

výskyt plícních infiltrátů na CT hrudníka

eozinofílie v krvi, ve sputu a v bronchoalveolární laváži

průkaz aspergilového antigenu v séru

Aspergilózy

Aspergilomu pacientů s preexistujícími dutinami v plících

aspergilom je projevem saprofytické kolonizace plicních dutin vzniklých většinou po prodělané plicní tuberkulóze, z rozpadléhotumoru (Jovresova kaverna), při invazivní plicní aspergilóze

houba do okolní tkáně neinvaduje, ani nedochází k diseminaci infekce

rentgenologický nález ukáže typický obraz vzdušné dutiny s pohyblivým kulovitým útvarem uvnitř, který je tvořen shlukem hyf, zbytků tkání, fibrinu a zánětlivých buněk

https://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/imagepages/17263.htm

Aspergilózy

Aspergilom - diagnostikarentgen nebo CT hrudníku

kultivace ze sputa je pozitivní jen v 50 % případech

přítomnost protilátek IgG proti A. fumigatus

http://www.nature.com/pr/journal/v65/n5-2/fig_tab/pr2009120f1.html

AspergilózyInvazivní aspergilóza (IA)

k infekci dochází aspirací konidií ze vzduchu

plicní (80-90%) nebo sinonazální infekce vyskytující se téměř výhradně u imunosuprimovaných jedinců

podle invaze do plicních struktur se rozlišují 3 typy plicní aspergilózy– bronchoinvazivní aspergilóza, angioinvazivní aspergilóza a nekrotizující aspergilóza

u 10 – 20% případů infekce diseminují do CNS, kůže či jiných lokalit klinickými příznaky plicní IA je neustupující horečka i přes léčbu ATB, kašel, bolest na hrudi, dušnostpři invazivní sinonazální aspergilóze dominují příznaky: horečka, kašel, bolest hlavy, výtok z nosu, lokální bolest, bolest v krkupři šíření infekce krevním řečištěm dosahuje mortalita 50 – 100%

Aspergilózy

Invazivní aspergilóza (IA)

konidie pronikají do alveolů, kde v závislosti na stavu hostitele postupně vyrůstají ve formě hyfových vláken

růst mycelia má 3 fáze:

1. fáze logaritmického růstu - bohatá látková výměna spojená s tvorbou organických substrátů nutných k výstavbě myceliální stěny. Je podmíněna dostatkem živin a hlavně glukózy v okolní tkáni. V této fázi může být uvolňován galaktomanan, který pak detekujeme v materiálu z dolních dýchacích cest nebo v séru.

2. fáze stacionární - po vyčerpání zdrojů glukózy

3. fáze - lýza a destrukce hyf

Aspergilózy

Invazivní aspergilóza (IA)

Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus

vzácně pak Aspergillus clavatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae

Diagnostika IFD (invazivní mykotická onemocnění)

Podle mezinárodních kritérií jsou IFD děleny :

prokázané

pravděpodobné

možné

AspergilózyDiagnostika IFD (invazivní mykotická onemocnění)

Mezinárodních kritéria:

přítomnost predispozičních faktorů(neutropenie, transplantace krvetvorných buněk , dlouhodobá léčba

kortikosteroidy)

klinické projevy onemocnění

(dušnost, radiologický nález plicních infiltrátů)

průkaz mykózy pomocí mikrobiologických technik

(přímá mikroskopie, kultivace klinického materiálu, detekce antigenů, histologický průkaz mykotických vláken ve tkáni)

nestandardizované postupy – panfungální PCR, specifická PCR v reálném čase

AspergilózyInvazivní aspergilóza (IA)Prokázaná invazivní aspergilóza

histo/cytopatologický průkaz vláken získané aspirací tenkou jehlou nebo z bioptického vzorku tkáně s průkazným vztahem (mikroskopicky nebo nesporně zobrazovací technikou) k poškozené tkáni nebopozitivní kultivace ze vzorku získaného sterilním odběrem z normálněsterilního místa (s výjimkou vzorků moči a sliznic), které klinicky nebo radiologicky odpovídá místu infekce

Pravděpodobná invazivní aspergilózapřítomnost alespoň jednoho z rizikových faktorů hostitele a jednoho mikrobiologického kritéria a jednoho velkého (nebo dvou malých) klinických kritérií s klinickými projevy místa (orgánu) odpovídajícími infekci

Možná invazivní aspergilózapřítomnost alespoň jednoho z rizikových faktorů hostitele a buď jeden mikrobiologický faktor nebo jeden velký klinický faktor (nebo dva malé) odpovídající infekci

Aspergilózy

Mikrobiologické faktory (IA)

pozitivní kultivace nebo mikroskopický průkaz Aspergillus spp. ze sputa nebo BAL

pozitivní kultivace nebo mikroskopický průkaz Aspergillus spp. z aspirátu ze sinusů

pozitivní antigen – galaktomanan – v BAL, likvoru, krvi (v krvi minimálně ze dvou po sobě jdoucích odběrů)

AspergilózyKlinický materiál pro mykologické vyšetření (IA)

za ideální se považují vzorky odebrané přímo z podezřelého ložiska invazivními technikami (biopticky, endoskopicky, peroperačně) v případě, že nemáme tuto možnost, snažíme se odebrat materiál z postižené lokality, např. BAL při postižení plic, výplach z dutin, mok při ložiskovém postižením CNStechnika odběru by měla maximálně omezit možnost kontaminace vzorkupři malém množství získaného materiálu nebo hrozí-li vyschnutí, je vhodnější odebírat přímo do tekutého kultivačního media nebo sterilního fyziologického roztokuvzorky dodáme do laboratoře co nejrychleji, v případě nutnosti uchováváme při 4 °C, materiál odebraný do kultivačních mediíuchováváme při pokojové teplotě

Aspergilózy

Diagnostika IAMikroskopické metody:

- septované hyfy s charakteristickým dichotomickým větvením

hystologický průkaz (PAS, stříbření dle Grocotta, barvení HE)

nativní preparát

barvení podle Grama

http://www.prolekare.cz/pdf?ida=vl_07_13_01.pdf#page=25&zoom=auto,-265,41

Aspergilózy

aspergilóza plic

Aspergilózy

aspergilóza plic, Grocottovo barvení

AspergilózyHyfy mikroskopických hub při fluorescenčním vyšetření pomocí Rylux BSU v KOH

Detekce v bioptickém materiálu do 20 – 30 minut

AspergilózyDiagnostika IAKultivace klinického materiálu :

kultivační průkaz ze sterilních tkání získaných biopsií,bronchoalveolární laváže, pleurálního výpotku, hemokultury

kultivace na Sabouraudově glukózovém agaru při 30 – 37 °C, následná identifikace na diagnostických médiích

nejdříve můžeme očekávat narostlé kolonie aspergilů za 24–48 hod u druhu Aspergillus fumigatus nebo Aspergillus flavus

http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina-priloha/prakticke-zkusenosti-z-mykologicke-laboratore-nazorny-appendix-455848

Růst A. fumigatus na SGA po 48 h při 37 °C (sputum)

Postup zpracování sputa v mykologické laboratoři

http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina-priloha/prakticke-zkusenosti-z-mykologicke-laboratore-nazorny-appendix-455848

AspergilózyDiagnostika IA

kultivační vyšetření má vysokou specifitu (92 %) v případěpozitivního nálezu, ale nízkou senzitivitu (50 % a méně) ve srovnánís dalšími metodami

Interpretace nálezuvýznamný je nález oportunních patogenů z prim árně sterilních lokalit (krev, mozkomíšní mok, bioptické tkáně)při izolaci z materiálů, jako je sputum nebo i sekret z dolních dýchacích cest (DDC), musí být nález interpretován s velkouopatrností

Aspergilózy

Diagnostika IA

Nekultiva ční diagnostické metodymetody sérologické – využívající detekci antigenů, protilátek nebo metabolitů aspergilových kmenůmetody molekulárně genetické – detekující nukleové kyselinyaspergilů

Aspergilózy

Detekce galaktomananuzástupci rodu Aspergillus uvolňují při svém růstu do okolí exoantigeny, které mohou být detekovány v tělesných tekutinách

jedním z těchto exoantigenů je termostabilní heteropolysacharid, který je součástí buněčné stěny houby – galaktomanan (GM)na zvířecích modelech byla prokázána korelace mezi mykotickounáloží ve tkáních a množstvím detekovatelného GM v sérufaktory ovlivňující množství GM: fáze růstu hyf, mikroprostředí, ve kterém probíhá infekce, imunitní stav jedince, stav funkce ledvin a antimykotická léčbapravidelný a rutinní monitoring GM umožňuje zkrátit časový interval do stanovení diagnózy IA

Aspergilózy

Detekce galaktomananu

pro jeho detekci je možno použít latexovou aglutinaci a zejména sendvičovou ELISumetody se liší detekčním limitem i senzitivitoukomerčního užití – latexová aglutinace (Pastorex Aspergillus, BioRad, Francie) a sendvičová ELISA (Platelia Aspergillus, BioRad, Francie)

oba komerční sety využívají při detekci vazbu antigenu s králičímonoklonální protilátkou EB-A2

Aspergilózy

Detekce galaktomananu

ELISA – vyšší citlivost, výsledek je udáván jako index pozitivity(IP) – tj. poměr mezi optickou denzitou testovaného vzorku a optickou denzitou kontrolního séra obsahujícího přibližně 1 ngGM/mlpozitivní se označuje vzorek s IP > 0,5pozitivní pacient je nemocný s více než 2 po sob ě jdoucími pozitivními odb ěrytest je primárně určen pro detekci GM v séru, ale lze ho použít k detekci GM i v jiných tělesných tekutinách ev. v tkáních

Aspergilózy

součástí buněčné stěny většiny hub

glukan se vylučuje o něco později než galaktomanan a jeho koncentrace je nižší

pro laboratorní diagnostiku se využívá schopnosti glukanu reagovat s lyzátem amébocytů ostrorepa

Komerční kity:

Fungitell TM (USA), cutt-off 80 pg/ml, kolorimetrická

Fungitec G TM (Japonsko), cutt-off 20 pg/ml, kolorimetrickáWako WB003 (Japonsko), cutt-off 11 pg/ml, turbidimetrická

Cut-off je hodnota tzv.cut-off indexu pozitivity (cut-off IP), tedy hodnota indexu pozitivity, od které je vzorek označen jako pozitivní a ovlivňuje senzitivitu testu

http://thomuv.blog.cz/galerie/nezarazene-vylety-akce-atd/zoo-olomouc-7-3-2010/obrazek/62594795

Detekce 1,3-ß-D glukanu

AspergilózyDetekce 1,3-ß-D glukanu

Výhodypozitivita v časných stadiích invaze houby široké spektrum patogenů, které lze detekovat (i nevýhoda)umožňuje monitorovat status infekce a léčebnou odpověď

Nevýhodyvysoká cenalaboratorní náročnost falešné pozitivity (např. laboratorní kontaminace) falešné negativity (malé množství materiálu vstupujícího do reakce (5 µl), vysoká koncentrace bilirubinu)

Využití v diagnosticeverifikaci infekcí vzácnými mykotickými agenskonfirmace falešných pozitivit GM

http://procproto.cz/priroda-2/prirodni-unikat-zivocich-s-modrou-krvi/

Aspergilózy

Identifikace druhů rodu Aspergilluspolyfázická taxonomie: http://www.mycobank.org/

makroskopická a mikroskopická morfologie

sledování produkce sekundárních metabolitů

molekulární genetika

Aspergilózy

Identifikace druhů rodu AspergillusMolekulárně genetické metody

panfungální PCR

specifická PCR v reálném čase – kvantifikace fungální nálože

identifikace do rodu a druhu – části genu pro rRNA (18S, 5,8S a 28S) nebo sekvence mezerníků (ITS)

pro sledování genetické příbuznosti druhů je u aspergilů nutná sekvenční analýza dalších lokusů


Aspergilózy

Identifikace druhů rodu AspergillusVnitrodruhová typizace aspergilů

PCR-RFLP s následnou sekvenční analýzou genu pro ß-tubulin (benA) či genu rodlet A (rodA) - pro rozlišení druhů fenotypicky podobných A. fumigatus

multilokusová sekvenční typizace (MLST) – sekvenování fragmentů „referenčních“ genů – využívána pro rutinní typizaci umožňující mezinárodní srovnávání izolátů

https://www.researchgate.net/publication/227879416_Molecular_typing_of_Aspergillus_species

Aspergillus – makroskopické znakyrychle rostoucí, plně vybarvené kolonie do pěti dnů

kolonie bohatě pigmentované (v odstínech žluté, žlutozelené, zelené, zelenomodré, hnědé a černošedé)

pigmentace je výrazná na Czapek-Doxově agaru (CZ)

kolonie se hodnotí na standardních živných médiích: Czapkův agar s kvasničným extraktem (CYA), agar se sladovým extraktem (MEA), CZ při standardní kultivační teplotě: 25°C, 37°C

Makroskopické znaky:rychlost růstu

zbarvení kolonií, spodní strany koloniípovrchová struktura kolonií

velikost kolonií po 7, 10, 14 dnech

vzhled konidiální hlavice pod binokulární lupou

http://samatoros.blogspot.cz/2008/03/plsn-aneb-co-mi-to-proboha-vyrostlo-na.html

Aspergillus – makroskopické znaky

https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-aspergillus.pdf

Aspergillus – mikroskopické znaky

Nativní preparát: vlákna hub se špatně smáčejí a v preparátu často bývajívzduchové bubliny, je lépe použít místo vody 10 až 20% vodný roztok glycerolu, který nevysychá tak rychle. Místo glycerolu lze použít i roztok laktofenolu nebo kyselinu mléčnou.

Mikrokultura:

http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1665-27382011000200007http://webserver.pa-ucl.com/wwwdocs/micro/microbiology.htm


Nepohlavní stádium

konidiofor vyrůstá přímo ze substrátu nebo ze vzdušných hyf

měchýřek (kolumelu)

fialidy (konidiogenní buňky) v jedné nebo ve dvou řadách nad sebou(uniseriátní a biseriátní)

konidiální hlavice - měchýřek s fialidami a řetězci konidií

tlustostěnné buňky zvané „Hülle cells“

KonidiogenezeENTEROBLASTICKÁ PHIALIDICKÁ KONIDIOGENEZE

konidiogenní buňka - fialida

KonidiogenezeENTEROBLASTICKÁ PHIALIDICKÁ KONIDIOGENEZE

schizolytický způsob oddělování konidií od konidiogenní buňky - při odštěpení konidie vnější stěna puká, vnitřní se vchlipuje až na malý

pór, který při oddělení zacpou Woroninova tělíska

tvorba límečku


Pohlavní stádiumtvorba drobných plodnic (menších než 1 mm) typu kleistotheciumteleomorfa Eurotium, Emericella, Neosartorya

http://www.uoguelph.ca/~gbarron/Misc2009/eurotial.htm

Kleistotheciumuzavřená plodnice s vytvořenou stěnou, otvírá se rozpadem; vřecka nejsou nijak uspořádána

vřecka

http://ziva.avcr.cz/2012-5/houby-v-nasich-domacnostech-aneb-o-cem-doma-vite-i-nevite.html


Aspergillus fumigatus

kontaminant potravin, oportunní patogen člověka a jiných živočichůčastý ve vlhkém, teplém prostředí (kompost, ale i zvlhčovací systémy, obytnéprostory)zodpovědný za 90% všech případů IA

termotolerantní - roste i p ři 55°Cadaptace na nedostatek kyslíku je podmínkou pro jeho přežití v zánětlivé tkáni a umožňuje šíření do jiných orgánůprodukuje mykotoxiny gliotoxin, verruculogen, fumitremorginy aj.

dvě podskupiny – ve vzduchu a ve vodě

druhy fenotypicky podobné: A. lentulus, A. viridinutans, Neosartorya fischeri, N. pseudofischeri, N. undagawae

diagnostcký znak: A. fumigatus roste při teplotě 50°C a neroste při 10°C, kdy ostatní zaměnitelné druhy rostou (výjimkou je A. viridinutans)

Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Eurotiales, Trichocomaceae, Aspergillus

Aspergillus fumigatus

kolonie rychle rostoucí při 25 i 37°C, zelené, sametové

https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-aspergillus.pdfFoto.: A. Kubátová

Aspergillus fumigatuskonidiofory uniseriátní s široce kyjovitým měchýřkemkonidiální hlavice typicky sloupcovitékonidie kulovité nebo téměř kulovité, zelené, bradavčité, 2,5-3 µm v průměru

https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-aspergillus.pdf

Foto.: A. Kubátová http://www.mycobank.org/BioloMICS.aspx?Link=T&TargetKey=14682616000002126&Rec=3660

Aspergillus flavuskolonie rychle rostoucí, žlutozelené, roste i při teplotě až 48 °C

výskyt v půdě, na potravinách (arašídy, koření, obiloviny apod.)

produkuje mykotoxin aflatoxin B1, 3-nitropropionovou kyselinu, kojovou, aspergilovou a cyklopiazonovou kyselinuz 10% původce bronchopulmonárních infekcí

https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.04_eurotiales-asp_sekce_flavi.pdfFoto.: A. Kubátová

Aspergillus flavus

konidiofory biseriátní i uniseriátní, bradavičnaté s kulovitým nebo téměřkulovitým měchýřkemkonidiální hlavice paprsčitékonidie kulovité nebo téměř kulovité, bradavčité

http://ziva.avcr.cz/2012-5/houby-v-nasich-domacnostech-aneb-o-cem-doma-vite-i-nevite.htmlFoto.: A. Kubátová

http://www.mycobank.org/BioloMICS.aspx?Table=Mycobank&Rec=58206&Fields=All

Foto.: J. Machač

Aspergillus niger

kontaminant potravin rostlinného tak i živočišného původu

produkuje naphtho-4-pyrony, malforminy a u několika kmenů byla zaznamenána produkce ochratoxinu A

z 5% původcem IA, otomykózyoptimální klíčivost konidií v acidofilním prostředí

teplotní optimu je 30°C

specifickým diagnostický znakem infekcí způsobených A. niger je přítomnost kalcium oxalátum ve form ě krystal ů v patologickém vzorku

Aspergillus niger

kolonie rychle rostoucí, černé, zrnité, často produkuje žlutý pigment do agaru


Aspergillus niger

konidiofory biseriátní, hladké s kulovitým měchýřkemkonidiální hlavice paprsčitékonidie kulovité nebo téměř kulovité, černé, nepravidelně bradavčité, 3,5-5 µm v průměru

https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-aspergillus.pdfFoto.: A. Kubátováhttp://www.mycobank.org/BioloMICS.aspx?Table=Mycobank&Rec=2506&Fields=All

Aspergillus terreus

kolonie rychle rostoucí, okrové, sametové, roste i při 37 °Cvýskyt na potravinách a v prostředí budov, bývá izolován i z půdy

původce IA se sklonem k diseminaci, sekundární kožní infekce


Aspergillus terreuskonidiofory biseriátní, hladké s téměř kulovitým měchýřkem

konidiální hlavice sloupcovité

konidie kulovité až elipsoidní, hladké,malé, 1,5 - 2,5 µm v průměru

na substrátovém myceliu se tvoří

kulovité buňky

https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-aspergillus.pdfFoto.: J. Machač

Aspergillus nidulanskolonie rychle rostoucí při 25 i 37 °C, sametové, zelenétvorba plodnic – syn. teleomorfa Emericella nidulanskontaminant potravinprodukuje mykotoxin sterigmatocystin aj. vyskytuje se vzácně, virulentnější než A. fumigatus, vyšší rezistence k některým antimykotikům

https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.01_eurotiales-teleomorfy.pdfFoto.: A. Kubátová

Aspergillus nidulans

plodnice kulovité, 100-300 µm v průměru, obalené vrstvou světle žlutých až béžových „hülle cells“vřecka kulovitá, s 8 askosporami, askospory červené, čočkovitězploštělé, hladké, se 2 obvodovými hřebínky


Aspergillus nidulans

konidiofory biseriátní, hladké, nahnědlé s kulovitým měchýřkem

konidie v řetízcích, kulovité, bradavčité


Příště:Mukormykózy

Entomoftoromykózy

5 lekarska mykologie aspergilózy - is.muni.cz · podle invaze do plicních struktur se rozlišují...

Documents