GASCROMATOGRAFIA

La tecnica cromatografica consiste nello sfruttare in modo particolarmente efficiente la diversa attitudine che ogni molecola o ione possiede nel distribuirsi tra due differenti fasi (una stazionaria e una mobile). La classificazione fondamentale dei metodi cromatografici si basa sul fatto che la fase mobile può essere un liquido (cromatografia liquida) o un gas (cromatografia gassosa o gascromatografia). Le miscele da separare possono essere costituite da gas, da liquidi o da solidi sciolti in solventi volatili; i liquidi e i solidi devono però essere vaporizzabili e, soprattutto, termostabili. La termostabilità alla temperatura di vaporizzazione è un requisito molto importante; se i composti da analizzare infatti subiscono decomposizioni termiche, si effettuerà l’analisi dei prodotti di pirolisi e non dei composti di partenza.

GASCROMATOGRAFIA

Secondo lo stato fisico della fase stazionaria, la gascromatografia si può suddividere in cromatografia gas solido (GSC) e in cromatografia gas liquido (GLC). La limitazione della gascromatografia é la necessità di rendere volatili i campioni da analizzare, per cui in alcuni casi essa è soppiantata dall’HPLC (cromatografia liquida ad alto potere risolutivo). I meccanismi di separazione relativi alla GC sono sostanzialmente due: ripartizione e adsorbimento. Il primo nel caso che la fase stazionaria sia liquida, il secondo quando e solida.

GASCROMATOGRAFO

Filters/Traps

Air

Hyd

rog

en

Ga

s C

arrie

r

Column

Data system

Syringe/Sampler

Inlets

Detectors

Regulators

H

RESET

GASCROMATOGRAFO

Sistema di alimentazione gas di trasporto (carrier) Si tratta di bombole di gas inerte (azoto, elio, argon), talvolta può essere utilizzato anche l’idrogeno. Lo scopo principale è quello di trascinare i componenti della miscela in analisi lungo la colonna cromatografica. Il gas permanente (carrier o gas di trasporto) rappresenta la fase mobile che fluisce attraverso una colonna in cui è posta la fase stazionaria.

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Iniettore o camera di iniezione L’iniettore è un dispositivo posto immediatamente prima della colonna che ha la funzione di consentire l’introduzione del campione in essa e assicurare l’istantanea vaporizzazione del campione. La sua geometria e le relative specifiche tecniche ed operative dipendono essenzialmente dal fatto che si operi con colonne impaccate o con colonne capillari.

•Per campioni liquidi o soluzioni si utilizzano apposite siringhe della capacità di 1-5 µL

(colonne impaccate) e di 1 µL (colonne capillari).

•Per campioni gassosi si utilizzano siringhe da gas, con pistoni a tenuta e iniettori a

valvola rotante con “loop” di riempimento (come nella GLC), della capacità di 10-2000

µL.ml.

Spesso si utilizzano quindi opportune tecniche (split, splitless) che consentono di far entrare effettivamente in colonna solo una parte (ad esempio ca. 1/100) del liquido iniettato. La camera di iniezione è corredata da un sistema di resistenze variabili attraverso le quali è possibile fissare la temperatura ritenuta più adatta per la vaporizzazione della miscela. L’introduzione del campione viene effettuata con una iniezione su un apposito disco di gomma al silicone, posto tra una ghiera metallica e il dispositivi di attacco alla colonna.

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Tecnica split (con divisione): il campione viene preliminarmente miscelato con il gas di trasporto. Di questa miscela solo una parte passa realmente nella colonna, mentre buona parte viene indirizzata verso la valvola regolabile di spurgo. Tecnica splitless (senza divisione): tutto il campione viene inviato direttamente in colonna.

carrier gas

campione

spurgo

GASCROMATOGRAFO

Il campione è iniettato in una camera di vaporizzazione di vetro (glass liner) nella quale

volatilizza rapidamente. Il flusso di gas è relativamente elevato e segue 3 vie: una parte (purge

line) lambisce e pulisce il setto siliconico, una parte (sample line) trasporta i vapori di

campione nella colonna e una parte (split line) trasporta i vapori di campione all’uscita del

separatore (splitter), regolato da una valvola a spillo (split valve). Il rapporto tra il flusso del

separatore (split flow) e il flusso della colonna (column flow) si chiama “rapporto di

splittaggio” (split ratio) ed è quello che, regolato dalla split valve, determina la quantità di

campione che effettivamente entra nella colonna cromatografica.

Esempi

split flow = 50 ml/min

column flow = 2 ml/min

split ratio = 2:50 = 1:25 (solo 1/25 del campione iniettato entra in colonna)

split flow = 500 ml/min column flow = 0,5 ml/min split ratio = 0,5:500 = 1:1000 (solo 1/1000 del campione iniettato entra in colonna)

GASCROMATOGRAFO Lo split mode:

• è semplice;

• è applicabile a campioni con un ampio intervallo di concentrazioni dei soluti, ma non a

bassa concentrazione;

• produce picchi normalmente di ottima forma;

• per le considerazioni precedenti è particolarmente idoneo all’analisi di miscele di soluti con

un intervallo ridotto di volatilità (“spazi di testa”), operando in condizioni isoterme e ad

elevate temperature del forno.

Lo splitless mode:

• ha maggiore sensibilità e precisione rispetto lo split mode;

• è applicabile a campioni a bassa concentrazione di soluti perché si possono

iniettare volumi elevati di campione (> 5 µl);

• è applicabile a matrici così dette “sporche”, cioè non precedentemente

purificate per via preparativa;

• è particolarmente idoneo all’analisi di miscele di soluti basso-bollenti,

cioè con tempi di ritenzione molto simili a quello del solvente, per fare in

modo che il picco del solvente sia molto stretto e non presenti asimmetria

“tailing” (scodamento).

GASCROMATOGRAFO

La disponibilità di siringhe capaci di iniettare anche frazioni di µL (0,2-0,3) ha contribuito

alla diffusione di iniettori per capillari che introducono il campione direttamente nella

colonna. Gli iniettori “on-column” non prevedono un setto, ma una valvola di

introduzione manuale (a rotazione) che accoglie l’ago della siringa in un canale dell’ago.

La valvola viene aperta prima dell’introduzione della siringa e richiusa subito dopo la sua

estrazione. La miscela di soluti entra nella glass liner con l’iniettore mantenuto a

temperatura ambiente da un flusso di aria fredda; solo successivamente si opera il

riscaldamento dell’iniettore per ottenere l’evaporazione del solvente e la vaporizzazione

dei componenti del campione, che vengono trasportati dal gas dentro la colonna. La

modalità on-column è utile nell’analisi di sostanze termolabili in soluzioni diluite, ma è

anche la modalità che non discriminando in alcun modo i soluti fornisce l’analisi

quantitativa più attendibile.

GASCROMATOGRAFO

Colonna

La colonna può essere di due tipi: impaccata o capillare.

La fase stazionaria è un liquido altobollente che riveste come film sottile una colonna di vetro

cava (colonna capillare) oppure impregna della silice e viene inserito in una colonna di vetro

o di metallo (colonna impaccata).

L’impaccata, usata nella gascromatografia classica, comporta una separazione in colonna di

acciaio o di vetro riempita di materiale inerte (supporto per la fase stazionaria) sul quale è

distribuita una pellicola sottile di liquido (fase stazionaria) continuamente attraversata da un

gas (fase mobile) detto gas di trasporto. Il processo di separazione è limitato dalla lentezza di

eluizione della molecole del campione lungo la colonna. La capillare, ormai di uso comune,

rappresenta un’importante innovazione per la sua rapidità di eluizione e per una migliore

risoluzione. Essa è molto più lunga dell’impaccata, di diametro molto minore e quindi

contiene una quantità molto minore di fase stazionaria, per cui la quantità di campione da

iniettare è molto più piccola e viene eluita prima.

GASCROMATOGRAFO

Colonna impaccata: la fase stazionaria è formata da un solido granulare poroso o da un liquido deposto su un supporto costituito da particelle inerti. La colonna è costituita da un tubo di acciaio o vetro di lunghezza da 1 a 6 metri con diametro interno di 0.75-4 mm.

Colonna capillare: la fase stazionaria viene depositata sotto forma di film sottilissimo (0.1-5µm) sulla parete interna di un capillare con diametro 0.1-0.75 mm e lungo da 15 a 100 m. Il carrier percorre il canale lasciato libero dalla fase stazionaria.

GASCROMATOGRAFO Colonne capillari: Colonne capillari aperte (Wall Coated Open Tubular, WCOT), in cui le pareti

sono ricoperte (o legate chimicamente) dalla fase stazionaria liquida; Colonne capillari aperte con rivestimento supportato (Support Coated Open

Tabular, SCOT), in cui un materiale granulare poroso molto fine, su cui è stato depositato un sottilissimo film di liquido di ripartizione, viene fatto aderire alle pareti della colonna;

Colonne capillari aperte con rivestimento poroso (Porous Layer Open Tubular, PLOT); in cui la fase stazionaria è costituita solo da particelle porose fatte aderire alle pareti.

GASCROMATOGRAFO

Vantaggi delle colonne capillari maggiore efficienza pur avendo un diametro interno minore, offrono al gas un canale di

passaggio più grande, e dunque ridotte perdite di carico. Ciò consente una lunghezza maggiore che consente di aumentare l’efficienza

Vantaggi delle colonne impaccate meno costose hanno maggiore durata consentono di usare campioni più voluminosi senza rischio di

impaccamento

GASCROMATOGRAFO

La fase stazionaria deve essere stabile termicamente, non reattiva e non volatile nell’intervallo di temperatura a cui lavora la colonna. La fase stazionaria può essere non polare o polare. Le fasi non polari separano i composti sulla base del punto di ebollizione. Le fasi polari hanno anche interazioni dipolo-dipolo di vario grado con i

composti che passano sopra

Le interazioni tra soluto e fase stazionaria sono maggiori quanto più simile è la loro polarità: sostanze che risulteranno avere una polarità simile alla fase stazionaria saranno maggiormente trattenute in colonna (tempi di ritenzione più lunghi). Un altro fattore che determina la separazione tra i soluti è la volatilità, in quanto i soluti meno volatili avranno maggiore tendenza a passare nella fase liquida (liquido di ripartizione).

GASCROMATOGRAFO

Camera termostatica Le colonne sono alloggiate in una camera termostatica, in genere a circolazione di aria calda, con questo sistema viene assicurata una buona stabilità di temperatura. Un dispositivo permette all’operatore di fissare la temperatura, la quale può essere mantenuta costante per tutta la durata dell’analisi (isoterma) oppure fatta variare (programmata). Una temperatura troppo bassa riduce i tempi di percorrenza della colonna, aumentando i tempi di analisi, tuttavia una temperatura troppo elevata determina l’accavallamento dei picchi. La scelta della temperatura della colonna è molto importante Le colonne sono termostatate in un forno a temperatura controllata. La temperatura massima raggiungibile è in genere di 400°C.

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La temperatura è cruciale nelle separazioni cromatografiche e pertanto la colonna è alloggiata in forni termostatati. L’analisi GC può essere effettuata a T costante (isoterma) o variabile (gradiente di temperatura). Le rampe di temperatura possono essere lineari o asimmetriche con diverse fasi di plateau.

GASCROMATOGRAFO

Quando sono presenti composti dalla volatilità molto diversa, una temperatura troppo alta consente una buona separazione dei componenti altobollenti ma fa uscire troppo rapidamente quelli bassobollenti, sovrapponendone i picchi.

Al contrario, una temperatura troppo bassa, determina tempi di permanenza troppo alti per i componenti altobollenti.

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Isoterma (45°C)

Isoterma (145°C)

Gradiente (da 30 a 180°C)

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Rivelatori I rivelatori (detector) GC forniscono un segnale di tipo integrale o di tipo differenziale. E’ un dispositivo posto subito dopo il termine della colonna con la funzione di indicare la presenza del componente all’uscita della colonna, e di fornire la misura della concentrazione di esso nel gas di trasporto.

RIVELATORI DIFFERENZIALI

Sono i più diffusi perché consentono la valutazione diretta della quantità di

sostanza rilevata. Sono classificati:

• rivelatori con risposta in funzione della concentrazione del soluto (TCD)

• rivelatori con risposta in funzione della massa del soluto (FID, ECD)

GASCROMATOGRAFO

Il segnale integrale produce un cromatogramma cumulativo, rappresentato da una serie di rampe a

cui corrispondono i soluti separati dalla colonna, con un ordine che corrisponde al loro ordine di

eluizione.

Il segnale differenziale produce un cromatogramma rappresentato da una serie di picchi a cui

corrispondono i soluti separati dalla colonna, con un ordine che corrisponde al loro ordine di

eluizione.

GASCROMATOGRAFO Il rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) si basa sul principio che una fiamma prodotta dal giusto rapporto combustibile (H2)/comburente (aria o O2) pirolizza le molecole organiche producendo ioni ed elettroni che possono condurre l’elettricità attraverso la fiamma. I due elettrodi collegati al circuito di misura sono l’ugello stesso della fiamma (anodo) e il cilindro metallico che lo circonda (catodo). Tra gli elettrodi è applicata una d.d.p. di circa 300 volt. Se dalla colonna arriva soltanto il carrier gas (inerte), la fiamma produce prevalentemente i radicali liberi dell’acqua:

2H2 + O2 + 2H2O 3H. + .OH + .O

Se il carrier gas trasporta dei soluti organici la fiamma provoca la loro combustione finale a CO2 e H2O, ma la pirolisi intermedia dei soluti organici forma i radicali R. e HC.. Questi ultimi reagiscono con i radicali .O presenti nella fiamma, secondo la reazione:

HC. + .O HCO+ + e-

La formazione di ioni positivi e di elettroni produce la loro migrazione rispettivamente verso il catodo e verso l’anodo, con produzione di un flusso di cariche, cioè di una corrente elettrica capace di fornire un segnale. La risposta del FID non dipende dalla concentrazione del soluto, ma dal numero di atomi di carbonio presenti nella molecola.

GASCROMATOGRAFO

CARATTERISTICHE DEL FID selettività: universale (composti organici) •stabilità: elevata • modalità: distruttiva • gas di trasporto: N2 , He • temperatura limite: < 400°C • esigenze: carrier gas puri e flusso costante

I limiti del FID sono la sua scarsa sensibilità verso i gruppi funzionali C=O, -NH2, -OH e l’impossibilità di ottenere il segnale elettrico dalle molecole che non possono essere carbonizzate (He, Ne, Ar, Kr, Xe, O2, N2, H2O, CS2, H2S, SO2, NO, N2O, NO2, NH3, CO, CO2, SiCl4, SiF4).

GASCROMATOGRAFO Il rivelatore a conducibilità termica (TCD) si basa sul principio che un gas, fluendo su un filamento riscaldato, ne abbassa la temperatura rimuovendo parte del calore. La quantità di calore rimosso dipende dal flusso e dalla conducibilità termica del gas che fluisce. In una miscela di gas, pertanto, dipende dalla conducibilità termica di ogni componente (soluti, solvente, gas di trasporto) e dalla pressione parziale di ciascuno di essi. Il corpo del TCD a doppia cella è un blocco metallico di massa ed inerzia termica elevate nel quale sono ricavate due celle. Esso è termostatato ad una temperatura di circa 50°C superiore a quella massima della colonna, in modo da evitare fenomeni di condensazione. Sia nella cella di riferimento che nella cella di misura è alloggiato un filamento di tungsteno (o di leghe tungsteno/renio) riscaldato elettricamente. Il carrier gas attraversa sia la cella di riferimento che la cella di misura, mentre l’effluente dalla colonna (carrier gas, solventi e soluti) attraversa soltanto la cella di misura. La resistenza R (in ohm) del filamento varia in funzione della temperatura

GASCROMATOGRAFO

CARATTERISTICHE DEL TCD selettività: universale •stabilità: buona •modalità: non distruttiva •gas di trasporto: He •temperatura limite: < 450°C •esigenze: flusso e temperatura costanti

L’alimentatore elettrico porta la temperatura del filamento da T0 a T1 e, al passaggio del carrier gas, che è alla temperatura T0 , si ha un trasferimento di calore per conduzione e per irraggiamento dal filamento (che ritorna a T0) alle molecole del carrier gas (che salgono a T1), ma anche per convezione tra le molecole. Il blocco metallico è costruito in modo che il filamento trasferisca il calore al gas quasi esclusivamente per conduzione (90%).

GASCROMATOGRAFO

Se il flusso di gas è costante la temperatura del filamento si porta ad un valore di equilibrio (ovviamente dipendente dal valore del flusso) e se la temperatura è costante anche la resistenza elettrica R è costante. Quando il carrier gas trasporta sul filamento un soluto volatilizzato del campione, in teoria ci potrà essere un minore o maggiore trasferimento di calore in funzione del fatto che il soluto abbia rispettivamente una minore o una maggiore conducibilità termica rispetto il carrier gas. In realtà i gas di trasporto impiegati nel TCD sono quelli a più elevata conducibilità termica (H2 e He, quest’ultimo preferito per problemi di sicurezza e di minore reattività con i soluti) in modo che la presenza di soluti produca un abbassamento della conducibilità termica del carrier gas. Questo effetto produce un aumento di temperatura del filamento che determina un aumento della sua resistenza R, ovvero una diminuzione dell’intensità I della corrente. conducibilità termica ( )

(W/cm°K)

H2 = 18,1 . 10-4 He = 15,2 . 10-4 N2 = 2,6 . 10-4

Ar = 1,8 . 10-4

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La risposta R di un rivelatore differenziale sensibile alla concentrazione del soluto è un picco

gascromatografico la cui area A è proporzionale alla concentrazione del soluto rivelato.

L’area A del picco è data dall’integrale:

GASCROMATOGRAFO Ogni sostanza in uscita dalla colonna genera un segnale che verra registrato sotto forma di 'picco'. Ogni picco e caratterizzato da: -Altezza del picco. E’ la distanza fra il massimo del picco e la sua base, misurata perpendicolarmente all’asse dei tempi. -Ampiezza del picco. E’ il segmento delimitato sulla base del picco dai punti di intersezione delle tangenti tracciate nei punti di flesso di ambedue i lati.

La successione dei vari picchi, corrispondenti alle varie sostanze in uscita dalla colonna, costituisce il 'cromatogramma'. Il cromatogramma si presenta come in figura, dove in ordinate e riportata la risposta del rivelatore e in ascisse i tempi di uscita delle varie sostanze.

GASCROMATOGRAFO

L’analisi quantitativa cromatografica è basata sulla misura delle aree dei picchi, dalle quali, dopo opportuna elaborazione, si risale alle concentrazioni percentuali dei componenti.

C

C

C

Detector Response

Retention Time

14

16

18

Peak Area (cm )

Sample Concentration (mg/ml)

2

4

6

8

10

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

2

cromatogramma curva di taratura

GASCROMATOGRAFO

cromatogramma

GASCROMATOGRAFO

cromatogramma

t = 43.956 min Area= 12933

t = 42.948 min Area= 91801

t = 42.513 min Area= 20108

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Methyl oleate

Tempo di ritenzione [min] Concentrazione [mg/mL] Area

42,958 5,0 538250

42,954 2,5 253632

42,961 1,25 74931

Methyl linoleate

Tempo di ritenzione [min] Concentrazione [mg/mL] Area

44,010 5,0 417520

43,998 2,5 209624

44,006 1,25 97192

Methyl stearate

Tempo di ritenzione [min] Concentrazione [mg/mL] Area

42,572 5,0 480579

42,552 2,5 202520

42,565 1,25 85161

Esercizio: • Costruire la retta di taratura per ciascun composto organico; • Determinare la concentrazione dei tre composti organici