4 4color-kh sv-2010
TRANSCRIPT
1
Хайдуков С.В.
Многоцветныйцитометрический анализ для
идентификации малыхпопуляций лимфоцитовпериферической крови
условно здоровых доноров.
Кудрявцев И.В., к.б.н., Хайдуков С.В., д.б.н.
Хайдуков С.В.
Иммуннаясистема
АнтителаАГ
Иммунная система
Клеточный иммунитетГуморальный иммунитет
Стволовые клетки
B клетка предшественник
Т клетка предшественник
Зрелая T-клетка
Зрелая В-клетка
АГ
Макрофаг
Представление АГ
Интерлейкины
Интерлейкины
T хелперT регуляторныйT цитотоксический
B-клетки памяти
Плазматическая клетка
Активация B-клеток
Стимуляция Т клетокЛимфокины
Супрессия Супрессия
Стимуляция
АГ-зависимый
Т-клетки памяти
2
Хайдуков С.В.
Анализ лимфоцитовпериферической крови
Эозинофил
Лимфоцит
Моноцит
Нейтрофил
Тромбоциты
Базофил
Эритроцит
Хайдуков С.В.
Околосуточные ритмыФизический или физиологический стрессВывод: взятие крови проводить утром инатощакХранение образцаПодготовка образца т.е. при выделениеклеток на FICOLL возможны потери
Проблемы при иммунофенотипировании
3
Хайдуков С.В.
АнтикоагулянтWBC/ Дифференциальный счет K3EDTA, 1,5 +/-
0,15 мг/мл кровиИммунофенотипирование K3EDTA, Heparin
Анализ образцаWBC/Дифференциальный счет < 20 ч
Иммунофенотипирование < 30 ч
ВзятиеВзятие кровикрови длядля анализаанализа
Хайдуков С.В.
Хранение образца
Комнатная температура (18-22°C)> 37°C разрушение клеток< 22°C снижение T хелперов
Проверьте качество образцаТемпература? Гемолиз? Агрегация?
4
Хайдуков С.В.
Готовые для анализа 3-, 4- или 5-цветныенаборы антител
Панель реагентов только от одногопоставщика
Эпитопная специфичностьСоотношение белок/флуорохромПостоянная концентрация белкаОптимальная концентрация (соотношение сигнал/шум)
Подготовка образца дляанализа
Хайдуков С.В.
WBC - Автоматический дифференциальный счетМетод цельной крови/без отмывкиПрямая иммунофлуоресценция3, 4 или 5-цветный анализ10.000 - 30.000 клетокВключение контроля качества
Проверка воспроизводимостиПроверка чистоты анализаПроверка контрольных сумм
Подготовка образца и анализ
5
Хайдуков С.В.
Абсолютный счет - проблемы
Изменчивость WBC счета 2-17 %%
Изменчивость счета лимфоцитовАвтоматическое определение 2-5 %%Ручное определение 12-27 % %
⇒ Решение – абсолютный счет сиспользованием проточной цитометрии водноплатформенной системе
Хайдуков С.В.
Необходимо для стандартизациианализа иммунофенотипа пациента.
Стандартная настройка проточногоцитометра и протоколов анализа.
Стандартный набор анализируемыхмаркеров (допускается расширение панелимоноклональных антител для более полнойхарактеристики исследуемого образца).
Стандартный анализ с использованиемконтроля качества и контрольных сумм.
6
Хайдуков С.В.
Алгоритм оптимизации настройкипроточных цитометров и протоколованализа для стандартизации метода..
FL1FL1FL
2FL
2
1. Оптимизация установки дискриминатор: Оптимальное значениедискриминатора.2. Оптимизация установки и настройка каналов светорассеяния:Оптимальное размещение на гистограмме всех основных популяцийлейкоцитов периферической крови.3. Оптимизация установки и настройки каналов флуоресценции: Оптимальное напряжения на фотоэлектронных умножителях (негативныеклетки должны находиться в первой декаде гистограммы)4. Оптимизация установки и настройка компенсаций междуканалами флуоресценции: Первое и второе правило компенсации. . Взаимосвязь между усилением напряжения на ФЭУ и компенсацией. Взаимосвязь между плотностью экспрессии маркеров и компенсацией.
Хайдуков С.В.
Второе логическоеограничение В
Алгоритм выбора зоны анализа лимфоцитов прииспользовании логических ограничений по CD45 и
морфологическим параметрам.Последовательное внесение логических ограничений в
морфологическую гистограмму I.Выделение зоны
лимфоцитов по CD45
Анализ клеток одновременнопопадающих в зоны А и В
Лимфоциты CD45bright
дуплеты
разрушенныеклетки
Первое логическоеограничение А
7
Хайдуков С.В.
FITC PE ECD (или APC) PC5 (или PerCP)
1. IgG IgG IgG CD45изотипический контроль
2. CD19 CD5 CD27 CD45В1, В2, В-клетки памяти
3. CD16 CD56 CD3 CD45T-NK-клетки и субпопуляции NK-клеток
4. CD8 CD4 CD3 CD45субпопуляции Т-клеток
5. CD4 CD25 HLA-DR CD45активированные Т хелперы
7. CD45RA CD45RO CD4 CD45наивные и активированные Т хелперы, Т-клетки памяти
8. TcR-αβ TcR-γδ CD3 CD45αβ- и γδ-Т-клетки
9. CD4 CD25 CD127 CD45регуляторные Т-клетки
Четырехцветная панель моноклональныхантител для определения иммунного статуса
Опубликовано в: Хайдуков С.В., и др. Российский Иммунологический Журнал, 2007, 1(10), 3-4, С. 20–30.Хайдуков С.В., и др. Российский Иммунологический Журнал, 2008, 2(11), 1, С. 20–30.Хайдуков С.В., и др. Медицинская иммунология, 2008, 10(2-3), C. 113-121Хайдуков С.В., и др. Мед. иммунол., 2009 Т. 11, № 2-3, стр. 227-238
Хайдуков С.В.
В-клетки
Аутореактивныйклон В клеток
CD20 может экспрессироваться внизкой плотности на Т клетках(Leandro MJ, at al., Arthritis Rheum. 2006 Sep;54(2):3062-3; Katopodis O, at al., Br J Haematol. 2003 Feb;120(3):478-81; )
CD5 на Т клетках
В-клетки
8
Хайдуков С.В.
Анализ В-клетокВ-2 (CD19+CD5-)
CD19/CD5/CD27/CD45
В-клетки памяти(CD19+CD27+CD5-)
В-1 – аутореактивныйклон (CD19+CD5+)
Хайдуков С.В.
Наивные В-клетки
≥80%
60%
СиндромШегрена
Системнаякраснаяволчанка
Норма
Плотность экспрессии CD27
В-клеткипамяти
В-клетки памяти
Анализ В-клеток - В-клетки памятиCD19/CD5/CD27/CD45
9
Хайдуков С.В.
CD19/CD5/CD27/CD45
Анализ В-клеток – B-1
Пример: Аутоиммунный тиреоидит
До терапии В процессе терапии Норма
В-1 клетки (CD19+CD5+)
Хайдуков С.В.
++++++++++++++
+++++++++++++
+?
1.Системная красная волчанка (СКВ)2.Синдром Шегрена3.Ревматоидный артрит4.Инсулин-зависимый диабет5.Аутоиммунный тиреоидит6.Миастения7.Неспецифический язвенный колит8.Аутоиммунные поражения при инфекционныхзаболеваниях (хламидиоз, синдром Рейтера, бруцеллез и др.)9.Другие заболевания, имеющие в своей основеаутоиммунные механизмы
Повышениеотносительного
уровня В1 клеток
Заболевание
Заболевания, при которых определениеотносительного уровня В-1 клетокявляется диагностически значимым.
10
Хайдуков С.В.
Анализ по зоне CD45T-NK клетки
NK-клетки
Анализ NK-клеток
1 - CD16dim-to-negCD56bright - секретируют IFN-γ и другие цитокины, имеют меньшую цитолитическую активность.
2 - CD16brightCD56dim - слабо секретируют цитокины, но обладаютвысокой цитолитической активностью.
CD16/CD56/CD3/CD45
Хайдуков С.В.
АктивированныеNK клеткиАктивированныецитотоксическиеТ клеткиПокоящиеся CD8 позитивные Тклетки
CD8/CD38/CD3/CD45
CD16+CD56+CD8dim
CD16+CD56+CD8-
CD16-CD56-CD8bright
11
Хайдуков С.В.
NK-клетки Анализ по зоне B
Анализ по зоне D
CD8/CD38/CD3/CD45
Анализ по зоне С
Хайдуков С.В.
Постоянно низкие активность и количество NK-клетокАссоциированные симптомы и рискиПатологическое состояние
Высокий риск возникновения онкологии идостаточно частые инфекционные заболевания.Повышенный риск образования лимфом.Увеличенная восприимчивость к вирусным
инфекциям.Распространение метастазов.Вероятность появления злокачественного обра-
зования выше нормального.Предшествует рецидиву.Повышенная чувствительность к вирусу Эпштейна-
Бар.Неблагоприятный прогноз.Неблагоприятный прогноз.Более высокая вероятность рецидива.Более высокая частота, серьезность и продолжи-
тельность заболевания.Более высокая частота, серьезность, и продол-
жительность заболевания.Возможно более активное течение болезни, уве-
личенная частота инфекций.
Усталость, сниженная восприимчивость, лихорадка.Повышенная утомляемость, апатичность,
увеличенная частота вирусных заболеваний.Более серьезные признаки.Неспособность справляться с ежедневными
проблемами, усталость .
Приобретенный или врожденныйиммунодефицит включая СПИД.Синдром Чедиака-Хигасси.Дефицит CD11/CD18 молекул
семейства клеточной адгезии.Онкологические заболеванияОнкологические заболевания
связанные с наследственностью.Лейкемия.Х-связанный лимфопролифератив-
ный синдром.Рак молочной железы (при диагнозе).Рак шеи и головы (до терапии).Терапия цитостатиками.Вирусная инфекция (цитомегало-
вирус, Эпштейна-Бар, герпес).Другие вирусные и бактериальные
инфекции.Аутоиммунные заболевания.
Психические расстройстваСиндром дефицита NK-клеток.
Синдром хронической усталости.
Депрессия.Хронический стресс.
По Whiteside et al., 1994
12
Хайдуков С.В.
Ассоциированные симптомы ирискиПатологическое состояние
LGL-лимфоцитоз, цитопения, спленомегалия
Встречается совместно с активнойлейкемией/лимфомой
Лимфопролиферация NK-клеток
Хроническая пролиферация большихгранулярных лимфоцитов (LGL-пролиферация
Острая пролиферация большихгранулярных лимфоцитов (LGL-пролиферация
Постоянно высокие активность иколичество NK-клеток
По Whiteside et al., 1994
Хайдуков С.В.
Т-клетки хелперы
Цитотоксические Т-клетки
CD4+CD8+ Т-клетки(вышедшие из тимусанедифференцированныеТ-клетки)
Анализ Т-клеток
Экспрессия CD8 на NK-клетках
CD8/CD4/CD3/CD45
13
Хайдуков С.В.
Т-клетки памяти. активированные Т-клетки, Treg и T17
Наивные Т клетки
CD45RA/CD45RO/CD4/CD45
Анализ Т-клеток
Хайдуков С.В.
CD45RA/CD45RO/CD4/CD45
Анализ по CD4+ и CD45+Анализ только по CD45+
Анализ Т-клеток
14
Хайдуков С.В.
?
CD8/CD4/CD3/CD45
Опубликовано в: Хайдуков С.В., и др. Мед. иммунол., 2008, 10(2-3), C. 113-121
Анализ Т-клеток
Хайдуков С.В.
TcR-αβ/TcR-γδ/CD3/CD45
Анализ Т-клеток
CD3+CD8brightTcR-αβ+ Т-клетки
CD3highCD8dimTcR-γδ+ Т-клетки
15
Хайдуков С.В.
Вирусные инфекции:ВИЧЦитомегаловирусВирус Эпштейн-БараБактериальные инфекции:Туберкулез легкихMycobacteriumЛегионеллез LegionellaТуляримия Francisella tularensisСальмонеллез SalmonellaБоррелиоз (болезнь Лайма) BorelliaАтопический дерматит (у детей)Болезнь КронаБолезнь БехчетаПервичные иммунодефицитыАтопический дерматит (у взрослых)Возрастное снижение относительногоуровня γδ-T-клеток
Повышение относительногоуровня γδ-T-клеток
Понижение относительногоуровня γδ-T-клеток
ЗаболеваниеИзменение относительногоколичества γδ-T-клеток
Изменения относительного количества γδ-T-клеток приразличных заболеваниях и патологиях.
Хайдуков С.В.
Активированные Т-клетки(ранняя активация)
Активированные Т-клетки(поздняя активация)
Анализ активированных T-клеток
16
Хайдуков С.В.
Анализ активированных Tхелперов и цитотоксических
T-клеток
Поздняяактивация
Анализ по зоне B
Активированные
Ранняяактивация
Регуляторные Т-клетки
CD4/CD25/HLA-DR/CD45
Хайдуков С.В.
РегуляторныеТ-клетки
Анализ по зоне CD3+CD4+
Анализ по зоне CD3+CD4+Анализ по зонелимфоцитов
Анализ регуляторных Т-клетокCD4/CD25/CD127/CD45
Идентификация Treg - CD3+CD4+CD25brightCD127neg
17
Хайдуков С.В.
Инверсия соотношения T4/T8 - интерпретация
Острая вирусная инфекцияХроническая вирусная инфекцияГематологические нарушенияПервичные иммунодефицитыАутоиммунные заболеванияСолидные опухоли
Хайдуков С.В.
Интервалы распределения фенотипов лимфоцитовусловно здоровых доноров (n = 362)
Тип клеток % ПК Абс.к-во кл/лЛимфоциты (CD45bright) 28 - 36 1,363-2,808 х 109
В-клетки (CD3-CD19+HLA-DR+) 7 - 17 0,111-0,376 х 109
В-1 клетки (CD19+CD5+) 0,5 - 2,1 0,022-0,115 х 109
В-2 клетки (CD19+CD5-) 6,5 - 14,9 0,081-0,323 х 109
В клетки памяти (CD19+CD5-CD27+) 1,8 - 6,8 0,012-0,040 х 109
NK (LGL) (CD3-CD16+CD56+CD8+) 8 - 17 0,123-0,369 х 109
NK цитолитические (от общих NK-клеток) 2,5 - 6,2 0,003 - 0,022 х 109
NK цитокин-продуцирующие (от общих NK-клеток) 93,7 - 97,5 0,081-0,323 х 109
Т-клетки (CD3+CD19-) 61 - 85 0,946-2,079 х 109
Т хелперы (CD3+CD4+) 35 - 55 0,576-1,336 х 109
Т цитотоксические (CD3+CD8+) 19 - 35 0,372-0,974 х 109
Т хелперы активированные/памяти (CD4+CD45R0+) 5 - 25 0,068-0,702 х 109
Т хелперы наивные (CD4+CD45RА+) 20 - 40 0,272-1,123 х 109
αβ-Т клетки (CD3+αβ-ТсR+γδ-ТcR-) 60,8 - 80,2 0,924-1,964 х 109
γδ-Т клетки (CD3+γδ-ТcR+αβ-ТсR- ) 1,8 - 7,4 0,022-0,115 х 109
Т-NK клетки (CD16+CD56+CD3+) 0,5 - 6 0,007-0,165 х 109
Т клетки актив. (HLA-DR+CD25+) 0,5 - 6 0,007-0,165 х 109
Регуляторные Т-клетки (CD4+CD25brightCD127neg) 0,6 - 3,19 0,009-0,078 х 109
Индекс соотношения (Тх/Тц) 1,5 - 2,6
Опубликовано в: Хайдуков С.В., и др. Мед. иммунол., 2009, Т. 11, № 2-3, стр. 227-238
18
Хайдуков С.В.
EPICS® XL-MCL
Cytomics® FC500
Хайдуков С.В.
19
Хайдуков С.В.
СПАСИБО ЗАВНИМАНИЕ