MINISTERIO PBLICO DE LA NACIN

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES FORENSES LABORATORIO DE GENETICA FORENSE

PNT N 10

Aislamiento de ADN a partir de huesos por el mtodo

fenol-cloroformo Microcon 100

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Objetivos:

Extraccin y aislamiento de ADN a partir de huesos. Muestras:

Huesos. Tcnica:

Mtodo de extraccin de ADN con fenol-cloroformo. Fundamento:

Este mtodo se fundamenta en la rotura de las membranas celulares por accin de la proteinasa K y purificacin del ADN libre mediante una mezcla de fenol-cloroformo (fase orgnica) que elimina los lpidos y gran parte de las protenas desnaturalizadas, encontrndose el ADN soluble en la fase acuosa y su posterior concentracin en unos filtros que permiten el paso de molculas de tamao menor al ADN.

Equipos:

Microcentrfuga

Freezer Mill.

Urna de metacrilato.

Minitaladro tipo DREMEL.

Campana de extraccin.

Bao Mara.

Vortex

Nanofuga. Realizado por: Firma: Fecha:

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PNT N 10

Aislamiento de ADN a partir de huesos por el

mtodo fenol-cloroformo

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Reactivos:

Buffer de extraccin.

Proteinasa K

Nitrgeno lquido.

Mezcla: Fenol-cloroformo-alcohol isoamlico.

Material de laboratorio:

Tubos de 1,5 ml de capacidad

Tubos Falcon de 15 ml de capacidad

Cepillo.

Micropipetas de 1000 ul, 200 ul y 20 ul.

Puntillas con filtro para 1000 ul, 200 ul y 20 ul.

Procedimiento:

1. Seleccionar la pieza sea a analizar. 2. Limpiar la superficie del hueso con un minitaladro tipo Dremel. 3. Pulverizar el diente o hueso con el equipo Freezer Mill, en presencia de

nitrgeno lquido. 4. Al pulverizado aadir 300 ul de Buffer y 20 ul de proteinasa K. 5. Llevar a incubacin por 18 a 24 horas a 56 C. 6. Aadir 600 ul de fenol-cloroformo-alcohol isoamlico. 7. Centrifugar a mxima velocidad por 3 minutos. 8. Trasvasar la fase superior (acuosa) a un nuevo tubo Microcon 100 de 1,5

ml. Previamente a este colocar 100 ul de agua estril. 9. Centrifugar a 2500 r.p.m. durante 25 minutos. 10. Aadir 200 ul de agua estril y centrifugar a 2500 r.p.m. por 20 minutos. 11. Aadir 100 ul de agua estril para recuperar.

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Aislamiento de ADN a partir de huesos por el

mtodo fenol-cloroformo

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12. Volcar el filtro sobre un nuevo tubo de 1,5 ml. 13. Centrifugar a 3500 r.p.m. por 5 minutos. 14. Quitar y desechar el filtro, dejando el lquido en el tubo donde se encuentra el

ADN. 15. Si no se va a procesar en ese momento guardar al refrigerador a 4 C a

20 C. 16. Cuantificar el ADN por electroforsis en gel de agarosa

Resultado:

P.N.T. N 11. Bibliografa:

Protocolos de trabajo, Laboratorio de Identificacin Gentica, Departamento de Medicina Legal y Toxicologa, Universidad de Granada Espaa. Luque Cabrera Jos, Fernndez Snchez ngel. Biologa Molecular e Ingeniera Gentica. Conceptos, Tcnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud. 1ed. 2001. Harcourt. S.A.

Begoa Jarreta, Fabricio Gonzles, Tcnicas instrumentales en Gentica Forense. 1 ed; 2001. Fernando el Catlico.

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