22/11/16 transgenia na agropecuária - uspusp.br/gmab/discip/zab1304/aula11.pdf · • vegetais...
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TRANSGÊNICOS NA AGROPECUÁRIA
M.V.Dra.FabianaFernandesBressanFZEA/USP2016
Novasbiotecnologiasdareprodução,aplicaçõesbiomédicaseagropecuárias
Transgenia na agropecuária • Animais transgênicos
• Tecnologia do DNA recombinante • Metodologias/técnicas de produção de animais
transgênicos • Estudos na FZEA/ USP • Prós e contras
• Vegetais transgênicos • Foco na alimentação animal
DNA
Animais ou vegetais transgênicos
Organismos diferenciados
Produtos farmacêuticos Informação
vetor
Engenharia genética
Aspectos positivos Aspectos negativos
- Transgenia - Tecnologia transgênica
DNA recombinante • 1972/1973 – Universidade de Stanford • 1a utilização da tecnologia: insulina humana pelas empresas
Genentech e Eli Lilly (1982).
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DNA recombinante • Fármacos e vacinas
• Insulina, fator de coagulação, hormônio de crescimento, vacinas de raiva e hepatite, etc…
• Bactérias e células animais - biorreatores
Animais transgênicos • 1982��Palmiteretal.
• microinjeçãodeDNAexógenoempronúcleosdezigotos
• Camundongos
• 1985��Hammeretal.• microinjeçãodeDNAexógenoempronúcleosdezigotos
• ovinos,suínosecoelhos
1) Produtos farmacológicos (animais biorreatores)
Por que produzir animais transgênicos? Animais biorreatores • Produção de proteínas ativas biologicamente humanas:
hormônios, enzimas, imunomoduladores, anticorpos, etc. • Microorganismos (bactérias): incapazes de modificações pós-traducionais em proteínas eucarióticas complexas.
• Células animais: caro! (1 biorreator = U$100 milhões) e manutenção instável.
¡ Ovelhas transgênicas para ofator IX de coagulação(SCHNIEKEetal.,1997).
Polly (Fator IX de coagulação)
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Pampa Mansa (hGH)
Portenha (BST)
Patagônia (pró-insulina humana)
Alfa-1-antitripsina
Vantagens da produção de proteínas recombinantes no leite
• Fácil/seguro de purificar • Sangue de doadores: pouca quantidade e risco de doenças.
• Grandes quantidades • Fonte renovável
• Promotores específicos de glândula mamária • β-caseína
BioSteelTM goat
• Nexia Biotechnologies • No mínimo 6 vezes mais resistente que o aço. • Pode esticar 20 x. • Resistente a temperaturas extremas: -20 – 330oC. • Não reconhecido pelo sistema imune.
• 40 animais
Webster e Pete – �silk milk�
- Armadura p/ exército (a prova de balas) - Fios de sutura - Linha de pesca - Tendões e ligamentos artificiais
Nephila clavipes “aranha da teia dourada”
Factor VIII de coagulação humano
120 g 2 vacas 10 - 25 ovelhas
Alfa - 1 - antitripsina 5.000 kg 33.000 ovelhas 42.000 cabras
Factor IX de coagulação humano
2 kg 13 ovelhas 22 suínos
Albumina sérica 1000 kg 300 vacas 8.300 cabras
Requerimentos mundiais de proteínas humanas e número de animais transgênicos necessários
Insulina: 25 vacas supre a necessidade da Argentina, que possui 1,5 milhões de diabéticos
São necessários poucos animais biorreatores!
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ATryn – 1º remédio vindo de transgênico
• 3L /dia
• 3 Kg de proteína
purificada /ano
• Aprovado pelo FDA
• Antitrombina recombinante humana
(profilaxia do tromboembolismo)
• GTC Biotherapeutics
• Artigo em 1991 • Aprovação pelo FDA em 2009
Ruconest • Angioedema hereditário • Pharming • Artigo em 2005 • Aprovação FDA em 2014
Proteínas recombinantes produzidas em animais biorreatores em testes clínicos ou pré-clínicos
Proteína uso empresa teste
Alfa 1 antitripsina
Enfisema hereditário Fibrose cística
Bayer e outras
I-T
Alfa fetoproteína
Esclerose múltipla, miastenia gravis, artrite reumatóide
GTC
Fase II
Antitrombina III (Atryn)
Embolias, tromboses GTC Fase III (aprovação comercial)
Butirilcolinesterase (Protexia)
�antídoto� para agentes neurotóxicos
Nexia
Pré-clínico
calcitonina osteoporose PPI I-T
colágeno Artrite reumatóide Pharming Pré-clínico prolactina Aumento da imunidade GTC I-T
Proteína uso empresa teste
Fator VIII Hemofilia A Pharming Pré-clínico
Fator IX Hemofilia, desordens de coagulação GTC, Pharming
Pré-clínico
Fibrinogênio Tecidos �in vitro� Pharming Pré-clínico
G-CSF Leucopenia Avigenics Pré-clínico
hCG Síndrome de Turner, problemas de desenvolvimento
GTC I-T
insulina Diabetes GTC I-T
Spider steel (Biosteel)
Desenvolvimento de materiais Nexia Pré-clínico
Fator ativador de plasminogênio tecidual
Falências cardíacas (infartos), dissolução de coágulos
Genzyme I-T
www.clinicaltrials.gov
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Por que produzir animais transgênicos? 2) Características de produção animal
– Proteção contra doenças
Proteção contra mastite: Resistência ao Staphylococcus aureus
Wall et al., 2005 Nature Biotechnology
Produção de lisostafina: Glandulas mamarias infundidas com a bactéria - 14% infectadas nos animais transgênicos - 71% infectadas nos animais controles
2) Características de produção animal – Proteção contra doenças – Aumento de crescimento, fertilidade
GH α-lactalbumina 70% a mais de leite 500g a mais em 21d de lactação
2) Características de produção animal – Proteção contra doenças – Aumento de crescimento, fertilidade – Alteração da composição de carne, leite, ovos, etc.
Lisozima humana no leite Daisy: leite sem β-lactalbumina (hipoalergênico)
3) Produção de modelos genéticos de estudos (doenças humanas)
Por que produzir animais transgênicos?
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3) Produção de modelos genéticos de estudos (doenças humanas)
Lai et al., Science 295:1089-1092, 2002.
Xenotransplante: modelo para não rejeição de órgãos
- Falta (knockout) da enzima α-1,3-galactosyltransferase
Suínos como modelos experimentais Similaridades fisiológicas e anatômicas aos humanos – suínos são modelos biomédicos
• Sistema cardiovascular • Sistema urinário • Sistema tegumentar • Sistema digestivo
Modelos animais - Tamanho/
metabolismo - Tempo de vida - Organização do
genoma
Suínos como modelos experimentais Similaridades fisiológicas e anatômicas aos humanos – suínos são modelos biomédicos
• Sistema cardiovascular • Sistema urinário • Sistema tegumentar • Sistema digestivo
Estratégias de produção
• Ganho de função (Knock-in) • Expressão gênica aumentada • Expressão de um gene novo
• Perda de função (Knock-out)
• Silenciamento gênico – alteração do gene endógeno
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Estratégias de produção • Ganho de função (Knock-in)
5´ 3´
Exemplo: hormônio do crescimento (GH)
• aprox. 25000 genes • 1 cópia a mais do GH : 100% a
mais de crescimento
Promotor GH
1982: � Super mice��
Salmão: 3Kg x 1,3Kg em 1,5 anos
Estratégias de produção • Perda de função (Knock-out)
• Recombinação homóloga
-Knockout da miostatina
Belgian blue
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Tecnologias para produção de animais transgênicos
3. Transferência de DNA mediada por espermatozoides
4. Transferência nuclear de célula somática (clonagem)
2. Microinjeção pronuclear de DNA
5. Polimorfismos direcionados
1. Injeção de células-tronco embrionárias em embriões
Isolamento da MCI
Comprometimento e desenvolvimento celular
Cultivo in vitro
Comprometimento e diferenciação celular
Auto renovação
Células-tronco embrionárias
Expressão dos genes OCT4, SOX2, NANOG
(pluripotência)
• gene targeting • knockout
• Camundongo
Injeção de células embrionárias previamente modificadas em blastoceles (agregação) CTEs em animais domésticos: stem-like cells
Pant and Keefer, Cloning and Stem Cells .11(3), 2009.
Jin et al., 2012 Cytotechnology
CTEs humanas
CTEs �like� bovinas
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• 1. Fertilização
• 2. Visualização dos pro-núcleos e microinjeção do DNA
Microinjeção pronuclear de DNA exógeno em zigotos Primeiro animal de
produção transgênico no Brasil
2007
• Microinjeção • Granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) • Prof. Vicente de Freitas (Ceará), colaboração
com grupo russo.
24 doadoras Saanen
SO e lavagem uterina
129 zigotos c/ pro- núcleo
3/6 embriões
em 27 receptoras
10 prenhes, 12 cabritos,
1 transgênico
Transferência de DNA mediada por espermatozóides
oócito oócito
Transferência de DNA mediada por espermatozóides
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ICSI – Injeção intracitoplasmática de espermatozóide
1. Inseminação laparoscópica
2. Fertilização in vitro (FIV) 3. ICSI
0% tg 0% tg >90% tg
Pereyra-Bonet et al., J. Reprod. Dev. 2011.
Ovinos Transgenia – desvantagens e riscos
1. Inserção aleatória do transgene no genoma hospedeiro
• expressão transgênica imprevisível
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2. Tempo para formação de rebanhos muito alto em animais de produção
• Camundongos: ciclo de 5 dias, gestação de 21 dias, desmame 21 dias, vários filhotes: 2-3 meses para a obtenção dos animais fundadores
• Bovinos: 280 dias de gestação, meses de lactação, puberdade em ~ 2 anos, 1 animal nascido por vez: > 3 anos
Transgenia – desvantagens e riscos Transgenia – desvantagens e riscos
• 3) Baixa eficiência.
• Microinjeção:
• 2800 zigotos microinjetados • 2500 zigotos após microinjeção • 250 embriões transferidos • 50 prenhezes • 1 bezerro transgênico
• Produção de animais geneticamente modificados
Clonagem por transferência de núcleo
Célula da pele
Oócito reconstruído
Embrião blastocisto
Oócito (gameta feminino)
Núcleo
Retira-se o núcleo (material
genético)
Clonagem por transferência de núcleo
Dolly (1996)
¡ Ovelhas transgênicas para ofator IX de coagulação(SCHNIEKEetal.,1997).
Polly (Fator IX de coagulação)
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Modificação gênica da célula
Vetor proteína verde
Atualidade: Edição gênica de precisão • Inserção aleatória x inserção dirigida (específica)
• Reparo direcionado por homologia
Atualidade: Edição gênica de precisão • Inserção aleatória x inserção dirigida (específica)
• Reparo direcionado por homologia
Atualidade: Edição gênica de precisão • - Endonucleases capazes de introduzir pequenas inserções ou
deleções (poucos pares de base - indels) em locais específicos do genoma.
- Zinc fingers (ZNFs)
- Talens (Tal effector nucleases)
- CRISPR/cas 9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)
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CRISPR / Cas9 - Edição gênica de precisão
• Nuclease guiada por RNA
• Precisa somente de
um RNA guia e da proteína Cas9
• Isolada de bactérias • Funcional para
todas as sequencias!
O exemplo da musculatura dupla...
Piemontês
Belgian Blue
Whippet
Miostatina (GDF8)
• �introgressão de variações genéticas�
controle
mutação • Mutação na miostatina • TALENS
• Bovinos (Nelore) e ovinos - Proudfoot et al., 2015 • CRISPR/Cas9
• Ovinos– Crispo et al., 2015
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Chifre • Alelo Polled
- China: humanos - Câncer agressivo de pulmão - Knock out gene PD-1: genes do sistema imune podem combater o cancer
CélulasexpressandoogenerepórterGFP(GreenFluorescentProtein)
Promotor de ubiquitina
Gene da Proteína Fluorescente Verde
Ub eGFP 5´ 3´
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2008
Ex.: Nascimento de dois animais – F IX • Bovinos expressando fator de coagulação IX humano no
leite (promotor de β-caseína)
Promotor de β-caseína
Gene do fator humano de
coagulação IX (hFIX)
β-cas hFIX 5´ 3´
Células da glândula mamária
clonagem
21 vacas receptoras 2 animais nascidos
Animal 1 Animal 2
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Gluca: produzirá glucocerebrosidase (para tratamento da Síndrome de Gaucher)
O “lado negro” da tecnologia transgênica
• Animais biorreatores:
• alta expressão de proteína recombinante = indícios de fisiologia mamária comprometida!
• Lactaçãocomcomeçotardio,piconormaletérminoprecoce• SecreçãolipídicacompromeYda• Menorexpressãodecaseínas
• Foconasproteínasquenãopodemserproduzidasemmicro-organismosoucélulas!
• Produção animal: Animais maiores: alterações fisiológicas
• Problemas nas articulações • Anormalidades ósseas • Metabolismo alterado (elevado) • Úlceras gástricas • Infertilidade Efeitos foram mimetizados em animais normais através do tratamento
prolongado com altas doses de GH
Pursel et al., 1989; Nancarrow et al., 1991
transgênico controle
O “lado negro” da tecnologia transgênica Vegetais / alimentos transgênicos • 1996: tomate Flavr Savr (Calgene-Monsanto)
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Transgênicos na alimentação animal • 2010: 10% da plantação mundial é de OGMs.
Porcentagem transgênicos x
convencionais - 2012
Soja Milho Algodão Canola
Transgenia vegetal – Para quê?
• * Aumentar a produção alimentos e reduzir os custos de produção; • 40% da produção de lavouras não transgênicas – não é
aproveitada
• * Produção de alimentos de maior qualidade nutricional e menor perecibilidade;
• Produção de anticorpos em plantas transgênicas e sua distribuição em massa.
Aumentar a produção alimentos e reduzir os custos de produção
• Resistência a insetos: utilização de inibidores de proteinase de plantas, ou a partir de toxinas bacterianas (Bacillus thuringiensis), o gene Bt. Ex.: milho, algodão, batata e soja transgênicas (a toxina é inseticida).
Aumentar a produção alimentos e reduzir os custos de produção
• Tolerância a herbicidas: engloba o maior número de plantas transgênicas, tolerantes a uma série de herbicidas. Ex.: milho, eucalipto, cana-de-açúcar, soja (soja ‘roundup ready’ – resistente ao glifosato).
• Soja roundup ready (RR) Monsanto
• Resistência ao glifosato
• Soja Intacta RR2 pro (dupla resistência)
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Dupla resistência - Cana-de-açúcar Monsanto Brasil
Aumentar a produção alimentos e reduzir os custos de produção
• Resistência a vírus: silenciamento de gene ou proteção mediada pelo RNA (Ácido Ribonucléico). Ex.: mamão com resistência ao vírus da mancha anelar do mamoeiro (PRSV), desenvolvido pela EMBRAPA-CNPMF e a Universidade de Cornell; batata transgênica resistente ao vírus do mosaico da batata (PVY), pela EMBRAPA-CNPH/CENARGEN.
Agrobacterium tumefaciens
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Brasil - aprovações comerciais - vegetais • Resistência a insetos, tolerante a herbicidas ou ambos
• Algodão Bollgard II, Roundup Ready, Widestrike; 12 variedades.
• Milho Bt, milho Roundup Ready; 21 variedades.
• Soja Roundup Ready, Liberty Link; 5 variedades.
• Feijão resistente ao vírus do mosaico
• Eucalipto
• Outros países (EUA principalmente): canola, ameixa, etc...
Transgênicos na alimentação animal
- 100 bilhões de animais: sem efeito na saúde, produtividade e perfil nutricional dos produtos derivados
Alimentos transgênicos
• Saúde humana • Alergias (proteínas novas na
planta) • Resíduos de agrotóxicos
(plantas com resistência aos efeitos dos agrotóxicos, ex: soja roundup ready).
• Meio ambiente • Impacto sobre biodiversidade
(uniformidade genética = maior vulnerabilidade)
• Outros...??
Vantagens Desvantagens • Aumento da produção
• Maior resistência e durabilidade
• Melhoria do conteúdo nutricional/ alimentos terapêuticos