저 시-비 리- 경 지 2.0 한민

는 아래 조건 르는 경 에 한하여 게

l 저 물 복제, 포, 전송, 전시, 공연 송할 수 습니다.

다 과 같 조건 라야 합니다:

l 하는, 저 물 나 포 경 , 저 물에 적 된 허락조건 명확하게 나타내어야 합니다.

l 저 터 허가를 면 러한 조건들 적 되지 않습니다.

저 에 른 리는 내 에 하여 향 지 않습니다.

것 허락규약(Legal Code) 해하 쉽게 약한 것 니다.

Disclaimer

저 시. 하는 원저 를 시하여야 합니다.

비 리. 하는 저 물 리 목적 할 수 없습니다.

경 지. 하는 저 물 개 , 형 또는 가공할 수 없습니다.

i

학 사학 논문

파리 생체시계에 CLOCK

PERIOD 결합 도 역할

아주대학 대학원

생 과학과/신경과학전공

강 현

ii

파리 생체시계에 CLOCK

PERIOD 결합 도 역할

지도 수김

논문 학 사학 논문 로제 함.

2012년8월

아주대학 대학원

생 과학과/신경과학전공

강 현

iii

강 현 학 사학 논문 함.

아주대학 대학원

2012년06월22

iv

- 국 요약 -

리 생체시계에 CLOCK PERIOD 결합 도 인 역할

생체시계 작동 Transcriptional/Translational Feeldback Loop

(TTFL)이다. 리에 는 사인자인 CLOCK (dCLK)과 CYCLE (CYC)가

결합하여 period (per) timeless (tim) 진하고, PER TIM

단 질 결합하여 CLK/CYC 억 함 써 자신 해하며

하는 임 고리가 TTFL 핵심 고리를 이룬다. PER/TIM 이합체에

PER 가 CLK/CYC 억 하는 역할 하는데 어떤 생 학

통하여 억 하는가에 한 이해가 많이 부족하다.본 연구에 는 CLK

아미노산 각각 100~200 개 도 단 내부 거하여 변이체를

만들고 PER 가 결합하는 도 인 찾고자 하 다.Schneider2 (S2) 리

포라인에 각각 CLK 변이체들과 PER 결합 도를 면역침강법

한 결과 아미노산 657-707 이 거 dCLK (dCLKD657-707 명명)이

PER 결합 도가 감소하는 것 찰하 다. 미롭게도 S2 포에

CLKD657-707 E-box 존 인 사 나타내지 못하 다. 그러나

dCLKD657-707 이 CYC 단 질과는 상 결합하는 것 보아

아미노산 657-707 거 인한 구조 변 같 특이 결함에

해 가 아니라 아미노산 657-707 부 가 dCLK 단 질 사 PER

단 질과 결합에 필요한 도 인임 미하는 것이다.아미노산 657-707 in

vivo 역할 탐색하 하여 dCLK△657-707 시키는 리를

v

작하고 dCLK 하지 못하는 ClkOUT 경 (dClk△657-

707;ClkOUT 명명)에 분자 •행동학 리듬 찰하 다.dClk△657-

707;ClkOUT 리는 생체리듬 나타내지 못하여 리 포라인에 얻

결과 마찬가지 아미노산 657-707 부 가 CLK 이 생체시계를 작동시키는

데 있어 요한 역할 하는 도 인임 입증할 있었다. 미롭게도 S2 에

dCLK△657-707 사 나타내지 못하 는데, 리에 는

PER TIM 단 질이 상 리에 보다는 약간 낮 도 만들어지는

것 인 어 이에 한 후속 연구가 진행 어야 할 것 보인다.

핵심어 : 리, 생체시계, dCLOCK,dPERIOD, 사 , 결합도 인

vi

차

국 요약 ·················································································································· iv

차 ··························································································································· vi

그림차 ·················································································································· viii

차 ·························································································································· x

Ⅰ. ····················································································································· 1

Ⅱ. 재료 법 ······································································································ 4

A. plasmid ············································································································ 4

1. S2 에 시키 한 plasmid 들 ······················································ 4

(1) plasmid 종 ·····································································4

(2) Site-directed mutagenesis 를 한 primer··························4

(3) Site-directed mutagenesis·················································6

2. 질 리 작 한 plasmid ··················································· 8

B. Schneider 2 (S2) 포 양과 transfection ······································· 9

C. 질 리 (Transgenic Drosophila melanogaster)·············10

D. Locomotor activity assays·······················································11

E. Immunoblot analysis································································12

F. Immunoprecipitation(IP) ·············································································15

G. Luciferase Reporter Assay β-Galactosidase Enzyme Assay

System·······················································································18

H. Quantitative Real-time RT-PCR··············································20

vii

Ⅲ. 결과 ··························································································21

A. S2 포에 dCLK(△579-778) dPER 가 결합 하지 못하지만

CYC 단 질 결합에는 향이 없다.············································21

B.S2 포에 dCLK(△657-707) dPER 결합 하지못한

다.································································································25

C.dCLK(△657-707) 하는 질 리는 상 인 생체리듬

가지지 못한다.·····························································29

Ⅳ. 고찰 ···························································································38

Ⅴ. 결 ···························································································40

참고 헌··························································································42

ABSTRACT ·····················································································46

viii

그림 차

Fig. 1.Schematic diagram of internally deleted amino acid region on dCLK

protein·······························································································23

Fig. 2.Interaction between PERIOD with CLOCK internal deletion

mutants········································································································24

Fig. 3.Interaction between CYCLE with CLOCK internal deletion

mutants········································································································25

Fig. 4.Amino acid 657-707 is necessary for PERIOD binding to

CLOCK·······································································································27

Fig. 5.CLOCK△657-707 does not have transcriptional

activity········································································································28

Fig. 6.Amino acid 657-707 is not necessary for CYCLE binding to

CLOCK·····························································································29

Fig. 7.Daily activity patterns of Clk-WT; ClkOUTand Clk△657-707;

ClkOUT·····························································································33

ix

Fig. 8.Amino acid 657-707 is necessary for PERIOD binding to CLOCK at

in vivo································································································34

Fig. 9.Molecular rhythms of Clk-WT; ClkOUT andClk△657-707;ClkOUT

during Light/Dark Cycle········································································35

Fig. 10.Molecular rhythmsofClk-WT; ClkOUT andClk△657-707;ClkOUT

during Light/Dark Cycle·······································································36

Fig. 11.Daily levels of tim and clk mRNAsClk-WT; ClkOUT andClk△657-

707;ClkOUT flies·········································································37

x

차

Table 1. Circadian behavior of Clk-WT; ClkOUT andClk△657-707;ClkOUT

flies·············································································32

- 1 -

I.

지구상에 존재하는 모든 생명체는 지구 자 변 하는 경 미리

할 있다. 를 들면 포 경우 뇌 시상하부에 한

SCN(Suprachiasmatic Nuclei) 이 낮과 하고 각 장 다양한

포 필요한 보를 보내어 하루 사작용, 체 , 르몬분 , 면 등

조 한다. 이 인해 하루를 주 생명체 여러 생리작용과 행동 사

변 시키는 생체리듬이 나타나게 다. 생체시계 질병과 상 계는

암, 면장애, 여러가지 태 우울증, 신경퇴행 질 , 사증후군, 약 독

등 히 많 부 요 이 입증 고 있다(Bunney Bunney,2000;

Cardinali, 2000; Fu Lee, 2003; McClung, 2007; Rudic 등 , 2004). 라

생체시계 작용 생체리듬 일 키는 원인과 상 생체리듬이

생함 인해 어떠한 질병이 나타나며, 과 료를 한 단과 법

탐색하는데 요한 단 가 것이다.

생체시계는 미생 에 부 포 지 지구상 모든 생 이 가지고

있는데 원 부 과학자들 생 내부에 자체 인 시계를 가지고 있

것이라고 생각하고 있었 며, 이에 한 연구는 리를 동 모델 이용하면

히 진행 었다.생체시계 핵심 “interlocked transcriptional-

translational feedback loop” 써 개 loop 이 맞 생체시계 핵심

자들 이 하루를 주 진동할 있도 한다. 리에 는

dperiod(dper) / timeless (tim) loop 이 개 feedback loops 이루고

있다. 이 dCLK/CYC 단 질 이 이합체를 이루어 dper/tim 자

- 2 -

promotor 부분 E-box 에 붙어 사를 진하고 dPER/TIM 단 질

이 이합체를 이루어 자신 자를 만들게 하는 dCLK/CYC 단 질

사 해하는 임 고리를 만들게 다. 한 dCLK/CYC 단 질

이 이합체는 vrille (vri )과 PAR domain protein 1ε (PDP1 ε) 자 E-

box 에 결합하여 이들 진하는데, 이 VRILLE (VRI) dClk

억 하고 면 PDP1 ε dClk 진하는 다른

feedback loop 를 이루게 다(Cyran 등 , 2003).

생체시계 “interlocked transcriptional-translational feedback loop”

에 dPER TIM 이 이합체가 dCLK 과 CYC 이 이합체

억 한다는 것 잘 알 있다. 이 dPER-TIM 이 이합체 단 질이

사인자인 dCLK-CYC 이 이합체 단 질 억 하 해 직 인 결합이

필요할 것이며 (Lee 등 , 1998; Lee 등, 1999; Sato 등 , 2006), Chang 등

dPER 가 단독 도 dCLK-CYC 해할 있 보고하여

dCLK-CYC 이합체 해하는 주요 단 질 dPER 임

다(Chang 과 Reppert, 2003). Chang 등 이 연구에 dPER 에 dCLK

억 하는데 필요한 소 도 인 탐색하 고, 그 결과 dPER 에

아미노산 764-1034 가 내부 거 었 dCLK 사 이

억 지 않았고 이 부 Chang 등 dPER 아미노산 764-1034 를

dCLK:CYCInhibition Domain(CCID)라 명명하 다(Chang 과 Reppert, 2003).

여러 리 종 부 CCID domain 단 질 열 분 해 보면

종간 보존 이 높 부 (Conserved region) 종간 보존 이 상

높지 않 부 (Non-conserved region) 나 는 것 알 있다. 특히

dPER 에 종간 보존 이 높 부 인 C3 부 (아미노산 768-842)는 DBT

- 3 -

결합하는 부 라는 것 지도 이 연구에 해 고 C4

부 (아미노산 926-977)도 임연구자에 해 dCLK 과 결합하는 부 라는

것이 다.(Kim 등,2007 ; Sun 등,2010)

라 본 연구에 는 생체시계 “interlocked transcriptional-

translational feedback loop” 에 dCLK 사 해하 해 dPER

단 질이 dCLK 에 결합하는 부 를찾고 이 도 인 능 분자 • 생 학

에 탐구하고자 한다.

- 4 -

Ⅱ. 재료 법

A. plasmid

1. S2에 시키 한 plasmid 들

(1) plasmid 종

pMT(A)-dClk△DBD-V5,pMT(A)-dClk△HLH-V5,pMT(A)-

dClk△63-95-V5,pMT(A)-dClk△PAS-A-V5,pMT(A)-dClk△145-

263-V5,pMT(A)-dClk△PAS-B-V5,pMT(A)-dClk△310-378-

V5,pMT(A)-dClk△379-479-V5, pMT(A)-dClk△480-578-V5,

pMT(A)-dClk△579-656-V5,pMT-dClk△579-778,pMT-

dClk△657-707,pMT-dClk△708-778, pMT-dClk△784-834,pMT-

dClk△837-945

(2) Site-directed mutagenesis를 한 primer

(A) clk△DBD

Forward :5’- GAC AAG GAT GAT ACA TTC AAC TCG CTG GTC -3’

Reverse :5’- GAC CAG CGA GTT GAA TGT ATC ATC CTT GTC -3’

(B) clk△HLH

Forward :5’- AAG CGA CGA GAT CAG AAA AAT CAT AAT GAG -3’

Reverse :5’- CTC ATT ATG ATT TTT CTG ATC TCG TCG CTT -3’

(C) clk△63-95

- 5 -

Forward :5’- ACG ATA GCC TTC CTG CTG GAG TCT CTC GAT -3’

Reverse :5’- ATC GAG AGA CTC CAG CAG GAA GGC TAT CGT -3’

(D) clk△PAS-A

Forward :5’- TAC ACT CAC CTC ATG GAG GCG CTG CTG AAT -3’

Reverse :5’- ATT CAG CAG CGC CTC CAT GAG GTG AGT GTA -3’

(E) clk△145-263

Forward :5’- TAT GAG ATG GAC CAT AGT AAT GAG TTC ACT -3’

Reverse :5’- AGT GAA CTC ATT ACT ATG GTC CAT CTC ATA -3’

(F) clk△PAS-B

Forward :5’- ATT ATT GAT CCC ACA GAC AGT ATT GTG GCG -3’

Reverse :5’- CGC CAC AAT ACT GTC TGT GGG ATC AAT AAT -3’

(G) clk△310-378

Forward :5’- CAC TTT GAT GAT CTG GGC CAA AAA TCG GGA -3’

Reverse :5’- TCC CGA TTT TTG GCC CAG ATC ATC AAA GTG -3’

(H) clk△379-479

Forward :5’- GAT AGT CGA AAG GAG AAT ATC AGC TCC ACA -3’

Reverse :5’- TGT GGA GCT GAT ATT CTC CTT TCG ACT ATC -3’

(I) clk△480-578

Forward :5’- GCT TCG AGT TAT GGC ACT CCG AAA ATG GTG -3’

Reverse :5’- CAC CAT TTT CGG AGT GCC ATA ACT CGA AGC -3’

(AJ) clk△579-778

Forward :5’- CTG CAA CAT ACA GTG CAC CAG CAC AAT CTC -3’

- 6 -

Reverse :5’- GAG ATT GTG CTG GTG CAC TGT ATG TTG CAG -3’

(K) clk△579-656

Forward :5’- CTG CAA CAT ACA GTG CC GAT ACG GTG GTT -3’

Reverse :5’- AAC CAC CGT ATC GGG CAC TGT ATG TTG CAG -3’

(L) clk△657-707

Forward :5’- CAA ACG GAT ATG CTG CCC ATG ATG TCG ATG -3’

Reverse :5’- CAT CGA CAT CAT GGG CAG CAT ATC CGT TTG -3’

(M) clk△708-778

Forward :5’- TAC ACA TAT CTG CAG CAC CAG CAC AAT CTC -3’

Reverse :5’- GAG ATT GTG CTG GTG CTG CAG ATA TGT GTA -3’

(N) clk△784-834

Forward :5’- CAC CAG CAC AAT CTC CAA AAT GAT ATT TTA -3’

Reverse :5’- TAA AAT ATC ATT TTG GAG ATT GTG CTG GTG -3’

(O) clk△837-945

Forward :5’- CAA AAT GAT ATT TTA AAT CTG GTG CAG CAG -3’

Reverse :5’- CTG CTG CAC CAG ATT TAA AAT ATC ATT TTG -3’

(3)Site-directed mutagenesis

QuickChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene Co., La Jolla,

CA,U.S.A) 사용하여 site directed mutagenesis를 행하 다. 이

pfuTurbo DNA polymerase (Stratagene Co., La Jolla, CA, U.S.A)를 이용

하 며, 각 plasmid에 한 PCR 조 건 pfuTurbo DNA polymerase

- 7 -

(Stratagene Co., La Jolla, CA, U.S.A) 가 시하는 법 사용하 고 PCR

합액 구 요소는 100 ng pMT-HAdClk-V5, 5 ㎕ 10X cloned

Pfu reaction buffer , 2 ㎕ 10mM dNTP, 각각 150 ng primer (F)(R),

1㎕ Pfu Turbo DNA polymerase (Strata gene Co., La Jolla, CA,U.S.A)

그리고 멸균 종 양 50 ㎕ 맞추어 조 하 다. PCR 핵산증폭

(MJ Research, Inc., Waltham, MA, U.S.A)를 이용하 다. PCR 산

mutation 지 않 주 DNA를 거 하 해 한효소 Dpn I 1 ㎕를 처리한

후 37℃에 1 시간 후 , XL10-Gold Ultracompetent cells (Stratagene

Co., La Jolla, CA,U.S.A) 에 42 ℃ 45 간 heatshock 주고 난 후, 1 시간

30 분 동안 shaking incubator에 양하여 transformation 하 다. 재조합

plasmid를 가진 니 임 인하 해 sequencing 보내 염 열

인 하 다.

- 8 -

2. 질 리 작 한 plasmid

AttbpAcman-dClk-V5이plasmid NcoI-SphI단편 pSP72

vector(promega Co., Madison, WI, U.S.A) 에subcloning하 다.이 plasmid 를

pSP72-dClk (NcoI/SphI) 명명하 다. site-direct mutagenesis를 행 후

pSP72-dClk△657-707(NcoI/SphI)를 작하 다. 아미노산 657-707

거는 DNA sequencing analysis를통해 인하 다.pSP72-dClk△657-

707(NcoI/SphI)에 NcoI 과 SphI 한효소를 이용하여 dClk△657-707

잘라낸 후 pSP72-dClk(NheI-SphI)에subclonning 하여 pSP72-dClk△657-

707(NheI/SphI)를 작하 다. 이 게 plasmid를 attbpAcman-dClk

vector 에NheI-SphI 이용하여 subcloning 함 써 종

attbpAcman-dClkD657-707 작하 다

- 9 -

B. Schneider 2(S2) 포 양과 transfection

S2 포는 10% Fetal Bovine Serum, Certified(FBS) (Invitrogen Co.,

Carlsbad, CA, U.S.A) 0.5% penicillin streptomycine (Sigma-Aldrich

Co., Carlsbad, CA, U.S.A)를 사용하 고 23℃ 항 에 양하 다.

Transfection Effectene Transfection reagent (Qiagen Co., Hilden,

Germany)를 사용하 고 조사가 시한 실험 법에 라 실험하 다. 각

transfection 각각 다른 0.4 ㎍ pMT-HAdClk 포함한 plasmid

0.6 ㎍ pAct-per 는 각각 다른 0.5 ㎍ pMT-HAdClk 포함한

plasmid 0.5 ㎍ pMT-CYC-3F 를 사용하 다. pAct-per pMT-

cyc-3F는 transfection 후 종 500 uM CuSO4 를 어 induction 함 써

특 시간 동안 양하여 증가를 도하 다.

- 10 -

C. 질 리 (Transgenic Drosophila melanogaster)

이 pAcman-dClkD657-707 plasmid를 BestGeneInc (BestGene Inc.,

Chino Hills, CA, U.S.A)에 보내 질 리 작 뢰하 다. 이

pAcman-dClkD657-707 plasmid를 주입하는 리 라인 VK00018

이용하 다. 그 결과 4개 독립 라인 얻었고 각각 리를 Clk

하지 않 ClkOUT 리 하여 경에 ClkD657-707

하는 리 라인 립하 다. 리 다 과 같다.

W; ClkD657-707,4M;ClkOUT

W; ClkD657-707,3M;ClkOUT

W; ClkD657-707,2M;ClkOUT

W; ClkD657-707,1M;ClkOUT

- 11 -

D. Locomoter activity assays

리 각각 locomotor activity 는 Drosophila Activity System

(DAM) 이용하여 하 다. (Waltham MA) (Hemblen-Coyle 등, 1992).

해 리는 어린 컷 체를 사용하 다. 25℃ 항 에 12시간

간격 과 어 속에 4일 간 노출하 고 (12:12LD, zeitgeber time zero

[ZT0] sms light phase 가 시작 는 시 를 내린다.), Constant-

darkness condition (DD) 12:12LD 이후 연속해 7일간 지하 다. 각

리 Locomotor activity 는 Dr. F. Rouyer. (France) 부 Faax

software (MacOSX 를 한 Fly Activity Analysis Suite) 를 이용하여

분 하 다. Period 는 리 각각 chi-square periodogram analysis 하여 ,

각 그룹별 평균 산출하여 그 값 획득하 다. power는 DD동안

rhythm strength 도이다. 각각 리들 power 가 10 이상 값

가지고 width 값 (periodogram 95% confidence line 보다 30분 에 peak

를 시 ) 이 2 이상 rhythm 나타낸다.

- 12 -

E. Immunoblot analysis

동용 Gel 6% polyacrylamide gel (Resolving gel mix; 1.2 ㎖

30% polyacrylamide/Bis solution,37.5:1(BIO-RAD),2.325 ㎖ DW, 2.4 ㎖

1M Tris-Hcl pH 8.8, 60㎕ 10% SDS, 25 ㎕ 25% APS, 6㎕

TEMED) (Stacking gel ; 375 ㎕ 30% Acrylamide Bis,37.5:1,BIO-RAD

1.85 ㎖ DW, 250 ㎕ 1M Tris-Hcl pH 6.8, 25 ㎕ 10% SDS, 10 ㎕

25% APS, 3㎕ TEMED) 작하여 사용했다. 시료 처리를 해 S2

포를 거 어 들인 뒤 PBS 한 번 씻어 후 150 ㎕ Modified

RIPA(50mM Tris-Hcl pH 7.5, 1% NP-40, 0.25% deoxycholate, 50mM Nacl,

5% glycerol) 에 신 한 1 mM EDTA, 100X Xpert protease inhibitor cocktail

solution(GenDEPOTCo., U.S.A), 2.5M NaF , 200mM Na3VO4, 0.5mM

PMSF 추가하여 포를 용해 하 다. 용해 법 얼 에 5 분 마다

10 씩 번 voltexing 하여 15분간 용해한 후 4℃ 에 13000 rpm

15분간 원심 분리하여 상 액 만 회 하 다. 회 한 각 포 용해액

ELIZA leader (BioTex Inc., Houston, TX, U.S.A) 를 이용하여 595 nm

농도를 하여 OD3과 OD6 량한 후 단 질 변 시키 해

4X SDS-PAGE sample buffer(2.5㎖ 1M Tris-Hcl pH 6.8, 4㎖

Glycerol(100%) , 0.8㎖ β-mercaptoethano, 0.8g SDS, 2.5㎖ Autoclaved

water )를 추가하여95℃ 이상 도에 3 분간끓인후spindown하여 sample

들 loading 하 다. sample들 SDS-PAGE 동법 (Sodium

Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide gel Electrophoresis, Laemmli법)

- 13 -

행하 다. Mini-PROTEIN Tetra Cell (BIO-RAD Laboratories, Inc.,

Hercures, CA, U.S.A) 이용하 고, 동용 buffer (1 L ; 3.025 g Tris,

14.4 g Glycine, DW, 1% SDS)를 채운 뒤 동 하 다. Stacking gel에 는

130 V Resolving gel에 는 190 V 하 고 PRO-STAIN

Prestained protein marker (Intron Biotechnology Inc., Korea) 함께

loading 하여 marker 90.5 kDa 드가 gel 가장 하단에 할 지

동 하 다. 동 료 gel resolving gel 만 잘라낸 후

transfer buffer 에 충분히 신 Gel Blot Paper (Whatman Inc., Springfield

Mill, Kent, U.K) Immobilon-P Transfer Membrane(Millipore

Inc.,U.S.A)를 함께 semi-dry blot sandwich를 만들어 Trans-Blot SD semi-

dry electrophoretic transfer cell (BIO-RAD Laboratories Inc., Hercures,

CA, U.S.A)에 함께 장착한 다 240mA 에 45분간 transfer 하 고,

Transfer nitrocellulose transfer membrane 0.1% Ponceau S(0.1%

Ponceau S, 5% acetic acid) 인 하 다. Orbital shaker 에 5%

Blocking 하 고, 1차 항체가 포함 5% Blocking 용액에 어 냉장실에

하룻동안 시킨 뒤 , 2차 항체가 포함 5% Blocking 용액에 어 상 에

시간 동안 하 다. 이 Anti-V5(Invitrogen Co., Carlsbad, CA,

U.S.A) 는 1:10000, Anti-HA(3F10)(Roche Diagonostics Co., Mannheim,

Germany) 1:4000 희 하여 사용하 고, Goat anti-mouse

IgG(H+L)horseradish peroxidase(molecular Probes Inc., Eugene, OR,

U.S.A)는 1:10000,Goat anti–rat IgG (H+L), (molecular Probes Inc., Eugene,

- 14 -

OR, U.S.A)는 1:5000 희 하여 사용하 다. 항체 이 끝난 뒤에는 항상

15분 간격 4번 TBST(4M NaCl, 1M Tris-HCl pH 7.5, 0.05% Tween-20,

DW) 척하 다. 항체 이 끝나면 Immobilon Western chemiluminescent

HRP substrate(Millipore Co., Billerica, MA, U.S.A)를 nitrocellulose transfer

membrane 에 히 힌 후 CP-BU NEW medical X-ray film blue (Agfa

HealthyCare Co., Soptestraat, Mortsel,Belgium) 에 시간 동안 노출시

상하 다.

- 15 -

F. Immunoprecipitation(IP)

pMT-HAdClk 는 pMT-HAdClk(△) series 0.4㎍ 과 함께 pAct-

dper-V5/His(0.6㎍) ,pMT-HAdClk 는 pMT-HAdClk(△) series 0.5㎍ 과

함께 pMT-cyc-3F(0.5㎍) S2 포에 Effectene Transfection reagent

(Qiagen Co., Hilden, Germany) 사용하여 조사 명에 라 transient

transfection 하 다. 36 시간 동안 양한 뒤 종 500 uM CuSO4 를 어

dClk 도한 후 24 시간 동안 양하 다. 포를 하고 PBS 한

번 씻어 후 Modified RIPA (50mM Tris-Hcl pH 7.5, 1% NP-40, 0.25%

deoxycholate, 50 mMNaCl, 5% glycerol) 에 신 한 0.5mM PMSF, , 100X

Xpert protease inhibitor cocktail solution(GenDEPOT Co., U.S.A), 2.5M

NaF , 200mM Na3VO4,1 mM EDTA 를 추가한 lysis buffer 를 이용하여

포를 용해하 다. 용해 법 얼 에 5 분마다 10 씩 번

voltexing 하여 15 분간 용해한 후 13000 rpm 15 분간 4℃ 원심 분리

하여 상 액만 회 하 다. 회 한 포용해액 ELIZA leader (BioTex Inc.,

Houston, Tx, U.S.A) 를 이용하여 595nm 에 O.D값 한 후 단 질

양 동일하게 맞추고 각각 dPER에 한 anti-V5 항체 (Invitrogen Co.,

Carlsbad, CA, U.S.A) 는 dCLK 에 한 Anti-HA (12CA5) 항체 (Roche

Diagonostics Co., Mannheim, Germany)를 3㎕ 씩 어 다 4℃

냉장실에 하루 동안 lotation 하 다. 다 날 GammaBind G sepharose (GE

Health care Bio-Sciences AB.,Bjorkgatan, Uppsala, Sweden) bead 를

사용할 만큼 미리 하여 포용해시 사용했 동일한 buffer (Modified-

RIPA) 약하게 번 척 한 후. 각 sample 마다 한 bead를 25㎕

- 16 -

씩 고 4℃ 에 시간 동안 lotation 하 다. Sample 들 4℃ 에 2분

동안 원심 분리한 후 상 액 모아 고, bead를 다시 4℃에 5분간

lotation 하여 buffer(Modified-RIPA) 척하는 과 번 복한 후

buffer (Modified-RIPA) 를 한 거한다. 1.2X Sample buffer 를 각

sample 마다 30㎕ 씩 고 95℃ 에 5 분간 끓인 후 15 ㎕ 씩 loading 하여

immunoblottung 행하 다. Immunoblotting 에는 6% polyacrylamide gel

사용하 고, IP 행 시 3F10(Roche Diagonostics Co., Mannheim,

Germany) dCLK 검출한 sample 에는 dPER를 찾 해 1 차 항체

Anti-HA(12CA5)(Roche Diagonostics Co., Mannheim, Germany) dCLK

검출한 sample 에는 dPER를 찾 해 Anti-V5 (incitrogen Co., Carlsbad,

CA, U.S.A) 항체를 사용하 다. 한 원래 포 용해액 dCLK과 dPER

다 O.D 10 량하여 함께 loading 하여 써 포 내 존재하는 각

단 질 양과 dPER 는 dCLK 각각 결합도를 하 다.

이것과 함께 dClk과 CYC는EZ view tmRed ANTI-FLAG M2 Affinity

gel( sigma-Aldrich, Inc., Missouri 63103 U.S.A)bead 를 각 sample 마다

25㎕ 씩 고 4℃ 냉장실에 하루 동안 lotation 하 다.Sample 들 4℃

에 2분 동안 원심 분리한 후 상 액 모아 고, bead만 있는 곳에 pH

2.7 0.1M Glycine-Hcl 27㎕ 고 10분동안 room temperature 에

incubation 한다. 10분간 incubation 동안 2분마다 tapping 한 다 4℃

에 2분 동안 원심 분리한 후 상 액 새 운 e.tube 에 다. 이 는

e.tube 에는 3㎕ pH 8.8 tris-Hcl 미리 어 다. 30 ㎕

sample 이 들어있는 e.tube에 10㎕ 4X sample buffer 를 고 95℃ 에 3

분간 끓인 후 20㎕ 씩 loading 하여 immunoblottung

- 17 -

행하 다.Immunoblotting 에는 8% , 10% polyacrylamide gel 사용하 고,

IP 행 시 Anti-FLAG( sigma-Aldrich, Inc., Missouri 63103 U.S.A)

CYC 를 검출한 sample 에는 dCLK 찾 해 1 차 항체 Anti-

HA(12CA5)(Roche Diagonostics Co., Mannheim, Germany) dCLK

검출한 sample 에는 CYC를 찾 해 Anti-FLAG(Monoclonal ANTI-FLAG

M2) ( sigma-Aldrich, Inc., Missouri 63103 U.S.A) 항체를 사용하 다. 한

원래 포 용해액 dCLK O.D 8, CYC 는 O.D 3 량하여 함께

loading 하여 써 포 내 존재하는 각 단 질 양과 CYC 는 dCLK

각각 결합도를 하 다.

- 18 -

G. Luciferase Reporter Assay β-Galactosidase Enzyme

Assay System

Assay를 해 포 용해액 해야 한다. 24well plate에 S2 포를

양한 후 dclkE-Luc, pMT-dclk-V5/His pMT-dclk△ 657-707 -

V5/His 를 Effectene Transfection reagent (Qiagen Co., Hilden, Germany )

사용하여 조사 명에 라 transfection 하 고, 모든 sample

transfection 효 동일 시키 해 pMTB 보 하 며 차범 를

이 해 triplecation 하 다. 36 시간 후 종 500mM CuSO4 induction

한 다 12시간 후 well PBS 번 척하 다. 5X RepoterLysis Buffer

(RLB)(Promega Co., Madison, WI, U.S.A) 를 1X 희 하여 각 well 면

충분히 덮 있 도 150㎕ 를 분주 하 고 , 4℃ shaker 강하게

들면 20 분 가량 incubation 하면 포를 한 용해 시 다. 포 용

해액 4℃에 13000rpm 5 분간 원심분리하여상 액만 회 하 다.

Luciferase repoter assay 를 해 상 에 Luciferase Assay

Reagent(LAR) )(Promega Co., Madison, WI, U.S.A) 를 녹인 다 1.5 ㎖

microcentrifuge tube 에 100㎕ LAR 포용해액 어 잘 어

delay 는 3 , integration time 15 , replication 1

Luminometer (Turner Designs Inc., Sunnyvale, CA, U.S.A) 에 하 다.

이 포용해액 dClk△ 657-707 이 아닌 dClk 2 ~ 10 ㎕ 어

하 경우 값이 약 3000 이 나 하다. β-Galactosidase

Enzyme Assay 를 해 96 well plate 에 각 sample 20 ㎕ , 1X RLB 30

㎕ Assay 2X buffer (2 mM MgCl2, 100mM 2-mercaptoethanol, 1.33 mg/

- 19 -

㎖ ONPG) 50 ㎕ 를 고 37℃ 에 노란색 변할 지 약 30 분 도

시킨 후 150 ㎕ 1 M Sodium Carbornate 를 어 단시키고

즉시 ELIZA leader (BioTex Inc., Houston, TX, U.S.A) 를 이용해 420 nm

장 하 다. β-Galactosidase Enzyme Assay 값 이용하여

Luciferase Reporter Assay 값 보 하여 graph를 작 하 다.

- 20 -

H. Quantitative Real-time RT-PCR

리 리를 TRI reagent(Molecular Research center, Inc) 용해하여

RNA를 획득한다.이 게 얻 500ng RNA 를 oligo-dT primer

amfiRivert reverse transcriptase (GenDEPOT)를 이용하여 cDNA를 합 한다.

cDNA를 주 Quantitect SYBR Green PCR kit (Qiagen) 이용하여

Corbett Rotor Gene 6000 instrument (Corbett Life Science) 에 real-time

RT-PCR 행하 다.primer sequence는 dClkforward : 5´

CAGTTCAACTCGCTGGTCAA-3´; dClk reverse : 5´

TCAGGAAGGCTATCGTGGAC-3´timforward: 5´-CCCT

ATACCCGAGGTGGAT-3´;timreverse:5´-

TGATCGAGTTGCAGTGCTTC-3´.여 에 mRNA가 cycling 하지 않는

CBP20 를 첨가하여 값 보 하 다(Majercak et al. 2004). CBP20

sequence 는 다 과 같다.CBP20 forward: 5´-

GTCTGATTCGTGTGGACTGG-3´; CBP20 reverse: 5´-

CAACAGTTTGCCATAACCCC-3´. 행 후 나 결과를Roter Gene 6000

software 를 이용하여분 하 다.그리고 상 인 mRNA level 2-△△Ct 법

이용하여양 하 다.

- 21 -

III. 결과

A. S2 포에 dCLK(△579-778) dPER 가 결합 하지 못

하지만 CYC 단 질 결합에는 향이 없다.

근 우리 연구실에 는, dCLK 단 질에 사 억 인 dPER가 결합

하는 부 인 아미노산 579-778 dCLK에 거하게 면 dPER 단 질이

결합하지 못한다는 연구결과를 얻게 었다.(Fig.1) dCLK(△579-778)

단 질이 partner 단 질 알 진 CYC 단 질과 결합이 지 않 일

가능 조사해보았다. dCLK full length domain 12가지 종 부분

아미노산 내부 삭 를 시 dCLK 단 질에 dPER 단 질이 결

합하지 못하는 부 를 찾아 냈다. 그리고 dPER 단 질이 결합하지 못하는 부

에 partner 단 질인 CYC 단 질과 결합에는 어떤 향 미 는 지를

immunoprecipitation(IP)를 통해 알아보았다. dCLK(△579-778)는 dPER 단

질이 결합하지 않았지만 dCLK 단 질과 이 합체를 하는 partner 단

질인 CYC 경우dPER 단 질과는 다르게 결합하는데 아 가 없었다. 이

같 실험 진행하면 얻게 다른 실험결과는 dCLK 과 CYC 가 결합

하는 부 는 PAS-A 가 요한 역할 할 것이라는 실험 결과를 얻게 었다.

dCLK 단 질에 아미노산 PAS-A, 145-263, PAS-B, 310-378 부 가

삭 가 면 dCLK 량에도 향 미 는 것 인이 었다.

- 22 -

Fig.1.Schematic diagram of internally deleted amino acid region on dCLK

protein

bHLH, basic helix loop helix; A, PAS-A; B, PAS-B; Q-rich, glutamine rich; Poly Q,

Poly glutamine; (1), DBD;(2). HLH;(3). 63-95;(4). PAS-A;(5), 145-263;(6).

PAS-B;(7), 310-378;(8), 380-478;(9), 479-578;(10), 579-778;(11), 784-

834;(12), 837-945

- 23 -

Fig.2.Interaction between PERIODwith CLOCK internal deletion mutants

S2 cells were co-transected with 400 ng of each variant form of Clkplasmids as

indicated on top (numbers as same as in Fig. 1) in combination with 600ng

pAct-dper. At 36 h after transfection, cells were incubated in media

containing 500 uM CuSO4(final) to induce ectopic expression of target

proteins and harvested 24 h later. Extracts were prepared and either

subjected to immunoprecipitation (IP) or analyzed directly (input). Immune

complexes were recovered with anti-dPER (GP339) or anti-HA(12CA5)

- 24 -

Fig.3.Interaction between CYCLEwithCLOCK internal deletion mutants

S2 cells were co-transected with 500 ng of each variant form of Clk

plasmids as indicated on top (numbers as same as in Fig. 1) in combination

with 500 ngpMT-cyc -3F. At 36 h after transfection, cells were incubated

in media containing 500 uM CuSO4 (final) to induce ectopic expression of

target proteins and harvested 24 h later. Extracts were prepared and either

subjected to immunoprecipitation (IP) or analyzed directly (input). Immune

complexes were recovered with anti-HA(12CA5) or anti-CYC (anti-

FLAG)

- 25 -

B. S2 포에 dCLK(△657-707) dPER과 결합 하지

못한다.

이 결과에 dCLK(△579-778)이 dPER 결합 하지 못하지만

다른 요 단 질인CYC 결합에는 가 없

immunoprecipitation(IP) assay 를 통해 인하 다. 앞 인한 아미노산

579-778 부 를 좁 아미노산 657-707 부 가 삭 가 면 dPER 단

질이 dCLK에 결합하는데 요한 소 domain인 것 앞 실험한 법과 같이

immunoprecipitat ion(IP) 를 통해 알아 내었다. 이 도 앞 결과 마찬가

지 CYC 결합 가 없었다.dCLK wild-type 과 dCLK(△657-707)

사 luciferase assay 해 보았다. 그 결과 dCLK (△657-707) 는

사 이 wild type에 해 사라 버린 것 인할 있었다. 아미노산

657-707이 삭 면 dPER 단 질이 결합하지 못하고 dCLK 자체 사

도 없어지게 다.

- 26 -

Fig .4. Amino acid 657-707 is necessary for PERIOD binding to CLOCK

S2 cells were transected with 400 ngpMT-dClk-WT ,pMT-dClk(△657-707) in

combination with 600ng pAct-dper.at 36 h after transfection, cells were

incubated in media containing 500 uM CuSO4(final) to induce ectopic

expression of target proteins and harvested 24 h later. Extracts were

prepared and either subjected to immunoprecipitation (IP) or analyzed

directly (input). Immune complexes were recovered with anti-dPER

(GP339) or anti-HA(12CA5) S2 cells were transected with pMT-dClk-WT or

pMT-dClk(△657-707) in combination with pAct-dper .

- 27 -

Fig .5. CLOCK△657-707 does not have transcriptional activity

Shown are the average values for relative luciferase activity. S2 cells were

transfected pMT-Clk-WT and pMT-Clk△657-707. Cells were incubated

with 500uM CuSO4 (final in the media) to induce ectopic expression of

dCLK at 36h after transfection and harvested 24h later. Luc activity in the

absence of transfecting pMT-dClk(BL)was set to 1, and all other values

were normalized.

- 28 -

Fig.6.Amino acid 657-707 is not necessary for CYCLE binding to CLOCK.

S2 cells were transected with 500 ngpMT-dClk-WT ,pMT-dClk(△657-707) in

combination with 500ngpMT-cyc -3F.at 36 h after transfection, cells were

incubated in media containing 500 uM CuSO4(final) to induce ectopic

expression of target proteins and harvested 24 h later. Extracts were

prepared and either subjected to immunoprecipitation (IP) or analyzed

directly (input). Immune complexes were recovered with anti-HA(12CA5)

or anti-CYC (anti-FLAG).S2 cells were transected with pMT-dClk-WT or

pMT-dClk(△657-707) in combination with pAct-dper .

- 29 -

C. dCLK(△657-707) 하는 질 리는 상

인 생체리듬 가지지 못한다.

dCLK 아미노산 657-707 in vivo 에 역할 탐색하 하여 아미

노산 657-707 부 가 거 dCLK 하는 리를 작하 다..dCLK

(△657-707) 하는 독립 인 2개 질 리 라인 (3M, 4M)

립하 고 CLKOUT background 리 후 이를 dClk(△657-707)

리라 명명하 다. 상 인 dClk 하는 리 역시 CLKOUT

background 리 후 이를 dClk(WT)이라 명명하고 조군 사

용하 다. 생체리듬 DAM(Drosophila Activity Monitoring)system 이용하

여 분 하 다. (Table. 1) 그 결과 dClk(WT) 리는 homozygote 태

존재 할 경우 24.4시간 주 를 가지고 heterozygote 상태가 면 27.3 시

간 주 를 가지게 다.이처럼 transgene 어 경우에는 dose effect 가

존재하 에 WT gene이 1copy (heterozygote) 가 들어가면 2 copy

(homozygote) 가 들어갔 에 해 rhythmicity가 연히 떨어지는 것

인할 있다.dClk(△657-707) 경우에는 WT 과는 연히 다른 결과를 보

여 주었다. Homozygote heterozygote 태에 상 없이 주 를 가지는

리가 없다는 실험 결과가 나 다. 같 mutant이지만 line 에 라 다양

나타내는데 이는 같 자를 가지고 하 라도 모 같 행동 양상

나타내는 것이 아니라는 것 알 주는데 3M 과 4M mutant line 같 경우

- 30 -

activity 양 차이는 있 나 이들 행동 양상 슷하게 나타나는 것 볼

있었다. 이는 dClk(△657-707) 하는 리 경우 주 를 하는데

요한 역할 하는dPER 단 질이 dCLK 단 질에 결합하지 못해 앞 in

vitro 실험에 도 보았듯이 dCLK 사 이 사라지는 것에 한 결과인 것

말해 다. 그 다면 생체리듬 주 가 사라 버린 dClk(△657-707)

질 리 생체 내에 dPER 는 어떠한 변 가 있는지 조사하 해

dClk(△657-707) 질 리를 12:12 LD cycle 에 entrainment 시킨

후 4 시간 간격 리를 하여, 리 부 단 질 액 얻어 western

blot 행하 다. 상 dCLK단 질 시간에 라 그 인산 도가

한다. 늦 과 이른 아침에는 과도하게 인산 (hyperphosphorylation)

isoform 들이 많이 존재하고 하루 간에는 게 인산

(hypophosphorylation) isoform들이 많이 존재한다 (Fig 8). 면에 dCLK(△

657-707 단 질 하룻 동안 인산 isoform 변 가 없이 일 한 것 찰

할 있었고, 욱이 그 양이 상 dCLK 단 질에 해 매우 높 것

찰하 다PER TIM 단 질 dClk△657-707;ClkOUT 리에 그 양

dClk;ClkOUT 리보다 낮지만 시간에 라 변 하는 것 찰하 다. 그리고

24 시간 동안 constant - dark (DD) 상태일 는 WT LD 슷하게

rhythmic한 양상 나타내는데 해 mutant TIM과 PER는daily activity

patterns 결과 동일하게 peak이 뒤 차 리는 것 인할 있었

다.dCLK△657-707 단 질 사 하 해 dClk△657-

707;ClkOUT 에 하룻 동안 tim mRNA 양 하 다. CLK mRNA 경

우 LD DD 에 mutant는 슷한 graph를 나타내는데 dCLK level

mutant 경우 높 것 인할 있었다. 하지만 dCLK repressor인

- 31 -

TIM mRNA 변 량 ZT에 WT에 해 mRNA 양이 떨어 있

인할 있었다. 이것 S2 cell 에 같이 dCLK△657-707 단 질이 사

히 잃 것 아니고 어느 도는 가지고 있는 것 미한다.DD에

는 mRNA peak이 뒤쪽 리는 것 볼 있었다. 이 결과는 앞 행

동분 결과 그리고 molecular rhythm 변 에 일 하는 결과를 보여주고 있

다.

- 32 -

a Measure of the strength or amplitude of the rhythm.

bPercentage of flies with activity rhythms having a power value of 10 and

a width value of 2.

cTotal number of flies that survived until the end of the testing period.

d AR = arrhythmic

Period

± SEM(h) Power

a

Rhythmicity

(%)b

Number

c

ClkOUT AR AR AR 11

w;Clk-wt,1A;ClkOUT 24.4±0.11 77.6 100 11

w;Clk-wt,1A/CyO;ClkOUT 27.3±1.79 59.7 46.2 15

w;Clk△657-707-3M;ClkOUT 26±0.43 81.2 67.9 28

w;Clk△657-707-3M/CyO;ClkOUT 24.3±0.17 47.8 15 20

w;Clk△657-707-4M;ClkOUT AR AR AR 10

w;Clk△657-707-4M/CyO;ClkOUT AR AR AR 8

Table.1 Circadian behavior of Clk; ClkOUT andClk△657-707;ClkOUT flies

- 33 -

Fig. 7.Daily activity patterns of Clk-WT; ClkOUT and Clk△657-707; ClkOUT

Flygenotypes are A(w;Clk-WT,1A;Clkout) ,B(w;Clk-

WT,1A/CyO;Clkout) ,C(w;Clk△657-707-3M;Clkout) ,D(w;Clk△657-707-

3M/CyO;Clkout) ,E(w;Clk△657-707-4M;Clkout) ,F(w;Clk△657-707-

4M/CyO;Clkout)

- 34 -

Fig.8. Amino acid 657-707 is necessary for PERIOD binding to CLOCK atin

vivo

Adult flies of each genotype (indicated above the panel; WT, w;Clk-

WT;ClkOUT; △657-707, w;Clk△657-707;ClkOUT) were collected at the

indicated ZT. Fly headextracts were preparedand either subjected to

immunoprecipitation (IP) with anti-V5 antibody or analyzed directly (input).

Immune complexes were recovered with anti-dPER (Rb1) or anti-

dCLK(Rb-V5).

- 35 -

Fig.9.Molecular rhythms of Clk-WT; ClkOUT andClk△657-707;ClkOUT

during Light/Dark Cycle

Adult flies of each genotype (indicated above the panel; WT, w ;Clk△657-

707) were collected at the indicated ZT . Head extracts were prepared and

analyzed by immunoblotting. Anti-CLK(V5) or anti-TIM(TR-3) and anti-

PER(Rb1) antibodies were used to visualize dPER or TIM, respectively

- 36 -

Fig.10.Molecular rhythmsofClk-WT; ClkOUT andClk△657-707;ClkOUT

during Light/Dark Cycle

Adult flies of each genotype (indicated above the panel) were collected at

the indicated CT. Head extracts were prepared and analyzed by

immunoblotting. Anti-CLK(V5) or anti-TIM(TR-3) and anti-PER(Rb1)

antibodies were used to visualize dPER or TIM, respectively

- 37 -

Fig.11.. Daily levels of tim and clk mRNAs Clk-WT; ClkOUT andClk△657-

707;ClkOUT flies

cycles in dclkor timRNA levels. Adult flies of the indicated genotypes (as

shown in Fig.8.9 were collected at the indicated ZT and CT. RNA was

extracted from fly heads and quantitative real-time RT-PCR used to

measure the relative levels of total dclk or tim mRNA. RNA levels from

control flies (A,C =clk-wt )(B,D = clk△657-707) at ZT4 were set to 1

and all other values were normalized. Shown are the average values from

three independent experiments. Error bars denote S.E.M.

- 38 -

IV. 고 찰

모든 생 생체시계를 가지며 이것 이용하여 하루 생체리듬

조 한다. 그 에 도 분자생 학 학 연구가 가 뛰어나며 인간과

상동 이 높 리 동 모델 생체시계 transcriptional-translational

feedback loop 에 요한 역할 행하는 dCLK 분자생 학 • 생 학

역할 규명하는 것 생체시계 연구 분야에 매우 요한 연구이다.

dCLK 열 dPER binding domain (아미노산 657-707) 역할

찾고자 하 다. 그 결과 우리는 아미노산 579-778 에 도 요한 역할

하는부 를 아미노산 657-707 일 있었고 이 부 가 거 었

경우 사 억 역할 하는 dPER 결합이 지 않는 것 인할

있었 며, dCLK 사 마 잃어 버리는 것 견하 다.

한 편 in vitro 뿐만 아니라 in vivo 결과에 도 요한 미를 가진다.

dCLK-WT gene 하는 질 리는 약 24.4 시간 주 를

가지며 rhythmic 한 면 dCLK(△657-707) 하는 질

리 독립 인 라인에 모 주 가 없어 고 상 인 생체리듬

가지지 못하는 것 알 있었다. 리 포 양에 인한 에 하면,

dCLK (△657-707) dPER 결합할 있는 능 잃어버 dCLK

사 억 하지 못하 다. dCLK (△657-707) 일부분만이 삭 가

었 에도 사 억 역할 하는 dPER 가 결합할 있는 능 도

잃어버릴 뿐만 아니라 dCLK 자체 인 사 능 마 도 잃어 버린다는

사실 매우 미롭다. 이러한 dClk (△657-707) 시키는 질

- 39 -

리는 주 도 나타나지 않 뿐 아니라 arrhythmic 한 상 나타낸다.

in vitro 에 는 dCLK (△657-707)이 사 잃어 버리지만 in vivo

에 는 dPER TIM 이 시간에 라 thythmic 하게 생 는 것 매우

미롭다. 이는 dCLK (△657-707) 단 질 분자 생 학 결함이 in

vivo 에 는 다를 있다는 것 시사하는 것 이에 한 연구는 앞

욱 진행 어야 할 것이다.

이러한 dCLK 아미노산 657-707 역할 재 한 논 에

사 , 단 질 변 , 그리고 행동학 면에 찰 하 는데 앞

다른 근 연구가 필요할 것이라고 생각 다. 그래 우리는 첫 째,

질 리 생체 내 gene 들 RNA level 인할 것이다. 째,

dCLK 과 dPER 가 생채 내에 도 결합할 있는지

Immunoprecipitation(IP) 통해 조사 할 것이다. in vitro 결과

동일하다면 생체 내에 도 결합하지 못할 것이다. 재 진행 에 있는 이러한

연구들이 결실 맺게 다면 생체시계 연구분야 생 학 • 분자생 학

이해하는데 매우 요한 역할 할 것이라 생각 다.

- 40 -

V. 결

모든 생명체는 생체시계를 가지고 있 며, 생체시계 핵심

“interlocked transcriptional-translational feedback loop” 써 개

loop 이 맞 생체시계 핵심 자들 이 하루 24 시간

주 진동할 있도 한다.

앞 논 에 dPER 아미노산 926-977 역할이 dCLK 이

결합하는 부 고 (Sun 등 2010), 우리는 dCLK 아미노산 657-

707 역할 내 해 연구를 진행하 다. dCLK 에 아미노산

657-707 이 거 plasmid 를 만들었고, 이것 이용하여 S2

포에 immunoprecipitation(IP) 통해 인 결과 dPER 가 결합하지

못하 다. 뿐만 아니라 dPER 사 억 가 일어나지 않 에도

dCLK 에 아미노산 657-707 이 거 plasmid 는 사 자체가

없어지는 것 찰할 있었다. 이 상이 dCLK 과 이 이합체를 하는

CYC 가 결합하지 못해 일어나는 상이 아니라는 것

Immunoprecipitation (IP)를 행함 써 알 있었다.

리 에 dCLK 아미노산 657-707 역할 연구하 해

아미노산 657-707 이 거 dCLK 하는 리를 작하 다.

작한 질 리를 이용하여 하루 생체리듬 한 결과

상 인 dCLK 하는 리는 상 인 rhythm 나타내는데

해 dClk(△657-707) 하는 리는 개 독립 인 라인에

activity 에 는 차이가 보이 했 나 모 arrhythmic 해지는 것 알

- 41 -

있었다.그리고 dClk(△657-707) 하는 리 molecular rhythm

에 는 in vitro 결과에 상 못했 PER TIM 단 질 생 이

WT 에 해 level 이 낮지만 rhythmic 하게 만들어 진다는 사실 알게

었다. 이 것 좀 자 히 알아보 해 12:12 LD 상태에 리

하루 동안 어 상태에 리 mRNA 변 량 인한 결과 dClk

경우 WT 에 해 PER 에 한 해를 지 않 에 level 이 높 것

인할 있었지만 시간에 른 변 량 WT 과 슷한 주 를 가지고

있었다. 하지만 tim 경우에는 12:12 LD 상태에 리 하루 동안

변 량 WT 에 해 level 이 낮 며 거 주 를 가지지 않는 것

인이 었다. 이 결과는 우리가 만든 dClk(△657-707) 하는

리가 사 잃어 버리는 것에 해 가능한 결과 다.하루

동안에 어 상태에 놓 리 dClk mRNA 변 량 WT 과 크게

차이가 없 며 level 이 높 것 볼 있는데 tim mRNA

변 량 WT 에 해 사 이 욱 떨어진 것 인할 있었다.tim

mRNA 가 시간에 른 주 를 가지지 못하면 늦 인 CT 20 에

peak 나타내는데 mRNA 에 도 시간에 른 변 가 molecular level

변 일 하는 상 인 할 있었다.

- 42 -

참고 헌

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- 46 -

-Abstract-

Role of PERIOD binding domain for CLOCK in Drosophila

circadian clock

Doo-Hyun Kang

Department of Medical Sciences (Neuroscience)

The Graduate School, Ajou University

(Supervised by Associate Professor Eun-Young Kim)

Negative transcriptional feedback loops are a core feature of

eukaryotic circadian clocks and are based on rhythmic interactions between

clock-specific repressors and transcription factors. In Drosophila, the

repression of CLOCK (CLK)-CYCLE (CYC) transcriptional activity by

PERIOD (PER) is critical for driving circadian gene expression. To better

understand how PER inhibits CLK-CYC transcriptional activity, we sought

to identify PER binding domain of CLK. To this end, we made several

versions of mutant CLK which is internally deleted with 100~ 200 amino

- 47 -

acids.We evaluated the interaction between each CLK internal deletion

mutants and PER via immunoprecipitation. CLK internally deleted with aa

657-707, which is similar to 19 region of mammalian CLK, could not

interact well with PER in S2 cells. To investigate the role for amino acid

657-707 in vivo,we made transgenic flies expressing Clk△657-707 while

clk-WT rescued the arrhythmicity of clkOUT flies, CLK△657-707 could

not restore arrhythmic locomotorbehavior.This result suggest that as in the

case of S2 tissue culture, amono acid 657-707 might play critical roles

for maintaining circadian clock system. Further study will be necessary to

investigate the role of amino acid 657-707 in vivo using Clk△657-

707 ;ClkOUT flies

Keywords: Drosophila, Circadian clock, dPERIOD, dCLOCK, per binding

domain, Transcription