1 

SUPPLEMENTARY INFORMATION 

 A novel mechanism for activating uncoupled nicotinic acetylcholine receptors 

  

Corrie J.B.  daCosta¶†, Lopamudra Dey¶, J.P. Daniel Therien, and John E. Baenziger*    Department of Biochemistry, Microbiology, and Immunology, 451 Smyth Rd., Ottawa, ON, K1H 8M5; Tel: (613) 562‐5800 x8222; Fax: (613) 562‐5440  ¶These authors contributed equally to this work  †Present  Address:  Receptor  Biology  Laboratory,  Department  of  Physiology  and  Biomedical Engineering, Mayo Clinic College of Medicine, Rochester, Minnesota 55905, USA.   

 

 

SUPPLEMENTARY RESULTS 

Includes:   Supplementary Figures 1‐10 with captions   

Nature Chemical Biology: doi:10.1038/NChemBio.1338

2 

  

   Supplementary Figure 1 | The uncoupled nAChR.  (a) The nAChR in reconstituted membranes adopts coupled (resting, R; open, O; and desensitized, D conformations) and uncoupled (U) conformations.  (b) The uncoupled POPC‐nAChR does not transition to the desensitized state upon agonist binding.  Ethidium bromide fluorescence emission intensity plotted in arbitrary units (au) as a function of time after addition of i) native‐nAChR, ii) PC/PA/Chol‐nAChR, or iii) POPC‐nAChR.  At the indicated time points, the noted nAChR membranes (~60 μM BTX binding sites), 500 μM Carb, and 500 μM dibucaine were added.  Dibucaine is an open channel blocker that binds competitively with ethidium.  (c) The fraction of peptide hydrogens that remain in the protiated versus deuterated form is plotted as a function of time after exposure to 2H2O for PC‐nAChR (●) and PC/PA/Chol‐nAChR (■) both in the presence (filled symbols) and absence (open symbols) of Carb.     

   

Nature Chemical Biology: doi:10.1038/NChemBio.1338

3 

    Supplementary Figure 2 | Effect of lipid acyl chain length on the stability of detergent solubilized nAChR and its incorporation into lipid bilayers.  (a) nAChR protein yields from affinity columns run in parallel in the presence of 1% cholate and the noted lipid to assess the effects of each lipid on the stability of the nAChR in the solubilized state.  Percentage yields are relative to columns run in the presence of soybean asolectin.  All values are ±standard deviation, n=2 experiments. (b)  Incorporation of the nAChR into di14:1PC, di18:1PC, di22:1PC, and asolectin membranes was determined using step sucrose‐density gradients.    nAChR‐free liposomes, reconstituted nAChR membranes (lipid:nAChR ratio roughly 500:1 (mol:mol)), and low lipid:nAChR aggregates settle at the interfaces between 0%/20%, 20%/35%, and 35%/70% sucrose, respectively (daCosta et al. J. Biol. Chem. (2009) 284, 17,819‐25).  (c) Representative thin layer chromatography of lipid extracts from a di22:1PC reconstitution.  TLC includes the lipid standards diacylglycerol (DAG), cholesterol (Chol), phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), and phosphatidylserine (PS).  Mock refers to a mock lipid extraction performed in the absence of reconstituted nAChR membranes.   

di14:1PC

di18:1PC

di22:1PC

Asolectin

9.9 ± 4.4

93.5 ± 5.6

100.0 ± 0.0

99.7 ± 0.5

Prot

ein

Yiel

d (%

)

100

90

80

di14:1

PC

di16:1

PC

di18:1

PC

di20:1

PC

di22:1

PC

di24:1

PC

1% C

holat

e

Mock

DAGCho

lPC

di22:1

PC PE PS

a b

c

0%

20%

35%

70%

di14:1PC di18:1PC di22:1PC Asolectin

Membrane % Incorporationa

% of total protein at the 20-35% interface± standard deviation, n = 2

a

b

b

Nature Chemical Biology: doi:10.1038/NChemBio.1338

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Supplemamide  I nAChR, trypsinogβ‐sheet amixed α‐Spectra smoothinRes. Com

mentary  Figuband  shapeii)  myoglobgen (10% α‐are  shown  i‐helix/β‐shewere  deconng = 80%. Dmmun. (2011

ure  3  |  Dece  and  protebin  (85%  α‐helix, 55% βin grey.     Coet secondarnvolved  usiata from da1) 407:456‐6

i ii iii iv

convolved  inein  secondaα‐helix),  iii)β‐sheet).   Fromparison ory structure ng  GRAMS Costa et al.,0).  

4 

nfrared  speary  structurelysozyme 

requency reof  the  spectwith a slighAI  betwee, 2011 (data

α β

ctra  showine.    Spectra (45%  α‐hegions typicatra  suggests ht predominn  1900  anda from daCo

 

β

ng  the  correare  from  i)lix,  20%  β‐ally attributethe α4β2 nance of α‐hd  1300  cm‐

sta et al., Bi

elation  betw)  neuronal  α‐sheet),  anded to α‐helixnAChR exhibhelical struct1,  with  γ=8iochem. Bio

ween α4β2 d  iv) x and bits a tures.  8  and phys. 

Nature Chemical Biology: doi:10.1038/NChemBio.1338

5 

 

 

 

  

 

Supplementary  Figure  4  |  Infrared  difference  spectroscopy  detects  the  structural  changes induced  in  the nAChR upon  ligand binding.    (a)  FTIR  spectra  of  the nAChR  recorded  in  the resting (top trace) and Carb‐desensitized (middle trace) states are visually identical because the structures of and  local environments surrounding most residues  in the protein are unaffected by the conformational change.  Subtle vibrational shifts upon Carb‐induced desensitization can be  detected  by  digitally  subtracting  the  two  spectra  (lower  trace)  ‐  note  the  different absorption  scale.    (b)  To  obtain  sufficiently  high  fidelity  spectra  for  calculating  spectral differences, films of the nAChR are deposited on a germanium internal reflection element.  Two spectra in the ligand‐free and then one spectrum in the ligand‐bound states are recorded while alternately flowing buffer without and then with the ligand of interest (in this case, Carb), past the nAChR  film.   The spectrum recorded  in  the presence of Carb minus  the second spectrum recorded  in the absence of Carb  is referred  to as a Carb‐difference spectrum.   The difference between the two spectra recorded in the absence of Carb is referred to as a control difference spectrum  (see  Supplementary  Fig.  6b).    The  ability  to  remotely  and  repetitively  trigger  the conformational transition allows for the acquisition of highly reproducible infrared spectra from which  subtle  spectral differences  can be accurately assessed.   To achieve  sufficient  signal  to noise,  difference  spectra  are  typically  the  average  of  between  >50  individual  difference experiments.           

Nature Chemical Biology: doi:10.1038/NChemBio.1338

6 

 

 Supplementary Figure 5 | Infrared difference spectra provide a spectral fingerprint of nAChR‐agonist physical  interactions.   The majority of peaks  in  the Carb‐difference  spectrum  reflect shifts in the vibrations of binding site residues that occur when they interact physically with the agonist.   (a) Structures of the agonists Carb and tetramethylamine (TMA).   (b) A schematic of the nAChR agonist binding site showing the “anionic sub‐site”, which is formed by aromatic π‐electrons (blue) that interact with the quaternary amine of Carb or TMA, and the “esterophilic sub‐site”  (green), which  interacts with  the  ester  carbonyl  of  Carb.    (c)  Carb‐difference  (top trace),  TMA‐difference  (middle  trace),  and Carb‐minus‐TMA  (lower  trace)  difference  spectra.  The  Carb‐difference  spectrum  exhibits  a  vibration  due  to  the  Carb  C=O  stretching  vibration (asterisk),  but  this  vibration  is  absent  in  the  TMA‐difference  spectrum  (TMA  lacks  the  C=O functional group).   Both Carb‐ and TMA‐difference spectra exhibit vibrational shifts that result from  the  resting‐to‐desensitized  conformational  change  (light  shading).    They  also  exhibit prominent negative  and positive peaks near 1620  and 1515  cm‐1 due  to  vibrational  shifts of anionic  sub‐site  aromatic  residues  that occur upon binding  the quaternary amine of Carb or TMA.   A Carb‐minus‐TMA difference  spectrum  is obtained when a  spectrum  recorded  in  the presence of TMA is subtracted from a spectrum recorded subsequently in the presence of Carb.  The Carb‐minus‐TMA difference  lacks peaks due to the resting‐to‐desensitized conformational change, as the desensitized conformation  is stabilized  in the presence of both Carb and TMA.  Difference  peaks  due  to  the  formation  of  quaternary  amine‐aromatic  interactions  are  also absent because the same amine‐aromatic  interactions occur  in the presence of both agonists.  The Carb‐minus‐TMA difference exhibits two positive/negative couples (labeled, +/‐) due to the vibrational shifts of an esterophilic sub‐site residue.  The negative peaks reflect the vibrations of this  residue  in  the presence of TMA  (i.e. no  interactions with TMA), while  the positive peaks reflect  the  vibrations  of  this  same  residue  upon  formation  of  physical  interactions with  the ester carbonyl of Carb.   

Nature Chemical Biology: doi:10.1038/NChemBio.1338

7 

  

   

Supplementary  Figure 6 | Conformationally  sensitive bands  in Carb‐difference  spectra.    (a) Carb‐difference  spectra  recorded  from  aso‐nAChR  (trace  i)  and  PC/PA/Chol‐nAChR  (trace  ii) both  exhibit  amide  I  and  II  band  intensity  near  1655  and  1545  cm‐1  that  reflects  structural changes in the polypeptide backbone upon transition from the resting to the desensitized state.  Carb‐difference  spectra  recorded  while  the  nAChR  is  maintained  continuously  in  the desensitized state by  the  local anesthetic, dibucaine, do not exhibit  intensity at  these marker frequencies (trace iii).  PC‐nAChR does not exhibit intensity at the same marker frequencies and thus also does not undergo the resting‐to‐desensitized conformational transition, despite Carb binding  (trace  iv).   Note  that  the  appearance  of  a  vibration  due  to  bound  Carb  (1724  cm‐1) shows  that  Carb  binds  to  PC‐nAChR.      (b)  Comparision  of  the  Carb‐difference  and  control difference spectra recorded from aso‐nAChR (trace i),  di22:1PC‐nAChR (trace ii), and di18:1PC‐nAChR (trace iii).  The control difference spectra are shown in grey.      

Nature Chemical Biology: doi:10.1038/NChemBio.1338

8 

      Supplementary  Figure  7  |  Kinteics  of  ethidium  binding  to  the  nAChR.    (a)  Fluorescence emission  intensity of ethidium bromide  recorded as a  function of  time after addition of aso‐nAChR ii) without (grey line) or iii) with (black line) 30 min prior incubation with Carb:  In i) the traces recorded with and without prior incubation with Carb are superimposed, normalizing the spectra to highlight the different rates of ethidium binding under the two conditions.  (b)  Curve fitting of the ethidium binding data.   

Nature Chemical Biology: doi:10.1038/NChemBio.1338

9 

    

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Supplementary Figure 8 | Rapid ethidium binding after the addition of Carb is governed by a rapid transition to the open state.  The fluorescence emission of ethidium was monitored with PC/PA/Chol‐nAChR.  Trace i, at the indicated times ~50 nM nAChR, 500 μM Carb, and 500 μM dibucaine (Dib) were added to a 0.3 μM solution of ethidium.  Trace ii, nAChR was preincubated with 500 μM Carb before adding to the ethidium solution. Trace iii, the nAChR was added to a solution of both ethidium and Carb.  The latter shows that the rapid binding upon Carb addition (trace  i)  is  not  due  to  a  mixing  phenomenon,  but  is  governed  by  agonist‐induced conformational transitions.  Data from daCosta et al., J. Biol. Chem. (2009) 284, 33841‐33849. 

Nature Chemical Biology: doi:10.1038/NChemBio.1338

10 

 

Supplementary  Figure  9  |  Effects  of  membrane  physical  environment  on  nAChR conformational  transitions.  (a)  The  deconvolved  lipid  ester  carbonyl  vibration  showing components  due  to  hydrogen  bonded  (~1730  cm‐1)  and  non‐hydrogen  bonded  (~1740  cm‐1)  lipid C=O from i) aso‐nAChR, ii) PC/PA‐nAChR, iii) PC/PG‐nAChR, iv) PC/Chol‐nAChR, v) di22:1PC‐nAChR, vi) di18:1PC‐nAChR, vii) di14:1PC‐nAChR, and viii) POPC‐nAChR.  All spectra recorded at 22.5 oC.    (b) No ethidium binding shows that POPC‐nAChR  is  locked  in a  low‐affinity ethidium binding uncoupled conformation at temperatures close to or well above the gel‐to‐liquid crystal phase transition of the reconstituted bilayer (‐1.8 oC).  (c) The nAChR in PC/PA membranes, with PA containing palmitoyloleoyl    (POPA) or dioleoyl  (DOPA) acyl chains  is stabilized  in a  resting conformation that undergoes robust conformational transitions at varying temperatures above and below the gel to liquid crystal phase transition temperatures of the two bilayers (PC/POPA‐nAChR, +23.7 oC; PC/DOPA‐nAChR, +0.5 oC (data from daCosta et al.  J. Biol. Chem. (2002) 277, 201‐208)).     The deconvolved  lipid ester carbonyl (left panel) and Carb‐difference (right panel) recorded from i) PC/POPA‐nAChR at 22.5 oC, PC/DOPA‐nAChR at 22.5 oC, iii) PC/POPA‐nAChR at 15 oC, and iv) PC/POPA‐nAChR at 30 oC. 

Nature Chemical Biology: doi:10.1038/NChemBio.1338

11 

 

Supplementary Figure 10 | The lipid exposed transemembrane α‐helices of the nAChR and KcsA.  (a) Comparison of the nAChR M4 α‐helix sequences with those of the lipid‐exposed transmembrane α‐helices of KcsA.  Solid boxes denote the transmembrane α‐helices.  Dashed boxes highlight regions that are not observed in the nAChR structure.  (b) The transmembrane domain structures of the nAChR (pdb code 2BG9) and KcsA (pdb code 1BL8).  For the nAChR, the γ‐subunit is in the foreground with the αγ and αδ subunits on the left and right, respectively.  Transmembrane α‐helices are shown as transparent ribbon diagrams.  Lipid exposed aromatic (yellow), positive (blue), and negative (red) residues on the nAChR M4 α‐helices and on the KcsA inner and outer α‐helices are highlighted as spheres.  Individual subunits of both the nAChR (α‐subunit) and KcsA are shown below, with two residues lining the channel axis in each subunit shown as tan sticks.  

Nature Chemical Biology: doi:10.1038/NChemBio.1338