2011_23 clonacion y transgenesis animal
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Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Agrobiotecnología Curso 2011
Clonación y transgénesis animalLino Barañao
Clonación
Referencias
Aplicaciones
Animales transgénicos
Recombinación homóloga
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Sumario
Clonación en distintas especies
Clonación
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
• En los animales, la clonación se basa en el uso de la técnica de transplante nuclear.
• Mediante esta técnica, una célula donante. del individuo a clonar se transfiere a un . ovocito previamente enucleado.
TRANSPLANTE NUCLEAR
La clonaciónconsiste en la producciónde individuosgenéticamenteidénticos
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
ovocito embrión sintético
célula donante
Enucleación Electrofusión
Células embrionarias(totipotenciales)
Células diferenciadas
X
Nuevo individuo
La diferenciación es un proceso irreversible asociado a la pérdida de totipotencialidad. Sólamente las células embrionarias tienen la potencialidad de generar un organismo completo. De ahí el estatusúnico del embrión.
La diferenciación es un proceso irreversible asociado a la pérdida de totipotencialidad. Sólamente las células embrionarias tienen la potencialidad de generar un organismo completo. De ahí el estatusúnico del embrión.
Dolly fue clonada a partir de una célula de glándula m amaria, demostrando que aún las células somáticas diferenciada spueden ser totipotenciales.
Dolly fue clonada a partir de una célula de glándula m amaria, demostrando que aún las células somáticas diferenciada spueden ser totipotenciales.
La diferenciación celular sería la consecuencia de la unión reversible de factores de transcripción tejido-específicos que regulan la expresión de un grupoparticular de genes.
Embrión Célula somática
Corolario: La “potencialidad” para dar un nuevoindividuo no es privativa del núcleo de las célulasembrionarias
Corolario: La “potencialidad” para dar un nuevoindividuo no es privativa del núcleo de las célulasembrionarias
Reprogramación: Los factores de transcripción origi nalmentepresentes en la célula donante se diluyen y son reempla zados por aquellos presentes en el oocito
• ¿Cuáles son las aplicaciones de la clonación animal?
Para la clonación de bovinos suele partirse de células fetales como donantes del material genético. Los ovocitos pueden provenir de animales sacrificados paraconsumo ya que sólo aportan el ADN mitocondrial. El embrión obtenido en cultivo debe ser luego transferido a una hembra receptora para completar su desarrollo.
Clonación reproductiva de bovinos
Células donantes
• Células fetales
- La vida media es de 35 divisiones celulares.Ello permite su manipulación genética.
- La tasa de divisiones de 1,3 divisiones por día.- Son muy sensibles a la inhibición por contacto.
- Se desarrollan en mayor proporción.
• Células adultas
- La vida media es de 20 divisiones celulares.- La tasa de divisiones de 0,8 divisiones por día.- Son muy sensibles a la inhibición por contacto.- Se desarrollan en menor proporción.
cortar el tejido
explanto
OVOCITOS MADUROSOVOCITOS INMADUROS
• Los ovocitos obtenidos de ovarios de animalessacrificados para consumodeben ser madurados in vitro .
• La maduración consiste en el avance de la división meióticahasta la metafase II.
• En este estadío se observa la extrusión del primer cuerpopolar.
Ovocitorecipiente
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Expansión de lascélulas del cúmulus
24 hs
Primer cuerpo polar
Para implementar la técnica de transplante nuclear se requiere disponer de micromanipuladores y de un microscopio con accesorios para visualizar fluorescenci a.
Gentileza de Biosidus S.A.
Transplantenuclear
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Gentileza de Biosidus S.A.
Transplante nuclear
Ovocito en MII Enucleación
Célula donante Transplante nuclear
Gentileza de Biosidus S.A.
Fusión celular
Activación
Post-fusión
Post-activación
Desarrolloembrionario
y preñez
Aplicacionesde la clonación
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
• La clonación reproductiva tiene distintasaplicaciones en biotecnología animal.
- Clonado con fines agropecuarios
- Clonado de animales de zoológicosy mascotas
- Clonado para introducir modificacionesgenéticas
• La clonación terapéutica se aplica en medicina humana.
Clonación en distintas especies
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Clonación en ovinos
El primer mamífero clonado a partir de una célula somáti cafue una oveja, la ahora mundialmente conocida Dolly.
Tomado de: http://www.roslin.ac.uk/imagelibrary/
Tomado de: Hill et al., Biol. Reprod., 2000.
Uno de los primeros bovinos clonados fue “ Second chance ”
Clonaciónde bovinos
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Clonación en la Argentina
(De cómo una sucesión de fracasos puede conducir al éxito)
“Pampa” fue la primera ternera nacida por clonacióna partir de fibroblastos fetales en Argentina
Clonaciónde bovinos
Agrobiotecnología
Animales
transgénicosGentileza de Biosidus S.A.
Tomado de: Poleiaeva et al., Nature, 2000.
Cerdos clonados obtenidos por transferencianuclear de células somáticas de un animal adulto
El clonado de cerdos requiriómodificar la técnica habitual
de transplante nuclear.
A pesar de que su dueño invirtió más de 3 millones de dólares en ello, “Missy”murió en 2002 sin haber sido clonada.
Clonación de mascotas
http://www.missyplicity.com
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Clonación de mascotas
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
http://www.savingsandclone.com/clients/our_latest_clones.html
Clon de Little Gizmo
Clon de Rainbow
Tomado de: Meng et al ., Biol. Reprod.,1997.
Clonaciónde primates
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
”Neti” y “Ditto”
• La clonación reproductiva carece de justificación médica.
• Su aplicación masiva es totalmenteimprobable en las condiciones actuales
¿Clonaciónde humanos?
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Clonación terapéutica
• La denominada clonación terapéutica permite generartejidos de reemplazo a partir de células del paciente.
Ovocito (donado)
Tejido normal
(ej. fibroblastos)
Transplante nuclear
Embrión (?) sintético
Células embrionarias
(pluri o totipotenciales)
Factores de crecimiento
Matriz extracelular
Células precursoras del
tejido dañado
Autotransplante
Animales transgénicos
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
• Un animal transgénico es aquel que tiene una porción de ADN foráneo en su genoma.
Animalestransgénicos
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Hembra superovuladaMacho fértil
X
Inyección con ADN foráneo
PromotorPromotorPromotorPromotor
Colecta de embriones
Implantación de los embriones en hembras seudopreñadas
Extracción del ADN y detección de la presencia del transgen
Crías
Hembra superovuladaMacho fértil
X
Inyección con ADN foráneo
PromotorPromotorPromotorPromotor
Colecta de embriones
Implantación de los embriones en hembras seudopreñadas
Extracción del ADN y detección de la presencia del transgen
Crías
- Los primeros animales transgénicos producidos fueron. ratones, obtenidos mediante microinyección de cigotas
Elementosrequeridosen unaconstruccióngenética
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
exones
ADN copia
Promotor original del gen a expresar
ADN genómico
intrones
ARN mensajero
intrónPromotor regulable o tejido específico
Gen recombinante
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
La técnica de microinyecciónde cigotasresulta muypoco eficienteen bovinos
Microinyección de cigotas bovinos
Eficiencia en la producción de animalesTransgénicos por microinyección
Eficiencia en la producción de animalesTransgénicos por microinyección
Cigotas microinyectadas 2.800
Sobreviven la microinyección 2.500
Embriones transferidos a receptoras 250
Preñeces 50
Terneros transgénicos 1
La introducción de genes por transfección y posterior selección de células totipotenciales permite producir
animales transgénicos con muy alta eficiencia.
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Clonación y transgénesis
Gentileza de Biosidus S.A.
Day of milking after lactogenesis
10 20 30 40 50 60 70 80 90
hGH
g /
day
0
10
20
30
40
50
60
70
• High level expression of bioactive recombinant human growth hormone in the milk of a cloned transgenic cow (J. Biotechnology, 2006)
• Daniel Salamone1,2, Lino Barañao3 Claudio Santos,1Jorge Artuso1, Carlos Werning1, Leonardo Bussmann6 Aida Prync1CesarCarbonetto1, , Susana Dabsys1, , Carlos Munar5 Guillermo Berra4, Ignacio Berra, Roberto Salaberry1, Nahuel Fernández1, Mariana Papouchado, Marcelo Foti1, Norberto Judewicz1, Ignacio Mujica5, , Luciana Muñoz, Silvana Mannocci 1, Silvina Fenández Alvarez1, Eliseo González, Juan Zimmermann, Marcelo Criscuolo1, Carlos Melo1.
•• 1. Biosidus S.A.• 2. Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires• 3. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires• 4. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria• 5. Munar y Asociados• 6. Instituto de Biología y Medicina Experimental-CONICET
25 profesionales, 2 empresas, 3 instituciones
Res non verba
•PAMPAAugust 6, 2002•PAMPAAugust 6, 2002
•PAMPA MANSASeptember 24, 2002•PAMPA MANSASeptember 24, 2002
•PAMPA MANSA II & IIIJanuary 5, 2004•PAMPA MANSA II & IIIJanuary 5, 2004
PAMPERO •December 7, 2004
PAMPERO •December 7, 2004
Recombinación homóloga
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Recombinación homóloga
Neo
el alelo en el que se ha producido la recombinación homologa no produce proteína activa
exonespromotor
contrucción conteniendo un gende resistencia a antibióticoflanqueado por secuencias
homólogas al exón a eliminar
intronesgen de resistencia a antibiotico
gen endógeno
secuencias homólogas
recombinación
Neo
Neo
• La recombinación homóloga elimina un alelo por vez.• Los animales resultantes son heterocigotas.
Recombinación homóloga
recombinación homóloga
transferencia nuclear
linea celular de partida
se ha eliminado uno de los alelos del gen
el animal resultante posee todavía una copia activa del gen
NeoNeoNeo
Para obtener homocigotas (que no expresen la proteína) es necesarioel cruzamiento de machos y hembras genéticamente modificados.
Recombinación homóloga
XNeoNeo
NeoNeo
NeoNeo
NeoNeoNeoNeo
NeoNeo
Homocigota
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Recombinaciónhomóloga
Tomado de: McCreath et al., Nature, 2000.
“Cupido” y “Diana”, primeros corderosproducidos por la técnica de “ gene targeting ”
Estrategiasalternativaspara la supresión de una proteína
ADN
ARNm
Transcripción
Traducción
Proteína a suprimir
Recombinación homóloga
Silenciamientopor RNAi
X
X
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
La introducción de secuencias cortas (22pb) de ARNs homólogos de doble cadena desencadena
un proceso que degrada al ARNm blanco y conduce a la supresión de la proteína respectiva
Silenciamientogénico
Degradacióndel ARNm
ADN
Transcripción
ARN doblecadena
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Características de los métodos usadospara suprimir proteínas
- Afecta al ADN (suprime el gen)
- Requiere dos generaciones para obtener el fenotipo deseado
- La supresión es total
- Proteínas candidatas: PrP, lactoglobulina
- Afecta al ARN (suprime al mensajero)
- El fenotipo deseado se obtiene en la primera generación
- Pueden obtenerse niveles intermedios
- Proteínas candidatas: lactoglobulina, proteínas de la leche, miostatina
Recombinación homóloga Silenciamiento por ARNi
Aplicaciones
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
• Producción de alimentos:- Incremento en la velocidad de crecimiento y/o masa muscular en cerdos y peces- Introducción de genes de resistencia a enfermedades
• Producción de órganos para xenotransplante:- Producción proteínas humanas que bloquean la acción del complemento en cerdos(ejemplo, CD59)
- Transplantes temporaríos de corazón o hígado hasta la obtener donantes compatibles
• Fines ornamentales:- Peces que expresan proteinas fluorescentes
• Producción de fármacos (“ molecular pharming ”)- Producción de proteínas recombinantes humanas en leche y suero
• Modelos animales para patologías humanas- Efectos de sobreexpresión de genes- Eliminación de genes (“knock out”)
• Producción de alimentos:- Incremento en la velocidad de crecimiento y/o masa muscular en cerdos y peces- Introducción de genes de resistencia a enfermedades
• Producción de órganos para xenotransplante:- Producción proteínas humanas que bloquean la acción del complemento en cerdos(ejemplo, CD59)
- Transplantes temporaríos de corazón o hígado hasta la obtener donantes compatibles
• Fines ornamentales:- Peces que expresan proteinas fluorescentes
• Producción de fármacos (“ molecular pharming ”)- Producción de proteínas recombinantes humanas en leche y suero
• Modelos animales para patologías humanas- Efectos de sobreexpresión de genes- Eliminación de genes (“knock out”)
Aplicaciones
• Cambios cualitativos en la producción de leche:
- Producción de lactoferrina en leche bovina- Producción de leches “humanizadas”- Modificación de las caseínas para la producción de . quesos especiales
• Cambios cualitativos en la producción de carne:
- Producción de carne bovina libre de riesgode BSE
- Modificaciones cualitativas
• Cambios cualitativos en la producción de leche:
- Producción de lactoferrina en leche bovina- Producción de leches “humanizadas”- Modificación de las caseínas para la producción de . quesos especiales
• Cambios cualitativos en la producción de carne:
- Producción de carne bovina libre de riesgode BSE
- Modificaciones cualitativasAgrobiotecnología
Animales
transgénicos
Transgénesis en bovinos.Producciónde alimentos
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Transgénesis en bovinos.Producciónde alimentos
Bovinosgenéticamentemodificadospara mejorarla producciónláctea
La introducciónde copias extra del gen de hormona de crecimientoaumentanotablementela velocidadde desarrollode truchas y salmones.
Tomado de: Devlin et al., Nature, 2001.
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Transgénesis en peces.Producciónde alimentos
www.aquabounty.com
Expresión de proteínas fluorescentesen peces cebra
http://www.glofish.com/photos.asp
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Transgénesis en peces.Fines ornamentales
El uso de promotores específicos permite detectarpatrones de expresión durante el desarrollo
Tomado de: Wittbrodt et al., Nat. Rev. Genet., 2002.
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Transgénesis en peces.Modelosexperimentales
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Transgénesis en insectos: transformaciónde gusanosde seda
Tomado de: Tomita et al., Nat. Biotechnol., 2003.
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Transgénesis en insectos: mosquitos
Tomado de: Catteruccia et al., Nature, 2000.
• Se está intentando producir mosquitosresistentes al parásito de la malaria.
Larvas de mosquitos transgénicos (izquierde y centro) que expresan el gen de la proteína GFP. Panel de la izquierda: luz UV; panel de la derecha: luz blanca
• La expresión de proteínas en la clara de huevotiene un enorme potencial.
• La transgénesis en aves se enfrenta todavíacon notables dificultades técnicas derivadasde los problemas del aislamiento de ovocitosy cigotas y el posterior cultivo embrionario.
• Se ha logrado expresar enzimas en la clara del huevo y se obtuvieron quimeras que expresangenes marcadores. La heredabilidad de estoscaracteres es baja.
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Transgénesis en aves
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Transgénesis en cabras
Tomado de: Keefer et al., Biol. Reprod., 2001.
La empresa Nexia (Canadá) ha logrado producir cabras queexpresan fibroína (proteína de la tela de araña) en su l eche.
Universidadde Missouri-Colombia
Immerge BioTherapeutics Inc
• Se han transformado cerdos con el gen de la Green Fluorescent Protein mediante transfección de célulassomáticas en cultivo y posterior clonado.
• Xenotransplante:
- La eliminación de genes para la alfa 1-3 galactosil transferasa permitiría obtener cerdos que no posean el residuo galactosaen su endotelio y, por lo tanto, sean menos proclives al rechazo agudo.
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Transgénesis en cerdos
ENVIROPIG University of Guelph
Cerdo
Cabra
Oveja
Vaca
Litros/año
250
400
500
10.000
Proteína
250
400
500
10.000
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
AplicacionesProducciónde proteínasrecombinantes humanasen la lecheanimal
Capacidad de producción de proteínasrecombinantes en la leche en distintas especies
Capacidad de producción de proteínasrecombinantes en la leche en distintas especies
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Aplicaciones.Producciónde fármacos
Volumen del mercado mundial en proteínas humanas:
- U$S 20.000 millones
Ejemplos:- Antitrombina 3: U$S 200 millones- Albúmina sérica: U$S 1.500 millones
Volumen del mercado mundial en proteínas humanas:
- U$S 20.000 millones
Ejemplos:- Antitrombina 3: U$S 200 millones- Albúmina sérica: U$S 1.500 millones
Factor VIII 120 g 2 vacas10-25 ovejas
Alfa-1-antitripsina 5.000 kg 33.000 ovejas42.000 cabras
Factor IX 2 kg 13 ovejas22 cerdos
Albúmina sérica 1000 kg 300 vacas8.300 cabras
Activador tisular del plasminógeno
75 kg 600 cabras
Requerimientos mundiales de proteínas humanas y númerode animales transgénicos necesarios para satisfacerlo
1 huevo de oro(1,3 kg) por día
Vaca transgénica2 g/L hTPA
10.000 U$S/g30 L por día
U$S 15.000/día U$S 600.000/día
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
AplicacionesProducciónde proteínasrecombinantes humanasen la lecheanimal
• El uso de animales transgénicos comobioreactores permitiría suplir la demanda de
proteínas recombinantes, en particular de aquellas que requieren producción masiva.
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Aplicaciones
Demanda de capacidad productiva instalada(datos a nivel mundial)
Productividadde 1 animal transgénico:
1,5 kg de proteínaterapéutica/año =equivalente a 200.000 L de fermentación
o sea
1 animal transgénico =4 fermentadoresde 500 L
• Producción de proteínas recombinantes en lechede animales transgénicos:
• Demanda anual de hormona de crecimiento (hGH):
- Mercado latinoamericano: producción de 2 animales transgénicos
- Mercado mundial: producción de 40 animales transgénicos
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Aplicaciones
ANDi
Agrobiotecnología
Animales
transgénicos
Referencias 1. Palma, G.A. Biotecnología de la Reproducción. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA, Argentina), 2001.
2. Hwang, W.S., Ryu, Y.J., Park, J.H., Park, E.S., Lee, E.G., Koo, J.M., Jeon, H.Y., Lee, B.C., Kang, S.K., Kim, S.J., Ahn, C., Hwang, J.H., Park, K.Y., Cibelli, J.B., Moon, S.Y. Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a clonedblastocyst. Science, 303:1669-74, 2004.
3. Cristophides, G.K. Transgenic mosquitoes and malaria transmission. Cellular Microbiology, 7:325-333, 2005.
4. Wilmut, I. Cloning for Medicine. Scientific American, 279:58-63, 1998.
5. Sitios relacionados con clonación animal:
http://ag.arizona.edu/ANS/courses/cloning2/http://www.infigen.com/http://www.advancedcell.com/http://www.emtran.com/http://gslc.genetics.utah.edu/units/cloning/whyclone