Funghi opportunisti

PATOGENI OPPORTUNISTI

Absidia corymbiferaAspergillus fumigatus

Candida albicansCrytococcus neoformans

Pneumocystis cariniiRhizomucor pusillus

Rhizopus oryzae (R.arrhizus)

Candida Candida albicansalbicansè un fungo dimorfico

CANDIDOSI

• Provocate da Candida albicans e altre candidaspp. che costituiscono la normale flora nellabocca, sulla pelle, nella vagina e nell’intestino

• Può manifestarsi in seguito a trattamenti conantibiotici che sopprimono la normale florabatterica e ne permettono una crescita maggiore

Infezioni sistemicheInfezioni sistemiche dadaCandidaCandida si manifestano si manifestano

• In pazienti fortemente debilitati (es. cancro)• In diabetici• In pazienti sottoposti a chemioterapia• Soggetti sottoposti a trapianto

(immunosoppressi)• Nei leucemici• Nei malati di AIDS

Terapia orale-fluconazolo etc

La transizionelievito ifelievito ife

•Aumento della temperatura (25° → 37°C)

•Aumento del pH del mezzo (acido → basico)

•Limitazione dei nutrienti (es. glucosio)

•Siero

in vitro viene indotta da:

IFE: pH 7.0 / 37°C

GERM TUBES

4-6 MICRONS

Pseudoifa

Clamidospore

DIAGNOSI di Candida albicans

1. Osservazione macroscopica

Colonie: inizialmente bianche, cremose, brillantipoi diventano rugose

• Candida: piastra dopo 24 ore

2. Osservazione microscopica

• Forma:rotondeggiante - ovale

• Blastospore• Presenza di Pseudoife

3. Tests specifici

• Test di blastèse:Mette in evidenza i tubi germinativi: filamenti che si formano

a partire dalle blastospore (nessun restringimento allabase)

• Ricerca di clamidospore:Spore (endosporulazione) sferiche o ovali prodotte in

condizioni avverse.

3.1. Test di blastèse:

Coltura liquida

1 mlsiero

Agitare

Incubare 3h a37°C

3.2. Ricerca di clamidospore

Una goccia di coltura

Terreno a base di mais

Mettere un vetrino

Incubare 24 - 48h a 28°C

Guardare almicroscopio

Isolamento Isolamento in in Candida Candida albicansalbicansdi geni differenzialmentedi geni differenzialmente

espressi medianteespressi mediante DDRT-PCRDDRT-PCR

Isolamento di geni differenzialmenteIsolamento di geni differenzialmenteespressi medianteespressi mediante DDRT-PCRDDRT-PCR

Omologia di CaGS Omologia di CaGS con con trasportatoritrasportatorie e sensori di glucosiosensori di glucosio

Identità Similarità Tipo di proteina Organismo

47% 67% Snf3p S.cerevisiae 46% 67% Rgt2p “ 47% 65% Rag4 K.lactis 44% 61% Rco3 N.crassa 35% 59% Hxt2 S.cerevisiae 33% 60% CaHgt1 C.albicans

E’ presente la sequenza consensus tipica dei trasportatori e sensoriper il glucosio: 334-[-G-I-i-l-V-E-t-W-G-R-R-p-l-l-m-a-g-S-]-351

Distruzione Distruzione del gene del gene mediante mediante lalatecnica della tecnica della cassettacassetta

PstIPstI

URA3

PCR2

AflII

HisG

null mutant

ura -/-

ATG TAA

CaGS

PstI

AflIII

Reinserimento Reinserimento del gene del gene CaGSCaGS nel nel locuslocus di originedi origine

Analisi per Northern

Analisi per Analisi per SouthernSouthern

CAI12 T1 T3 T5

CaGS1600 nt

A

B

rRNA

Analisi Analisi del del fenotipofenotiposu piastrasu piastra

CAI12 T1etero

T3null

T5revert

YNB/2% gl.+ 10% siero

YNB/0.1%gl.+ 10% siero

H2O+ 10% siero

M0199pH 7.5

Infezione dei macrofagiInfezione dei macrofagi

CAI12 T1 T3

Aspergillusspecie (185), raccolte in ben 18 gruppimuffe ubiquitarie

Aspergillus fumigatus

Ife settate di A. fumigatusche si diramano

dicotomicamente in uncampione di tessuto

Aspergillus fumigatusPuò riprodursi fino a 50°C : uccelli infezionimortali (in particolare A. fumigatus).

Nei rifiuti organici quando la T ↑, gliaspergilli coltura pura.

miceli simili a polvere verde-bluastro:fumigatus (latino fumoso).

I conidiofori lunghezza di 500um, conidiformano catene parallele verdastri(Aspergillus in latino significa spazzola)

Aspergillosi

Aspergillosi

L’invasione del tessuto polmonare è limitata a soggetti immunodepressi.

Aspergillus fumigatus

•dimensioni del tallo fungino maggiori di quelle dellecellule fagocitarie

•dimensioni della spora 2 a 3 µm

•l’energia meccanica del conidio in germinazione

•Micotossine

Fattori di Virulenza

Micotossine

Le micotossine (un gruppo di circa 100 sostanze)metaboliti secondari di alcuni funghi filamentosi

Aspergillus sp Penicillium sp Fusarium sp

Alimenti per lattanti e prima infanziaAlimenti per lattanti e prima infanzia Regolamento N. 683/2004

aflatossina B1 0,10 µg/kg

aflatossina M1 0,025 µg/kg

ocratossina A 0,50 µg/kg

TERAPIA

Il trattamento con Amfotericina B è incoraggiante.

Aspergillosi

Una sostanza antifungina ottimaledovrebbe avere...

• Un ampio spettro di attività• Proprietà farmacocinetiche

ottimali• Adeguata efficacia in vivo• Bassa tossicità• Basso costo

HOST

DRUG

FUNGUS

• Amphotericin B• Nystatin• Ketoconazole• Fluconazole• Itraconazole

Al momento esistono solo Fungistatici Tossici

se somministrati per lunghi periodi

CandidaCandida è in è in grado grado didi sopravvivere sopravvivereadattandosi agli ambienti più ostiliadattandosi agli ambienti più ostili,,

come come quello allquello all’’interno interno deidei macrofagi macrofagi

•Regolazione dell’espressione genica

•Secrezione di proteinasi (SAP)

•Produzione di ife

Isolamento di geni differenzialmente espressidurante l’infezione dei macrofagi

Studio della funzione dei geni isolati, perpoter individuare potenziali antifungini sui prodottiproteici

Amphotericin BMeccanismo di Azione

Azoles

• Azoles

• Causes Inhibition ofC-14 α demethylase,(an enzyme requiredfor the synthesis ofergosterol) by bindingto cytochrome P450

Imidazoles Triazoles

Imidazolo

Allyamines

• Inhibits squaleneepoxidase, an enzymeessential for synthesisof ergosterol

• Drug acculmulates innails, skin and fat

• Very useful for nailinfections

Polyenes

• Amphotericin, nystatin• Antifungal activity by

binding to membranesterols such asergosterol and theyincrease membranepermeability and leadsto cell death

Amphotericin Bè in uso clinico dal 1960

• Un poliene macrolide• Isolato dallo

Streptomyces nodosus• Insolubile in acqua• Solubilizzato in sodio

deossicolato

Amphotericin Bé attiva in vitro contro

• Candida spp.(incluse le specie azolo-resistenti)

• Aspergillus spp.• Cryptococcus neoformans• Mucor spp.• Blastomyces dermatitidis• Coccidioides immitis• Histoplasma capsulatum• Paracoccidioides brasiliensis

Ridotta suscettibilità(resistenza) all’ amphotericin B

• C. lusitaniae• C. krusei• C. neoformans• Trichosporon spp.• A. terreus

Walsh et al. JCM 1990; 28: 1616Sutton et al. JCM 1999; 37: 2343Arikan et al. JCM 1999; 37: 3946Arikan et al. JCM 2002; 40: 1406

• S. apiospermum• Fusarium spp.• C. carrionii• F. pedrosoi• ...

Resistenza all’ Amphotericin B

• Resistenza all’ amphotericin B èfrequentemente osservata in vivo

• Generalmente è dovuta ad una riduzionedell’attività del sistema immunitario

Amphotericin B

Amphotericin B è tossica

Effetti collaterali dell’ AmB

Nefrotossicità

Disfunzioni epatiche

Anemia,..